Badania przesiewowe in vitro oparte na diodach LED do oceny fotoaktywowanych cząsteczek w inaktywacji fotodynamicznej bakterii
24 stycznia 2025
Ten protokół opisuje prostą i ekonomiczną metodę oceny skuteczności potencjalnych fotosensybilizatorów w antybakteryjnej inaktywacji fotodynamicznej (aPDI), przy użyciu formatu 96-dołkowej płytki w połączeniu ze źródłem światła na panelu LED. Takie podejście umożliwia jednoczesne testowanie wielu warunków eksperymentalnych, w tym różnych stężeń, związków i szczepów bakterii.
Moje badania koncentrują się na badaniu różnych cząsteczek z rodziny związków flavyliowych, zarówno naturalnych, jak i syntetycznych, z głównym zainteresowaniem badaniem ich bioaktywności w kontekście fotoprotekcji UV i oceną ich potencjału jako fotouczulaczy w zastosowaniach terapii fotodynamicznej. Ostatnie odkrycia naszej grupy badawczej wykazały aktywowane światłem właściwości barwników flawiliowych na bazie aminokwasów, ustanawiając je jako obiecującą nową klasę fotouczulaczy. Związki te wykazują znaczny potencjał do dalszych badań, torując drogę do innowacyjnych zastosowań w tej dziedzinie.
Korzystając z 96-dołkowego systemu mikropłytek i paneli świetlnych, możemy uzyskać wysokoprzepustowe badania przesiewowe fotouczulaczy w kontrolowanym środowisku, upraszczając identyfikację i porównanie różnych kandydatów do terapii fotodynamicznej. Na początek wprowadź bakterie Staphylococcus aureus na płytce agarowej Muellera-Hintona z kultury zatrzymanej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny, aby uzyskać świeżą kulturę.
Zbierz dwie do trzech świeżych kolonii z płytki agarowej i rozcieńcz je w sześciu mililitrach wstępnie podgrzanego, sterylnego, przefiltrowanego PBS o pH 7,4. Wirować inokulum z prędkością 1 200 obrotów na minutę przez trzy do czterech cykli, aby homogenizować próbkę i pobrać trzy mililitry homogenizowanego inokulum do jednorazowej kuwety. Po zmierzeniu gęstości optycznej przy 600 nanometrach rozcieńczyć próbkę, aby dopasować ją do gęstości optycznej 0,1 za pomocą PBS.
Przygotować roztwór podstawowy związku fotouczulającego w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak DMSO lub PBS. Rozcieńczyć roztwór podstawowy w PBS, aby utworzyć roztwór roboczy, upewniając się, że składniki pożywek do hodowli bakteryjnych nie zakłócają absorpcji światła. Zwiruj roztwór roboczy, aby zapewnić całkowitą homogenizację.
Na początek przygotuj zawiesinę Staphylococcus aureus i roztwór roboczy związku fotouczulającego. Przygotuj dwie oddzielne płytki 96-dołkowe, jedną przeznaczoną do ekspozycji na światło, a drugą do kontroli ciemności. Na każdą płytkę wlej po 100 mikrolitrów roztworu fotouczulacza i zawiesiny bakteryjnej.
Wymieszaj roztwory od 5 do 10 razy za pomocą pipety. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby fotouczulacz mógł wejść w interakcję z komórkami bakteryjnymi. Po inkubacji wyjąć płytki z inkubatora.
Chroń jedną z płyt przed światłem jako ciemną kontrolkę. Umieść drugą 96-dołkową płytkę nad prostokątnym panelem LED o mocy 50 W. Zaznacz krawędzie płytki na powierzchni diody LED, aby zapewnić spójne rozmieszczenie w powtórzeniach protokołu.
Wystaw płytkę na działanie światła LED przez około 15 minut. Użyć innej 96-dołkowej płytki do przygotowania seryjnych rozcieńczeń próbek, w tym kontrolnych, studzienek nienapromieniowanych i napromieniowanych. Dodaj 180 mikrolitrów PBS do każdej studzienki, w zależności od liczby próbek.
Podwielokrotność 20 mikrolitrów z każdej studzienki w napromienionych i nienapromienionych płytkach do pierwszej kolumny płytki wypełnionej PBS. Za pomocą wielokanałowej mikropipety wykonaj proste rozcieńczenie szeregowe od studzienki 1 do 6. Podzielić płytkę agarową na sześć równych części, z których każda odpowiada jednemu z rozcieńczeń.
Podwielokrotność 10 mikrolitrów z każdej studzienki na odpowiednią sekcję płytki agarowej. Inkubować płytkę przez 18 do 20 godzin. Wyjąć płytkę agarową z inkubatora i zidentyfikować obszary odpowiednie do zliczania kolonii.
W każdej sekcji płyty ślimaka policz liczbę jednostek tworzących kolonię. Widmo światła widzialnego wykazało trzy wyraźne piki od 400 do 700 nanometrów. W ciemnych warunkach żaden z badanych związków flawiliowych nie wykazywał działania cytotoksycznego.
Natomiast po ekspozycji na światło badane związki powodowały zależny od dawki spadek żywotności Staphylococcus aureus z istotnymi efektami obserwowanymi przy stężeniach 6 i 12 mikromolowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje ekonomiczną metodę oceny skuteczności światłoczułych związków w antybakterycznej inaktywacji fotodynamicznej (aPDI) za pomocą formatu płytki 96-dołkowej z panelem LED. Ta technika pozwala na jednoczesną ocenę różnych warunków eksperymentalnych, w tym różnych stężeń, związków i szczepów bakteryjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biochemia
- Terapia fotodynamiczna
Tło
- Badania koncentrują się na związkach flawylowych dla ochrony przeciw UV.
- Eksploracja ich bioaktywności jako światłoczułych związków.
- Ostatnie odkrycia podkreślają potencjał flawilowych barwników opartych na amino.
- Wysoko przepuszczalne badania upraszczają ocenę kandydatów.
Cel badania
- Ocenienie skuteczności różnych światłoczułych związków.
- Identyfikacja obiecujących związków do terapii fotodynamicznej.
- Zwiększenie zrozumienia antybakteryjnej inaktywacji fotodynamicznej.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie 96-dołkowej płytki mikro do testów.
- Zastosowanie świetlnego źródła z panelem LED.
- Zaszczepienie Staphylococcus aureus na agarze Mueller-Hinton.
- Inkubacja w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.
Główne wyniki
- Identyfikacja skutecznych światłoczułych związków.
- Wykazanie aktywowanych światłem właściwości flawilowych barwników.
- Wysoko przepuszczalne badania prowadzą do efektywnego porównania kandydatów.
- Potencjał dla innowacyjnych zastosowań w terapii fotodynamicznej.
Wnioski
- Ustalono prostą metodę oceny światłoczułych związków.
- Związki flawiliowe wykazują potencjał do dalszych badań.
- To podejście może prowadzić do postępów w terapiach antybakteryjnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-throughput LED-based in vitro screening enables rapid assessment of photoactivable molecules for antibacterial photodynamic inactivation, addressing urgent needs in antibiotic resistance. This platform supports early-stage triage of photosensitizer candidates by providing standardized, reproducible, and quantitative viability data. Integrating such screening into discovery pipelines accelerates identification of promising compounds for further translational development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of photosensitizer efficacy against bacterial targets.
- Supports biological de-risking by distinguishing light-dependent cytotoxicity from dark toxicity.
- Facilitates predictive confidence in candidate selection through quantitative viability reduction data.
Screening & Assay Development
- Delivers high-throughput, standardized evaluation of multiple compounds and concentrations in parallel.
- Ensures reproducibility and comparability across experimental runs using controlled LED illumination and microplate format.
- Generates quantitative outputs (colony forming units) for robust compound ranking and assay optimization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational goals by identifying candidates with potent, light-activated antibacterial activity.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by enabling dose-response and selectivity profiling.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for novel anti-infective modalities.
Pipeline & Workflow Integration
This LED-based screening method fits at the interface of early discovery and lead identification for antibacterial photodynamic agents.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on light-activated cytotoxicity and mechanistic de-risking of candidate molecules.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility for scalable compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative measurement of bacterial viability and dose-dependent effects.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical assessment by identifying candidates with translational potential.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, reusable platform adaptable to diverse photosensitizer classes and bacterial strains.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage anti-infective discovery.
- Operational Value: Standardizes workflows and enables reproducible, scalable screening campaigns.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by focusing resources on validated candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of novel antibacterial modalities.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology, photochemistry, and quantitative assay design.
- Needs access to calibrated LED panels, microplate readers, and sterile handling infrastructure.
- Demands cross-team standardization of light exposure, plate handling, and data analysis protocols.
- Adaptable to various bacterial strains and photosensitizer chemotypes with protocol optimization.
- Potential limitations include compound solubility, light penetration, and interference from media components.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:57
Preparation of Culture and Compounds for Evaluating Photodynamic Activity of Photosensitizers Against Antibiotic-Resistant Bacteria
2:18
In Vitro Photodynamic Inactivation Assay for Bacteria: High-Throughput Testing of Photosensitizers Using LED Illumination
4:37
Representative Results
