Name: Niewirusowe podejście do generowania przejściowych limfocytów T receptora chimerycznego antygenu przy użyciu mRNA do immunoterapii nowotworów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Poznaj niewirusową metodę generowania przejściowych limfocytów T CAR przy użyciu mRNA do immunoterapii nowotworów. To podejście eliminuje ryzyko integracji DNA i obniża koszty produkcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez ProMab Biotechnologies.

Użyte tutaj PBMC zostały wcześniej wyizolowane z pełnej krwi z Centrum Krwi Szpitala Stanford, zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Institutional Review Board (IRB) (13942) przy użyciu gradientu gęstości Ficoll-Paque opisanego wcześniej42. Świadoma zgoda uczestników nie miała zastosowania, ponieważ krew, której użyliśmy do pobrania PBMC, została uzyskana komercyjnie z Centrum Krwi Szpitala Stanforda.
1. Przygotowanie mRNA CAR
<ol>
	<li>Przygotowanie szablonu 
	UWAGA: Zarówno zlinearyzowany plazmid, jak i fragment PCR mogą służyć jako matryca do syntezy mRNA CAR in vitro, pod warunkiem, że zawierają odpowiedni promotor 5' SP6 lub T7, region 5' bez translacji (UTR), transgen CAR i 3'UTR z odpowiednim ogonem poli(A). W tym badaniu użyliśmy konstruktu plazmidowego DNA CAR zawierającego promotor SP6, krótki ludzki beta-globinę 5'UTR, transgen CAR i 3'UTR złożony z dwóch tandemowych beta-globiny 3'UTR, po których następuje 112-bp poly(A) tail43. UTR, sekwencja kodująca i ogon poli(A) wpływają na stabilność RNA i wydajność translacji43,44,45. Wykazano, że ogon poli(A) o długości 120 pz zwiększa wydajność białka w hodowli komórkowej w porównaniu z krótszymi ogonami poli(A)43.
	<ol>
		<li>Przygotuj CAR skonstruuj plazmidowe DNA za pomocą zestawu do przygotowania plazmidu zgodnie z instrukcjami producenta. Wysokiej jakości plazmidowe DNA jest niezbędne do wygenerowania wysokiej wydajności mRNA CAR.</li>
		<li>Linearyzuj DNA plazmidu CAR za pomocą enzymu restrykcyjnego BglII. Wybierz enzym restrykcyjny, który tnie za ogonem poli(A), preferencyjnie blisko końca ogona poli(A). Trawić 10 μg (lub 10 000 ng) plazmidu oznaczonego ilościowo za pomocą spektrofotometru w 100 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 10 U enzymu, 10 μl buforu wytrawiającego i wody wolnej od nukleaz przez noc w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Upewnij się, że enzym restrykcyjny nie przecina transgenu CAR i jego bocznego promotora, UTR i sekwencji ogonowych poli(A). Pełna linearyzacja plazmidu CAR jest niezbędna do efektywnej transkrypcji mRNA CAR.</li>
		<li>Dodać 200 μg/ml proteazy K i 0,5% w/v SDS do mieszanki wytrawiającej i inkubować w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Oczyść zlinearyzowane DNA plazmidu CAR. Dodać równą objętość fenolu: chloroform: alkohol izoamylowy (25:24:1, v/v) do reakcji trawienia. Wirować energicznie przez około 15 s. Wirować próbkę w wirówce stołowej z maksymalną prędkością przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Przenieś górną warstwę wodną, która zawiera DNA, do nowej probówki do mikrowirówki. Unikaj przenoszenia którejkolwiek ze środkowych i dolnych warstw, które zawierają zanieczyszczenia białkowe i fenolowe. Wykonaj drugą rundę ekstrakcji chloroformem w celu zmniejszenia zanieczyszczeń.</li>
		<li>Dodać 1/10 objętości 7,5 M octanu amonu lub 3 M octanu sodu i delikatnie wymieszać. Dodaj 2,5 objętości etanolu, aby wytrącić DNA. Przechowywać próbkę w temperaturze -20 °C przez co najmniej 30 minut.</li>
		<li>Wirować próbkę z maksymalną prędkością przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia DNA. Ostrożnie usunąć supernatant. Dodaj 500 μl 70% etanolu, aby przepłukać osad DNA.</li>
		<li>Ponownie wirować próbkę przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant. Pozostaw niewielką ilość roztworu w probówce.</li>
		<li>Powtarzaj wirowanie przez 2 minuty w temperaturze 4°C. Ostrożnie usuń pozostały supernatant. Suszyć osad DNA na powietrzu w temperaturze pokojowej przez około 10 minut w sterylnym kapturze, aż na dnie probówki nie będzie widać roztworu etanolu. 
		UWAGA: Unikaj przesuszenia osadu DNA, ponieważ może być trudny do rozpuszczenia.</li>
		<li>Dodaj 20 μl wody wolnej od nukleaz i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby rozpuścić DNA. Odwirować próbkę na krótko z maksymalną prędkością. Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru.</li>
		<li>Przechowywać próbkę na lodzie do natychmiastowego użycia lub w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości. Załaduj 100 ng oczyszczonego DNA na żel agarozowy i sprawdź rozmiar i integralność. DNA powinno wyglądać jak pojedyncze, wyraźne prążki o oczekiwanej wielkości. Nie należy obserwować żadnych dodatkowych lub rozmazanych pasków. 
		UWAGA: Jakość matrycowego DNA ma kluczowe znaczenie dla efektywnej transkrypcji mRNA. Unikaj używania nieczystego, fragmentarycznego i zdegradowanego DNA jako matrycy do transkrypcji mRNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transkrypcja in vitro (IVT)
	<ol>
		<li>Zsyntetyzuj mRNA CAR in vitro. Upewnij się, że podczas zabiegów używasz odczynników, probówek i końcówek do pipet wolnych od nukleaz.</li>
		<li>Rozmrozić odczynniki wymienione w Tabeli 1 do RT, z wyjątkiem mieszaniny polimerazy SP6 RNA, która powinna być przechowywana w temperaturze -20 °C do czasu użycia. Przygotować reakcję transkrypcji w kolejności przedstawionej w tabeli 1 w RT. Delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 godziny 
		UWAGA: Reakcję można skalować w górę lub w dół w zależności od potrzebnej ilości mRNA. Reakcja pokazana powyżej zazwyczaj daje co najmniej 100 μg (lub 100 000 ng) zamkniętego mRNA przy użyciu wysokiej jakości matrycy DNA. Dłuższa inkubacja, czyli przez noc, może zwiększyć wydajność mRNA.</li>
		<li>Dodać 2 μl DNazy I wolnej od RNaz do reakcji, delikatnie wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C w celu degradacji matrycowego DNA.</li>
		<li>Oczyść transkrybowane mRNA CAR za pomocą zestawu do czyszczenia RNA (patrz tabela materiałów). Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta zestawu dotyczącymi oczyszczania. Eluuj mRNA w wodzie wolnej od nukleaz. 
		UWAGA: mRNA można również oczyścić za pomocą metody ekstrakcji fenolowo-chloroformowej pokazanej powyżej (krok 1.1.4).</li>
		<li>Zmierz stężenie mRNA za pomocą spektrofotometru. Załaduj co najmniej 200 ng mRNA na żel agarozowy i sprawdź jego wielkość i integralność. mRNA powinno pojawić się jako pasmo dominujące o oczekiwanej wielkości, bez żadnych dodatkowych lub rozmazanych prążków. Przechowuj mRNA w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Aktywacja i elektroporacja limfocytów T
<ol>
	<li>Zawiesić 1 x 106 kriokonserwowanych ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) w 1 ml pożywki CAR-T (pożywka AIM-V uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), penicyliną/streptomycyną i 10 ng/ml ludzkiej rekombinowanej IL-2). Aktywuj limfocyty T równą liczbą wstępnie umytych ludzkich kulek T-aktywatora CD3 / CD28 (patrz tabela materiałów). Hodować i namnażać komórki w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze z 5% stężeniem CO2 przez kilka dni. 
	UWAGA: Ilość PBMC można skalować w górę lub w dół w zależności od ilości limfocytów T wymaganych do kolejnych eksperymentów.</li>
	<li>Rozmrozić przygotowane mRNA CAR na lodzie. Dodać 1 ml pożywki CAR-T na studzienkę do dwóch dołków na płytce 12-dołkowej i wyrównać pożywkę, umieszczając płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przenieś 5 x 10 6 limfocytów T do sterylnej probówki i usuń kulki, kładąc probówkę na stojaku magnetycznym i ostrożnie pipetując zawiesinę komórek do nowej probówki.</li>
	<li>Odwirować probówkę o stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml sterylnego PBS.</li>
	<li>Ponownie odwirować probówkę. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu neonowego T (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Odpipetuj 100 μl komórek do nowej probówki i dodaj 5 μg (lub 5 000 ng) mRNA CAR do komórek46. Uzupełnij bufor neonowy T do całkowitej ilości 125 μl i mieszaj, pipetując w górę i w dół. 
	UWAGA: Ilość mRNA CAR do transfekcji przez elektroporację może być zwiększona do 8 μg (lub 8,000 ng) na 1 x 106 limfocytów T bez negatywnego wpływu na żywotność komórek, a wyższa ilość mRNA może prowadzić do zwiększonej ekspresji CAR46.</li>
	<li>Dodaj 25 μl buforu neonowego T do pozostałych 100 μl komórek. Służy to jako kontrola negatywna.</li>
	<li>Elektroporować limfocyty T. Użyj pipety Neon, aby zassać mieszaninę limfocytów T/mRNA CAR lub limfocytów T kontroli ujemnej do końcówki Neon 100 μL i elektroporować ogniwa impulsem 10 ms 1800 V.</li>
	<li>Natychmiast po elektroporacji przenieść komórki do zrównoważonej pożywki hodowlanej na 12-dołkowej płytce (przygotowanej w kroku 2.2).</li>
	<li>Włożyć płytkę z powrotem do inkubatora i rozprężyć komórki, aż będą gotowe do użycia. Aby zapewnić zdrowy i szybki wzrost limfocytów CAR T, utrzymuj gęstość komórek między 1-3 x 106 komórek/ml ze świeżą pożywką, aż będzie potrzebna.</li>
</ol>
3. Ocena ekspresji CAR
<ol>
	<li>Wymieszać limfocyty T CAR, delikatnie pipetując w górę i w dół kilka razy w każdym dołku, a następnie przenieść co najmniej 1 x 105 komórek do probówki FACS o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Dodać 3 ml buforu do płukania na zimno (PBS zawierający 2 mM EDTA i 0,5% w/v BSA) do probówki. Odwirować probówkę o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 100 μl buforu do przemywania wody. Dodać 2 μl odczynnika do wykrywania CAR allofikocyjaniny (APC) sprzężonego z kozią przeciwciałem przeciwko ludzkiej IgG F(ab')2 (patrz tabela materiałów) i 2 μl barwnika żywotności 7-AAD do zawieszonych komórek. 
	UWAGA: CAR może być również wykryty za pomocą odpowiednio oznakowanego antygenu docelowego lub przeciwciała anty-tag, jeśli CAR zawiera znacznik (tj. FLAG). Jeżeli do wykrywania CAR stosuje się nieznakowane przeciwciało, po kroku 3.4 wymagana jest inkubacja z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym znakowanym fluorescencyjnie.</li>
	<li>Wymieszać próbkę, delikatnie potrząsając probówką i inkubować na lodzie przez 30 minut. Podczas inkubacji należy unikać światła. Przemyć komórki 3 ml buforu do przemywania na zimno i odwirować probówkę o stężeniu 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu do przemywania wody. Natychmiast przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego. Upewnij się, że etykieta fluorescencyjna odczynnika do wykrywania i barwnik żywotności są odpowiednio skompensowane przy użyciu odpowiednich kontroli dodatnich i ujemnych.</li>
	<li>Oceń wyrażenie CAR przy użyciu następującej strategii bramkowania: Bramka na komórkach przy użyciu wykresu FSC-A vs SSC-A; Bramka na pojedynczych komórkach przy użyciu wykresu FSC-A vs FSC-H; Bramka na żywych komórkach za pomocą barwienia 7-AAD.</li>
	<li>Oblicz procent żywych limfocytów T, które zostały wybarwione przeciwciałem anty-ludzkim IgG F(ab')2. Porównaj komórki CAR-T z limfocytami T kontroli negatywnej, które powinny mieć minimalne zabarwienie.</li>
</ol>
4. Analiza funkcji komórek CAR-T
<ol>
	<li>Analiza cytotoksyczności
	<ol>
		<li>Upewnij się, że docelowe komórki nowotworowe wyrażają antygen w konformacji, która może być rozpoznana przez CAR. Aby potwierdzić ekspresję antygenu, przeanalizuj komórki nowotworowe za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu przeciwciała macierzystego, z którego poprowadzono CAR. Jeśli CAR nie może rozpoznać komórek nowotworowych, komórki CAR-T nie zdołają zabić komórek nowotworowych.</li>
		<li>Przygotuj docelowe komórki nowotworowe wykazujące ekspresję antygenu CAR na powierzchni komórki. Trypsynizować przylegające komórki nowotworowe 0,05% roztworem trypsyny-EDTA przez 1 minutę w temperaturze 37 °C i przygotować zawiesinę pojedynczych komórek z odpowiednią pożywką hodowlaną w temperaturze 1−4 x 105 komórek/ml. 
		UWAGA: Komórki nowotworowe powinny być dobrze przylegające, aby zapewnić dokładną analizę w kolejnych krokach. Jeśli komórki nowotworowe słabo przylegają, łatwo się odklejają lub rosną w zawiesinie, pokryj dołki płytki użytej w następnym kroku odpowiednim przeciwciałem, polimerem polikationowym lub materiałem biologicznym, takim jak fibronektyna lub kolagen, aby ułatwić przyczepianie komórek.</li>
		<li>Przygotuj E-Plate (patrz Tabela materiałów). Zaprojektuj konfigurację eksperymentalną. Dodaj 50 μl wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórek nowotworowych do każdej studzienki i umieść E-Plate w przyrządzie do analizy komórek w czasie rzeczywistym (RTCA) w celu zmierzenia impedancji tła. Zmierz impedancję co 1 minutę na pomiar (lub przemiatanie) dla 3 przemiatań. 
		UWAGA: Impedancja tła służy do ustawiania indeksu komórki na zero. Bez pomiaru impedancji tła odwierty nie mogą być ze sobą porównywane, co sprawia, że wyniki są niemożliwe do interpretacji.</li>
		<li>Usuń E-Plate z instrumentu RTCA i dodaj 100 μl zawiesiny komórek nowotworowych do każdej studzienki. Dlatego każda studzienka zawiera 1−4 x 104 komórki o całkowitej objętości 150 μl. 
		UWAGA: Liczba komórek nowotworowych, które mają zostać wysiane w każdym dołku, powinna zostać określona przed eksperymentem. Zasiej E-Plate zakresem numerów komórek, a następnie monitoruj indeksy komórek przez następne 24−48 godzin. Pożądana liczba komórek utrzymuje stały wzrost indeksu komórkowego przez co najmniej 24 godziny bez plateau. Nadmierne wysiewanie komórek może przyspieszyć wyczerpanie składników odżywczych i zakwaszenie podłoża, co skutkuje wczesnym ustabilizowaniem się indeksu komórkowego. Ponadto dla każdej grupy należy dołączyć odwierty replikowane w celu zidentyfikowania potencjalnych pomiarów wartości odstających.</li>
		<li>Równoważyć płytkę E w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Ten krok pozwala komórkom nowotworowym osiąść i przylgnąć do dna studzienek. 
		UWAGA: Ten krok jest niezbędny do dokładnego pomiaru indeksu komórek. Pominięcie tego kroku zwykle powoduje zmienność między studniami w pomiarach indeksu komórkowego i nierównomierną adhezję komórek nowotworowych w studzienkach, co skutkuje zwiększonym szumem w teście.</li>
		<li>Umieść E-Plate z powrotem w przyrządzie RTCA i monitoruj indeksy komórek przez około 24 godziny, z przemiataniem co 5-15 minut.</li>
		<li>Następnego dnia należy przygotować zawiesinę komórek CAR-T. Zawiesić komórki CAR-T (komórki efektorowe) od kroku 2.10 w pożywce RPMI 1640 plus 10% FBS do stężenia określonego przez komórkę nowotworową (komórkę docelową) i pożądany stosunek komórek efektorowych do docelowych (E:T). Na przykład, jeśli zawiesina komórek nowotworowych miała gęstość 2 x 105 komórek/ml i pożądany jest stosunek E:T 10:1, wówczas komórki CAR-T powinny być zawieszone na 2 x 106 komórek/ml. Uwzględnij odpowiednie kontrole, takie jak same komórki nowotworowe (bez komórek efektorowych) i kontrolne limfocyty T (limfocyty T elektroporowane bez mRNA lub z kontrolnym mRNA). 
		UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, należy używać ogniw CAR-T 1-2 dni po elektroporacji, gdy ekspresja CAR na powierzchni jest wysoka. Aby zbadać optymalny stosunek E:T, można przetestować szereg współczynników E:T (na przykład 3:1 do 20:1). O ile częstość CAR-T nie jest bardzo niska, tj. poniżej 10%, stosunek E:T wynoszący 10:1 lub 20:1 jest zwykle wystarczający do osiągnięcia prawie całkowitego zabicia komórek nowotworowych.</li>
		<li>Wstrzymaj zapis indeksu komórek i wyjmij E-Plate z instrumentu RTCA.</li>
		<li>Lekko przechylić płytkę, ostrożnie usunąć 50 μl pożywki hodowlanej z każdej studzienki, nie dotykając komórek nowotworowych, i dodać 100 μl komórek CAR-T lub kontrolnych limfocytów T do każdej studzienki.</li>
		<li>Umieść E-Plate z powrotem w instrumencie RTCA i wznów monitorowanie indeksu komórki przez co najmniej 24 godziny z przemiataniem wykonywanym co 5−15 min. 
		UWAGA: Czas monitorowania indeksu komórkowego zależy od tego, jak szybko komórki CAR-T celują w komórki nowotworowe. 24-godzinny okres inkubacji jest zwykle wystarczający, aby komórki CAR-T wywarły maksymalny efekt cytotoksyczny.</li>
		<li>Zatrzymaj monitorowanie indeksu komórek, wyjmij E-Plate z instrumentu RTCA i przeanalizuj wynik cytotoksyczności. Oblicz cytotoksyczność jako odsetek komórek nowotworowych, które zostały zabite przez komórki CAR-T. Obliczyć średnią cytotoksyczność limfocytów CAR-T i kontrolnych limfocytów T za pomocą oprogramowania RTCA. Aby ręcznie obliczyć cytotoksyczność, należy użyć wzoru 
		Cytotoksyczność = ((Indeks komórkowy komórek nowotworowych) − (Indeks komórkowy komórek nowotworowych plus komórki efektorowe)) / (Indeks komórkowy komórek nowotworowych) × 100%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza wydzielania cytokin
	<ol>
		<li>Aby przeanalizować cytokiny, takie jak IFN-Υ, wydzielane przez komórki CAR-T podczas analizy cytotoksyczności, przenieś supernatant z płytki E na okrągłodenną lub 96-dołkową płytkę w kształcie litery V. 
		UWAGA: Jeśli pożądana jest analiza wydzielania cytokin w czasie, wstrzymaj monitorowanie indeksu komórek w kroku 4.1.10, zbierz niewielką porcję supernatantu z każdej studzienki, zwróć E-Plate z powrotem do instrumentu RTCA i wznów monitorowanie.</li>
		<li>Odwirować 96-dołkową płytkę o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie przenieść supernatanty na nową 96-dołkową płytkę, nie naruszając osadów komórkowych.</li>
		<li>Zmierz poziom cytokin w supernatantach za pomocą komercyjnych zestawów do testów immunoenzymatycznych (ELISA) zgodnie z instrukcjami producenta. Supernatanty zwykle wymagają rozcieńczenia przed pomiarem, czasami ponad 100-krotnie, w zależności od analizowanych cytokin.</li>
		<li>Analizuj dane, interpolując wartości absorbancji próbki w stosunku do krzywej wzorcowej wygenerowanej z seryjnie rozcieńczanych wzorców. Przygotuj wykresy ze słupkami błędów reprezentującymi średnią ± odchylenie standardowe (SD) za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Aby porównać różnicę między zabiegami, można wykonać test t Studenta. Wartość p mniejsza niż 0,05 jest zwykle uważana za statystycznie istotną. 
		UWAGA: Punkty danych, które są wyraźnymi wartościami odstającymi, prawdopodobnie z powodu błędów eksperymentalnych, powinny zostać wyłączone z analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy Liang Hu, Robert Berahovich, Yanwei Huang, Shiming Zhang, Jinying Sun, Xianghong Liu, Hua Zhou, Shirley, Xu, Haoqi Li i Vita Golubovskaya są pracownikami ProMab Biotechnologies. Lijun Wu jest pracownikiem i udziałowcem ProMab Biotechnologies.

W tym badaniu opisujemy szczegółowe, niewirusowe, nieintegrujące podejście do generowania przejściowych komórek CAR-T i przedstawiamy procedury techniczne do oceny funkcji komórek CAR-T. Takie podejście pozwala uniknąć stosowania konwencjonalnych wektorów retrowirusowych i lentiwirusowych do stałego i losowego dostarczania transgenu CAR, zamiast tego wykorzystując elektroporację do skutecznego wprowadzania zmodyfikowanego in vitro mRNA CAR do limfocytów T. Metoda ta umożliwia wysokopoziomową, przejściową ekspres...

Rak jest coraz ważniejszym zagrożeniem dla ludzkiego zdrowia, z rocznym szacunkiem 23,6 miliona nowo zdiagnozowanych przypadków i 10 milionami zgonów na całym świecie1. Leczenie chirurgiczne w połączeniu z radioterapią i chemioterapią pozostaje złotym standardem opieki nad różnymi typami zlokalizowanych nowotworów nieinwazyjnych i inwazyjnych2,3,4. Chociaż tradycyjne systematyczne leczenie osiągnęło ogromny sukces w leczeniu nowotworów we wczesnym stadium, jest bardzo toksyczne i ma ograniczony wpływ na nowotwory przerzutowe i hematologiczne5. Pacjenci z tymi nowotworami są poddawani częstym zabiegom i znoszą znaczną toksyczność w nadziei na ustabilizowanie i opóźnienie postępu choroby. Terapia limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) pojawiła się ostatnio jako rewolucyjna terapia celowana, która wykazuje silną skuteczność w leczeniu nowotworów hematologicznych komórek B i daje nadzieję tym zdesperowanym pacjentom6.
Komórki CAR-T to zmodyfikowane limfocyty T, które wyrażają CAR na powierzchni komórki, które specyficznie rozpoznają antygeny związane z nowotworem (TAA) i aktywują komórki bez konieczności prezentacji antygenowej z głównych białek kompleksu zgodności tkankowej (MHC)7. Po aktywacji komórki CAR-T wydzielają panel cytokin i lizują komórki nowotworowe niezależnie od MHC, zwiększając w ten sposób niszczenie guzów nawet wtedy, gdy MHC są regulowane w dół lub tracone z powodu immunosupresyjnego mikrośrodowiska guza8,9. CAR składają się z co najmniej trzech odrębnych domen - zewnątrzkomórkowego wariantu fragmentu pojedynczego łańcucha (scFv) zawierającego zmienne regiony przeciwciała specyficznego dla TAA rozpoznającego antygen, domeny transbłonowej, która zakotwicza CAR na powierzchni komórki, oraz domeny wewnątrzkomórkowej, która pośredniczy w rekrutacji białka adaptorowego i dalszej sygnalizacji10. Opierając się na zmianach w domenach wewnątrzkomórkowych, struktury CAR ewoluowały do tej pory przez pięć pokoleń, przy czym pierwsza generacja zawierała tylko domenę aktywacji CD3ζ, a kolejne generacje posiadały jedną lub więcej dodatkowych domen kocymulujących z cząsteczek takich jak 4-1BB i CD2811. Te domeny wewnątrzkomórkowe wpływają na mechanizmy sygnalizacji komórek CAR-T, proliferację, przeżycie i toksyczność, które razem decydują o klinicznej skuteczności przeciwnowotworowej. Sukces kliniczny terapii komórkami CAR-T wynika z komórek CAR-T drugiej generacji, które są specyficznie ukierunkowane na CD19, biomarker o wysokiej ekspresji na komórkach linii B, do leczenia białaczek i chłoniaków z komórek B12,13. Do tej pory Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) zatwierdziła sześć terapii komórkowych CAR-T drugiej generacji ukierunkowanych na CD-19 lub antygen dojrzewania komórek B (BCMA) w nawrotowych lub opornych na leczenie nowotworach hematologicznych, w tym chłoniaku z dużych komórek B, chłoniaka z komórek płaszcza i szpiczaka mnogiego 6. Nowsze generacje komórek CAR-T są obecnie poddawane intensywnym badaniom przedklinicznym i klinicznym14,15.
Kliniczna produkcja komórek CAR-T jest skomplikowanym, kosztownym i czasochłonnym procesem. Obecnie leukocyty używane do przygotowania komórek CAR-T pochodzą od samych pacjentów, aby uniknąć reakcji allogenicznych, chociaż uniwersalne (lub gotowe) komórki CAR-T pochodzące od dawcy są aktywnie rozwijane i oceniane klinicznie16. Po wyizolowaniu leukocytów z krwi obwodowej pacjenta za pomocą leukaferezy, obcy fragment genu kodujący CAR jest wprowadzany do aktywowanych limfocytów T przy użyciu metod wirusowych lub niewirusowych17,18,19. Retrowirusy i lentiwirusy są najczęstszymi wektorami wirusowymi do dostarczania genu CAR, co skutkuje losową i trwałą integracją DNA kodującego CAR z genomem limfocytów T20. Podejścia niewirusowe, w tym nanocząstki mRNA-lipid, systemy transpozonów i edycja genomu CRISPR/Cas9, są mniej powszechne21. Następnie limfocyty T wykazujące ekspresję CAR są namnażane ex vivo na dużą skalę, a następnie zbierane i ponownie podawane pacjentom22,23. Produkcja wektorów wirusowych, które spełniają rygorystyczne standardy Dobrej Praktyki Produkcyjnej (GMP), jest bardzo trudna, złożona i kosztowna, co stanowi znaczne obciążenie dla producentów, agencji regulacyjnych i pacjentów, ograniczając w ten sposób jej szerokie zastosowanie kliniczne.
Pomimo ekscytującego sukcesu terapii CAR-T, rosną obawy o jej bezpieczeństwo. Biorąc pod uwagę losowy charakter integracji transgenu CAR z genomem limfocytów T podczas transdukcji wirusa lub transpozonu, może dojść do zakłócenia genów supresorowych nowotworu lub aktywacji onkogenów, co prowadzi do złośliwej transformacji limfocytów T24,25. Od czasu zatwierdzenia przez FDA pierwszego produktu do terapii komórkami CAR-T w 2017 r., badania uzupełniające pokazują, że aż u 15% pacjentów, którzy otrzymują terapię, rozwijają się wtórne pierwotne nowotwory złośliwe (SPM), takie jak chłoniak z komórek T (TCL), niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC) i rak skóry26,27,28,29. Uderzające jest to, że transgeny CAR były często wykrywane w niektórych SPM30,31, a niektóre przypadki TCL były bezpośrednio spowodowane nieprawidłową ekspansją komórek CAR-T24,32,33, co wskazuje na bezpośrednią rolę produktów CAR-T w wywoływaniu niektórych SPM. Inne badania zidentyfikowały ponadto inserpozycje transgenu CAR w krytycznych genach, takich jak TET234, JAK135 i PBX236 w komórkach nowotworowych SPM. W świetle gromadzących się dowodów na nowotwory złośliwe komórek T po terapii komórkami CAR-T, FDA stwierdziła niedawno, że ostrzeżenie w ramce podkreślające poważne ryzyko złośliwości komórek T jest wymagane dla wszystkich obecnie zatwierdzonych terapii komórkami CAR-T skierowanych na CD19 i BCMA37. Jednak badania wielkokohortowe obejmujące długoterminowe skutki leczenia CAR-T wskazują na częstość występowania SPM w zakresie od 3,8% do 15% wśród leczonych pacjentów26,27,28,38,39. Częstość występowania nie jest istotnie wyższa niż obserwowana u pacjentów z rakiem krwi poddawanych tradycyjnemu systematycznemu leczeniu40,41, co sugeruje stosunkowo bezpieczny profil terapii komórkami CAR-T. Niemniej jednak istnieje pilna potrzeba opracowania bezpiecznych i skutecznych komórek CAR-T, które zminimalizują ryzyko wystąpienia SPM dzięki bardziej opłacalnym metodom.
Tutaj opisujemy szczegółowy protokół dla niewirusowego, nieintegrującego podejścia do generowania komórek CAR-T. Celem jest zapewnienie prostego, krok po kroku przewodnika do generowania małych, skutecznych komórek CAR-T z przejściową ekspresją CAR, unikając w ten sposób mutagenezy insercyjnej i minimalizując ryzyko SPM. Pokazujemy, że elektroporacja limfocytów T ze zmodyfikowanym mRNA kodującym CAR specyficzny dla TAA HER2 spowodowała silną i przejściową ekspresję anty-HER2 CAR na powierzchni limfocytów T. Podczas ekspresji CAR limfocyty T silnie zabijały komórki nowotworowe HER2-dodatnie i wydzielały wysoki poziom IFN-Υ. Protokół jest opisany w czterech oddzielnych, ale ciągłych sekcjach, które obejmują przygotowanie mRNA CAR, aktywację i elektroporację limfocytów T, ocenę ekspresji CAR oraz analizę funkcji komórek CAR-T. Takie podejście jest odpowiednie do opracowywania i wytwarzania przejściowych komórek CAR-T zarówno do badań akademickich, jak i klinicznych terapii komórkowych.

<table><tbody><tr><td>Barwnik żywotności 7-AAD&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>420404</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy ACEA Novocyte</td><td>Agilent</td><td>NovoCyte 3000</td><td></td></tr><tr><td>AIM-V podłoże</td><td>Gibco</td><td>12055083</td><td></td></tr><tr><td>APC kozie przeciwciało anty-ludzkie IgG F(ab')2</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>109-136-097</td><td></td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny BglII</td><td>New England BioLabs (NEB)</td><td>R0144L</td><td></td></tr><tr><td>3&acute;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog</td><td>NEB</td><td>S1411S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Ludzki aktywator T Koraliki CD3 / CD28</td><td>Gibco</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>E-Plate 96</td><td>Agilent</td><td>5232376001</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>459844-4L</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza.com</td><td>14-503F</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy RNA HiScribe SP6 New</td><td>England BioLabs (NEB)</td><td>E2070S</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie białko rekombinowane IL-2</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Markery RNA Millennium</td> Zestaw do oczyszczania RNA <td>Invitrogen</td><td>AM7150</td><td></td></tr><tr><td>Monarch (500 &mu; g)</td> <td>NEB</td><td>T2050L</td><td></td></tr><tr><td>N1-Methylpseudo-UTP</td><td>Trilink</td><td>N-1081-10</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfekcja Instrument</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfekcja System 100-&mu; L Zestaw</td><td>Invitrogen</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>14-503F</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>11875135</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>25300120</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy (25:24:1, v/v)</td><td>Invitrogen</td><td>15593049</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence Przyrząd do analizy komórek w czasie rzeczywistym (RTCA)</td><td>Agilent</td><td>RTCA MP</td><td></td></tr><tr><td>ZymoPURE II Zestaw do przygotowania plazmidu</td><td>Zymo Research</td><td>D4201</td><td></td></tr></tbody></table>

niewirusowe podejście do generowania przejściowych limfocytów t receptora chimerycznego antygenu przy użyciu mrna do immunoterapii nowotworów

A Nonviral Approach to Generate Transient Chimeric Antigen Receptor T Cells Using mRNA for Cancer Immunotherapy

Terapia limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) stała się pionierskim sposobem leczenia raka, osiągając bezprecedensowy sukces w leczeniu niektórych nowotworów hematologicznych, takich jak chłoniaki i białaczki. Jednak w miarę jak coraz więcej pacjentów z rakiem otrzymuje terapie komórkami CAR-T, wtórne nowotwory złośliwe związane z leczeniem są coraz częściej zgłaszane częściowo z powodu nieoczekiwanej insercji transgenu CAR, co budzi poważne obawy dotyczące bezpieczeństwa. Aby rozwiązać ten problem, opisujemy tutaj niewirusowe, nieintegrujące się podejście do generowania przejściowych komórek CAR-T za pomocą mRNA. Poddaliśmy elektropostacji limfocytów T zmodyfikowanym mRNA kodującym CAR specyficzny dla receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2) i wygenerowaliśmy przejściowe komórki CAR-T ukierunkowane na HER2. CAR ulegał efektywnej ekspresji na powierzchni limfocytów T 1 dzień po elektroporacji, wzrastał w 2 dniu i dramatycznie spadał w 5 dniu. Przejściowe komórki CAR-T wykazywały silną cytotoksyczność wobec HER2-dodatnich komórek raka jajnika SKOV-3 i wydzielały wysokie poziomy IFN-Υ. Protokół ten zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący opracowywania przejściowych komórek CAR-T na małą skalę bez trwałej integracji transgenu CAR, opisujący szczegółowe procedury przygotowania mRNA CAR, aktywacji i transfekcji limfocytów T, oceny ekspresji CAR oraz analizy in vitro funkcji komórek CAR-T. Metoda ta jest odpowiednia do przejściowego wytwarzania komórek CAR-T zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i klinicznych.

Skonstruowaliśmy drugiej generacji CAR skierowany przeciwko HER2, zawierający scFv pochodzący z humanizowanego mysiego przeciwciała monoklonalnego (mAb) anty-HER2 4D547, region transbłonowy oraz wewnątrzkomórkową domenę kostymulującą 4-1BB, za którą następowała domena aktywacyjna CD3ζ (Rysunek 1A). Sekwencja DNA kodująca CAR zawierała promotor SP6 na końcu 5', aby sterować transkrypcją mRNA CAR in vitro (Rysunek 1B). mRNA CAR mia...

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę generowania przejściowych limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) przy użyciu nieintegrującego mRNA do immunoterapii nowotworów i dostarcza wiarygodnych metod oceny komórek CAR-T i ich funkcji cytotoksycznej.

Niewirusowe podejście do generowania przejściowych limfocytów T receptora chimerycznego antygenu przy użyciu mRNA do immunoterapii nowotworów

Chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy has emerged as a pioneering cancer treatment, achieving unprecedented success in treating certain ...

Terapia komórkami CAR T osiągnęła bezprecedensowy sukces w leczeniu niektórych nowotworów patologicznych. W tym badaniu wprowadziliśmy niewirusowe, długo integrujące się podejście do generowania przejściowych komórek CAR T i zapewniliśmy ukierunkowane procedury oceny funkcji komórek CAR T. Nasze badania mają na celu wygenerowanie bezpiecznych i skutecznych limfocytów CAR T w bardziej opłacalny sposób.Limfocyty CAR T są zwykle generowane przez transdukcję wirusa. Retrowirusy i antywirusy są najczęstszymi wektorami wirusowymi dostarczania genu CAR. Produkcja wektorów wirusowych jest złożona i kosztowna, a transdukcja wirusa indukuje losową i trwałą integrację DNA kodującego CAR z genomem limfocytów T, co może powodować obawy dotyczące bezpieczeństwa.Nasz protokół oferuje niewirusowe podejście do generowania limfocytów T CAR, które tylko przechodnio wyrażają CAR. Metoda ta wykorzystuje mRNA do ekspresji CAR i wykorzystuje elektroporację do dostarczania mRNA do limfocytów T. Nie powoduje to integracji genów z genomem limfocytów T, a procedury produkcyjne są prostsze i bardziej opłacalne.Na początek zlinearyzuj DNA plazmidu CAR enzymem restrykcyjnym BGL2 i wykonaj procedurę ekstrakcji DNA fenolowo-chloroformowym alkoholem izoamylowym. Po oczyszczeniu zlinearyzowanego DNA sprawdź rozmiar i integralność matrycy za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. W przypadku transkrypcji in vitro należy wymieszać składniki reakcji i inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny.Po transkrypcji dodać do reakcji dwa mikrolitry rybonukleazy III, DNazy I. Delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zdegradować matrycę DNA. Oczyść transkrybowany CAR MRNA za pomocą zestawu do czyszczenia RNA i rozcieńcz go w wodzie wolnej od nukleaz.Zmierz stężenie mRNA za pomocą spektrofotometru przed przechowywaniem go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Rozmrozić transkrybowaną i oczyszczoną próbkę mRNA samochodu in vitro na lodzie. Zawiesić jeden razy 10 do mocy sześciu kriokonserwowanych ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej w jednym mililitrze pożywki CAR T.Aby aktywować limfocyty T, dodaj równą liczbę wstępnie umytych ludzkich kulek aktywatora T CD3 / CD28. Hoduj i namnażaj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżanym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez kilka dni. Dodać jeden mililitr pożywki CAR T na studzienkę do dwóch dołków 12-dołkowej płytki i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu zrównoważenia.Teraz przenieś pięć razy 10 do mocy sześciu limfocytów T do sterylnej probówki. Aby usunąć kulki CD3/CD28, umieść probówkę na stojaku magnetycznym i ostrożnie pipetuj zawiesinę komórek do nowej probówki. Odwirować probówkę o stężeniu 300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze sterylnego PBS. Ponownie odwirować probówkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach buforu neonowego T. Wymieszać pięć mikrogramów CAR MNA rozcieńczonych w buforze Neon T i 100 mikrolitrów komórek w łącznej objętości 125 mikrolitrów. Dodaj 25 mikrolitrów buforu neonowego T do pozostałych 100 mikrolitrów komórek, który służy jako kontrola ujemna.Ustaw system elektroporacji Neon na 1 800 woltów, 10 milisekund i pojedynczy impuls. Użyj pipety Neon, aby zassać mieszaninę mRNA limfocytów T CAR do końcówki Neon o pojemności 100 mikrolitrów i elektroporować komórki. Natychmiast przenieś elektroporowane komórki do zrównoważonej pożywki hodowlanej na 12-dołkowej płytce i włóż płytkę z powrotem do inkubatora w celu rozprężenia komórek, aż będą gotowe do użycia.Pobrać limfocyty T transfekowane mRNA CAR do analizy cytometrii przepływowej już sześć godzin po elektroporacji. Wymieszaj limfocyty CAR T kilka razy za pomocą pipety i przenieś co najmniej raz razy 10 do potęgi pięciu komórek do pięciomililitrowej probówki do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją lub FACS. Dodać trzy mililitry buforu do płukania na zimno do probówki i odwirować probówkę o stężeniu 500 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórek w 100 mikrolitrach buforu do przemywania popłuczyny. Dodaj dwa mikrolitry znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała detekcyjnego i siedmiu barwników żywotności AAD do zawieszonych komórek. Wymieszać próbkę i inkubować ją na lodzie przez 30 minut, unikając ekspozycji na światło, następnie przemyć komórki trzema mililitrami buforu do płukania na zimno i ponownie odwirować probówkę przy 500 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach buforu do przemywania i natychmiast przeanalizować komórki za pomocą cytometru przepływowego. Usuń pożywkę z komórek nowotworowych wyrażających antygen CAR na powierzchni komórki. Po umyciu komórek PBS inkubować je z jednym mililitrem 0,05% roztworu EDTA trypsyny przez jedną minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie przygotować zawiesinę pojedynczej komórki w odpowiedniej pożywce hodowlanej o gęstości od jednego do pięciu razy 10 do mocy pięciu komórek na mililitr.Następnie dodaj 50 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórek nowotworowych do płytki E i umieść ją w analizie komórek w czasie rzeczywistym lub przyrządzie RTCA w celu zmierzenia impedancji tła, a następnie dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórek nowotworowych do każdej studzienki i wyrównaj płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Umieść E-plate z powrotem w przyrządzie RTCA i monitoruj indeks ogniwa przez 24 godziny, z pomiarami wykonywanymi co pięć do 15 minut. Następnego dnia należy przygotować zawiesinę limfocytów CAR T.Wstrzymaj zapis indeksu komórek i wyjmij płytkę E z przyrządu RTCA. Lekko przechylić płytkę i ostrożnie usunąć 50 mikrolitrów pożywki hodowlanej z każdej studzienki bez naruszania komórek nowotworowych, a następnie dodać 100 mikrolitrów limfocytów CAR T lub kontrolnych limfocytów T do każdej studzienki. Umieść płytkę E z powrotem w przyrządzie RTCA i wznów monitorowanie indeksu komórek przez co najmniej 24 godziny, z przemiataniem co pięć do 15 minut.Zatrzymaj monitorowanie indeksu komórkowego i przeanalizuj wynik cytotoksyczności. W celu analizy wydzielania cytokin przenieś supernatant z każdej studzienki do okrągłego dna lub 96-dołkowej płytki w kształcie litery V. Odwirować 96-dołkową płytkę o stężeniu 300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i ostrożnie przenieść supernatanty na nową 96-dołkową płytkę.Na koniec zmierz poziom cytokin w supernatantach za pomocą komercyjnych zestawów ELISA. Sekwencja mRNA CAR została potwierdzona jako około dwóch kilozasad w elektroforezie żelowej. Ponad 50% aktywowanych limfocytów T wykazywało ekspresję CAR w pierwszym dniu po elektroporacji, wzrastając do ponad 70% w drugim dniu, zanim spadło do około 10% w piątym dniu.Limfocyty CAR T wykazywały znaczną cytotoksyczność wobec HER2-dodatnich komórek nowotworowych SK-OV-3, co wskazuje na gwałtowne zmniejszenie impedancji guza, podczas gdy kontrolne limfocyty T wykazywały minimalny efekt. Wysoki poziom wydzielania interferonu gamma wykryto w pożywce do hodowli komórek CAR T, ale nie w grupie kontrolnej.

a-nonviral-approach-to-generate-transient-chimeric-antigen-receptor-t

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film demonstruje technikę wytwarzania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) ex vivo. Ludzkie limfocyty T są inkubowane za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28, wraz z pożywką uzupełnioną interleukiną-2 (IL-2), co prowadzi do aktywacji i proliferacji limfocytów T. Wprowadzane są transgeniczne wektory lentiwirusowe, które umożliwiają transgenicznemu RNA integrację z genomem gospodarza i ekspresję transgenu. Powoduje to, że transdukowane...

Technika ex vivo do wytwarzania chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego

Ten film demonstruje technikę generowania ex vivo limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) specyficznym dla antygenu nowotworowego. Wektory retrowirusowe przenoszące transgeniczne RNA są mieszane z komórkami śledziony w pożywce uzupełnionej interleukiną-2 w celu promowania przeżycia i proliferacji komórek T. Mieszanina jest następnie przenoszona na płytkę pokrytą rekombinowanymi fragmentami ludzkiej fibronektyny i odwirowywana, aby ułatwić fuzję wirusa z komórką, umożliwiając...

Technika ex vivo do generowania specyficznych dla nowotworu chimerycznych komórek T receptora antygenowego

Ten film demonstruje technikę generowania limfocytów T z chemerycznym receptorem antygenu (CAR) specyficznym dla antygenu poprzez transdukcję retrowirusową. Aktywowane mysie limfocyty T CD8 + dodaje się do płytki mikrodołkowej pokrytej rekombinowanymi fragmentami fibronektyny. Następnie wprowadza się wektory retrowirusowe zawierające transgeniczne RNA kodujące specyficzny dla antygenu chimeryczny receptor antygenowy (CAR), a płytkę odwirowuje się w celu ułatwienia transdukcji. Po inkubacji...

Technika wytwarzania limfocytów CAR T specyficznych dla antygenu

Obecny protokół łączy sekwencjonowanie łańcucha alfa i beta TCR w parach pojedynczych komórek z usprawnionym generowaniem wektorów retrowirusowych kompatybilnych z ekspresją TCR in vitro i in vivo.

Usprawniona izolacja TCR z pojedynczych komórek i generowanie wektorów retrowirusowych do ekspresji TCR u ludzi in vitro i in vivo

Opisujemy podejście do niezawodnego generowania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) i testowania ich różnicowania i funkcji in vitro i in vivo.

Wytwarzanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) do immunoterapii adoptywnej

Ten protokół opisuje metodologię nieinwazyjnego śledzenia limfocytów T genetycznie zmodyfikowanych do ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych in vivo za pomocą klinicznie dostępnej platformy.

Dynamiczne obrazowanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej [18F] tetrafluoroboranu / tomografii komputerowej

Ten artykuł szczegółowo opisuje proces produkcji limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym do użytku klinicznego, w szczególności przy użyciu automatycznego procesora komórkowego zdolnego do przeprowadzania transdukcji wirusa i hodowli limfocytów T. Przedstawiamy rekomendacje i opisujemy pułapki, które należy wziąć pod uwagę podczas opracowywania procesu i wdrażania badania klinicznego wczesnej fazy.

Wytwarzanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym na zautomatyzowanym procesorze komórkowym

Ten protokół usprawnia produkcję wektorów retrowirusowych i transdukcję mysich limfocytów T, ułatwiając efektywne wytwarzanie mysich komórek CAR-T.

Wydajne wytwarzanie mysich chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-T

Ten protokół zapewnia usprawniony przepływ pracy do generowania i testowania ludzkich limfocytów regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (Treg CAR).

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego

Szczegółowy protokół jest dostępny dla użycia technologii CRISPR/Cas9 w celu osiągnięcia wysoce efektywnego docelowego wkręcania dużych, multicistronicznych konstruktów w pierwotnych ludzkich limfocytach T za pośrednictwem homologii (HMEJ) szlaku naprawy DNA. Limfocyty T zmodyfikowane za pomocą tego protokołu adaptowalnego do cGMP utrzymują doskonałą ekspansję komórek, cytotoksyczność i produkcję cytokin.

Inżynieria niewirusowa pierwotnych ludzkich limfocytów T poprzez ukierunkowaną integrację dużych matryc DNA za pośrednictwem homologii

Ten protokół opisuje kluczowe kroki uprawy pierwotnych komórek T, w tym ich izolację, aktywację, ekspansję oraz przejściową transfekcję przez elektroporację mRNA. Dodatkowo proponowany jest przepływ pracy i panel przeciwciał do analizy cytometrycznej fenotypu, markerów aktywacji, żywotności oraz ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych (CAR).

Izolacja, hodowla i przejściowa transfekcja pierwotnych ludzkich komórek T w celu wygenerowania komórek T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR)

Poznaj niewirusową metodę generowania przejściowych limfocytów T CAR przy użyciu mRNA do immunoterapii nowotworów. To podejście eliminuje ryzyko integracji DNA i obniża koszty produkcji.

Niewirusowe podejście do generowania przejściowych limfocytów T receptora chimerycznego antygenu przy użyciu mRNA do immunoterapii nowotworów (Wideo) | JoVE Journal

Niewirusowe podejście do generowania przejściowych limfocytów T receptora chimerycznego antygenu przy użyciu mRNA do immunoterapii nowotworów

Przeglądaj więcej filmów