Name: Ocena glutaminy jako źródła paliwa dla makrofagów pęcherzykowych narażonych na przewlekłe działanie etanolu przy użyciu bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj metodę oceny mitochondrialnej respiracji makrofagów pęcherzykowych przy użyciu bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Badanie wyjaśnia rolę glutaminy w metabolizmie komórek narażonych na przewlekłe działanie etanolu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Doceniamy wkład Sarah S. Chang, BS, w początkową hodowlę komórkową i przygotowanie komórek MH-S do eksperymentów. Prace te były wspierane przez NIAAA R01-AA026086 do SMY (ORCID: 0000-0001-9309-0233), NIAAA F31-F31AA029938 do KMC oraz NIGMS T32-GM008602 do Randy'ego Halla, Wydziału Farmakologii i Biologii Chemicznej, Emory University. Treść niniejszego raportu nie odzwierciedla poglądów Departamentu ds. Weteranów ani rządu Stanów Zjednoczonych.

Ethanol Impairs AM Bioenergetics by Shifting to Glutamine-Dependent Respiration

<ol><li>2021 National Survey on Drug Use and Health (NSDUH). Table 5.6A - Alcohol Use Disorder in Past Year: Among People Aged 12 or Older; by Age Group and Demographic Characteristics, Numbers in Thousands, 2021. , Substance Abuse and Mental Health Services Administration (SAMHSA). At
 <a target="_blank" href="https://www.samhsa.gov/data/sites/default/files/reports/rpt39441/NSDUHDetailedTabs2021/NSDUHDetailedTabs2021/NSDUHDetTabsSect5pe2021.htm">https://www.samhsa.gov/data/sites/default/files/reports/rpt39441/NSDUHDetailedTabs2021/NSDUHDetailedTabs2021/NSDUHDetTabsSect5pe2021.htm</a> (2021).</li>
<li>Everts, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+pneumonia+in+adult+general+medical+and+surgical+patients+at+Christchurch+Hospital%5BTitle%5D)+AND+%22N+Z+Med+J%22%5BJournal%5D)">Nosocomial pneumonia in adult general medical and surgical patients at Christchurch Hospital.</a> N Z Med J. 113 (1111), 221-224 (2000).</li>
<li>de Roux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+alcohol+abuse+in+the+etiology+and+severity+of+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Impact of alcohol abuse in the etiology and severity of community-acquired pneumonia.</a> Chest. 129 (5), 1219-1225 (2006).</li>
<li>Moss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+sepsis%3A+race%2C+sex%2C+and+chronic+alcohol+abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of sepsis: race, sex, and chronic alcohol abuse.</a> Clin Infect Dis. 41 (Suppl 7), S490-S497 (2005).</li>
<li>Fernandez-Sola, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+alcohol+intake+as+a+risk+and+prognostic+factor+for+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">High alcohol intake as a risk and prognostic factor for community-acquired pneumonia.</a> Arch Intern Med. 155 (15), 1649-1654 (1995).</li>
<li>Yeligar, S. M., Harris, F. L., Hart, C. M., Brown, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+attenuates+ethanol-induced+alveolar+macrophage+oxidative+stress+and+dysfunction+by+downregulating+NADPH+oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glutathione attenuates ethanol-induced alveolar macrophage oxidative stress and dysfunction by downregulating NADPH oxidases.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306 (5), L429-L441 (2014).</li>
<li>Yeligar, S. M., Mehta, A. J., Harris, F. L., Brown, L. A., Hart, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+regulates+chronic+alcohol-induced+alveolar+macrophage+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor gamma regulates chronic alcohol-induced alveolar macrophage dysfunction.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 55 (1), 35-46 (2016).</li>
<li>Liang, Y., Harris, F. L., Brown, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+induced+mitochondrial+oxidative+stress+and+alveolar+macrophage+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Alcohol induced mitochondrial oxidative stress and alveolar macrophage dysfunction.</a> Biomed Res Int. 2014, 371593(2014).</li>
<li>Liang, Y., Harris, F. L., Jones, D. P., Brown, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+induces+mitochondrial+redox+imbalance+in+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Alcohol induces mitochondrial redox imbalance in alveolar macrophages.</a> Free Radic Biol Med. 65, 1427-1434 (2013).</li>
<li>Morris, N. L., Harris, F. L., Brown, L. A. S., Yeligar, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+induces+mitochondrial+derangements+in+alveolar+macrophages+by+upregulating+NADPH+oxidase+4%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Alcohol induces mitochondrial derangements in alveolar macrophages by upregulating NADPH oxidase 4.</a> Alcohol. 90, 27-38 (2021).</li>
<li>Crotty, K. M., Kabir, S. A., Chang, S. S., Mehta, A. J., Yeligar, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pioglitazone+reverses+alcohol-induced+alterations+in+alveolar+macrophage+mitochondrial+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Pioglitazone reverses alcohol-induced alterations in alveolar macrophage mitochondrial phenotype.</a> Alcohol Clin Exp Res (Hoboken). 48 (5), 810-826 (2024).</li>
<li>Demine, S., Renard, P., Arnould, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+uncoupling%3A+A+key+controller+of+biological+processes+in+physiology+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial uncoupling: A key controller of biological processes in physiology and diseases.</a> Cells. 8 (8), 795(2019).</li>
<li>Hill, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+cellular+bioenergetics+with+mitochondrial+quality+control+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy.</a> Biol Chem. 393 (12), 1485-1512 (2012).</li>
<li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bioenergetic+Health+Index%3A+a+new+concept+in+mitochondrial+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Sci+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">The Bioenergetic Health Index: a new concept in mitochondrial translational research.</a> Clin Sci (Lond). 127 (6), 367-373 (2014).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+mitochondrial+respiration+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+myeloid+progenitors+using+Seahorse+technology%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analyzing mitochondrial respiration of human induced pluripotent stem cell-derived myeloid progenitors using Seahorse technology.</a> STAR Protoc. 4 (1), 102073(2023).</li>
<li>Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+respiration+in+adherent+cells+by+Seahorse+XF96+Cell+Mito+Stress+Test%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test.</a> STAR Protoc. 2 (1), 100245(2021).</li>
<li>Plitzko, B., Loesgen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oxygen+consumption+rate+%28OCR%29+and+extracellular+acidification+rate+%28ECAR%29+in+culture+cells+for+assessment+of+the+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism.</a> Bio Protoc. 8 (10), e2850(2018).</li>
<li>Winnica, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+differences+in+the+airway+epithelium+of+lean+versus+obese+asthmatics+are+driven+by+nitric+oxide+and+reflected+in+circulating+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic differences in the airway epithelium of lean versus obese asthmatics are driven by nitric oxide and reflected in circulating platelets.</a> Antioxid Redox Signal. 31 (10), 673-686 (2019).</li>
<li>Nickens, K. P., Wikstrom, J. D., Shirihai, O. S., Patierno, S. R., Ceryak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioenergetic+profile+of+non-transformed+fibroblasts+uncovers+a+link+between+death-resistance+and+enhanced+spare+respiratory+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">A bioenergetic profile of non-transformed fibroblasts uncovers a link between death-resistance and enhanced spare respiratory capacity.</a> Mitochondrion. 13 (6), 662-667 (2013).</li>
<li>Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+related+bioenergetics+profiles+in+isolated+rat+cardiomyocytes+using+extracellular+flux+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Age related bioenergetics profiles in isolated rat cardiomyocytes using extracellular flux analyses.</a> PLoS One. 11 (2), e0149002(2016).</li>
<li>Dranka, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+bioenergetic+function+in+response+to+oxidative+stress+by+metabolic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling.</a> Free Radic Biol Med. 51 (9), 1621-1635 (2011).</li>
<li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets%2C+lymphocytes%2C+monocytes%2C+and+neutrophils%2C+and+the+oxidative+burst+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).</li>
<li>Tyrrell, D. J., Bharadwaj, M. S., Jorgensen, M. J., Register, T. C., Molina, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+cell+respirometry+is+associated+with+skeletal+and+cardiac+muscle+bioenergetics%3A+Implications+for+a+minimally+invasive+biomarker+of+mitochondrial+health%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Blood cell respirometry is associated with skeletal and cardiac muscle bioenergetics: Implications for a minimally invasive biomarker of mitochondrial health.</a> Redox Biol. 10, 65-77 (2016).</li>
<li>Shah-Simpson, S., Pereira, C. F., Dumoulin, P. C., Caradonna, K. L., Burleigh, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profiling+of+Trypanosoma+cruzi+life+stages+using+Seahorse+extracellular+flux+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profiling of Trypanosoma cruzi life stages using Seahorse extracellular flux technology.</a> Mol Biochem Parasitol. 208 (2), 91-95 (2016).</li>
<li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J Vis Exp. 46, e2511(2010).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+I.+Kinetics+of+oxygen+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization.</a> J Biol Chem. 217 (1), 383-393 (1955).</li>
<li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Anal Chem. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li>
<li>Yeligar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARgamma+regulates+mitochondrial+structure+and+function+and+human+pulmonary+artery+smooth+muscle+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">PPARgamma regulates mitochondrial structure and function and human pulmonary artery smooth muscle cell proliferation.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 58 (5), 648-657 (2018).</li>
<li>Yeligar, S., Tsukamoto, H., Kalra, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-induced+expression+of+ET-1+and+ET-BR+in+liver+sinusoidal+endothelial+cells+and+human+endothelial+cells+involves+hypoxia-inducible+factor-1alpha+and+microrNA-199%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ethanol-induced expression of ET-1 and ET-BR in liver sinusoidal endothelial cells and human endothelial cells involves hypoxia-inducible factor-1alpha and microrNA-199.</a> J Immunol. 183 (8), 5232-5243 (2009).</li>
<li>Yeligar, S. M., Harris, F. L., Brown, L. A. S., Hart, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+reversal+of+post-transcriptional+alterations+implicated+in+alcohol-induced+alveolar+macrophage+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological reversal of post-transcriptional alterations implicated in alcohol-induced alveolar macrophage dysfunction.</a> Alcohol. 106, 30-43 (2023).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy nie mają do zgłoszenia żadnych istotnych finansowych konfliktów interesów.

Dane przedstawione w niniejszym dokumencie są dodatkowymi kontrpróbami biologicznymi dla nieleczonych i przewlekle narażonych na EtOH komórek MH-S poddanych kontroli pożywki lub BPTES, które zostały opublikowane w Crotty et al.11. Opisany protokół służy do oceny zależności komórek MH-S narażonych na EtOH od glutaminy jako źródła paliwa do oddychania mitochondrialnego i bioenergetyki przy użyciu bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, ważne jest tworzenie i zbieganie się komórek MH-S. Komórki MH-S są początkowo hodowane w studzienkach mikrokultur strumienia zewnątrzkomórkowego przy niskiej konfluencji i stosowane, gdy komórki znajdują się w monowarstwie przy końcowej konfluencji 90%. Ponieważ ekspozycja komórek MH-S na EtOH trwała 72 godziny, końcowa konfluencja 90% została osiągnięta przed przebiegiem eksperymentalnym na bioanalizatorze strumienia zewnątrzkomórkowego. Jest to zgodne z innymi doniesieniami o tworzeniu się monowarstw komórkowych i 90%-100% konfluencji przed przeprowadzeniem tych eksperymentów 15,16,17. Po drugie, krytyczna jest normalizacja wartości oddychania mitochondriów do białka w każdej próbce. Niektóre badania normalizują bioenergetykę mitochondriów do liczby komórek 18,19,20. Jednak strategia seryjnego wstrzykiwania w tym teście ma na celu sekwencyjne obciążanie mitochondriów. W komórkach, które opierają się głównie na fosforylacji oksydacyjnej, takich jak AM, może to prowadzić do śmierci komórki podczas eksperymentu na bioanalizatorze strumienia zewnątrzkomórkowego. W związku z tym liczba komórek może nie być spójna od początku eksperymentu do końca przebiegu eksperymentalnego, a normalizacja wartości oddychania mitochondrialnego do białka jest optymalna21,22. W tym miejscu sugerowany jest współczynnik normalizacji białka wykorzystujący średnie białko we wszystkich dołkach w celu uzyskania dokładniejszych profili OCR specyficznych dla komórki. Po trzecie, kluczowe znaczenie ma analiza wyników dotyczących replik biologicznych. Czasami prezentowane są reprezentatywne obrazy mitochondrialnych profili bioenergetycznych22,23, a nie przeciętnego oddychania mitochondrialnego w wielu powtórzeniach biologicznych 10,11,24. Jednak te reprezentatywne obrazy nie dają pełnego obrazu różnic między eksperymentami. Obliczając każdą kontrpróbę biologiczną oddzielnie, błąd standardowy średniej może pokazać zmienność średnich wartości oddychania mitochondrialnego we wszystkich kontrpróbach biologicznych i być wykorzystany do obliczenia różnic statystycznych między mitochondrialnymi profilami bioenergetycznymi.
Przed przeprowadzeniem testu na bioanalizatorze strumienia zewnątrzkomórkowego należało określić optymalną gęstość komórek MH-S do hodowli na płytce mikrokultury strumienia zewnątrzkomórkowego w celu uzyskania monowarstwy komórek w każdym dołku. Ponieważ konieczne było również ustalenie odpowiednich stężeń Oligo i FCCP dla komórek MH-S, przeprowadzono badania różnych gęstości komórek MH-S z seryjnymi rozcieńczeniami Oligo i FCCP21,25. Początkowa hodowla 10 000-15 000 komórek MH-S spowodowała uzyskanie monowarstwy komórek o 90% zbiegu po 72 godzinach ekspozycji z EtOH10 i bez niego. Na podstawie tych eksperymentów optymalizacyjnych określono 2 μM Oligo i 0,5 μM FCCP jako minimalne stężenia tych odczynników, które spowodowały zmiany w oddychaniu mitochondrialnym10.
Pomiary oddychania mitochondrialnego w czasie rzeczywistym na początku badania i po leczeniu BPTES, inhibitorem glutaminazy 1, który zapobiega enzymatycznej konwersji glutaminy do glutaminianu, są wykorzystywane do określenia zależności od glutaminy w oddychaniu podstawowym w komórkach MH-S narażonych na Cons- i EtOH. Ograniczeniem danych przedstawionych w tym badaniu jest to, że nie zbadano roli krótko- i średniołańcuchowych kwasów tłuszczowych jako źródeł paliwa dla oddychania mitochondrialnego i bioenergetyki, oprócz glutaminy w komórkach MH-S narażonych na EtOH. Wyniki poprzedniego badania przeprowadzonego przez Crotty'ego i wsp.11 sugerowały, że komórki EtOH MH-S wykazywały przejście od oddychania zależnego od pirogronianu w kierunku oddychania zależnego od glutaminy bez pełnej kompensacji utraty całkowitego oddychania mitochondrialnego. Ponadto, przeprowadzając ten sam eksperyment z połączonym wstrzyknięciem UK5099 (inhibitor utleniania pirogronianu) i etomosiru (inhibitor utleniania długołańcuchowych kwasów tłuszczowych), można określić udział glutaminy przy braku zarówno pirogronianu, jak i kwasów tłuszczowych jako źródeł paliwa dla oddychania mitochondrialnego w komórkach MH-S narażonych na działanie EtOH.
Oddychanie mitochondrialne jest mierzone za pomocą elektrody Clarka od prawie siedemdziesięciu lat26, a istnieją również testy fluorescencyjne na płytkach do pomiaru oddychania mitochondrialnego27. Metody te są jednak znacznie bardziej czasochłonne i/lub brakuje im czułości pomiarów, które można uzyskać za pomocą bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Zaletą stosowania bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do oceny glutaminy jako źródła paliwa dla oddychania mitochondrialnego i bioenergetyki jest to, że eksperymenty z wieloma kontrpróbami biologicznymi mogą być prowadzone w tym samym czasie. Dodatkowo, bioanalizator strumienia zewnątrzkomórkowego pozwala na elastyczność eksperymentowania na izolowanych mitochondriach lub nienaruszonych komórkach. W przypadku komórek, które nie mają wysokiego stężenia mitochondriów, takich jak komórki mięśni gładkich tętnicy płucnej, wyizolowanie wystarczającej liczby mitochondriów z ograniczonych próbek jest trudne. Za pomocą bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego można zmierzyć oddychanie mitochondrialne w nienaruszonych komórkach mięśni gładkich tętnicy płucnej28 lub pierwotnych mysich AM10,11. Protokół zastosowany w tym badaniu może być wykorzystany do oceny glutaminy jako źródła paliwa dla oddychania mitochondrialnego i bioenergetyki innych próbek o ograniczonej wielkości próby, takich jak pierwotne ludzkie AM. Wcześniej wykazaliśmy, że stres oksydacyjny i zaburzenia wywołane przez EtOH pochodzenia mitochondrialnego w komórkach MH-S wykazują podobny profil dysregulacji mitochondrialnej w pierwotnych myszach AM i ludzkich AM 6,7,11,28,29,30. Podsumowując, badania przemawiają za stosowaniem tej metody oceny glutaminy jako źródła paliwa dla oddychania mitochondrialnego i bioenergetyki w AM w stanach patologicznych, które charakteryzują się stresem oksydacyjnym pochodzącym z mitochondriów.

Zaburzenie związane z używaniem alkoholu (AUD) dotyka ponad 28 milionów ludzi w Stanach Zjednoczonych1. Osoby z AUD są 2-4 razy bardziej narażone na rozwój infekcji dróg oddechowych2,3, zwiększając ryzyko przedwczesnej zachorowalności i śmiertelności3,4,5. Nadużywanie alkoholu zwiększa podatność na infekcje dróg oddechowych, częściowo poprzez tłumienie funkcji immunologicznych płuc. Makrofagi pęcherzykowe (AM) są pierwszą linią obrony komórkowej przed patogenami w dolnym płucu, gdzie fagocytują i usuwają wdychane drobnoustroje. Jednak przewlekłe spożywanie alkoholu upośledza zdolność AM do pochłaniania i zabijania patogenów6,7.
Funkcje immunologiczne AMs, takie jak fagocytoza, są procesami wymagającymi energii, które wymagają metabolicznie aktywnych szlaków niezbędnych do wytwarzania wysokiego poziomu adenozynotrójfosforanu (ATP). Mitochondrialna fosforylacja oksydacyjna jest najbardziej wydajnym procesem komórkowym do wytwarzania ATP, ale przewlekła ekspozycja na etanol (EtOH) zwiększa stres oksydacyjny pochodzenia mitochondrialnego, co może skutkować dysfunkcją mitochondriów w AMs8,9,10. Oddychanie mitochondrialne mierzone za pomocą wskaźnika zużycia tlenu przez komórki (OCR) można określić ilościowo za pomocą bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym. Do określenia bioenergetyki mitochondriów wykorzystuje się profile oddychania mitochondrialnego oceniane w odpowiedzi na oligomycynę (inhibitor syntazy ATP), cyjanek karbonylu-p-trifluorometoksyfenylohydrazon (FCCP, rozprzęgacz protonów) oraz rotenon/antymycynę A (R/A, odpowiednio inhibitory kompleksu mitochondrialnego I i III). Przewlekłe EtOH zmniejsza bioenergetykę mitochondriów w AMs, o czym świadczy zmniejszone mitochondrialne oddychanie podstawowe, oddychanie sprzężone z ATP, maksymalne oddychanie i zapasowa pojemność oddechowa10.
Komórki mają różne poziomy zależności od źródeł paliw, takich jak pirogronian, glutamina, czy kwasy tłuszczowe, do produkcji ATP. Mają również poziom elastyczności, dzięki któremu mogą przełączać zużycie paliwa w celu regulacji bioenergetyki komórkowej. Glutaminoliza jest kluczowym szlakiem oddychania mitochondrialnego, szczególnie gdy pirogronian jest przetaczany w kierunku produkcji kwasu mlekowego lub gdy kwasy tłuszczowe są niewystarczające. Nasze ostatnie badanie wykazało, że przewlekła ekspozycja na EtOH zwiększa zależność AM od glutaminy i zmniejsza elastyczność AM w korzystaniu z glutaminy i innych źródeł paliwa do oddychania mitochondrialnego11. Wyniki te, wraz z danymi wykazującymi, że leczenie komórek MH-S narażonych na EtOH inhibitorem utleniania pirogronianu UK5099 nie zmieniło bioenergetyki mitochondriów w porównaniu z komórkami MH-S narażonymi na kontrolę pożywki leczonych UK5099, sugerują odejście od oddychania zależnego od pirogronianu w kierunku oddychania zależnego od glutaminy w komórkach EtOH MH-S. Jednak ta zmiana jest niewystarczająca, aby sprostać wymaganiom bioenergetycznym AM11. W niniejszym artykule opisano metody oceny glutaminy jako źródła paliwa do oddychania mitochondrialnego w przewlekłych AM narażonych na EtOH za pomocą bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Protokół ten został stworzony i zoptymalizowany dla formatu 96 dołków (obszar 11,04 mm2) i powinien być dostosowany do większych rozmiarów dołków do hodowli komórkowych. Zależność od glutaminy w bioenergetyce mitochondriów określa się za pomocą siarczku etylu bis-2-(5-fenyloacetamido-1,3,4-tiadiazol-2-ylo) (BPTES, inhibitor glutaminazy 1) w celu selektywnego hamowania enzymatycznej konwersji glutaminy do glutaminianu. Dane przedstawione w tym badaniu są dodatkowymi powtórzeniami biologicznymi dla grup eksperymentalnych traktowanych pożywką kontrolną i BPTES nieleczonej kontrolnej i przewlekłej linii komórkowej myszy AM narażonej na EtOH, komórek MH-S, które są publikowane w Crotty et al.11.

<table><tbody><tr><td>Rurka stożkowa 15 ml&nbsp;</td><td>VWR International, Inc.</td><td>21008-670</td><td>Służy do przygotowywania podstawowych stężeń odczynników związanych z mitochondriami.</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>M6250</td><td>Służy do hodowli komórek MH-S.</td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>Dot Scientific, Inc.</td><td>70-1180</td><td>Służy do skrobania ogniw MH-S z kolb T-75.</td></tr><tr><td>Countess 3 FL Instrument: licznik komórek</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>AMQAF2000</td><td>Służy do liczenia liczby komórek MH-S do płytki do eksperymentów.</td></tr><tr><td>D-glukoza&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>G8270</td><td>Używany do ośrodka bazowego strumienia zewnątrzkomórkowego.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>4355720</td><td>Eksperymentalne leczenie komórek MH-S.</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Sciencell Research Laboratories</td><td>500</td><td>Służy do hodowli komórek MH-S.</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>G1397</td><td>Służy do hodowli komórek MH-S.</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Stosowany do podłoża bazowego strumienia zewnątrzkomórkowego.</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 10.2.3</td><td>GraphPad Software</td><td>N/A</td><td>Oprogramowanie do analizy statystycznej. Do pobrania po zakupie na https://www.graphpad.com/features.</td></tr><tr><td>Komórki MH-S</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego</td><td>CRL-2019</td><td>Linia komórkowa makrofagów pęcherzykowych myszy.</td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek&nbsp;</td><td>Stany Zjednoczone Naukowe, Inc.</td><td>4036-3212</td><td>Służy do przygotowywania stężeń roboczych odczynników związanych z mitochondriami.</td></tr><tr><td>Microsoft 365 Excel: komputerowy arkusz kalkulacyjny</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>Software do organizacji danych i obliczeń bioenergetyki mitochondrialnej. Do pobrania po zakupie na https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel.</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>15140122</td><td>Służy do hodowli komórek MH-S.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>VWR International, Inc.</td><td>45000-446</td><td>Służy do mycia ogniw MH-S.</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>VWR International, Inc.</td><td>45000-396</td><td>Służy do hodowli komórek MH-S.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Seahorse Wave Pro: oprogramowanie komputerowe do projektowania i analizy testów</td><td>firmy Agilent Technologies, Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td>Komputer jest podłączony do urządzenia Seahorse XF Pro Analyzer. Do pobrania z&nbsp; https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/software-download-for-seahorse-wave-pro-software?productURL=https%3A%2F%2Fwww.agilent.com%2Fen%2Fproduct%2Fcell-analysis%2Freal-time-cell-metabolic-analysis%2Fxf-software%2Fseahorse-wave-pro-software-2007523.</td></tr><tr><td>Seahorse XF Base Medium: podłoże bazowe strumienia zewnątrzkomórkowego, pH 7,4</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>103334-100</td><td>Służy do przygotowywania stężeń podstawowych i roboczych odczynników związanych z mitochondriami oraz hodowli komórek MH-S przed seriami doświadczalnymi.</td></tr><tr><td>Seahorse XF Zestaw do testów warunków skrajnych związanych z utlenianiem glutaminy</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>103674-100</td><td>Zawiera zapas BPTES, oligomycynę, FCCP i rotenon/antymycynę A.</td></tr><tr><td>Seahorse XF Pro Analyzer: bioanalizator strumienia zewnątrzkomórkowego</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td>Bioanalizator strumienia zewnątrzkomórkowego.</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak: 96-dołkowe wkłady z zewnątrzkomórkowym topnikiem, 96-dołkowe płytki do mikrohodowli strumienia zewnątrzkomórkowego i roztwór kalibru</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>102416-100</td><td>Służy do przygotowania komórek MH-S do testów przy użyciu bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.</td></tr><tr><td>Pipipeta serologiczna&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-550678</td><td>Służy do usuwania mediów z ogniw MH-S.</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>S6014</td><td>Służy do hodowli komórek MH-S.</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>P4562</td><td>Używany do pożywki bazowej strumienia zewnątrzkomórkowego.</td></tr><tr><td>Kolby T-75</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-200263</td><td>Służy do hodowli komórek MH-S.</td></tr></tbody></table>

ocena glutaminy jako źródła paliwa dla makrofagów pęcherzykowych narażonych na przewlekłe działanie etanolu przy użyciu bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

Assessment of Glutamine as a Fuel Source for Alveolar Macrophages Exposed to Chronic Ethanol Using an Extracellular Flux Bioanalyzer

Makrofagi pęcherzykowe (AM) są pierwszą linią obrony komórkowej w dolnych drogach oddechowych przed patogenami. Jednak przewlekłe i nadmierne spożywanie alkoholu upośledza zdolność AM do fagocytacji i usuwania patogenów z przestrzeni pęcherzykowej, częściowo poprzez rozregulowany metabolizm paliw i bioenergetykę. Nasze wcześniejsze prace wykazały, że przewlekłe spożywanie etanolu (EtOH) upośledza bioenergetykę mitochondriów i zwiększa poziom mleczanu w AM. Co więcej, niedawno wykazaliśmy, że EtOH zwiększa zależność od glutaminy i maksymalne oddychanie zależne od glutaminy, jednocześnie zmniejszając elastyczność, odchodząc od oddychania zależnego od pirogronianu w kierunku oddychania zależnego od glutaminy. Glutaminoliza jest ważną ścieżką kompensacyjną dla oddychania mitochondrialnego, gdy pirogronian jest używany do produkcji kwasu mlekowego lub gdy inne źródła paliwa są niewystarczające. Korzystając z mysiej linii komórkowej AM, komórek MH-S, wystawionych na działanie braku EtOH lub EtOH (0,08%) przez 72 godziny, określiliśmy zależność oddychania mitochondrialnego i bioenergetyki od glutaminy jako źródła paliwa za pomocą bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Pomiary w czasie rzeczywistym przeprowadzono w odpowiedzi na siarczek etylu bis-2-(5-fenyloacetamido-1,3,4-tiadiazol-2-ylo) etylu (BPTES), inhibitor glutaminazy 1, który zapobiega enzymatycznej konwersji glutaminy do glutaminianu, w nośniku pożywki lub w odpowiedzi na sam nośnik, a następnie przeprowadzono badanie stresu mitochondrialnego. Protokół krok po kroku przedstawiony w niniejszym dokumencie opisuje nasze metody i obliczenia do analizy średnich poziomów podstawowego oddychania mitochondrialnego zależnego od glutaminy, mitochondrialnego oddychania związanego z ATP, maksymalnego oddychania mitochondrialnego i wolnej pojemności oddechowej mitochondriów w wielu powtórzeniach biologicznych i eksperymentalnych.

Przewlekła ekspozycja na EtOH zmniejsza zależność komórek MH-S od glutaminy. 
Glutaminoliza jest kluczowym szlakiem oddychania mitochondrialnego, w którym glutamina służy jako istotne źródło paliwa dla bioenergetyki komórkowej. Aby określić, czy przewlekła ekspozycja na EtOH zmienia zależność komórek MH-S od glutaminy jako źródła paliwa dla oddychania mitochondrialnego, komórki MH-S traktowano kontrolnie bez EtOH (Con) lub EtOH, a następnie mierzono OCR w czasie w odpowiedzi na seryjne iniekcje odczynników związanych z oddychaniem mitochondrialnym. Profile bioenergetyczne OCR w odpowiedzi na seryjne iniekcje oligomycyny (inhibitor syntazy ATP), FCCP (odsprzęgacz protonowy) oraz R/A (odpowiednio inhibitory kompleksu I i kompleksu III mitochondriów) są wykorzystywane do obliczenia innych parametrów bioenergetyki mitochondrialnej, takich jak oddychanie powiązane z ATP, oddychanie maksymalne i rezerwowa wydolność oddechowa. Wszystkie przedstawione dane stanowią dodatkowe powtórzenia biologiczne grup eksperymentalnych komórek MH-S Con + media, Con + BPTES oraz EtOH + media, EtOH + BPTES, które zostały opublikowane w pracy Crotty et al.11. Jak pokazano na Ryc. 2A, oligomycyna zmniejszyła OCR z powodu inhibicji kompleksu V, FCCP zwiększył OCR z powodu mitochondrialnego odsprzężenia potencjału błonowego i zależnej od mitochondriów generacji ATP12, a R/A skutecznie zahamował zależny od mitochondriów OCR. Przedstawione profile odpowiedzi bioenergetycznych OCR na seryjne iniekcje są zgodne z instrukcją oceny stresu mitochondrialnego przy użyciu analizatora przepływu zewnątrzkomórkowego13,14.
Po pomiarze bazowego OCR w komórkach MH-S traktowanych kontrolnie (Con) oraz EtOH, wstrzyknięto kontrolne medium lub BPTES, inhibitor glutaminazy 1. Między komórkami MH-S w grupach Con + medium a Con + BPTES oraz EtOH + medium a EtOH + BPTES nie stwierdzono różnic w bioenergetycznych profilach OCR (Rycina 2A). Komórki MH-S w grupie EtOH + BPTES wykazały spadek zależnej od glutaminy respiracji bazowej w porównaniu z grupą Con + BPTES (pomiar #4 w porównaniu z pomiarem #3 na Rycynie 2A i Rycynie 2B), co sugeruje, że EtOH zmniejsza bazowe utlenianie glutaminy w komórkach MH-S, które przyczynia się do respiracji mitochondrialnej. Komórki MH-S w grupie EtOH + BPTES wykazały utratę zależnej od glutaminy respiracji mitochondrialnej sprzężonej z produkcją ATP w porównaniu z grupą Con + BPTES (Rycina 2C). Chociaż komórki MH-S w grupie EtOH + BPTES wykazały mniejszy spadek zależnej od glutaminy respiracji maksymalnej w porównaniu z grupą Con + BPTES (Rycina 2D), to w grupie EtOH + BPTES odnotowano spadek zależnej od glutaminy zapasowej wydolności oddechowej w porównaniu z grupą Con + BPTES (Rycina 2E). Wyniki te sugerują, że komórki MH-S traktowane EtOH mają zdolność do większej zależności od glutaminy w procesach respiracji, na przykład podczas stresu wywołanego przez FCCP, jednak mogą być one niezdolne do realizacji tego procesu ze względu na to, że zwiększony popyt na glutaminę przewyższa jej biodostępność.
<img alt="Metoda analizatora przepływu zewnątrzkomórkowego; hodowla komórek, przygotowanie pożywki, schemat strategii wstrzykiwania; test metaboliczny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67579/67579fig01.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Ogólny przegląd schematu pomiaru mitochondrialnej respiracji i bioenergetyki zależnej od glutaminy w komórkach MH-S, linii makrofagów pęcherzykowych myszy. Monowarstwy komórek MH-S hodowanych w dołkach płytki do mikrokultur przepływu zewnątrzkomórkowego (krok 3.1) inkubowano w podstawowej pożywce do analizy przepływu zewnątrzkomórkowego z dodatkami (krok 3.2) w temperaturze 37°C w inkubatorze bezzwrotowym (bez CO2) z nawilżaniem przez 30 min-1 h (krok 3.4). Podstawową pożywkę do analizy przepływu zewnątrzkomórkowego z dodatkami (krok 3.2) zastosowano jako kontrolę pożywki oraz do rozcieńczenia stężeń roboczych inhibitora utleniania glutaminy BPTES do stężenia końcowego 3 µM, inhibitora kompleksu V mitochondriów oligomycyny (Oligo) do stężenia końcowego 0.5 µM, odsprzęgacza mitochondrialnego karbonylowego cyjanku p-trifluorometoksyfenylohydrazonu (FCCP) do stężenia końcowego 0.5 µM oraz inhibitorów kompleksu I i kompleksu III mitochondriów rotenonu/antmycyny A (R/A) do stężenia końcowego 0.5 µM w portach załadunkowych A-D w górnym kartridżu extracellular flux pak (krok 3.7). Strategia wstrzykiwania obejmująca czasy mieszania, oczekiwania i pomiaru dla serii eksperymentalnej z użyciem analizatora przepływu zewnątrzkomórkowego była następująca: 3 min mieszania, 0 min oczekiwania i 6 pomiarów po 3 min dla portu A (kontrola pożywki lub BPTES); 3 min mieszania, 0 min oczekiwania i 3 pomiary po 3 min dla portu B (Oligo); 3 min mieszania, 6 min oczekiwania i 3 pomiary po 3 min dla portu C (FCCP); oraz 3 min mieszania, 0 min oczekiwania i 3 pomiary po 3 min dla portu D (R/A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67579/67579fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza metabolizmu mitochondrialnego; wykresy OCR i zużycia O2; wpływ BPTES na oddychanie komórkowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67579/67579fig02.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2Przewlekłe podawanie etanolu (EtOH) obniża zależną od glutaminy respirację mitochondrialną w komórkach MH-S, linii komórkowej makrofagów pęcherzykowych myszy. Komórki MH-S pozostawiono nieleczone (Con) lub poddano działaniu EtOH (0,08%, 72 h), a następnie mierzono tempo zużycia tlenu (OCR) w czasie za pomocą bioanalizatora przepływu zewnątrzkomórkowego przed i po iniekcji kontrolnego medium lub inhibitora utleniania glutaminy (GLN) (3 µM BPTES), a następnie seryjnych iniekcji inhibitora kompleksu V mitochondriów (0.5 µM oligomycyny (Oligo), odsprzęgacza mitochondrialnego (0.5 µM cyjanurku karbonylowego p-trifluorometoksyfenylohydrazonu, FCCP), a także inhibitorów kompleksu I i kompleksu III mitochondriów (0.5 µM rotenonu/0.5 µM antymycyny A, R/A). (A) Profile bioenergetyczne OCR wykorzystano do obliczenia zależności od glutaminy (B) oddychanie podstawowe, (C) oddychanie powiązane z ATP, (D) maksymalne oddychanie oraz (E) rezerwowa zdolność oddechowa. Punkty liniowe reprezentują średnie ± SEM (n = 4, #p &lt; 0,05 w porównaniu do Con + media oraz *p &lt; 0,05 w porównaniu z grupą Con + BPTES, jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA z testem post hoc Tukeya). Słupki przedstawiają średnie ± SEM (n = 4, *p &lt; 0,05 w porównaniu z Con + BPTES, test t Studenta t-test). Przedstawione dane stanowią dodatkowe powtórzenia biologiczne dla grup kontrolnych (medium) oraz grup eksperymentalnych traktowanych BPTES w przypadku nieleczonych komórek kontrolnych oraz komórek MH-S eksponowanych na przewlekłe działanie EtOH, które zostały opublikowane w pracy Crotty i wsp.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67579/67579fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Nadużywanie alkoholu osłabia odporność makrofagów pęcherzykowych (AM) z powodu stłumionego oddychania mitochondrialnego i bioenergetyki. Niedawno wykazaliśmy, że ekspozycja na etanol (EtOH) zwiększa zależność od glutaminy w oddychaniu mitochondrialnym u AM. W niniejszym artykule przedstawiono metody określania zastosowania glutaminy do oddychania mitochondrialnego w AM traktowanych EtOH przy użyciu bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

Ocena glutaminy jako źródła paliwa dla makrofagów pęcherzykowych narażonych na przewlekłe działanie etanolu przy użyciu bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

Alveolar macrophages (AMs) are the first line of cellular defense in the lower airway against pathogens. However, chronic and excessive alcohol use ...

W tym badaniu zbadano, w jaki sposób przewlekłe nadużywanie alkoholu wpływa na funkcję immunologiczną makrofagów pęcherzykowych poprzez zmianę metabolizmu mitochondrialnego. Ogólnie rzecz biorąc, nasze badania podkreślają skrzyżowanie spożywania alkoholu, metabolizmu i funkcji immunologicznych, co czyni je istotnymi dla takich dziedzin jak immunologia, farmakologia i zdrowie publiczne. Chociaż spożywanie alkoholu ma znane szkodliwe skutki, specyficzne mechanizmy metaboliczne, a zwłaszcza rola utleniania glutaminy w makrofagach pęcherzykowych, nie są w pełni poznane.Ponadto protokół ten wypełnia lukę metodologiczną, umożliwiając odtwarzalność w przyszłych badaniach. Protokół ten pozwala na pomiary oddychania mitochondrialnego w czasie rzeczywistym wielu kontrprób technicznych i biologicznych. Można go dostosować do innych typów komórek i jest bardziej niezawodny w oznaczaniu funkcji metabolicznej niż inne techniki, które są bardziej czasochłonne lub wymagają większych rozmiarów próbek.Wyniki te wyjaśniają wpływ ekspozycji na etanol na metabolizm glutaminy w makrofagach pęcherzykowych, co może wpłynąć na interwencje terapeutyczne w przyszłych badaniach. Ogólnie rzecz biorąc, spodziewamy się zmiany w kierunku zrozumienia komórkowego metabolizmu glutaminy i innych modeli chorób. Nasze prace koncentrowały się na zrozumieniu, w jaki sposób makrofagi płucne metabolizują źródła paliwa w celu uzyskania energii.Ponieważ makrofagi potrzebują dużo energii do funkcji odpornościowych, takich jak sygnalizacja do innych komórek odpornościowych oraz fagocytoza i usuwanie patogenów, nasze następne kroki skupią się na powiązaniu zmian w metabolizmie energetycznym z funkcją immunologiczną makrofagów. Na początek weź hodowane komórki MHS traktowane etanolem przez 72 godziny i wyhodowane do co najmniej 50% konfluencji w kolbach T75. Utwórz mapę płytową z pięcioma do sześciu powtórzeniami technicznymi dla każdej kontrpróby biologicznej w warunkach kontrolnych i poddanych działaniu etanolu, w tym kontroli pożywek do porównania BPTES.Przepłucz komórki świeżym pożywką lub PBS, aby usunąć zanieczyszczenia i pływające komórki. Następnie dodaj sześć mililitrów pożywki zawierającej surowicę do kolby T75, aby odżywić komórki. Za pomocą skrobaka do komórek oderwać komórki, aż dno kolby będzie czyste.Oddzielić oderwane komórki, pipetując je za pomocą pipety serologicznej lub pipety o pojemności jednego mililitra. Przenieś zawieszone komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki i wiruj przy 200 G przez sześć minut, aby osadzać komórki. Następnie odessać supernatant z osadu z komory wirówki.Dodaj jeden mililitr pożywki do granulki i dokładnie zawieś komórki. Przenieść 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do probówki mikrowirówkowej. Dodaj 10 mikrolitrów błękitu trypanowego i dobrze wymieszaj roztwór.Teraz przenieś 10 mikrolitrów mieszaniny błękitu trypanowego komórkowego na jedną stronę hemocytometru lub licznika komórek, aby policzyć komórki. Oblicz wymagane rozcieńczenie na podstawie liczby potrzebnych studzienek i komórek, korzystając ze wzoru pokazanego tutaj. Następnie nałóż 80 mikrolitrów ponownie zawieszonych komórek do wymaganych studzienek w 96-dołkowej płytce mikrokultury strumienia zewnątrzkomórkowego.Inkubuj komórki przez noc w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, aby umożliwić im przyleganie i równowagę na płytce. Po zabiegu usuń górną część pakietu strumienia zewnątrzkomórkowego i umieść sondowaną część pakietu topnika ekranem do góry na stole. Nałóż 200 mikrolitrów roztworu kalibru strumienia zewnątrzkomórkowego do każdej studzienki w dolnej części wkładu z topnikiem zewnątrzkomórkowym.Zmontuj wkład z topnikiem zewnątrzkomórkowym, ponownie mocując sekcje i owijając go w Parafilm. Umieść wkład w nawilżanym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza lub kąpieli perełkowej bez dwutlenku węgla w celu zrównoważenia. Na koniec włącz komputer z projektem testu i otwórz oprogramowanie analityczne podłączone do instrumentu do bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.Zacznij od sprawdzenia komórek kontrolnych i MHS poddanych działaniu etanolu, aby upewnić się, że są zdrowe i przylegają do monowarstwy pod mikroskopem. Aby przygotować pożywkę bazową strumienia zewnątrzkomórkowego, podwielokrotność 35 mililitrów do 50-mililitrowej probówki. Dodaj po 350 mikrolitrów 100-milimolowego pirogronianu sodu, D-glukozy i GlutaMAX, aby uzyskać stabilność.Podgrzej przygotowany roztwór do 37 stopni Celsjusza. Następnie delikatnie odessać pożywkę wzrostową z płytki mikrokultury strumienia zewnątrzkomórkowego, pozostawiając minimalną pożywkę resztkową bez naruszania komórek. Umyj studzienki do 50 mikrolitrów pożywki bazowej strumienia zewnątrzkomórkowego.Następnie dodaj 180 mikrolitrów pożywki bazowej strumienia zewnątrzkomórkowego do każdej studzienki. Inkubować zewnątrzkomórkową płytkę mikrokultury w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, bez dwutlenku węgla, przez 30 minut do jednej godziny, aby umożliwić równowagę. Dodaj 700 mikrolitrów pożywki bazowej strumienia zewnątrzkomórkowego do probówki BPTES, aby uzyskać 120-milimolowy roztwór podstawowy.Odpipetować roztwór w celu prawidłowego rozpuszczania. Następnie dodaj 630 mikrolitrów pożywki bazowej strumienia zewnątrzkomórkowego do probówki z oligomycyną, aby przygotować 100-milimolowy roztwór podstawowy i dokładnie wymieszaj. Następnie dodaj 720 mikrolitrów pożywki bazowej strumienia zewnątrzkomórkowego do probówki FCCP, aby przygotować 100-milimolowy roztwór podstawowy.Pipetować roztwór w górę i w dół 10 razy, aby prawidłowo rozpuścić związek. Dodaj 540 mikrolitrów pożywki bazowej strumienia zewnątrzkomórkowego do probówki RA, aby przygotować 50-milimolowy roztwór podstawowy i wymieszaj pipetując. Aby przygotować 30-mikromolowy roztwór roboczy BPTES, zmieszaj 1 500 mikrolitrów pożywki bazowej strumienia zewnątrzkomórkowego z 500 mikrolitrami 120-milimolowego roztworu podstawowego BPTES.Wymieszaj 2 520 mikrolitrów pożywki bazowej strumienia zewnątrzkomórkowego z 480 mikrolitrami 100-milimolowego roztworu podstawowego oligomycyny, aby utworzyć 16-milimolowy roztwór roboczy. Następnie przygotuj roztwór roboczy FCCP, mieszając 2 865 mikrolitrów pożywki bazowej uzupełnionej strumieniem zewnątrzkomórkowym ze 135 mikrolitrami 100-milimolowego roztworu podstawowego FCCP. Aby przygotować roztwór roboczy RA, wymieszaj 2 700 mikrolitrów pożywki zasadowej uzupełnionej strumieniem zewnątrzkomórkowym z 300 mikrolitrami 50-milimolowego roztworu podstawowego RA.Załaduj tło, kontrolę pożywki i studzienki zawierające komórki pokazanymi tutaj odczynnikami. Komórki etanolowe i BPTES-MHS wykazywały niższy wskaźnik podstawowego zużycia tlenu zależny od glutaminy i oddychanie mitochondrialne związane z ATP z glutaminy w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Komórki etanolu i BPTES wykazywały mniejszą utratę maksymalnego oddychania i zmniejszoną wolną od glutaminy wolną pojemność oddechową w porównaniu z komórkami kontrolnymi.

assessment-glutamine-as-fuel-source-for-alveolar-macrophages-exposed

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano profilowanie stabilnych izotopów za pomocą analizy chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas w celu badania przepływu metabolitów pośrednich u nicienia Caenorhabditis elegans. Szczegółowo przedstawiono metody oceny wzbogacenia izotopowego w dwutlenku węgla, kwasach organicznych i aminokwasach po ekspozycji na izotopy, zarówno podczas rozwoju na płytkach agarowych, jak i w okresie dorosłości w hodowli ciekłej.

Stabilne profilowanie izotopowe strumieni metabolicznych produktów pośrednich u Caenorhabditis elegans w stadium rozwojowym i dorosłym

Ten protokół zapewnia biochemiczne podejście do pomiaru wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR) pierwotnych komórek białaczkowych za pomocą testu strumienia zewnątrzkomórkowego. Ocena profilu metabolicznego tych komórek pomaga scharakteryzować ich zapotrzebowanie, co prowadzi do spersonalizowanej terapii.

Test strumienia zewnątrzkomórkowego: metoda pomiaru profilu metabolicznego komórek

Przedstawiono opis kalibracji zintegrowanych czujników biologicznych (FIBS) Förster Resonance Energy Transfer do profilowania metabolicznego in situ. FIBS może być używany do pomiaru wewnątrzkomórkowych poziomów metabolitów w sposób nieinwazyjny, pomagając w rozwoju modeli metabolicznych i wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych warunków bioprocesowych.

Nieinwazyjne profilowanie metaboliczne z wykorzystaniem FIBS

Przeprogramowanie metaboliczne jest cechą charakterystyczną i warunkiem wstępnym polaryzacji makrofagów M1 i M2. Niniejszy manuskrypt opisuje test do pomiaru podstawowych parametrów glikolizy i funkcji mitochondriów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Narzędzie to można zastosować do zbadania, w jaki sposób poszczególne czynniki wpływają na metabolizm i fenotyp makrofagów.

Charakterystyka metaboliczna spolaryzowanych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego M1 i M2 przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Glikoliza jest definiującym markerem metabolicznym w wielu systemach biologicznych. Monitorowanie glikolizy poprzez pomiar zewnątrzkomórkowego strumienia H+ jest powszechne, ale wymaga korekty, aby była ilościowa i jednoznaczna. W tym miejscu pokazujemy, jak zbierać i korygować dane dotyczące strumienia zewnątrzkomórkowego, aby odróżnić oddechowe i glikolityczne źródła zakwaszenia zewnątrzkomórkowego.

Pomiar i analiza produkcji kwasu zewnątrzkomórkowego w celu określenia szybkości glikolitycznej

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół badania oddychania mitochondrialnego i funkcji glikolitycznej u Candida Albicans za pomocą dodatkowego analizatora strumienia.

Badanie bioenergetyczne Candida albicans przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Protokoły opisują metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z indeksem załamania światła lub detekcją spektrometryczną mas do badania reakcji metabolicznych w złożonych systemach bezkomórkowych opartych na lizacie.

Chromatografia cieczowa sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas w celu profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie

Test przepływu metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym mierzy zużycie tlenu i stopień zakwaszenia zewnątrzkomórkowego, co odpowiada produkcji mitochondrialnego i glikolitycznego trifosforanu adenozyny, przy użyciu czujników pH i tlenu. W manuskrypcie wyjaśniono metodę pozwalającą zrozumieć stan energetyczny osteoblastów oraz charakterystykę i interpretację statusu bioenergetycznego komórek.

Wykorzystanie analizatora strumienia metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym do monitorowania bioenergetyki osteoblastów

Tutaj szczegółowo opisujemy metody ekstrakcji makrofagów ze szpiku kostnego, śledziony i serca po zawale serca, a następnie oceny przepływu metabolicznego w żywych komórkach.

Analiza przepływu metabolicznego ex vivo w makrofagach śledziony i serca oraz monocytach szpiku kostnego

Protokół ten opisuje opłacalny sposób przeprowadzenia testu stresowego glikolizy w celu ilościowego przeprogramowania metabolizmu w pierwotnym mikrogleju myszy. Po izolacji i stymulacji zapalnej mierzy się tempo zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) przy użyciu świeżo przygotowanych, pH-skorygowanych odczynników, a następnie następuje normalizacja białek, umożliwiająca dokładną i powtarzalną ocenę zmian glikolitycznych.

Badanie glikolizy w mikrogleju pierwotnym za pomocą testu strumienia zewnętrznego

Poznaj metodę oceny mitochondrialnej respiracji makrofagów pęcherzykowych przy użyciu bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Badanie wyjaśnia rolę glutaminy w metabolizmie komórek narażonych na przewlekłe działanie etanolu.

Ocena glutaminy jako źródła paliwa dla makrofagów pęcherzykowych narażonych na przewlekłe działanie etanolu przy użyciu bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego (Wideo) | JoVE Journal

Ocena glutaminy jako źródła paliwa dla makrofagów pęcherzykowych narażonych na przewlekłe działanie etanolu przy użyciu bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

Przeglądaj więcej filmów