Name: Płukanie solą fizjologiczną do pobierania próbek mikrośrodowiska immunologicznego nosa u psów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 35 s
Description: Naucz się techniki płukania solą fizjologiczną do pobierania próbek mikrośrodowiska immunologicznego nosa u psów z nowotworami. Ta nieinwazyjna metoda umożliwia seryjną analizę odpowiedzi immunologicznych podczas radioterapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Opisana tutaj technika płukania nosa dla psów została zoptymalizowana dzięki projektom wspieranym przez K01 OD03109, CCTSI Colorado Pilot Grant Award, CSU CVMBS College Research Council Shared Resources Program, oraz CO HNC SPORE CA261605: Career Enhancement Program. Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com.

Ta procedura płukania nosa została zatwierdzona przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Kolorado oraz Komisję Oceny Klinicznej (IACUC #2425). Schemat metody płukania nosa przedstawiono w Rysunek 1.
1. Przygotowanie do płukania nosa
<ol>
	<li>Dzień przed zabiegiem płukania nosa napełnij pięć strzykawek o pojemności 20 ml sterylnym roztworem soli fizjologicznej (0,9% roztwór chlorku sodu) i zamknij nakrętką. Umieścić strzykawki w inkubatorze ustawionym na temperaturę 37 oC, aby mogły się ogrzać przez noc.</li>
</ol>
2. Ułożenie psa do płukania nosa
<ol>
	<li>Znieczulić psa do zabiegu (np. poprzez dożylne (IV) wstrzyknięcie deksmedetomidyny (1-4 μg/kg) i butorfanolu (0,2-0,5 mg/kg) przez cewnik dożylny), a następnie podać propofol IV (2-5 mg/kg) miareczkowany do momentu intubacji; utrzymać znieczulenie 1-2% izofluranem wziewnym, aby uzyskać efekt). Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia, sprawdzając reakcję powiekową i ton szczęki.</li>
	<li>Nasmaruj oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu.</li>
	<li>Monitoruj dane telemetryczne serca, ciśnienie krwi, kapnografię i wartości pulsoksymetrii przez cały czas trwania zabiegu.</li>
	<li>Ułóż znieczulonego psa w pozycji leżącej mostka. Umieść głowę psa tak, aby była naturalnie i wygodnie ustawiona pod kątem w dół od krawędzi stołu zabiegowego, aby uzyskać optymalne pobranie próbki z płukania nosa.</li>
	<li>Napompuj mankiet rurki dotchawiczej, aby zapewnić szczelne uszczelnienie dróg oddechowych.</li>
</ol>
3. Wykonywanie płukania nosa
<ol>
	<li>Wytnij sterylny, czerwony gumowy cewnik 8 FR u podstawy, tak aby ściśle przylegał do jednej z ampułkostrzykawek o pojemności 20 ml zawierających ciepłą sól fizjologiczną. Zmierz sterylny cewnik z czerwonej gumy tak, aby dystalna końcówka cewnika sięgała mniej więcej do połowy jamy nosowej po wprowadzeniu przez nozdrze. W przypadku pobierania próbki guza nosa należy skorzystać z obrazowania lub wskazówek rynoskopowych, aby oszacować lokalizację aspektu rostralnego guza nosa w celu zmierzenia długości cewnika z czerwonej gumy, tak aby końcówka rozciągała się do aspektu rostralnego guza.</li>
	<li>Następnie odetnij cewnik na końcówce na określoną długość cewnika donosowego, tak aby końcówka wylądowała w odpowiednim miejscu po włożeniu do jamy nosowej. Należy jednak pozostawić dodatkową długość podstawy cewnika wystającą na zewnątrz nozdrza (długość cewnika od punktu mocowania strzykawki do wejścia do nozdrza, około 3-5 cm). Nałóż znak trwałym markerem na podstawowy koniec cewnika, aby wskazać punkt początkowy, odpowiadający wejściu do nozdrza; Z góry określona długość cewnika będzie rozciągać się donosowo, a końcówka cewnika będzie umieszczona w żądanym miejscu w jamie nosowej.</li>
	<li>Wykonanie zabiegu płukania nosa będzie wymagało udziału dwóch osób. Niech jedna osoba (osoba A) będzie odpowiedzialna za wprowadzenie cewnika do jamy nosowej i podanie płukania, a druga osoba (osoba B) za pobranie próbki wychodzącej z nosa.</li>
	<li>Niech osoba A ustawi się przed i poniżej głowy psa. Rękami w rękawiczkach poproś osobę A, aby delikatnie poprowadziła końcówkę czerwonego gumowego cewnika do przyśrodkowej części jamy nosowej i przesuwała go, aż znak na cewniku zrówna się z zewnętrzną częścią nozdrza. Podczas tego procesu upewnij się, że cewnik jest podłączony do strzykawki zawierającej podgrzaną sterylną sól fizjologiczną. Niech osoba B trzyma stożkową rurkę o pojemności 50 ml poniżej nozdrza z założonym cewnikiem.</li>
	<li>Osoba A delikatnie zamyka przeciwległe nozdrze i zaczyna wlewać sól fizjologiczną do jamy nosowej z powolnym, stałym naciskiem lub pulsacyjnym wlewem. Ponieważ głowa psa jest ustawiona pod kątem skierowanym w dół, osoba B zbiera płyn, który spływa z jamy nosowej grawitacyjnie do stożkowej rurki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Powtórz tę technikę płukania nosa dla maksymalnie pięciu 20 ml płukania solą fizjologiczną, zmieniając stożkowe rurki w razie potrzeby w celu zebrania zbiorczych próbek. Zanotować całkowitą objętość zebranego płynu z płukania nosa w stosunku do ilości soli fizjologicznej podanej po zakończeniu zabiegu.</li>
	<li>Po zakończeniu, jeśli jest znieczulony deksmedetomidyną, należy podać domięśniowo taką samą objętość atipamezolu, jak w przypadku deksmedetomidyny, i pozwolić psu dojść do siebie po znieczuleniu. Aby zachować ostrożność, trzymaj psa w pozycji leżącej mostka z głową skierowaną w dół, aby ułatwić dodatkowy drenaż resztek soli fizjologicznej z płukania nosa.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie próbki płukania nosa
<ol>
	<li>Delikatnie zmieszać i/lub odpipetować próbki płukania nosa znajdujące się w stożkowych rurkach, aby rozbić grudki zanieczyszczeń i komórek. Przełóż zebrane próbki płukania nosa przez filtr odcedzający komórki o średnicy 70 μm, aby usunąć duże zanieczyszczenia i śluz. Odwirować próbki o masie 300 × g przez 5-10 minut, aby utworzyć osad komórkowy.</li>
	<li>Zebrać supernatant przez aspirację pipetą i umieścić go w czystej probówce w celu analizy interesujących białek.</li>
	<li>Zawiesić osady komórkowe w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) lub preferowanym roztworze do testów komórkowych będących przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>Aby usunąć czerwone krwinki z próbek, wykonaj lizę chlorku amonu i potasu (ACK) w celu zebrania komórek jądrzastych z płukania nosa11,12.</li>
</ol>

<ol><li>Cohn, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+nasal+disease%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin%3A+Small+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Canine nasal disease: An update.</a> Vet Clin: Small Anim Pract. 50 (2), 359-374 (2020).</li>
<li>Mortier, J., Blackwood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+nasal+tumours+in+dogs%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Small+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Treatment of nasal tumours in dogs: A review.</a> J Small Anim Pract. 61 (7), 404-415 (2020).</li>
<li>Plickert, H., Tichy, A., Hirt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+canine+nasal+discharge+related+to+intranasal+diseases%3A+A+retrospective+study+of+105+cases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Small+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Characteristics of canine nasal discharge related to intranasal diseases: A retrospective study of 105 cases.</a> J Small Anim Pract. 55 (3), 145-152 (2014).</li>
<li>Windsor, R. C., Johnson, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+chronic+inflammatory+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Tech+Small+Anim+Practice%22%5BJournal%5D)">Canine chronic inflammatory rhinitis.</a> Clin Tech Small Anim Practice. 21 (2), 76-81 (2006).</li>
<li>Van Pelt, D. R., Mckiernan, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+and+treatment+of+canine+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Small+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis and treatment of canine rhinitis.</a> Vet Clin North Am Small Anim Pract. 24 (5), 789-806 (1994).</li>
<li>Hazuchova, K., Neiger, R., Stengel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+treatment+of+mycotic+rhinitis-rhinosinusitis+in+dogs+with+meticulous+debridement+and+1%25+clotrimazole+cream%3A+64+cases+%282007-2014%29%5BTitle%5D)+AND+%22JAVMA%22%5BJournal%5D)">Topical treatment of mycotic rhinitis-rhinosinusitis in dogs with meticulous debridement and 1% clotrimazole cream: 64 cases (2007-2014).</a> JAVMA. 250 (3), 309-315 (2017).</li>
<li>Lobetti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+lymphoplasmacytic+rhinitis+in+33+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22JS+Afr+Vet+Assoc%22%5BJournal%5D)">Idiopathic lymphoplasmacytic rhinitis in 33 dogs.</a> JS Afr Vet Assoc. 85 (1), 1-5 (2014).</li>
<li>Ashbaugh, E. A., Mckiernan, B. C., Miller, C. J., Powers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+hydropulsion%3A+A+novel+tumor+biopsy+technique%5BTitle%5D)+AND+%22JAAHA%22%5BJournal%5D)">Nasal hydropulsion: A novel tumor biopsy technique.</a> JAAHA. 47 (5), 312-316 (2011).</li>
<li>Wheat, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+immune+and+microbiological+responses+to+mucosal+administration+of+a+liposome-tlr+agonist+immunotherapeutic+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Local immune and microbiological responses to mucosal administration of a liposome-tlr agonist immunotherapeutic in dogs.</a> BMC Vet Res. 15 (1), 330(2019).</li>
<li>Darragh, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elective+nodal+irradiation+mitigates+local+and+systemic+immunity+generated+by+combination+radiation+and+immunotherapy+in+head+and+neck+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Elective nodal irradiation mitigates local and systemic immunity generated by combination radiation and immunotherapy in head and neck tumors.</a> Nat Commun. 13 (1), 7015(2022).</li>
<li>Pinard, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+lymphocyte-specific+programmed+cell+death+protein+1+receptor+expression+and+cytokines+in+blood+and+urine+in+canine+urothelial+carcinoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Comp+Oncol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of lymphocyte-specific programmed cell death protein 1 receptor expression and cytokines in blood and urine in canine urothelial carcinoma patients.</a> Vet Comp Oncol. 20 (2), 427-436 (2022).</li>
<li>Choi, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+canine+pd-1%2Fpd-l1+specific+monoclonal+antibodies+and+amplification+of+canine+t+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of canine pd-1/pd-l1 specific monoclonal antibodies and amplification of canine t cell function.</a> PLoS One. 15 (7), e0235518(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

W protokole płukania nosa składa się kilka krytycznych kroków. W odniesieniu do psa poddawanego zabiegowi płukania nosa, pies musi znajdować się w wystarczająco głębokiej płaszczyźnie znieczulenia, aby nie zareagował na założenie cewnika lub podanie płukania. Jeśli są reaktywne w znieczuleniu, może to pogorszyć jakość i ilość pobranych próbek z płukania, a także potencjalnie zwiększyć ryzyko ostrego uszkodzenia tkanki nosa z powodu miejscowego urazu z cewnika donosowego lub dla psa zasysającego płyn z płukania.
Ułożenie głowy psa ma również kluczowe znaczenie dla optymalnego pobrania próbki z płukania nosa. Jeśli kąt nachylenia głowy w dół jest niewystarczający do zależnego od grawitacji cofania się wkroplonej soli fizjologicznej, płyn z płukania nosa może płynąć doogonowo, a próbka może zostać utracona przez nosogardziel. Dodatkowo podczas zabiegu płukania nosa ważna jest wyraźna komunikacja między osobą A a osobą B. Osoba B może wymagać szybkich korekt w celu umieszczenia rurki do pobierania, ponieważ płyn spływa z nozdrza, podczas gdy osoba A spłukuje; Widoczność płynu płuczącego wpływającego do stożkowej rurki może nie być całkowicie wyraźna zarówno dla osoby A, jak i osoby B podczas zabiegu, dlatego aktywna komunikacja przez cały proces ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego pobrania próbki. Po pobraniu próbki z płukania nosa, jeśli żywotność komórek ma zostać zachowana do przyszłej analizy, bardzo ważne jest, aby komórki były utrzymywane w fizjologicznym roztworze pH, takim jak 0,9% sól fizjologiczna lub 1x PBS.
Protokoły płukania nosa mogą być modyfikowane na wszystkich etapach pobierania i przetwarzania. Podczas pobierania próbki głębokość znieczulenia może być regulowana, aby pies nie zareagował na płukanie nosa. Można to osiągnąć, dostosowując procentową zawartość gazu znieczulającego (np. izofluranu) lub podając bolus krótko działającego dożylnego środka znieczulającego (np. propofolu).
Jeśli po wkropleniu soli fizjologicznej do jamy nosowej w rurce zbiera się tylko niewielka ilość płynu, ustaw głowę psa pod kątem w dół, tak aby wygodnie spoczywała na krawędzi stołu, aby zwiększyć potencjał grawitacji, aby umożliwić odpływ płynu z nosa. Jeśli zauważysz, że płyn spływa z przeciwległego nozdrza, szczelnie zatkaj przeciwległe nozdrze na kolejne płukania. Podczas fazy przetwarzania, jeśli początkowa liczba komórek próbki jest niska, należy ponownie odwirować część sklarowanej próbki w celu zebrania wszelkich dodatkowych komórek, które mogą być obecne w celu zwiększenia całkowitej wydajności.
Istnieją znaczące ograniczenia w stosowaniu metody płukania nosa do analizy mikrośrodowiska immunologicznego nosa u psów. Dzięki tej technice próbki płukania nosa są zbiorem komórek powierzchniowych i białek z jamy nosowej, które można łatwo usunąć. Te komórki powierzchniowe i białka mogą nie być w pełni reprezentatywne dla głębszych tkanek mikrośrodowiska nosa psa. Trwają prace nad porównaniem profili komórkowych i białkowych płukania nosa psów z próbkami biopsji w celu określenia podobieństw i różnic w tych czynnikach między dwiema technikami pobierania próbek z jamy nosowej.
Pomimo tych ograniczeń, technika płukania nosa do pobierania próbek mikrośrodowiska immunologicznego nosa psów stanowi alternatywne podejście do istniejących metod. W porównaniu z biopsją tkanki, a nawet zabiegiem rynoskopii, płukanie nosa jest stosunkowo nieinwazyjne dla psiego pacjenta. Gromadzenie komórek i białek za pomocą płukania nosa w porównaniu z biopsją tkanek zmniejsza ryzyko klinicznie niepokojącego, przedłużającego się lub znacznego ostrego krwotoku; Po zabiegu płukania nosa prawdopodobnie występuje również mniejszy miejscowy stan zapalny i dyskomfort w porównaniu z biopsją tkanki nosa. Z tego powodu płukanie nosa może być wykonywane seryjnie w celu pobrania wielu próbek do analiz w czasie. Ponadto istnieje większa względna łatwość przetwarzania próbek popłuczyn z nosa w porównaniu z próbkami z biopsji tkanek w odniesieniu do oddzielania składnika komórkowego od białek w supernatancie dla dalszych metod laboratoryjnych i testów.
Metoda płukania nosa ma potencjał do ważnych zastosowań w obszarach badawczych związanych z mikrośrodowiskiem immunologicznym. W badaniach nad rakiem zastosowano technikę płukania nosa10 i można ją wykorzystać do udokumentowania seryjnych zmian w mikrośrodowisku jamy nosowej u psów z guzem w stosunku do warunków leczenia; Te próbki z płukania nosa mogą również okazać się cenne w korelowaniu zmian w mikrośrodowisku immunologicznym, aby lepiej zrozumieć reakcje na leczenie raka. Podobne aspekty badania seryjnych zmian w mikrośrodowisku immunologicznym nosa mogą być badane i badane w wielu klinicznych i translacyjnych obszarach badań klinicznych i translacyjnych dotyczących chorób zakaźnych i zapalnych.

U psów rutynowo rozwijają się stany zapalne nosa przez całe życie. Podstawowa przyczyna ostrego lub przewlekłego nieżytu nosa u psów może wahać się od zakaźnego (wirusowego: np. grypy, paragrypy, herpeswirusów; bakteryjnego [np. Bordetella, mykoplazmy], grzybiczego [np. aspergiloza, kryptokokoza]; pasożytniczego [np. Roztocza nosa]) do nowotworowego (np. nowotwory zatok przynosowych, najczęściej histotypy raka lub mięsaka) do ciała obcego (np. ciało obce, donosowa migracja przemieszczonych zębów) do chorób przyzębia, a także idiopatyczny zapalny nieżyt nosa u psów1,2,3,4,5,6,7.
Oprócz badania fizykalnego, stosuje się różne podejścia do oceny stanu jamy zatokowej u psów z zapaleniem nosa. Procedury obrazowania mogą obejmować zdjęcia rentgenowskie (zębowe, czaszki), tomografię komputerową (CT) lub rezonans magnetyczny (MRI). Innym podejściem do obrazowania jamy nosowej jest rynoskopia. Pobieranie próbek tkanek może obejmować pobieranie wymazów z nosa, próbek szczoteczek lub biopsji tkanek, na podstawie których można przeprowadzić ocenę cytologiczną i/lub histopatologiczną, a także pobranie próbki do hodowli grzybów lub bakterii. Próbki te można uzyskać na różne sposoby, od "ślepego" pobierania próbek, po obrazowanie za pomocą rynoskopii lub zaawansowanego obrazowania, i pozyskiwane przez nozdrza, z nosogardzieli lub z chirurgicznym podejściem trepanacji, rynotomii lub sinusotomii.
Płukanie nosa, które polega na podawaniu sterylnego roztworu soli fizjologicznej do jamy nosowej, było również używane do pobierania próbek z jamy nosowej psów w celach diagnostycznych i terapeutycznych. Alternatywna wersja techniki płukania nosa, która była stosowana w przypadku guzów nosa, jest określana jako hydropulsacja nosa, opisana jako silne płukanie nosa, które może usunąć duże próbki guza w celu oceny diagnostycznej, a także zapewnić ulgę terapeutyczną w celu poprawy objawów klinicznych związanych z rakiem nosa8.
Prezentujemy tutaj kolejną wersję techniki płukania nosa do zamierzonego celu zbierania i analizowania komórek i białek mikrośrodowiska immunologicznego nosa. Dzięki delikatnemu, stosunkowo nieinwazyjnemu podejściu, zoptymalizowaliśmy tę technikę płukania nosa do seryjnego pobierania próbek mikrośrodowiska immunologicznego nosa. W badaniach z udziałem psów z niezapalnymi jamami nosowymi, aktywnym zakażeniem wirusem opryszczki i guzami zatok przynosowych wykazaliśmy przydatność płukania nosa do pobierania i przetwarzania próbek do dalszych zastosowań9,10.
W tym manuskrypcie opisujemy technikę płukania nosa solą fizjologiczną do seryjnego pobierania próbek mikrośrodowiska immunologicznego nosa u psów. Zapewniamy szczegóły protokołu skutecznego pozyskiwania próbki płukania nosa przy minimalnym zakłóceniu tkanek, a następnie przetwarzania próbek do różnych analiz.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml&nbsp; Dętki</td><td>Eppendorf</td><td>05-402</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Pipeta</td><td>VWR</td><td>89079-974</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>20 mL Strzykawki</td><td>VWR</td><td>BD302830</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Probówki stożkowe</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Sitko do komórek</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>8FR Sterylny czerwony gumowy cewnik</td><td>Med Vet International</td><td>50-252-2428</td><td></td></tr><tr><td>ACK Bufor do lizy</td><td>Gibco</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna (0,9%)</td><td>Vetivex</td><td>17033-492-01</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>Numer katalogowy: 10153-838</td><td></td></tr></tbody></table>

płukanie solą fizjologiczną do pobierania próbek mikrośrodowiska immunologicznego nosa u psów

Saline Lavage for Sampling of the Canine Nasal Immune Microenvironment

Ocena lokalnego mikrośrodowiska immunologicznego w jamie nosowej psa może być ważna dla badania prawidłowego stanu tkanek i stanów chorobowych, szczególnie tych związanych z miejscowym stanem zapalnym. Zoptymalizowaliśmy technikę oceny lokalnego mikrośrodowiska immunologicznego nosa psów za pomocą seryjnego płukania nosa. Krótko, gdy psy są pod narkozą i znajdują się w pozycji leżącej mostka, wstępnie podgrzana sterylna sól fizjologiczna jest spłukiwana do chorego nozdrza za pomocą elastycznego cewnika z miękkiej gumy. Przepływ wsteczny płynu jest zbierany do stożkowych rurek i proces ten się powtarza. Płyny zawierające usunięte komórki i białka są łączone, a zebrane próbki płukania nosa są filtrowane przez sitko komórkowe w celu usunięcia dużych zanieczyszczeń i śluzu. Próbki są odwirowywane, a granulki komórek są izolowane do analizy. Po przetworzeniu próbek analizy, które mogą nastąpić po płukaniu nosa, obejmują cytometrię przepływową, analizę transkryptomiczną komórek za pomocą sekwencjonowania RNA masowego lub jednokomórkowego i/lub oznaczanie ilościowe cytokin obecnych w płynie płukanym.

W przypadku zastosowania tej metody płukania nosa zebrana próbka będzie lekko mętna, a po zakręceniu probówką mogą być widoczne fragmenty debris komórkowego i śluzu. Próbkę uzna się za zanieczyszczoną krwią obwodową, jeśli procedura płukania nieumyślnie wywoła krwawienie, a próbka nabierze czerwonego zabarwienia. Choć część wprowadzonej soli fizjologicznej zostanie utracona podczas procedury, płukanie uzna się za negatywne, jeśli wprowadzona sól fizjologiczna nie wypłynie z nozdrza do probówki; potencjalnymi przyczynami mogą być: niewystarczające pochylenie głowy w dół, co uniemożliwia skuteczny odpływ, odprowadzenie próbki w kierunku gorszym lub bocznym przez przeciwległe nozdrze, lub niedokładne przymocowanie czerwonego gumowego cewnika do strzykawki, co spowodowało wyciek soli fizjologicznej w miejscu połączenia.
W przypadku pomyślnego pobrania próbek płukania jamy nosowej od psów z rakiem nosa, oczekiwaną liczba komórek zjądrzowych mieści się w zakresie 1 × 106-200 × 106, przy 75-96% żywych komórek. Z kolei w przypadku pomyślnego pobrania próbek od psów ze zdrowymi, nieobjętymi stanem zapalnym jamami nosowymi, liczba komórek mieściła się w zakresie 7 × 105-2 × 106, przy 6-16% żywych komórek. Reprezentatywny obraz preparatów cytologicznych uzyskanych z płukania jamy nosowej u psów z nowotworem przedstawiono na Ryc. 2. Dodatkowo na Ryc. 3 zaprezentowano analizę cytometryczną populacji komórkowych z próbek płukania jamy nosowej zdrowych psów oraz psów z nowotworem. Można przypuszczać, że liczba komórek i procent żywotności niższe od powyższych zakresów wskazują na niepowodzenie procedury płukania jamy nosowej i pobrania próbki. W Tabeli 1 podsumowano wyniki techniki płukania jamy nosowej przeprowadzonej przez autorów w odniesieniu do liczby wykonanych procedur, liczby psów, stanu jamy nosowej (zdrowa lub z nowotworem), uzyskaną liczbę komórek zjądrzowych, żywotność komórek uzyskanych w procedurze oraz informację, czy próbka z płukania została uznana za sukces czy porażkę w kontekście dalszych analiz. Na potrzeby eksperymentów przeprowadzonych z próbkami płukania jamy nosowej ujętymi w Tabeli 1, za pomyślne pobranie próbki uznano uzyskanie minimum 150 000 komórek.
W tej technice płukania jam nosowych do pobierania komórek stosuje się sterylną 0,9% sól fizjologiczną. Alternatywnie można rozważyć zastosowanie roztworu Hartmanna (mleczanowego roztworu Ringera); jednak próbki pobrane zarówno solą fizjologiczną, jak i roztworem Hartmanna powinny zostać przetestowane w celu zapewnienia porównywalnej żywotności i wyników dla analizowanych komórek. Ponadto, w przypadku psów bez nowotworów, alternatywą dla zastosowania czerwonego gumowego cewnika może być wykonanie płukania jam nosowych za pomocą cewnika Foleya. Choć nie zastosowano go w prezentowanej tutaj technice, użycie cewnika Foleya pozwoliłoby na nadmuchanie balonika na końcu cewnika, co spowodowałoby zamknięcie jamy nosowej i zapobiegło utracie płynu w kierunku ogonowym. Można również rozważyć dodanie hialuronidazy do próbki z płukania jam nosowych w celu rozbicia zgromadzonego śluzu i uwolnienia większej liczby komórek do analizy, choć nie zostało to przetestowane w prezentowanym tutaj podejściu do przetwarzania próbek. Metoda ta musiałaby zostać zoptymalizowana, aby upewnić się, że dodatek hialuronidazy do procedury przetwarzania nie wpływa na wyniki.
Opublikowane wyniki uzyskane z pomyślnie przeprowadzonych procedur płukania nosa u psów uczestniczących w badaniu klinicznym nad rakiem u psów przedstawiono na Rysunku 310. Wyniki przedstawione na Rysunku 3 pochodzą z badania nad wpływem wybiórczego napromieniowania węzłów chłonnych na lokalne mikrośrodowisko odpornościowe u psów z guzami nosowo-zatokowymi, których guzy były naświetlane albo samodzielnie, albo w połączeniu z napromieniowaniem regionalnych węzłów chłonnych szyjnych. Dzięki seryjnemu pobieraniu próbek z jamy nosowej psów w badaniu klinicznym za pomocą płukania nosa, analiza cytometryczna przepływowa zebranych komórek wykazała istotny spadek populacji efektorowych limfocytów T w ostatnim dniu radioterapii w przypadku jednoczesnego napromieniowania regionalnych węzłów chłonnych i guza nosowo-zatokowego, w porównaniu z psami, które otrzymały radioterapię celowaną w guza, podczas gdy regionalne węzły chłonne zostały oszczędzone. Dowodzi to użyteczności seryjnego pobierania próbek z jamy nosowej metodą płukania w celu badania zmian w populacjach komórkowych w różnych punktach czasowych i przy różnych warunkach leczenia.
<img alt="Schemat pobierania śliny psiej, przy użyciu strzykawki i probówki, do badań nad analizą biomarkerów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67577/67577fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat metody płukania nosa.Podgrzana, sterylna sól fizjologiczna jest wprowadzana do jamy nosowej znieczulonych psów za pomocą czerwonego gumowego cewnika. Płyn do płukania nosa jest zbierany do probówki podczas wypływania z nosa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67577/67577fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Morfologia komórek na obrazie mikroskopowym; badanie cytologiczne; wizualizacja barwionych komórek; analiza diagnostyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67577/67577fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Skład komórkowy próbki z płukania nosa pobranej od psa z guzem nosa. Reprezentatywny obraz preparatów cytologicznych uzyskanych z pobrania materiału metodą płukania nosa (powiększenie 500x, barwienie zmodyfikowaną metodą Wrighta-Giemsy). Dominującymi komórkami są neutrofile (strzałki), przy obecności kilku płaskich komórek nabłonkowych (grot strzałki) oraz małych dojrzałych limfocytów (wyróżnionych w kwadracie). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67577/67577fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy procentowego udziału żywych komórek; porównanie wyjściowe psów zdrowych i psów z rakiem nosogardzielnym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67577/67577fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3Analiza cytometryczna próbek płukania jam nosowych pobranych od zdrowych psów oraz psów z nowotworami. Porównanie liczebności żywych komórek, komórek odpornościowych oraz neutrofili u zdrowych psów (kolor niebieski, n = 3) i psów z nowotworem w obrębie jam nosowych i zatok (kolor czerwony, n = 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67577/67577fig3v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres komórek T CD5 przedstawiający dane dla komórek CD5+CD4+ oraz CD5+CD8+ przed i po radioterapii (RT)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67577/67577fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Analiza cytometryczna przepływowa komórek pobranych z płukania nosa u psów uczestniczących w badaniu klinicznym sprawdzającym wpływ selektywnego napromieniania węzłów chłonnych (ENI) na lokalne mikrośrodowisko odpornościowe.Ilościowe oznaczenie limfocytów T CD4 (CD5+CD4+) i CD8 (CD5+CD8+) z próbek płukania nosa. Psy leczone za pomocą ENI równolegle z napromienianiem guza (n = 3) wykazały znacząco zredukowaną liczbę efektorowych limfocytów T CD4 i CD8 w ostatnim dniu napromieniania (Dzień 3) w porównaniu z psami leczonymi wyłącznie napromienianiem celowanym w guz (n = 3). Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Darragh et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67577/67577fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Zdrowi (n=3)</td>
			<td>z nowotworem (n= 19)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba wykonanych procedur</td>
			<td>3</td>
			<td>80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba komórek</td>
			<td>0,7 x 106 - 2,8 x 106</td>
			<td>1,6 x 106 - 210 x 106; mediana: 8,7 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Żywotność komórek</td>
			<td>6.3 - 15.9%</td>
			<td>75% – 96%; mediana: 87%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wskaźnik sukcesu</td>
			<td>100%</td>
			<td>98.80%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Podsumowanie przeprowadzonych procedur płukania nosa oraz charakterystyki komórkowej uzyskanych próbek.

Płukanie nosa solą fizjologiczną może być użyte do pobrania próbek mikrośrodowiska immunologicznego nosa psa. Ponieważ podejście to jest stosunkowo nieinwazyjne i nie narusza tkanek nosa, można je wykonywać seryjnie. Komórki i białka pobrane z techniki płukania nosa mogą być przetwarzane do różnych analiz laboratoryjnych.

Płukanie solą fizjologiczną do pobierania próbek mikrośrodowiska immunologicznego nosa u psów

Evaluating the local immune microenvironment of the canine nasal cavity can be important for investigating normal tissue health and disease conditions, ...

Badamy odpowiedzi immunologiczne związane z radioterapią i psami z guzami nosa. Próbujemy zrozumieć, w jaki sposób możemy poprawić wyniki leczenia radioterapią u pacjentów z rakiem poprzez modulację układu odpornościowego. Zmiany w mikrośrodowisku immunologicznym mogą być ważne w badaniu efektów leczenia. Dlatego pożądana jest seryjna analiza komórek mikrośrodowiska. Jednak pobieranie próbek tkanek jamy nosowej przy wielokrotnych biopsjach może być trudne ze względu na złożoną anatomię i skłonność błony śluzowej do krwawień.Technika płukania nosa solą fizjologiczną umożliwia seryjne pobieranie próbek mikrośrodowiska immunologicznego jamy nosowej przy minimalnym rozerwaniu tkanek. Komórki i białka zebrane techniką płukania nosa mogą być analizowane za pomocą różnych testów w celu zbadania stanu mikrośrodowiska immunologicznego nosa w czasie.Dzień przed zabiegiem należy napełnić 520 mililitrowe strzykawki sterylną solą fizjologiczną. Szczelnie zakręć strzykawki i umieść je w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby ogrzały się przez noc. Następnie umieść znieczulonego psa na zewnątrz leżącego na stole zabiegowym. Dostosuj głowę psa tak, aby była pochylona w dół, naturalnie i wygodnie od krawędzi stołu, aby ułatwić optymalne pobieranie próbki z płukania nosa. Napompuj mankiet rurki dotchawiczej, aby zapewnić szczelne uszczelnienie dróg oddechowych. W przypadku płukania nosa wytnij u podstawy osiem francuskich sterylnych czerwonych gumowych cewników, aby ściśle przylegały do jednej z ampułkolitrowych strzykawek o pojemności 20 mililitrów zawierających ciepłą sól fizjologiczną. Za pomocą markera permanentnego zaznacz koniec podstawy cewnika, aby wskazać punkt początkowy przy wejściu do nozdrza. Upewnij się, że z góry określona długość rozciąga się donosowo z końcówką umieszczoną w żądanym miejscu. Następnie odetnij końcówkę cewnika, aby dopasować ją do określonej długości cewnika donosowego, upewniając się, że wyląduje on w odpowiednim miejscu w jamie nosowej. Aby wykonać zabieg płukania nosa, wyznacz jedną osobę do wprowadzenia cewnika do jamy nosowej i podania go, a drugą osobę do pobrania próbki w miarę jej opuszczania nosa. Ustaw jedną osobę przed i pod głową psa, w rękawiczkach. Delikatnie wprowadź czerwony gumowy cewnik do przyśrodkowej części jamy nosowej, aż znak na cewniku zrówna się z wejściem do nozdrza. W tym samym czasie druga osoba trzyma 50-mililitrową stożkową rurkę poniżej nozdrza z założonym cewnikiem. Jedną ręką delikatnie zatkaj przeciwległe nozdrze. Rozpocznij wlewanie soli fizjologicznej do jamy nosowej powolnym, stałym ciśnieniem lub naparem pulsacyjnym, utrzymując głowę psa pod kątem skierowanym w dół. Zbierz płyn odpływowy do 50-mililitrowej stożkowej rurki umieszczonej poniżej nozdrza. Po zabiegu pozwól psu dojść do siebie po znieczuleniu, trzymając go na zewnątrz w pozycji leżącej z głową skierowaną w dół. Teraz zapisz całkowitą objętość zebranego płynu z płukania nosa w stosunku do całkowitej ilości podanej soli fizjologicznej. Aby przetworzyć próbkę, delikatnie zwiruj lub pipetuj próbki płukania nosa w stożkowych rurkach, aby rozbić grudki gruzu i komórek. Przepuść zebrane próbki przez filtr komórkowy o średnicy 70 mikrometrów, aby usunąć duże zanieczyszczenia ze śluzu. Odwirować przefiltrowane próbki o stężeniu 300 G przez pięć do 10 minut, aby utworzyć osad komórkowy. Za pomocą pipety ostrożnie odessać supernatant z próbek wirówki. Umieścić supernatant w czystej probówce w celu dalszej analizy białka. Na koniec ponownie zawiesić granulki komórek w PBS lub preferowanym roztworze do testów komórkowych będących przedmiotem zainteresowania.

saline-lavage-for-sampling-of-the-canine-nasal-immune-microenvironment

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisujemy technikę badawczą bronchoskopii światłowodowej i płukania oskrzelowo-pęcherzykowego za pomocą odsysania niskociśnieniowego. Technika ta służy do pobierania komórek odpornościowych z powierzchni oskrzelowo-pęcherzykowych płuc. Stosuje się znieczulenie miejscowe i łagodną świadomą sedację (midazolam). Badani dobrze tolerują zabieg i odczuwają minimalne skutki uboczne.

płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL) do badań; Uzyskanie odpowiedniej wydajności próbki

Opisano metodę podawania leków drogą donosową u czuwających myszy w celu ukierunkowania ich działania na mózg. Metoda ta umożliwia wielokrotne dawkowanie w długich okresach poprzez podawanie leku donosowo bez znieczulenia, zapewniając transport z nosa do mózgu przy minimalnej ekspozycji systemowej.

Podawanie terapeutyków OUN drogą donosową u czuwających myszy

Ten film demonstruje użycie cytometrii przepływowej do identyfikacji i liczenia różnych komórek odpornościowych w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego. Początkowo pojedyncze komórki odpornościowe są identyfikowane za pomocą barwnika żywotności, a następnie następuje różnicowe barwienie powierzchniowych białek markerowych, co umożliwia precyzyjne wyliczenie każdego typu komórek.

Identyfikacja i liczenie komórek odpornościowych w płynie płucnym oskrzelowo-pęcherzykowym metodą cytometrii przepływowej

Opisano kolonizację mysiego nosogardzieli Streptococcus pneumoniae i późniejszą ekstrakcję przylegających lub zrekrutowanych komórek. Technika ta polega na przepłukiwaniu nosogardzieli i zbieraniu płynu przez nozdrza i można ją dostosować do różnych odczytów, w tym różnicowej kwantyfikacji komórek i analizy ekspresji mRNA in situ.

Charakterystyka reakcji zapalnych podczas kolonizacji donosowej Streptococcus pneumoniae

Ten artykuł opisuje techniki bronchoskopowe w płucach bydlęcych w warunkach eksperymentalnych, tj. inokulację pod kontrolą bronchoskopową, płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe, szczotkowanie oskrzeli i przezoskrzelową biopsję płuc.

Płuca bydlęce w badaniach biomedycznych: bronchoskopia sterowana wizualnie, inokulacja dooskrzelowa i techniki pobierania próbek in vivo

Obecna praca ilustruje wygodę stosowania immunoterapii podjęzykowej w celu wzmocnienia wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w płucach i zapewnienia ochrony przed ostrym pneumokokowym zapaleniem płuc u myszy.

Immunoterapia podjęzykowa jako alternatywa dla indukowania ochrony przed ostrymi infekcjami dróg oddechowych

Stan zdrowia płuc jest odzwierciedlony przez typ i liczbę komórek odpornościowych, które są obecne w oskrzelikach płuc. Opisujemy technikę płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, która umożliwia izolację i badanie nieprzylegających komórek i rozpuszczalnych czynników z dolnych dróg oddechowych myszy.

Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe płuc myszy w celu analizy nacieku komórek zapalnych

Ten protokół opisuje nieinwazyjną technikę pobierania próbek nienaruszonego płynu z błony śluzowej z górnych dróg oddechowych. Może być stosowany do ilościowego oznaczania in vivo poziomów mediatorów białkowych, takich jak cytokiny i chemokiny, u osób w każdym wieku.

Nieinwazyjne pobieranie próbek płynu wyściełającego błonę śluzową w celu ilościowego określenia in vivo poziomów mediatorów immunologicznych w górnych drogach oddechowych

Ten manuskrypt opisuje użycie technik wchłaniania przez nos i oskrzela, w szczególności przy użyciu syntetycznych matryc absorpcyjnych (SAM) do pobierania próbek płynu wyściełającego błonę śluzową (MLF) górnych i dolnych dróg oddechowych. Metody te zapewniają lepszą standaryzację i tolerancję niż istniejące techniki pobierania próbek z układu oddechowego.

Absorpcja płynów z nosa i oskrzeli: precyzyjne pobieranie próbek z błony śluzowej układu oddechowego człowieka i laboratoryjne przetwarzanie próbek

Obecny protokół opisuje nowatorską metodę unikania zanieczyszczenia krwi mysim płynem do płukania nosa (NLF). Ponieważ metoda ta zapewnia pobranie NLF bez zanieczyszczenia krwi, pozwala na dokładniejsze wykrywanie składników immunologicznych i różnych patogenów układu oddechowego.

Pobieranie płynu do płukania nosa dla myszy bez zanieczyszczenia krwi

Naucz się techniki płukania solą fizjologiczną do pobierania próbek mikrośrodowiska immunologicznego nosa u psów z nowotworami. Ta nieinwazyjna metoda umożliwia seryjną analizę odpowiedzi immunologicznych podczas radioterapii.

Płukanie solą fizjologiczną do pobierania próbek mikrośrodowiska immunologicznego nosa u psów

Przeglądaj więcej filmów