Wykrywanie autoprzeciwciał anty-MDA5 za pomocą komórek HeLa oraz immunocytochemii za pomocą mikroskopii świetlnej

Głównym celem następującego eksperymentu jest wykorzystanie immunocytochemii do wykrywania przeciwciał anty-MDA5. Odbywa się to poprzez wykorzystanie komórek HeLa, a następnie transfekcję komórki HeLa za pomocą konstruktu MDA5. W związku z tym komórki HeLa produkują białka MDA5, które mogą być przyłączane przez przeciwciała MDA5.

Po włączeniu komórki HeLa do konstrukcji MDA5, odczynnik Triton służy do przepuszczania błony komórek HeLa, co pozwala na przepuszczenie przeciwciał anty-MDA5. Następnie dodaje się surowicę pacjenta zawierającą przeciwciała przeciwciała przeciw MDA5. Przeciwciała anty-MDA5 przyczepiłyby się następnie do białek MDA5 wewnątrz komórek HeLa.

Następnie do komórek wprowadzane są przeciwciała wtórne, do których przyczepiona jest nadtlenaza chrzanu, a przeciwciała wtórne przyczepiają się do przeciwciał przeciw MDA5. Na koniec chromogen jest dodawany do komórek i utleniany w obecności przeciwciał wtórnych sprzężonych z peroksydazą chrzanu, co daje widoczny kolor pod mikroskopem optycznym. Pozytywny wynik w stanie startowym pokazałby coś podobnego do powyższego zdjęcia.

W dzisiejszej demonstracji wideo przechodzimy do kluczowego obszaru badań medycznych – wykrywania przeciwciała związanego z różnicowaniem czerniaka – genu numer pięć, zwanego także przeciwciałem anty-MDA5. Te autoprzeciwciała odgrywają kluczową rolę jako prosty wskaźnik diagnostyczny dla pacjentów z chorobą śródmiąższową płuc, zwłaszcza tych z szybko postępującymi chorobami. Znaczenie tych badań polega na ich potencjalnym wpływie na wyniki leczenia pacjentów. Wczesne i dokładne wykrycie autoprzeciwciał MDA5 jest kluczowe dla skutecznego zarządzania tą ciężką chorobą autoimmunologiczną.

Główną zaletą metody, którą pokazaliśmy w porównaniu z złotą metodą przesiewowego autoprzeciwciał anty-MDA5, jest to, że można ją wykonać szybciej oraz zaoszczędzić czas i wysiłek w porównaniu do tradycyjnego radioaktywnie znakowanego testu immunowizytacyjnego. Ta zwiększona wydajność pozwala nam przetwarzać więcej próbek i szybko generować wyniki. Ponadto należy zauważyć, że nasza metoda nie tylko zapewnia wyższą wydajność, ale także bezpieczeństwo i opłacalność w porównaniu z testem immunoprecypitacyjnym przejściowym.

Zobaczmy teraz, jak to się robi. Mój asystent badawczy, Teo Kai Fa, poprowadzi ten zabieg. Utrzymuj komórki HeLa za pomocą Zmodyfikowanego Medium Orła Dulbecco, zawierającego 10% surowicy płodowej bydła oraz 1% antymykotycznego antymikotyku w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonej atmosferze o zawartości 5% CO2.

Przepuszczaj komórki co dwa do trzech dni lub gdy komórki osiągną 90 do 100% konfluentności. Umieść 70 000 komórek HeLa na każdym odwiercie przy płycie 24-dołowej. 24 godziny przed transfekcją i połącz komórki, które mają około 90% współbycia.

Rozcieńcz po 500 nanogramów plazminy i 1,5 mikrolitra odczynnika transfekcyjnego każdy w 25-mikrolitrowym medium surowicy o pojemności 25 mikrolitrów. Dodaj rozcieńczone DNA, rozcieńczony odczynnik transfekcyjny w proporcji jeden do jednego. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez pięć minut.

Dodaj mieszankę do komórek umieszczonych dzień wcześniej i natychmiast mieszaj, aby wymieszać kompleks lipidowy DNA. Potwierdź, że komórki są łączne w 80 do 90%. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonej półkuli o zawartości 5% CO2, przez 40 do 4 godzin, a następnie przekonuj immunocytochemię.

Używamy komercyjnie dostępnego czynnika. Więcej informacji można znaleźć w tabeli materiałów. Skuteczność transfekcji wynosi 50%. Skuteczność transfekcji i ekspresji docelowego białka można określić, transfekując komórki plazmidem z mrożonym białkiem ekspresyjnym oraz przewodząc zachodnią krew, aby wizualizować ekspresję docelowego białka. Po inkubacji dwukrotnie przemyj komórki PBS, aby usunąć wszelkie pozostałe nośniki.

Mycie można wykonać poprzez potrząsanie talerzem lub wstrząsaczką orbitalną. Zabezpiecz komórki 4% paraformaldehydem w PBS. Uwaga. Paraformaldehyd jest toksyczny.

Stosuj odpowiednie zasady postępowania. Zostaw ogniwa na 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie pozbądź się odczynnika utrwalającego.

Użyj PBS do dwukrotnego mycia komórki. Nałóż odczynnik trytonowy, a następnie pozwól komórkom odczekać 10 minut w temperaturze pokojowej. Użyliśmy Triton X 400 w PBS w stężeniu 0,3%. Po 10 minutach wyrzuciliśmy odczynnik Triton.

Dodaj PBS do przeprania komórek raz. Następny krok: wykonaj blokowanie z 10% surowicą bydła płodowego w PBS i pozostawienie komórek na godzinę w temperaturze pokojowej. Usuń odczynnik blokujący. Następnie dodaj PBS, aby raz przemyć komórki.

Dodaj rozcieńczoną plazmę pacjenta do komórek. Przed użyciem należy rozcieńczyć osocza pacjenta w stosunku 1 do 5 000 w PBS. Dostosowuj rozcieńczenie, aby wzmocnić sygnał lub zmniejszyć tło w razie potrzeby, aby zapewnić obiektywne rezultaty.

Personel przeprowadził test, nie mając wiedzy, które próbki należą do pacjentów, a które do zdrowych osób. Inkubuj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 12 do 16 godzin. Po upływie okresu inkubacji pobierz próbkę pacjenta i przepłucz komórki trzykrotnie PBS.

Należy podleczyć komórki rozcieńczonym IgG sprzężonym z chrzanem i nadoksydazą, antyludzkim w stosunku 1 do 250 w PBS. Zostaw ogniwa na godzinę w temperaturze pokojowej. Godzinę później pozbądź się przeciwciał wtórnych.

Przepłucz PBS trzy razy. Po umyciu komórek barw je roztworem roboczym DAB o pojemności 300 mikrolitrów na dołek. Rozwiązanie robocze DAB jest przygotowywane przez brak koncentratu promocyjnego DAB oraz rozcieńczalnika DAB zgodnie z instrukcjami producenta.

Po pięciu minutach barwienia komórki usuń barwnik. Po usunięciu barwnika przepłukaj jonizowaną wodą destylowaną i potrząsaj przez pięć minut. Zbarwij jądro komórkowe rozcieńczoną hematotoksyną.

Używamy hemotoksyny w 10-stopniowym rozcieńczeniu. Poczekaj pięć minut na proces bejcowania. Po pięciu minutach usuń hemotoksynę, a następnie przemyj analizowaną wodą destylowaną dwukrotnie po pięć minut każdy.

Ostatni krok: obserwowanie wyników barwienia pod mikroskopem optycznym. Zinterpretujmy wyniki testów immunocytochemii dla autoprzeciwciał anty-MDA5. Pozytywny wynik.

Prawdziwy plus pokazuje silne brązowe przebarwienia wewnątrz HeLa ekspresujące MDA5. Potwierdza to obecność autoprzeciwciał anty-MDA5 w próbce pacjenta. Negatywny wynik.

Wynik negatywny pokazuje komórki HeLa bez brązowego przebarwienia, co wskazuje na brak autoprzeciwciał przeciw MDA5. Wynik fałszywie pozytywny. Co istotne, fałszywie pozytywny wynik wykazuje rozległe brązowe przebarwienia we wszystkich komórkach, niezależnie od ekspresji MDA5.

To niespecyficzne zabarwienie obserwowane w chorobach autoimmunologicznych musi być odróżnione od prawdziwie pozytywnego, aby uniknąć błędnej diagnozy. Nasza metoda oferuje szybszy, bezpieczniejszy i bardziej opłacalny sposób wykrywania przeciwciał przeciwnarządowych przeciwciał anty-MDA5. Ma to potencjał istotnego wpływu na wyniki leczenia leczenia chorób śródmiąższowych płuc.

Po wyświetleniu tego filmu nauczysz się, jak wykonać procedurę immunocytochemii oraz jak rozpoznać kliniczne istoty w wynikach testu.