Name: Przygotowanie filtratu z hodowli Mycobacterium tuberculosis w celu zrozumienia patogenezy gruźlicy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Poznaj metodę przygotowania filtratu z hodowli Mycobacterium tuberculosis w celu identyfikacji białek sekretorycznych i czynników wirulencji. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów modulacji odpowiedzi immunologicznej gospodarza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Preparing Mtb Secretome to Study Host-Pathogen Interactions

<ol><li>Campbell, I. A., Bah-Sow, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+tuberculosis%3A+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+J%22%5BJournal%5D)">Pulmonary tuberculosis: diagnosis and treatment.</a> Br Med J. 332 (7551), 1194-1197 (2006).</li>
<li>Sonnenberg, M. G., Belisle, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+Mycobacterium+tuberculosis+culture+filtrate+proteins+by+two-dimensional+polyacrylamide+gel+electrophoresis%2C+N-terminal+amino+acid+sequencing%2C+and+electrospray+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Definition of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate proteins by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequencing, and electrospray mass spectrometry.</a> Infect Immun. 65 (11), 4515-4524 (1997).</li>
<li>Burts, M. L., Williams, W. A., DeBord, K., Missiakas, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EsxA+and+EsxB+are+secreted+by+an+ESAT-6-like+system+that+is+required+for+the+pathogenesis+of+Staphylococcus+aureus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">EsxA and EsxB are secreted by an ESAT-6-like system that is required for the pathogenesis of Staphylococcus aureus infections.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (4), 1169-1174 (2005).</li>
<li>Braunstein, M., Brown, A. M., Kurtz, S., Jacobs, W. R. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+nonredundant+SecA+homologues+function+in+Mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Two nonredundant SecA homologues function in Mycobacteria.</a> J Bacteriol. 183 (24), 6979-6990 (2001).</li>
<li>Feltcher, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+quantitative+proteomics+reveals+a+role+for+the+Mycobacterium+tuberculosis+SecA2+pathway+in+exporting+solute+binding+proteins+and+Mce+transporters+to+the+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Label-free quantitative proteomics reveals a role for the Mycobacterium tuberculosis SecA2 pathway in exporting solute binding proteins and Mce transporters to the cell wall.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (6), 1501-1516 (2015).</li>
<li>McDonough, J. A., Hacker, K. E., Flores, A. R., Pavelka, M. S. Jr, Braunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+twin-arginine+translocation+pathway+of+Mycobacterium+smegmatis+is+functional+and+required+for+the+export+of+mycobacterial+beta-lactamases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The twin-arginine translocation pathway of Mycobacterium smegmatis is functional and required for the export of mycobacterial beta-lactamases.</a> J Bacteriol. 187 (22), 7667-7679 (2005).</li>
<li>Saint-Joanis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Rv2525c%2C+a+substrate+of+the+twin+arginine+translocation+%28Tat%29+system+of+Mycobacterium+tuberculosis%2C+increases+beta-lactam+susceptibility+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Rv2525c, a substrate of the twin arginine translocation (Tat) system of Mycobacterium tuberculosis, increases beta-lactam susceptibility and virulence.</a> J Bacteriol. 188 (18), 6669-6679 (2006).</li>
<li>Braunstein, M., Espinosa, B. J., Chan, J., Belisle, J. T., Jacobs, W. R. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SecA2+functions+in+the+secretion+of+superoxide+dismutase+A+and+in+the+virulence+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">SecA2 functions in the secretion of superoxide dismutase A and in the virulence of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol Microbiol. 48 (2), 453-464 (2003).</li>
<li>Zulauf, K. E., Sullivan, J. T., Braunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SecA2+pathway+of+Mycobacterium+tuberculosis+exports+effectors+that+work+in+concert+to+arrest+phagosome+and+autophagosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The SecA2 pathway of Mycobacterium tuberculosis exports effectors that work in concert to arrest phagosome and autophagosome maturation.</a> PLoS Pathog. 14 (4), e1007011(2018).</li>
<li>Guinn, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+RD1-region+genes+are+required+for+export+of+ESAT-6%2FCFP-10+and+for+virulence+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Individual RD1-region genes are required for export of ESAT-6/CFP-10 and for virulence of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol Microbiol. 51 (2), 359-370 (2004).</li>
<li>Lewis, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+RD1+from+Mycobacterium+tuberculosis+mimics+bacille+Calmette-Guerin+attenuation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Deletion of RD1 from Mycobacterium tuberculosis mimics bacille Calmette-Guerin attenuation.</a> J Infect Dis. 187 (1), 117-123 (2003).</li>
<li>Kana, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+resuscitation-promoting+factors+of+Mycobacterium+tuberculosis+are+required+for+virulence+and+resuscitation+from+dormancy+but+are+collectively+dispensable+for+growth+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The resuscitation-promoting factors of Mycobacterium tuberculosis are required for virulence and resuscitation from dormancy but are collectively dispensable for growth in vitro.</a> Mol Microbiol. 67 (3), 672-684 (2008).</li>
<li>Russell-Goldman, E., Xu, J., Wang, X., Chan, J., Tufariello, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mycobacterium+tuberculosis+Rpf+double-knockout+strain+exhibits+profound+defects+in+reactivation+from+chronic+tuberculosis+and+innate+immunity+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">A Mycobacterium tuberculosis Rpf double-knockout strain exhibits profound defects in reactivation from chronic tuberculosis and innate immunity phenotypes.</a> Infect Immun. 76 (9), 4269-4281 (2008).</li>
<li>Biketov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+resuscitation+promoting+factors+in+pathogenesis+and+reactivation+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+intra-peritoneal+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of resuscitation promoting factors in pathogenesis and reactivation of Mycobacterium tuberculosis during intra-peritoneal infection in mice.</a> BMC Infect Dis. 7, 146(2007).</li>
<li>Verma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomic+and+phosphoproteomic+analysis+of+H37Ra+and+H37Rv+strains+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomic and phosphoproteomic analysis of H37Ra and H37Rv strains of Mycobacterium tuberculosis.</a> J Proteome Res. 16 (4), 1632-1645 (2017).</li>
<li>Malakar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+CFP10+modulates+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of CFP10 modulates Mycobacterium tuberculosis.</a> mBio. 14 (5), e0123223(2023).</li>
<li>Lochab, S., Singh, Y., Sengupta, S., Nandicoori, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+exploits+host+ATM+kinase+for+survival+advantage+through+SecA2+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis exploits host ATM kinase for survival advantage through SecA2 secretome.</a> Elife. 9, e51466(2020).</li>
<li>Kurtz, S., McKinnon, K. P., Runge, M. S., Ting, J. P., Braunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SecA2+secretion+factor+of+Mycobacterium+tuberculosis+promotes+growth+in+macrophages+and+inhibits+the+host+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The SecA2 secretion factor of Mycobacterium tuberculosis promotes growth in macrophages and inhibits the host immune response.</a> Infect Immun. 74 (12), 6855-6864 (2006).</li>
<li>Sullivan, J. T., Young, E. F., McCann, J. R., Braunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mycobacterium+tuberculosis+SecA2+system+subverts+phagosome+maturation+to+promote+growth+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The Mycobacterium tuberculosis SecA2 system subverts phagosome maturation to promote growth in macrophages.</a> Infect Immun. 80 (3), 996-1006 (2012).</li>
<li>Putim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretome+profile+analysis+of+multidrug-resistant%2C+monodrug-resistant+and+drug-susceptible+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Secretome profile analysis of multidrug-resistant, monodrug-resistant and drug-susceptible Mycobacterium tuberculosis.</a> Arch Microbiol. 200 (2), 299-309 (2018).</li>
<li>Naz, S., Dabral, S., Kumar, D., Nandicoori, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+ex+vivo+competition+and+sequencing+of+Mycobacterium+isolated+from+infected+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for ex vivo competition and sequencing of Mycobacterium isolated from infected guinea pigs.</a> STAR Protoc. 3 (4), 101804(2022).</li>
<li>Xu, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+identification+of+serum+potential+biomarkers+for+pulmonary+tuberculosis+using+iTRAQ-coupled+two-dimensional+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Discovery and identification of serum potential biomarkers for pulmonary tuberculosis using iTRAQ-coupled two-dimensional LC-MS/MS.</a> Proteomics. 14 (2-3), 322-331 (2014).</li>
<li>Prasad, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+purified+protein+derivative+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of purified protein derivative of Mycobacterium tuberculosis.</a> Clin Proteomics. 10 (1), 8(2013).</li>
<li>Miller, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+SatS+is+a+chaperone+for+the+SecA2+protein+export+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis SatS is a chaperone for the SecA2 protein export pathway.</a> Elife. 8, e40063(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jednym z kluczowych obszarów badawczych jest zrozumienie patogenezy Mtb oraz opracowanie skutecznej diagnostyki i szczepionek22,23. Izolacja białek filtratu hodowlanego z pożywek hodowlanych Mtb jest procesem, który umożliwia identyfikację czynników wirulencji wydzielanych przez patogen. Badanie roli białek wydzielniczych w modulowaniu patogenezy Mtb dostarcza informacji mechanistycznych, a także może dostarczyć kandydatów do interwencj...

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), jeden z najbardziej śmiercionośnych patogenów na świecie, zaraża zdrowe osoby poprzez aerozole przenoszone przez zakażoną osobę podczas kichania lub kaszlu1. Po dostaniu się do płuc jest pochłaniany przez makrofagi pęcherzykowe i przejmuje kontrolę nad układem odpornościowym gospodarza, aby przetrwać. Wśród różnych mechanizmów modulujących gospodarza, które Mtb ma dla przeżycia, jednym z nich są wydzielnicze czynniki wirulencji. Białka wydzielane do pożywki hodowlanej przez pałeczki podczas ich wzrostu są określane jako białka filtratu kulturowego (CF)2. Te białka filtratu kulturowego pomagają bakteriom przetrwać w trudnych warunkach wewnątrz komórek gospodarza. Mtb jest wyposażony w trzy różne rodzaje systemów wydzielania: wyspecjalizowany system sekrecji typu VII (T7SS), ogólny system wydzielania Sec (system Sec) i system wydzielania podwójnej argininy (system Tat). T7SS jest najbardziej ekskluzywnym systemem wydzielania u promieniowców, w przeciwieństwie do typu I-VI u bakterii Gram-ujemnych3. Wydzielanie niesfałdowanego białka przez błonę jest głównie zaangażowane w system Sec, a białka są rozpoznawane przez N-końcową sekwencję sygnałową4,5. Pofałdowane lub częściowo pofałdowane białka są transportowane przez system Tat, identyfikowany przez N-końcową sekwencję sygnałową z motywem podwójnej argininy6,7. To, w jaki sposób system Sec i Tat reguluje wydzielanie białek, nie zostało jeszcze ustalone.
Niektóre znane białka filtratu kulturowego w Mtb, które pomagają przetrwać atak oksydacyjny gospodarza po infekcji, to enzymy takie jak KatG i SodA8,9, niezbędne do degradacji reaktywnych form tlenu. Ponadto CFP10-ESAT6, heterodimeryczny kompleks białkowy, odgrywa istotną rolę w regulacji odpowiedzi cytokin, ucieczki bakterii, produkcji ROS itp.10. Locus RD1 bierze udział w modulowaniu układu wydzielania typu VII, który obejmuje wydzielanie CFP10-ESAT6, a genetyczna delecja CPF10-esat6 zagraża przeżywalności bakterii w modelach infekcji ex vivo i in vivo. Mycobacterium bovis (Mycobacterium bovis) Szczep szczepionki BCG nie posiada locus RD1 odpowiedzialnego za wydzielanie czynników wirulencji i dlatego może być stosowany jako żywa atenuowana szczepionka11. Różne niezbadane procesy komórkowe ściśle regulują proces wydzielania. Białka filtratu hodowlanego zawierają czynniki wspomagające resuscytację (RpF), które pomagają bakteriom odrosnąć ze stanu utajonego. Czynniki wspomagające resuscytację (Rpfs) to enzymy hydrolizujące peptydoglikany, o których wiadomo, że odgrywają rolę w stanie spoczynku. Mtb koduje pięć genów podobnych do rpf (rpf A-E), które pomagają bakteriom odrastać ze stanu spoczynku samodzielnie lub poprzez interakcję z innymi białkami12. Rpfs znajdują się w filtracie kultur bakteryjnych i wiadomo, że biorą udział w zjadliwości Mtb i odporności gospodarza13,14. Szeroko badane geny rpf rpfE i rpfB wykazują odporność ochronną in vitro13 i wzmacniają odpowiedź immunologiczną in vivo. W związku z tym rpfE i rpfB mogą być stosowane jako kandydaci na szczepionki Mtb.
Odwracalna fosforylacja15 to modyfikacja potranslacyjna, która zmienia różne procesy komórkowe, homeostazę komórki, podział komórki, itp. Na przykład fosforylacja CFP10 odgrywa ważną rolę regulacyjną, gdzie zarówno fosfoablacyjne, jak i mimetyczne mutanty CFP10 nie przywracają obserwowanego fenotypu w szczepie delecyjnym CFP10-ESAT616. Z drugiej strony SecA2 jest białkiem wydzielniczym biorącym udział w uszkadzaniu DNA komórki gospodarza17. Sekretom mutanta SecA2 jest wystarczający do zmiany odpowiedzi immunologicznej gospodarza i kaskady sygnalizacyjnej18,19. W związku z tym niezbędne i ekscytujące jest zbadanie sekretomu H37Rv i mutantów Mtb, w których geny białek wydzielniczych są usuwane (dane niepublikowane), aby uzyskać wgląd w to, jak wpływają one na immunomodulację i przeżycie gospodarza.
Ten raport skupia się na trzech aspektach: etapach związanych z przygotowaniem filtratu z kultur Mtb, przetwarzaniu próbek do spektrometrii mas oraz przeprowadzaniu eksperymentów ex vivo z filtratami hodowlanymi w celu zbadania funkcji immunomodulacyjnych. Wcześniejsze badania wykazały identyfikację białek filtratu kulturowego za pomocą elektroforezy żelowej 2D, a następnie analizy spektrometrii mas8. Za pomocą spektrometrii mas zidentyfikowano białka filtratu z wrażliwych na leki i opornych szczepów, aby uzyskać wgląd w zmiany sekretomu i zidentyfikować czynniki wirulencji, które mogą odgrywać rolę w oporności na leki20. Wcześniej badaliśmy sekretom i fosfosekretom Mtb za pomocą spektrometrii mas16. Techniki takie jak elektroforeza żelowa 2D są niskoprzepustowe i nie są wykorzystywane do badania globalnych zmian w proteomie lub sekretomie. Białka filtratu kulturowego różnią się od szczepów bakteryjnych, etapów wzrostu komórek, a nawet w różnych warunkach stresowych. W zależności od różnych sytuacji, zmiana w pulach białek wydzielniczych wewnątrz komórek umożliwiłaby całościowe zbadanie całego sekretomu i dostarczyłaby więcej informacji na temat bakteryjnego systemu wydzielania dla interwencji terapeutycznych. Jeszcze bardziej atrakcyjne byłoby przyjrzenie się sekretomowi w szczepach nokautów lub depleencji systemów wydzielniczych, aby uzyskać dalszy wgląd w szlaki i cele każdej ścieżki wydzielniczej. Traktowanie komórek białkami filtratu hodowlanego zamiast bakterii zmienia poziom cytokin i innych czynników immunomodulujących17. Za pomocą badania sekretomu można zidentyfikować nowe czynniki wirulencji i ich rolę w zjadliwości.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mikro; m Filtry strzykawkowe</td><td>mdi</td><td>SYPL0601MNXX204</td><td></td></tr><tr><td>0,2 i mikro; m Membrana nitrocelulozowa</td><td>Amersham</td><td>10600001</td><td></td></tr><tr><td>37% HCl</td><td>Merck</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>EMPLURA MERCK</td><td>SL9F690866</td><td></td></tr><tr><td>Acetonytryl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34851-2L</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid</td><td>BIORAD</td><td>1610107</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td><td>Bio Basic Kanada</td><td>Nr kat.:AD0023</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15</td><td>Merck, Millipore</td><td>UFC900396</td><td></td></tr><tr><td>Biowęglan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09830-500G</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-100G</td><td></td></tr><tr><td>anty-Ag85B</td><td>Abcam</td><td>AB43019</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysie przeciwciało wtórne skoniugowane HRP</td><td>Thermo Fischer</td><td>62-6520</td><td></td></tr><tr><td>Asparagina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0884-500G</td><td></td></tr><tr><td>bis-akryloamid</td><td>SIGMA</td><td>146072-500G</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Merck</td><td>MB083-500G</td><td></td></tr><tr><td>C-18</td><td>kolumna Thermo Fischer</td><td>SEM SS18V</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1345</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0759-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Difco Średni potok 7H9 bulion&nbsp; &nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian żelazowo-amonowy(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5879-100G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy 98-100%</td> <td>Merck</td><td>Z0823704246</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy 100%</td> <td>Merck</td><td>CD0C700160</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>SIGMA</td><td>G8898-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Gycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Immobilion Western Chemiluminescencyjny substrat HRP</td><td>Merck</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Amersham</td><td>RPN6302V</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Mycobroswer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas oleinowy</td><td>Sigma</td><td>Nr kat.:O1008</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA</td><td>Thermo Fischer</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Trypsin Protase</td><td>Thermo Fischer</td><td>90058</td><td></td></tr><tr><td>Proteome Discoverer 2.0</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Exactive HF (Thermo Scientific) (eksperymenty proteomiczne - sekwencjonowanie peptydów, identyfikacja i kwantyfikacja białek)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>Nr kat.:S3014</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7773-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771-1KG</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-25</td><td></td></tr><tr><td>Temed</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>BioRad</td><td>161-0719</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AMRESCO</td><td>0234-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr>Baza <td></td><td></td><td></td><td>danych białek UniProt</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>MP Bio</td><td>194857</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie filtratu z hodowli mycobacterium tuberculosis w celu zrozumienia patogenezy gruźlicy

Preparation of Mycobacterium tuberculosis Culture Filtrate to Understand TB Pathogenesis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) wydziela wiele białek do gospodarza, aby modulować różne procesy komórkowe, takie jak sygnalizacja gospodarza, odpowiedź immunologiczna, apoptoza, itp., aby zwiększyć przeżywalność. Chociaż funkcja kilku czynników wydzielniczych została wyjaśniona, wiele z nich nie zostało jeszcze scharakteryzowanych. W związku z tym badanie białka wydzielniczego Mtb jest istotnym obszarem badań. Mtb wydziela białka do przestrzeni pozacytoplazmatycznej za pomocą trzech różnych systemów wydzielania: ogólnego, podwójnego argininy i wyspecjalizowanego systemu wydzielania typu VII. Konieczne jest przygotowanie sekretomu, aby zidentyfikować nowe cząsteczki wydzielnicze i funkcjonalnie scharakteryzować znane czynniki. W tym miejscu przedstawiamy metodę przygotowania sekretomu i próbki do spektrometrii mas. Preparat sekretomu wymaga najwyższej staranności, aby uniknąć zanieczyszczenia białek cytozolowych, które można monitorować poprzez sondowanie przeciwciałami przeciwko dobrze scharakteryzowanym białkom błonowym, wydzielniczym i cytozolowym. Tak przygotowany filtrat hodowlany może być wykorzystany do różnych celów, w tym do badania właściwości immunomodulacji gospodarza.

W niniejszym protokole zaprezentowano izolację białek z filtratu hodowli Mycobacteria (Rysunek 1A). Następnie białka z filtratu hodowli sprawdzono pod kątem różnych markerów, aby potwierdzić izolację filtratu. Zgodnie z opisem w protokole, przeprowadzono barwienie Coomassie w celu sprawdzenia ilości naniesionego białka. W frakcji WCL (ostatnia ścieżka, Rysunek 1B) można zaobserwować rozmazany prążek białkowy, podczas gdy w ścieżkach CF (filtrat hodowli)...

Tutaj demonstrujemy przygotowanie filtratu kulturowego Mtb (CF), który jest pożywką do wzrostu bakterii, która składa się z białek wydzielanych przez bakterie. Mtb wydziela białka modulujące sygnalizację gospodarza i odpowiedź immunologiczną, które mają kluczowe znaczenie dla patogenezy. Przygotowane CF są analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu zidentyfikowania wszystkich czynników wydzielniczych.

Przygotowanie filtratu z hodowli Mycobacterium tuberculosis w celu zrozumienia patogenezy gruźlicy

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) secretes many proteins into the host to modulate various cellular processes, such as host signaling, immune response, ...

Wydzielina filtratu z hodowli Mtb dałaby wgląd w czynniki wirulencji lub inne białka wydzielane przez patogen w celu interwencji terapeutycznych. Tutaj próbujemy dowiedzieć się, jakie białka wydzielane przez bakterie dałyby wyobrażenie o systemie wydzielania Mtb, jego nieznanych czynnikach wirulencji i ich wpływie na modulację gospodarza w celu przetrwania patogenu wewnątrz gospodarza. W dziedzinie badań nad Mtb leki takie jak bedakilina, delamanid mogą być stosowane w leczeniu MDR i szczepów zewnętrznych.Nadal trwają badania nad opracowaniem leków na MDR i XDR, a także szczepionek przeciwko Mtb. Mtb w coraz większym stopniu uzyskuje oporność z powodu niezgodności schematów lekowych. Leczenie szczepów MDR, XDR jest najtrudniejszym zadaniem w dziedzinie badań nad Mtb.Nasza grupa dokonała wielu istotnych ustaleń w tej dziedzinie. Nasze laboratorium wykazało wpływ fosforylacji CFP-10 na zjadliwość Mtb i ustaliło fosfo-proteom, fosfo-wydzielanie i sieć wydzielniczą Mtb. Ponadto artykuł z laboratorium wykazał, że wydzielacz SecA2 pośredniczy w uszkodzeniu DNA w gospodarzu.Traktowanie komórek białkami przefiltrowanymi przez hodowlę zamiast bakterii zmienia poziom cytokin i innych czynnik

preparation-mycobacterium-tuberculosis-culture-filtrate-to-understand

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Badanie wrażliwości Mycobacterium tuberculosis na środki przeciwdrobnoustrojowe jest trudne, lecz kluczowe dla opieki nad pacjentem. Ten format z użyciem płytek mikrotytrujących umożliwia przetestowanie 12 leków przeciwprątkowych i pozwala wyznaczyć wartości minimalnego stężenia hamującego (MIC), co pomoże w doborze odpowiedniego leczenia.

Badanie wrażliwości kompleksu Mycobacterium tuberculosis na leki pierwszego i drugiego rzutu metodą rozcieńczeń w bulionie z wykorzystaniem płytek mikrotitracyjnych

Profil metabolomiczny Mycobacterium tuberculosis jest określany po hodowli w pożywkach płynnych. Warunki mogą być modyfikowane w celu zbadania wpływu suplementów odżywczych, utleniaczy oraz leków przeciwgruźliczych na profil metaboliczny tego mikroorganizmu. Procedura przygotowania ekstraktu jest odpowiednia zarówno dla analiz NMR 1D 1H, jak i 2D 1H-13C.

Przygotowanie próbek ekstraktów z Mycobacterium tuberculosis do metabolomicznych badań metodą rezonansu magnetycznego jądra

Mycobacterium tuberculosis tworzy lekooporne biofilmy podczas hodowli w określonych warunkach. W niniejszej pracy opisujemy metody hodowli biofilmów M. tuberculosis oraz określania częstotliwości występowania lekoopornych form przetrwalnikowych (persisterów). Protokoły te będą przydatne w dalszych badaniach nad mechanizmami tolerancji leków u M. tuberculosis.

Wzrost biofilmu Mycobacterium tuberculosis

Ten film demonstruje izolację i koncentrację białek filtratu kultur bakteryjnych, w tym pęcherzyków zewnątrzkomórkowych bakterii, przy użyciu ultrafiltracji. Skoncentrowane pęcherzyki zewnątrzkomórkowe służą jako markery diagnostyczne do wykrywania choroby.

Zagęszczenie białka filtratu kultur bakteryjnych za pomocą urządzenia do ultrafiltracji

Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

Zakażenie gruźlicą u ludzi jest złożonym procesem, który jest trudny do modelowania in vitro. W tym miejscu opisujemy nowatorski model 3D ludzkiej tkanki płucnej, który podsumowuje dynamikę zachodzącą podczas infekcji, w tym migrację komórek odpornościowych i wczesne tworzenie ziarniniaka w środowisku fizjologicznym.

Model 3D ludzkiej tkanki płucnej do badań funkcjonalnych nad zakażeniem Mycobacterium tuberculosis

Opracowaliśmy modułowy, wysokoprzepustowy system przesiewowy do odkrywania nowych związków przeciwko Mycobacterium tuberculosis, ukierunkowanych na bakterie rosnące wewnątrzkomórkowo i w bulionie, a także cytotoksyczność wobec komórki gospodarza ssaków.

System badań przesiewowych skuteczności i cytotoksyczności inhibitorów ukierunkowanych na wewnątrzkomórkowe prątki gruźlicy

Nowe modele i testy, które poprawiłyby wczesny proces opracowywania leków przeciwgruźliczych nowej generacji, są wysoce pożądane. Tutaj opisujemy szybki, niedrogi i zgodny z BSL-2 test do oceny skuteczności leku przeciwko Mycobacterium tuberculosis, który można łatwo dostosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Wysokoprzepustowy, kompatybilny test do oceny skuteczności leku przeciwko prątkom gruźlicy pasażowanym przez makrofagi

Opisujemy test molekularnego obciążenia bakteryjnego gruźlicy przeprowadzony po inaktywacji termicznej plwociny. Inaktywacja termiczna sprawia, że próbki plwociny stają się niezakaźne i eliminuje potrzebę stosowania laboratoriów o poziomie 3 hermetyczności do testów molekularnych na gruźlicę.

Test molekularnego obciążenia bakteryjnego gruźlicy (TB-MBLA)

Szybkie i skuteczne oznaczanie wzrostu wewnątrzkomórkowego M. tuberculosis jest kluczowe dla poszukiwania lepszych terapii przeciwko gruźlicy (TB). Protokół ten opisuje test detekcji kolorymetrycznej na bazie bulionu przy użyciu zautomatyzowanego systemu hodowli płynów do ilościowego określenia wzrostu Mtb w makrofagach traktowanych potencjalnymi terapiami kierowanymi przez gospodarza.

Zautomatyzowany system hodowli do stosowania w badaniach przedklinicznych terapii gruźlicy ukierunkowanych na gospodarza

Protokół ten opisuje hodowlę, zbiór i koncentrację wydzielanych białek Mycobacterium tuberculosis. Białka filtratu kulturowego (CFP) są oznaczane ilościowo, rozdzielane na 20 frakcji przez ogniskowanie izoelektryczne, a następnie rozdzielane na 30 frakcji za pomocą preparatywnego SDS-PAGE i systemu elektroelucji.

Rozdzielanie i frakcjonowanie białek filtratu kulturowego (CFP) z Mycobacterium tuberculosis

Poznaj metodę przygotowania filtratu z hodowli Mycobacterium tuberculosis w celu identyfikacji białek sekretorycznych i czynników wirulencji. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów modulacji odpowiedzi immunologicznej gospodarza.

Przygotowanie filtratu z hodowli Mycobacterium tuberculosis w celu zrozumienia patogenezy gruźlicy

Przeglądaj więcej filmów