Name: Przygotowanie pocisków do pistoletów genowych i biolistyczna transfekcja neuronów w kulturze Slice (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 42 s
Description: Naucz się przygotowywać pociski do pistoletów genowych i przeprowadzać biolistyczną transfekcję neuronów w kulturach plasterków hipokampu szczura. Ta metoda umożliwia efektywne transfectowanie pojedynczych komórek z zachowaniem czystego tła do wizualizacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Markowi Lucanicowi oraz Hwai-Jong Cheng za pomoc w uzyskaniu obrazów całych przekrojów hipokampa przy niskim powiększeniu, przedstawionych w tym filmie. Chcielibyśmy również podziękować Sarah Parrish za pomoc w przygotowaniu tekstu towarzyszącego filmowi.

PROTOKÓŁ TRANSFEKCJI BIOLISTYCZNEJ
Przygotowanie punktów
„Bulletsy” są stabilne do 6 miesięcy, jednak po 2-3 miesiącach ich wydajność transfekcji może zacząć spadać. „Bulletsy” należy przechowywać w temperaturze 4°C w obecności granulek osuszających. Przed otwarciem fiolek scyntylacyjnych, w których przechowywane są „bulletsy”, należy zawsze odczekać, aż osiągną one temperaturę pokojową.
Przed rozpoczęciem należy przygotować:
<ul>
<li>Spermidyna (0,05 M)</li>
<li>CaCl2 (1 M)</li>
<li>EtOH (100% – wysokiej czystości – nieotworzona butelka)</li>
<li>Autoklawowana H2O</li>
<li>DNA do transfekcji</li>
<li>Poliwinylopirydon (roztwór PVP-20 mg/ml)</li>
<li>2 x 15 ml probówki stożkowe (zestaw 2/pocisk)</li>
<li>Rurka (cięta na 1 x ~30 cali/zestaw pociskowy)</li>
<li>Fiolki do scyntylacji (1/zestaw pociskowy)</li>
<li>Granulaty osuszające</li>
<li>Strzykawka 10 ml z rurką na końcu</li>
</ul>
Przygotuj wężyki:
<ol>
<li>Osusz ~ 30 calów rurki (około 2 cali wystających poza prawym pierścieniem O-ring) w stacji do rurek za pomocą gazu N2 (ciśnienie 0,4) przez minimum 20 min.</li>
</ol>
Wytrącanie DNA na kuleczkach złota:
<ol>
<li>Przygotować DNA do transfekcji w całkowitej objętości 50 μL w probówce do mikrocentryfugi (maksymalnie 50 μg całkowitej ilości DNA)</li>
<li>Odważyć 6-8 mg złota i przenieść do probówki do mikrocentryfugi</li>
<li>Dodać do złota 100 μL 0,05M spermidyny i poddać sonikacji przez 20 s</li>
<li>Dodać 50 μL DNA do mieszaniny złota i spermidyny</li>
<li>Wymieszać w wstrząsarce Vortex (ustawienie około 5) przy otwartej zakrętce</li>
<li>Dodać kroplami 100 μL 1M CaCl2</li>
<li>Poddać krótkiej sonikacji (&lt; 5 s)</li>
<li>Pozostawić do wytrącenia przez 10 min w temperaturze pokojowej</li>
<li>Poddać krótkiej sonikacji</li>
</ol>
Przygotuj roztwór PVP podczas sonikacji:
<ol>
<li>Przygotuj rozcieńczony roztwór PVP w stożkowej probówce 15 ml, przygotowując 3,5 ml rozcieńczonego PVP dla każdego zestawu kuletek (dodaj 7,5 μL roztwoku PVP 20 mg/ml do 3,5 ml 100% EtOH)</li>
</ol>
Płukanie kulek złota EtOH:
<ol>
<li>Odwirować złote koraliki z maksymalną prędkością przez 10 sec w mikrocentryfudze</li>
<li>Odlać supernatant, pozostawiając niewielką ilość cieczy nad złotymi koralikami</li>
<li>Przemyć 3X za pomocą 1ml EtOH, w razie potrzeby krótko sonikując po każdym razie</li>
</ol>
Resuspenduj złoto/DNA w roztworze PVP:
<ol>
<li>Resuspend pellet złota w 200 μL rozcieńczonego roztworu PVP/EtOH (3,5 ml)</li>
<li>Wymieszaj pellet złota na wortexie w celu resuspensji (w razie potrzeby krótko poddaj sonikacji)</li>
<li>Przenieś 200 μL roztworu złoto/PVP do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 mL</li>
<li>Postępuj w ten sposób, dodając po 200 μL PVP, aż całe złoto zostanie przeniesione do probówki stożkowej 15 mL, a objętość końcowa wyniesie 3,2 mL</li>
</ol>
Powlekanie rurek:
<ol>
<li>Wyłącz N2 w stacji z rurkami i wyjmij wysuszone rurki</li>
<li>Podłącz wysuszone rurki do strzykawki 10 ml</li>
<li>Energicznie wstrząśnij probówką stożkową 15 mL wypełnioną roztworem złoto/PVP</li>
<li>Umieść koniec rurki w roztworze złoto/PVP i powoli wciągnij ciecz, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza</li>
<li>Pozostaw ok. 2 cali suchego odcinka na obu końcach rurek</li>
<li>Trzymając rurkę nadal podłączoną do strzykawki i wypełnioną roztworem złoto/PVP, ostrożnie umieść rurkę z powrotem w stacji</li>
<li>Zaznacz końce rurek w miejscu, w którym znajduje się roztwór</li>
<li>Pozostaw złoto na 5 min w celu osadzenia przy podłączonej strzykawce</li>
<li>Bardzo powoli wciągnij roztwór, przesuwając tłok strzykawki tak, aby osadzone złoto pozostało w probówce (należy upewnić się, że nie nastąpi przepłukanie wsteczne)</li>
<li>Odłącz strzykawkę</li>
<li>Obróć o 90° i odczekaj 2 sekundy</li>
<li>Obróć o 180° i odczekaj kolejne 2 sekundy</li>
<li>Obracaj rurką przez 5 sek</li>
<li>Włącz N2 tak, aby manometr wskazywał wartość między 0,4 a 0,5, i obracaj rurki pokryte złotem podczas suszenia przez 5 min.</li>
</ol>
Przycinanie rurek:
<ol>
<li>Zdejmij dren z przygotowawczej stacji drenów i odetnij końce w wyznaczonych miejscach.</li>
<li>Umieść opisaną fiolkę scyntylacyjną pod przecinarką do drenów, aby zbierać odcięte wkłady.</li>
<li>Umieść dren w przecinarce i przetnij go czystą żyletką.</li>
<li>Włóż pellety osuszające do fiolki scyntylacyjnej.</li>
<li>Przechowuj wkłady w temperaturze 4°C.</li>
</ol>
Filmowanie przekrojów tkanek
Podczas ostrzeliwania hodowanych skrawków tkanek ważne jest zastosowanie relatywnie sterylnej techniki, aby uniknąć kontaminacji. Należy pamiętać, że&nbsp;przy ostrzeliwaniu dwóch różnych konstruktów oba zestawy pocisków można załadować do jednego uchwytu kasetowego, jednak wkładkę lufy oraz ekran należy wymienić pomiędzy konstruktami.
Przed rozpoczęciem należy przygotować:
<ul>
<li>Kule DNA (pozostawić fiolkę scyntylacyjną do ogrzania do temperatury pokojowej przed otwarciem)</li>
<li>Przekroje tkanki</li>
<li>Gene Gun Helios</li>
<li>Butla z hellem z podłączonym wężem do gene gun</li>
<li>Uchwyt wkładu</li>
<li>Wkładka lufy z zamontowanym plastikowym o-ringiem</li>
<li>Dyfuzor (zmodyfikowany)</li>
<li>Sito dyfuzora</li>
<li>Pinceta</li>
</ul>
Przygotowanie pistoletu genowego:
<ol>
<li>Za pomocą pęsety umieść plastikowe wkłady powlekane złotem w uchwycie na wkłady.</li>
<li>Włóż uchwyt na wkłady do gene gun, przesuwając najpierw blokadę.</li>
<li>Zabezpiecz uchwyt na wkłady za pomocą blokady.</li>
<li>Pobierz tuleję lufy z zamontowanym pierścieniem O oraz ekranem dyfuzyjnym.</li>
<li>Wkręć tuleję lufy do gene gun.</li>
</ol>
Bombardowanie hodowlanych przekrojów za pomocą armatki genowej:
<ol>
<li>Założyć ochronniki słuchu</li>
<li>Podłączyć pistolet genowy do węża połączonego z butlą z Helem</li>
<li>Zwiększyć ciśnienie w butli do 180 PSI</li>
<li>Wykonać strzał jałowy w powietrze, aby usunąć kurz lub zanieczyszczenia z ekranu dyfuzyjnego. Aby wystrzelić z pistoletu, najpierw należy nacisnąć przycisk blokady bezpieczeństwa i trzymać go do momentu usłyszenia sygnału dźwiękowego, a następnie pociągnąć za spust.</li>
<li>Po wykonaniu strzału jałowego wyjąć skrawki z inkubatora</li>
<li>Przesunąć pistolet nad pierwszą konstrukcję</li>
<li>Wystrzelić, utrzymując ekran dyfuzyjny w odległości około 0,5 - 1 cala od skrawka</li>
<li>Przesunąć kasetę pomiędzy dołkami.</li>
<li>Po wystrzeleniu do ostatniego dołka umieścić skrawki z powrotem w inkubatorze</li>
<li>Zakręcić dopływ gazu i upuścić ciśnienie przed odłączeniem pistoletu od węża z Helem</li>
<li>Odkręcić tuleję lufy, a następnie wyjąć kasetę i zużyte ładunki</li>
</ol>
Czyszczenie uchwytów wkładów i wkładów rurki:
<ol>
<li>Umieścić wkłady, tuleje lufy i ekrany dyfuzyjne w zlewce z wodą z mydłem</li>
<li>Wstawić zlewkę do myjki ultradźwiękowej i sonikować przez 20 min</li>
<li>Dokładnie wypłukać wodą, aż do usunięcia wszystkich pozostałości mydła</li>
<li>Namoczyć w 70% EtOH przez godzinę</li>
<li>Położyć na suchym ręczniku papierowym na noc w celu wysuszenia</li>
<li>Oczyszczone wkłady, tuleje lufy i ekrany można następnie wykorzystać w kolejnych transfekcjach biolistycznych</li>
</ol>
Wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów w transfekcji biolistycznej
Transfekcja biolistyczna może czasami prowadzić do nieoptymalnych warunków transfekcji.&nbsp; Może ona skutkować zbyt małą lub zbyt dużą liczbą transfekowanych komórek, zbyt wysokim lub zbyt niskim poziomem ekspresji, bądź może spowodować ogólne pogorszenie stanu zdrowia przekrojów tkankowych. Często niezdrowe przekroje są wynikiem gwałtownego wyrzutu pod ciśnieniem. &nbsp;Oto kilka wskazówek, jak uzyskać optymalnie transfekowane przekroje tkankowe.
Jeśli przekroje wydają się niezdrowe (lub jeśli zbyt wiele komórki są transfekowane/ skrawek), spróbuj:
<ul>
<li>zwiększenie odległości strzału</li>
<li>zmniejszenie ciśnienia w zbiorniku gazu</li>
<li>zmniejszenie ilości złota</li>
<li>wycięcie środkowej części dyfuzora Bio-Rad i zastąpienie jej sitem dyfuzyjnym.</li>
</ul>
Jeśli przetransfekowano zbyt mało komórek, należy spróbować:
<ul>
<li>zmniejszenie dystansu strzału</li>
<li>zwiększenie ciśnienia w zbiorniku gazu</li>
<li>zwiększenie ilości złota</li>
<li>zwiększenie liczby przekrojów tkanki na studzienkę</li>
<li>należy upewnić się, że o-ring w tulei lufy jest nieuszkodzony.</li>
</ul>
Jeśli w jednej serii strzałów uzyskasz preparaty z zbyt dużą ORAZ zbyt małą liczbą przetransfekowanych komórek, upewnij się, że:
<ul>
<li>pistolet jest trzymany symetrycznie nad dołkiem</li>
<li>złoto równomiernie pokrywa wnętrze rurki. (Jeśli powstaje linia złota, po osadzeniu się złota należy szybciej odessać nadpływ z rurki i dłużej obracać złoto przed włączeniem azotu. Jeśli natomiast pojawiają się smugi złota, wynika to prawdopodobnie ze zbyt długiej ekspozycji na wilgoć podczas przygotowywania pocisków: należy upewnić się, że używana jest nieotwierana butelka EtOH, rurka jest całkowicie sucha przed powlekaniem, a nakładanie zakrętek i przygotowywanie pocisków odbywa się sprawnie i bezzwłocznie).</li>
</ul>
Jeśli wydajność transfekcji wydaje się optymalna (liczba przetransfekowanych komórek / plaster), ale poziom ekspresji wydaje się zbyt wysoki lub zbyt niski:
<ul>
<li>dostosuj stosunek DNA do złota&nbsp; (np. jeśli jest zbyt niski, zachowaj ilość złota, ale zwiększ ilość DNA).</li>
<li>dostosuj czas pomiędzy naświetlaniem a gromadzeniem danych</li>
</ul>
W przypadku transfekcji podwójnej, jeśli ekspresja jednego z konstruktów jest zbyt niska, należy odpowiednio dostosować stosunek obu konstruktów oraz upewnić się, że oba znajdują się pod kontrolą tego samego promotora, aby zapobiec sytuacji, w której jeden promotor zdominuje drugi.

<ol><li>Klein, T. M., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+foreign+genes+into+intact+maize+cells+with+high-velocity+microprojectiles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).</li>
<li>Wellmann, H., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+biolistic+transfection+of+brain+slices+and+dissociated+cultured+neurons+with+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).</li>
<li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+STKE%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neurons.</a> Sci. STKE. 51, 1-13 (2000).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
</ol>

Transfekcja biolistyczna jest fizyczną metodą transfekcji komórek poprzez bombardowanie żywej tkanki cząsteczkami złota powleczonymi DNA, poruszającymi się z dużą prędkością. W ogólnym ujęciu, w przypadku transferu genów za pośrednictwem cząsteczek, do transfekcji komórek dochodzi, gdy cząsteczka zatrzymuje się w jądrze komórkowym. Chociaż istnieje wiele różnych metod transfekcji, takich jak mikroiniekcja, lipofekcja, transfekcja fosforanem wapnia, elektroporacja i transfekcja wirusowa, transfekcja biolistyczna może stanowić mniej pracochłonną i wydajną alternatywę dla transfekcji komórek, które nie poddają się łatwo innym metodom. W rzeczywistości technika ta została opracowana początkowo jako metoda transferu genów u roślin, ponieważ obecność ściany komórkowej utrudniała transfekcję przy użyciu istniejących wcześniej metod1. Podobnie, metoda biolistyczna zyskała popularność w dziedzinie neurobiologii, gdyż neurony postmitotyczne są znane z trudności w transfekcji2,3. W szczególności jest ona powszechnie uznawana za główną technikę stosowaną w eksperymentach mających na celu ocenę szczegółowej morfologii pojedynczych neuronów w nienaruszonych skrawkach mózgu. Metody opisane w niniejszym materiale stanowią szczegółowe i wyczerpujące wyjaśnienie tego, jak przeprowadzić transfekcję biolistyczną hodowanych skrawków mózgu przy użyciu ręcznego pistoletu genowego (system Helios Gene Gun; Bio-Rad).
Transfekcja biolistyczna stała się preferowaną metodą transfekcji neuronów w kulturach skrawków tkanki, ponieważ pozwala na transfekcję niewielkiej liczby komórek rozproszonych w całym skrawku mózgu. W ten sposób poszczególne neurony mogą być badane w izolacji. Ponieważ technika ta jest szczególnie odpowiednia do transfekcji neuronów w skrawkach mózgu, często stosuje się ją w połączeniu z mikroskopią dwufotonową, gdyż wzbudzanie dwufotonowe umożliwia wizualizację komórek znakowanych fluorescencyjnie głęboko w tkankach rozpraszających światło4. Rzeczywiście, przedstawione w tym filmie obrazy pojedynczych neuronów piramidowych przy dużym powiększeniu zostały zarejestrowane przy użyciu specjalnie zbudowanego dwufotonowego skaningowego mikroskopu laserowego. Podsumowując, transfekcja biolistyczna jest wydajnym sposobem transfekcji pojedynczych komórek w kontekście wysokiej gęstości komórek otaczających, a co za tym idzie, okazała się niezwykle użyteczna w fluorescencyjnym znakowaniu pojedynczych neuronów w kulturach skrawków neuronalnych.

<table><tbody><tr><td>cząsteczki złota 1.6um (mikronośniki)</td><td>0.25g</td><td>Bio-Rad</td><td>1652264</td><td></td></tr><tr><td>1M CaCl2</td><td></td><td>Fluka</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>1 pinta</td><td>Goldshield</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubing do wkładów</td><td></td><td>Bio-Rad</td><td>1652412</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki scyntylacyjne</td><td>20ml, 500/opakowanie</td><td>VWR international</td><td>66021-668</td><td></td></tr><tr><td>Granulki osuszające</td><td>&amp;#8221;Dricap&amp;#8221; </td><td>MTI (800-445-9890)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonikator w kąpieli wodnej</td><td>model 50T</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do wkładów</td><td>opakowanie 5 szt.</td><td>Bio-Rad</td><td>1652426</td><td></td></tr><tr><td>Wkładka do tuby</td><td>opakowanie 5 szt.</td><td>Bio-Rad</td><td>1652417</td><td></td></tr><tr><td>Sito dyfuzyjne</td><td>opakowanie 5 szt.</td><td>Bio-Rad</td><td>1652475</td><td></td></tr><tr><td>O-ring</td><td>75 Viton, Rozmiar 007, Ilość 100</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sito (siatka)</td><td></td><td>McMaster-Carr</td><td>144258</td><td></td></tr><tr><td>PVP </td><td>20mg/ml w EtOH</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Dostarczane z tubingiem z firmy Bio-Rad</td></tr><tr><td>Stacja do przygotowania tubingów</td><td></td><td>Bio-Rad</td><td>1652418</td><td></td></tr><tr><td>Obcinarka do tubingów</td><td></td><td>Bio-Rad</td><td>1652422</td><td></td></tr><tr><td>Działo genowe Helios</td><td></td><td>Bio-Rad</td><td>1652411</td><td></td></tr><tr><td>Wąż do działa genowego </td><td></td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Dostarczany z działem genowym</td></tr><tr><td>Spermidyna</td><td>5g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s-0266</td><td></td></tr><tr><td colspan="5">Chociaż wszystkie produkty wymieniliśmy osobno, bardziej ekonomiczne jest zakupienie zestawu &quot;Helios Gene-Gun System&quot;, który zawiera wszystkie powyższe produkty firmy Bio-Rad (nr kat. 165-2431).</td></tr></tbody></table>

przygotowanie mikropocisków do armatki genowej oraz transfekcja biolistyczna neuronów w kulturze plastrów tkankowych

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Transfekcja biolistyczna jest fizyczną metodą transfekcji komórek poprzez bombardowanie tkanki cząsteczkami powleczonymi DNA, poruszającymi się z dużą prędkością. Przedstawiamy szczegółowy protokół transfekcji biolistycznej skrawków hipokampa szczura, począwszy od wstępnego przygotowania mikrocząsteczek powleczonych DNA, aż po końcowe „ostrzelanie” organotypowych kultur skrawków za pomocą armatki genowej. Transfekcja za pomocą armatki genowej jest wydajnym i prostym sposobem transfekcji neuronów i jest szczególnie użyteczna do fluorescencyjnego znakowania niewielkiej podgrupy komórek w skrawku tkanki. W tym filmie najpierw opisujemy kroki niezbędne do powlekania cząsteczek złota DNA. Następnie demonstrujemy, jak wyłożyć wnętrze plastikowej rurki mikrocząsteczkami złota/DNA oraz jak przeciąć tę rurkę, aby uzyskać plastikowe wkłady do załadowania do armatki genowej. Na koniec przeprowadzamy transfekcję biolistyczną kultur skrawków hipokampa szczura, prezentując obsługę armatki genowej Bio-Rad Helios oraz oferując wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów w celu uzyskania zdrowych i optymalnie transfekowanych skrawków tkanki.

Opisujemy metodę przygotowania złotych mikrocząsteczek (tzw. „bullets”) powlekanych DNA oraz demonstrujemy wykorzystanie tych cząsteczek do biolistycznej transfekcji neuronów w hodowanych plastrach hipokampa.

Przygotowanie mikropocisków do armatki genowej oraz transfekcja biolistyczna neuronów w kulturze plastrów tkankowych

Transfekcja biolistyczna to fizyczna metoda transfekcji komórek poprzez bombardowanie tkanki cząstkami powleczonymi DNA, poruszającymi się z dużą prędkością. Przedstawiamy szczegółowy...

Transfekcja biotyczna lub za pomocą armatki genowej to fizyczna metoda transfekcji komórek poprzez bombardowanie tkanki cząsteczkami powleczonymi DNA poruszającymi się z dużą prędkością. Technika ta jest wydajnym i łatwym sposobem transfekcji neuronów i jest szczególnie użyteczna w przypadku transfekcji jedynie niewielkiej liczby komórek w skrawku tkanki. Przykładem są badania z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej, których celem jest analiza morfologii neuronów w nienaruszonym skrawku.Transfekcja Bic ułatwia wizualizację pojedynczych neuronów na czystym tle nieprzestransformowanych komórek. W tym filmie prezentujemy metodę przygotowania pocisków do armatki genowej pokrytych DNA, a następnie przeprowadzamy transfekcję Bic w organotypowych kulturach plastrów hipokampa. Cześć, jestem Georgia Woods.Jestem studentem studiów doktoranckich w laboratorium dr Karen Zito na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis. Dzisiaj zaprezentuję, jak przygotować pociski powlekane DNA oraz jak przeprowadzić transfekcję Bic w skrawkach hipokampa szczura. Podstawowe etapy transfekcji Bic polegają na: po pierwsze, powleczeniu cząsteczek złota DNA przeznaczonym do transfekcji, po drugie, powleczeniu wnętrza plastikowej rurki tym złotem trzecie.Potnij rurkę na wkłady do załadowania do armaty genowej i po czwartym, wypaliw tkankę do transfekcji. Zatem zacznijmy. Zanim będziemy gotowi do transfekcji, musimy najpierw przygotować pociski pokryte DNA.Będzie to wymagało pokrycia cząsteczek złota o rozmiarze 1,6 mikrona plazmidem DNA, który ma zostać przetransfekowany. Podczas procesu „strzelania” pojedyncza cząsteczka złota będzie pełnić rolę pocisku, który przeniknie do komórki, prowadząc do transfekcji. W związku z tym w pierwszej kolejności musimy przygotować DNA do transfekcji.W idealnym przypadku należy zużyć mniej niż 50 µg DNA na zestaw nanocząsteczek w całkowitej objętości 50 µL wody. Należy pamiętać, że dokładna ilość DNA powinna zostać określona empirycznie dla każdego konstruktu w celu uzyskania optymalnego poziomu ekspresji. Po przygotowaniu alikwotu DNA należy dodać spermine do złotych kulek.Do odważonych 8 mg złota należy dodać 100 µL nasienia, wymieszać i poddać sonikacji przez około 20 sekund. Jest to nasienie.Meine jest poliaminą, która nadaje złote koraliki ładunek dodatni, dzięki czemu ujemnie naładowane DNA oddziałuje z dodatnio naładowanym metalem. Po 22. sekundzie dodaj 50 µL roztworu DNA w wodzie do złota. Po dodaniu DNA do koralików mieszaj na wortexie, dodając kroplami 100 µL chlorku wapnia; chlorek wapnia powoduje wytrącanie się DNA.Po krótkim wymieszaniu w wirówce vortex należy pozostawić roztwór do precypitacji na 10 minut. Po 10-minutowej precypitacji DNA i złoto należy wirować z maksymalną prędkością przez 30 sekund w wirówce stołowej; po tym szybkim wirowaniu należy odpipetować większość nadsączu, uważając, aby nie zassać osadu złota. Na tym etapie usuwam po prostu wszelkie DNA, które nie precypitowało na złocie.Następnie cząsteczki złota przemywa się 1 mL świeżego etanolu i krótko poddaje sonikacji. Po wytrąceniu DNA złoto ma tendencję do aglomeracji; lekka sonikacja rozbija te skupiska złota. Należy jednak uważać, aby nie doprowadzić do fragmentacji DNA poprzez zbyt długą sonikację.Granulki złota ponownie wirowano, a etanol usunięto za pomocą pipety. Płukanie etanolem powtórzono jeszcze dwukrotnie. Po trzecim płukaniu etanolem dodano 200 µL rozcieńczonego roztworu poliwinylopirrolonu (PVP) i poddano sonikacji.Szybko przenieś pokryte złoto do probówki stożkowej 15 ml, zawierającej już 200 µL rozcieńczonego roztworu PVP. PVP jest rozpuszczalnikiem, który spowoduje przyleganie cząsteczek złota do użytej plastikowej rurki. W następnym kroku usuń pozostałości kulek złota z probówki epi, dodając do niej 200 µL PVP.Następnie krótko wirować i przenieść do probówki stożkowej 15 ml. Powtarzać tę czynność do momentu, aż całe złoto zostanie przeniesione do probówki stożkowej 15 ml. Przenieść pozostały roztwór PVP, tak aby złoto zostało zawieszone w 3,2 ml roztworu PVP w etanolu.Teraz możemy przystąpić do powlekania plastikowej rurki, która będzie służyła do przechowywania pocisków do armatki genowej po ich załadowaniu do urządzenia. Ponieważ złoto zostało już powleczone DNA, musimy wyłożyć wnętrze plastikowej rurki cząsteczkami złota. Ta plastikowa rurka powleczona złotem zostanie faktycznie umieszczona w tubie armatki genowej.Na początek odciąć fragment rurki w taki sposób, aby wystawała ona około dwóch cali poza pierścień O. Po umieszczeniu rurki w stacji przygotowawczej przekręcić zawór ciśnienia tak, aby przepływomierz wskazywał około 0,4. Azot zapewnia atmosferę wolną od wody do osuszania rurki; suszyć rurkę przez około 20 minut.Najlepiej jest przeprowadzić ten etap suszenia w czasie powlekania złotych kulek DNA, zgodnie z opisem w poprzednim kroku. Dzięki temu rurki będą suche i gotowe do powlekania po zakończeniu tej czynności. Przygotowanie złotych kulek po wysuszeniu rurek oraz powleczeniu złota DNA.Wyłącz stację N dwa przed napełnieniem cewki roztworem złota z PVP, a następnie zdejmij wysuszoną cewkę ze stacji i podłącz ją do strzykawki 10 ml przed zassaniem PVP i złota do wnętrza cewki. Dokładnie wstrząśnij roztworem i niezwłocznie zassij go do wysuszonej cewki, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Należy również uważać, aby nie zassać roztworu do wnętrza strzykawki.Po napełnieniu rurek roztworem PVP Gold, ostrożnie umieść je z powrotem w stacji N dwa. Pozostaw roztwór na pięć minut z podłączoną strzykawką, aby cząsteczki złota mogły osiąść na dnie rurki. Zaznacz końce rurek w miejscach, w których osadził się roztwór.Po ustabilizowaniu się roztworu, na dnie rurki przy użyciu dołączonej strzykawki będzie widoczny złoty pasek. Bardzo powoli odessać nadsącz, upewniając się, że nie dojdzie do cofnięcia cieczy i odłączyć rurkę. Następnie należy obracać i suszyć rurkę, aby złoto równomiernie przyległo do jej wewnętrznej powierzchni.Najpierw obróć probówkę o 90 stopni. Odczekaj dwie sekundy. Teraz obróć ją o kolejne 180 stopni i odczekaj kolejne dwie sekundy.Wiruj przez pięć sekund, a następnie włącz N dwa tak, aby stacja wskazywała wartość od 0,4 do 0,5, i wiruj przez pięć minut, aż rurka wyschnie. Po upływie pięciu minut, gdy złoto jest już suche, należy pociąć rurkę na wkłady, które można załadować do gene gun. Teraz potnę rurkę na odcinki o długości około pół cala, aby przygotować kapsułki o rozmiarze odpowiednim do załadowania do cylindra gene gun.Aby zebrać tulejki, umieść symulowaną żółć foki pod przecinarką, przetnij rurkę w wyznaczonych miejscach, używając do tego czystej żyletki. Umieść rurkę w przecinarce do rurek, aby odciąć odpowiednią długość. Wsuwaj rurkę do przodu, aż poczujesz opór, a następnie ją przetnij.Po odcięciu i umieszczeniu odcinków rurek w fiolce scyntylacyjnej, należy włożyć do niej pellet osuszający. Próbki są stabilne przez maksymalnie sześć miesięcy, jednak po dwóch lub trzech miesiącach może zacząć występować spadek wydajności transfekcji. Dlatego dobrą praktyką jest opisanie fiolki nazwą konstruktu oraz datą.Mikrokule można wykorzystać natychmiast po przygotowaniu lub przechowywać w temperaturze 4 °C. W przypadku użycia mikrokulek przechowywanych w temperaturze 4 °C, należy pozostawić fiolkę w temperaturze pokojowej przez około 15 minut przed otwarciem, aby zapobiec pochłanianiu wilgoci przez mikrokule. Możemy teraz przystąpić do wprowadzania mikrokulek z DNA za pomocą armatki genowej.Po przygotowaniu mikrocząsteczek jestem gotowy do właściwej transfekcji komórek. Będę używać pistoletu genowego BioRad Helios i będę przeprowadzać strzały w skrawkach hipokampa szczura, które były inkubowane przez pięć dni od momentu wycięcia. Pistolet genowy zostanie podłączony do butli z helem.Po wystrzeleniu z pistoletu krótki impuls ciśnienia ze zbiornika przyspieszy cząsteczki złota w miejscu cięcia. Zasadniczo, gdy cząsteczka złota zostanie osadzona w jądrze komórki, komórka ta zostanie poddana transfekcji.Ponieważ dokonuję transfekcji hodowanych przekrojów, w całym procesie transfekcji stosuję względnie sterylną technikę, aby uniknąć kontaminacji. Po ogrzaniu wkładów do temperatury pokojowej otwórz fiolkę z preparatem i umieść powlekane złotem plastikowe wkłady w uchwycie wkładów. Następnie umieść uchwyt wkładów w pistolecie genowym, najpierw odsuwając blokadę cylindra.Teraz należy przymocować tuleję lufy do pistoletu. Najpierw należy upewnić się, że oring znajduje się w tulei lufy, a siatka dyfuzyjna jest stabilnie zamocowana. Siatka służy do rozpraszania ciśnienia z lufy, co prowadzi do rozpylenia złota, zapewniając jego bardziej równomierne rozprzestrzenienie w studzience.Wkręć wkładkę lufy do końca do genowej armaty. W przypadku wystrzeliwania dwóch różnych konstruktów, oba zestawy pocisków można załadować do tego samego uchwytu wkładów, jednak wkładkę lufy i ekran należy wymienić pomiędzy konstruktami. Genowa armata jest teraz gotowa do podłączenia do źródła helu.Podłącz pistolet genowy do węża połączonego ze zbiornikiem helu. Powinien on wskoczyć na miejsce; następnie zwiększ ciśnienie w zbiorniku do 180 PSI. Pistolet jest teraz gotowy do strzału, jednak najpierw pamiętaj o założeniu ochrony słuchu i, aby usunąć kurz lub zanieczyszczenia z sita dyfuzyjnego, wykonaj strzał jałowy.Najpierw naciśnij przycisk blokady bezpieczeństwa, aż pistolet wyda sygnał dźwiękowy, a następnie naciśnij spust. Teraz można przystąpić do aplikacji na skrawki. Po wykonaniu strzału próbnego wyjmij skrawki z inkubatora.Podczas sekcji hipokampa umieszczamy cztery plastry w każdej studzience, układając je tak, aby tworzyły narożniki kwadratu o boku dwóch centymetrów w pobliżu środka błony. Naświetlamy każdą studzienkę za pomocą ekranu dyfuzyjnego w odległości około od połowy do jednego cala od plastra. Transfekcyjne komórki można zazwyczaj badać w ciągu od jednego do pięciu dni, w zależności od zastosowanego konstruktu.Po wykonaniu pomiarów we wszystkich dołkach, wyłączyć dopływ gazu i zwolnić ciśnienie przed odłączeniem pistoletu od węża z helem. Wyjąć wkłady oraz zużyte łuski. Odkręcić wkładkę lufy; wkłady, wkładki lufy i sita można wyczyścić, umieszczając je w kąpieli z mydlaną wodą i poddając działaniu myjki ultradźwiękowej przez 20 minut, a następnie dokładnie płucząc w wodzie, mocząc w 70% ethanol przez godzinę i pozostawiając na suchym ręczniku papierowym na noc.Wyczyszczone wkłady i sitka mogą być następnie ponownie wykorzystane w kolejnych transfekcjach biotycznych. Przyjrzyjmy się teraz niektórym wynikom transfekcji. Nawet w przypadku standardowego przygotowania skrawka hipokampa zakres wydajności transfekcji może być dość szeroki, w zależności od użytych „pocisków” i samych skrawków.Zazwyczaj pożądana jest stosunkowo niska wydajność transfekcji, aby uzyskać dobrze odizolowane transfektowane neurony. Ponadto, gdy transfektowanych jest zbyt wiele komórek, ogólny stan zdrowia skrawka ulega pogorszeniu, nawet w optymalnych warunkach. Zwyczajowo na skrawku znajduje się mniej niż 20 komórek, lecz często w innych skrawkach w tej samej studzience kończy się znacznie większą liczbą komórek.Przez transfekcję i inne procesy w skrawkach znajdzie się mniej komórek. Niespójności w wydajności transfekcji między skrawkami wynikają zazwyczaj z faktu, że albo rozmieszczenie skrawków względem lufy nie było symetryczne, albo złoto nie zostało równomiernie naniesione na cewkę, lecz skoncentrowało się po jednej stronie. Jeśli przetransfekowano zbyt wiele komórek, należy spróbować zwiększyć odległość strzału od próbki, zmniejszyć ciśnienie strzału lub zmniejszyć ilość złota używanego do tworzenia pocisków.Tutaj można zobaczyć świetny przykład przetransfekowanego neuronu parametralnego w obszarze CA1. W tej konkretnej komórce widoczna jest osadzona złota nanokapsułka. Oto bliższe spojrzenie na przetransfekowany neuron. W obszarze CA1 stymulacja elektryczna może czasami prowadzić do uszkodzenia skrawków tkanki.Często w wyniku gwałtownego wzrostu ciśnienia powstają uszkodzone przekroje. System armatki genowej Helios jest wyposażony w dyfuzor z metalnym krzyżem w centrum. Wycinamy wewnętrzny metalny krzyż i zamiast niego stosujemy metalowy ekran.Siatkę wycinamy tak, aby była nieco większa od końcówki wkładki lufy, a następnie zaciskamy ją pomiędzy końcem wkładki a wyciętym dyfuzorem. Stwierdziliśmy, że poprawia to kondycję plastrów. Ponadto optymalne warunki wystrzału różnią się w zależności od preparatu eksperymentalnego; aby zoptymalizować proces dla różnych preparatów, należy zmieniać ciśnienie w zbiorniku z helem oraz odległość wystrzału od próbki.Wreszcie, w przypadku gdy chcą Państwo załadować do mikropocisków dwa różne konstrukty do transfekcji podwójnej, należy upewnić się, że oba konstrukty znajdują się pod kontrolą tego samego promotora. Dzięki temu jeden promotor nie będzie konkurował z drugim. Przedstawiłem właśnie sposób przygotowania mikropocisków do gene gun oraz metodę transfekcji plastrów hipokampa z wykorzystaniem transfekcji BIC.Jest to niezwykle skuteczna metoda przeprowadzania badań morfologicznych pojedynczych neuronów, które można obrazować w izolacji. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

preparation-gene-gun-bullets-biolistic-transfection-neurons-slice

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie pocisków do pistoletów genowych i biolistyczna transfekcja neuronów w kulturze Slice

Gene-gun Transfekcja Neurony hipokampa

Niniejszy artykuł przedstawia metodę preparowania i inkubacji siatkówki królika oraz zapośredniczony przez cząsteczki transfer genów plazmidów kodujących GFP lub różne markery subkomórkowe do komórek zwojowych siatkówki.

Organotypowa hodowla siatkówki dorosłego królika

Bezpośrednia injekcja cDNA do jądra komórkowego jest skuteczną techniką transfekcji komórek pomitotycznych. Metoda ta zapewnia wysoki poziom ekspresji białek heterologicznych z pojedynczych lub wielu konstruktów cDNA i umożliwia badanie funkcji białek w fizjologicznie istotnym środowisku z wykorzystaniem różnych testów na pojedynczych komórkach.

Wewnątrzjądrowa mikroiniekcja DNA do rozdzielonych neuronów dorosłych ssaków

Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania i utrzymania preparatu przekroju nowokory w kulturze organotypowej w celu wykonania rejestracji elektrycznej z neuronów piramidowych.

Rejestracja całokomórkowa z organotypowego preparatu skrawka neokory

W celu przeprowadzenia szybkiej oceny funkcji genów w rozwoju kory mózgu opisujemy metody obejmujące elektroporację ex vivo plazmidów koekspresujących inhibicyjne RNA (RNAi) i GFP w zarodkowej korze mysiej. Protokół ten nadaje się do badania różnych aspektów neurorozwoju, takich jak neurogeneza, migracja neuronów oraz morfogeneza neuronów, w tym wzrost dendrytów i aksonów.

Metody badania morfogenezy neuronalnej: Elektroporacja RNAi ex vivo w embrionalnej korze mózgu myszy

Źródło: Keener, D. G., et al. Elektroporacja pojedynczych komórek w różnych organotypowych kulturach warstwowych mysich neuronów pobudzających hipokampa i specyficznych dla klasy neuronów hamujących. J. Vis. Exp. (2020).Ten film pokazuje proces elektroporacji pojedynczej komórki w celu wprowadzenia plazmidowego DNA do neuronów w hodowlach plastrów hipokampa myszy. Procedura obejmuje precyzyjne pozycjonowanie pipety, regulację ciśnienia i impulsy elektroporacyjne w celu przejściowej...

Ekspresja genów poprzez elektroporację pojedynczych komórek w mysich kulturach warstw hipokampa

Ten film demonstruje protokół elektroporacji pojedynczych komórek genów zarówno w neuronach pobudzających, jak i hamujących w różnych kulturach in vitro w warstwach hipokampa. Technika ta jest przydatna do badania specyficznych funkcji molekularnych i fizjologicznych neuronów, w tym autonomicznych mechanizmów komórkowych i interakcji białek transsynaptycznych.

Elektroporacja pojedynczych komórek w organotypowych kulturach wycinków mózgu: technika in vitro dostarczania plazmidów do docelowych neuronów w wycinkach hipokampa mózgu

Źródło: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineerical Interneuron Pregenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia procedurę wstrzykiwania wektora plazmidowego przenoszącego interesujący nas gen do progenitorów interneuronów w embrionalnym wycinku mózgu, a następnie elektroporacji w celu wejścia plazmidu i ekspresji genu. Te zmodyfikowane komórki progenitorowe mogą być później wykorzystane do leczenia zaburzeń mózgu.

Transfer genów wspomagany elektroporacją osadzony w agarozie w progenitorach interneuronów kory myszy

Ostatnie ulepszenia w organotypowych preparatach do wycinania mózgu pozwoliły na ich wykorzystanie do zastosowań biotechnologicznych. Plastry organotypowe zachowują lokalne cechy strukturalne biologii in vivo, w tym funkcjonalne połączenia synaptyczne. Tutaj przedstawiamy regioselektywną biolistyczną metodę dostarczania do znakowania i genetycznej manipulacji tymi wycinkami.

Regioselektywne celowanie biolistyczne w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu zmodyfikowanego pistoletu genowego

Prezentowany tutaj jest protokół elektroporacji pojedynczej komórki, który może dostarczyć geny zarówno w neuronach pobudzających, jak i hamujących w różnych epokach hodowli in vitro w warstwach hipokampa. Nasze podejście zapewnia precyzyjną i wydajną ekspresję genów w poszczególnych komórkach, które można wykorzystać do badania funkcji autonomicznych i międzykomórkowych.

Elektroporacja jednokomórkowa w różnych organotypowych kulturach warstwowych mysich neuronów pobudzających hipokampa i specyficznych dla klasy neuronów hamujących

Naucz się przygotowywać pociski do pistoletów genowych i przeprowadzać biolistyczną transfekcję neuronów w kulturach plasterków hipokampu szczura. Ta metoda umożliwia efektywne transfectowanie pojedynczych komórek z zachowaniem czystego tła do wizualizacji.

Przygotowanie mikropocisków do armatki genowej oraz transfekcja biolistyczna neuronów w kulturze plastrów tkankowych

Przeglądaj więcej filmów