Name: Elektroporacja pokrojonych w plasterki organoidów korowych człowieka do badań funkcji genów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Poznaj elektroporację pokrojonych organoidów korowych człowieka do manipulacji genetycznej i badania funkcji genów. Ta metoda umożliwia zrozumienie rozwoju kory mózgowej oraz zaburzeń neurorozwojowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni obiektom partnerów CRTD i Dresden Concept za wyjątkowe wsparcie, w szczególności K. Neumann i jej zespołowi w Stem Cell Engineering Facility, H. Hartmann i jej zespołowi w Light Microscopy Facility, A. Gompf i jej zespołowi w Flow Cytometry Facility oraz Hartmutowi Wolfowi z warsztatu MPI-CBG za budowę komór elektroporacyjnych. Dziękujemy Joshui Schmidtowi za jego opinie na temat manuskryptu. MA dziękuje za finansowanie z Centrum Terapii Regeneracyjnych Uniwersytetu Technicznego w Dreźnie, DFG (Emmy Noether, AL 2231/1-1) oraz Fundacji Schram.

CRISPR/Cas9 Gene Knockout in Sliced Human Cortical Organoids via Electroporation

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Ludzkie organoidy mózgowe i korowe stały się kluczowymi modelami do badania rozwoju ludzkiej kory nowej 7,16,17. W modelowaniu zaburzeń u ludzi izogeniczne linie i organoidy hiPSC stały się złotym standardem68. Ponieważ jednak generowanie nowych linii iPSC jest czasochłonne i kosztowne, szeroko stosuje się ostre manipulacje modelami organoidów korowych do badań funkcji genów.
Elektroporacja organoidów mózgowych i korowych 14,22,26,46,47,48,49,50,51,55 jest łatwa do wdrożenia, a wiele laboratoriów, które tradycyjnie wykorzystywały modele zwierzęce do badań funkcjonalnych, jest wyposażonych w wymagane narzędzia. Do wstrzykiwań in vivo komory boczne są zwykle ukierunkowane 34,36,37,39,40,41,42. Są one modelowane w organoidach korowych przez struktury przypominające komory z centralnym światłem, które można również wstrzyknąć. Elektroporacja organoidów korowych jest ukierunkowana przede wszystkim na końcowe stopy komórek wyściełających komory, zwykle wierzchołkowy promienisty glej69. Skuteczność celowania różni się w zależności od eksperymentu, ale zazwyczaj po 3-7 dniach elektroporacji można uzyskać kilka od 100 do 1000 komórek GFP-dodatnich na organoid. Czas trwania cyklu komórkowego w ludzkich nerwowych komórkach progenitorowych jest mniej więcej dwa razy dłuższy w porównaniu z myszami, gdzie wierzchołkowe promieniste komórki glejowe mają długość cyklu komórkowego 14 godzin, a podstawowe komórki progenitorowe 23 godziny70. Dlatego po 3 dniach głównie wierzchołkowe promieniste komórki glejowe i pośrednie komórki progenitorowe są GFP-dodatnie, podczas gdy komórki GFP-dodatnie są rozmieszczone we wszystkich strefach po 7 dniach. Sygnał GFP można zaobserwować jeszcze kilka miesięcy po elektroporacji, przy czym komórki GFP-dodatnie reprezentują głównie neurony, które są rozproszone po całym organoidzie, co pozwala nam analizować morfologię poszczególnych komórek. Celowanie w neuronalne komórki progenitorowe wyściełające komorę jest możliwe na etapach, w których obszary podobne do komór można zidentyfikować pod mikroskopem jasnego pola. W obecnym protokole15 jest to możliwe od 2 do 12 tygodnia rozwoju organoidów korowych, po czym komory kurczą się i nie są już widoczne. Dla doświadczonego eksperymentatora możliwe jest wstrzyknięcie 50-80 organoidów podczas jednej sesji.
Podczas gdy potomstwo wierzchołkowego gleju promienistego dziedziczy odczynniki do manipulacji genami podczas podziału komórki, bezpośrednie celowanie w dojrzałe komórki, takie jak neurony i astrocyty, nie jest możliwe przy standardowym podejściu do elektroporacji. Zamiast tego metody celowania wirusa zostały zastosowane do komórek postmitotycznych w układzie nerwowym33,71. W szczególności rekombinowane wirusy związane z adenowirusami (AAV) są szeroko stosowane do transferu genów w układzie nerwowym, ponieważ są łatwe do wytworzenia i transdukują końcowo zróżnicowane komórki z wysoką wydajnością71. Co więcej, AAV mogą być ukierunkowane na określone subpopulacje neuronów. Różne podejścia do celowania w wirusy, w tym wykorzystanie adenowirusów, Sendai i lentiwirusów, zostały już zastosowane w organoidach mózgowych i korowych 15,25,29,30,32,47,72,73,74.
Jednym z ograniczeń w protokołach organoidów mózgowych jest rozwój martwiczego rdzenia z powodu ograniczonego zaopatrzenia w tlen i składniki odżywcze. Wdrożono kilka strategii mających na celu poprawę żywotności komórek w centrum organoidów, w tym hodowlę organoidów w wirujących bioreaktorach 14,54, kohodowlę komórek śródbłonka lub podejścia bioinżynieryjne do modelowego unaczynienia75,76, przeszczep organoidów do modeli gryzoni 18,77 i krojenie organoidów15,47. W tym przypadku zastosowaliśmy pokrojony protokół organoidów korowych człowieka, który, jak wykazano, wykazuje zmniejszone niedotlenienie w rdzeniu organoidu i wspomaga ekspansję struktur podobnych do komór i obszaru przypominającego płytkę korową15. Ponadto krojenie organoidów mózgowych jest również korzystne dla obrazowania na żywo gleju promieniowego podstawnego, który znajduje się w strefie podkomorowej, umożliwiając generowanie map decyzyjnych losu komórek72. Podobnie, obrazowanie na żywo wykorzystano do badania pokrojonych organoidów mózgowych hodowanych na granicy powietrzno-cieczowej, co wspiera przeżycie neuronów i wzrost aksonów47. Odkryliśmy, że krojenie ludzkich organoidów korowych sprawia również, że te modele organoidów są szczególnie podatne na elektroporację, ponieważ struktury podobne do komór można łatwo zidentyfikować po pokrojeniu. Elektroporacja organoidów korowych umożliwia wprowadzenie plazmidów DNA, klasycznie stosowanych do nadekspresji genów, a ostatnio do dostarczania całych bibliotek plazmidów55, oraz narzędzi do edycji genów CRISPR/Cas9 do inaktywacji funkcji genów26.
Technologia CRISPR/Cas9 zrewolucjonizowała badanie funkcji genów 56,57,58,63,66. W tym protokole przedstawiliśmy zastosowanie kompleksów rybonukleoproteinowych gRNA / Cas936 do ostrej inaktywacji genów w organoidach korowych człowieka. Wstępną walidację skuteczności gRNA przeprowadzono in vitro, najpierw w probówce, a następnie w iPSC. Odkryliśmy, że te proste testy wstępne pomagają w wyborze obiecujących par gRNA, szczególnie w przypadku braku działających przeciwciał. W miarę jak coraz więcej narzędzi do nokautowania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 zostaje scharakteryzowanych, początkowe etapy walidacji mogą zostać pominięte w przyszłości. Podczas gdy sekwencjonowanie nowej generacji docelowych regionów DNA wyizolowanych z iPSC jest bardziej ilościowe i ma wyższą zawartość informacji, okazuje się, że sekwencjonowanie Sangera może często oferować znacznie szybsze wyniki podczas wstępnych badań przesiewowych gRNA. Ostatecznie, walidacja wydajnej edycji CRISPR/Cas9 w organoidach korowych i obniżenie poziomu białek w komórkach będących przedmiotem zainteresowania jest najbardziej ostatecznym dowodem na udaną ablację genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9.
Elektroporacja pokrojonych w plastry organoidów ludzkiej kory mózgowej umożliwia ostrą manipulację genetyczną w badaniach nad zyskiem i utratą funkcji, wizualizacją morfologii komórek i aksonów neuronalnych, dostarczaniem bibliotek plazmidów do podejść przesiewowych i masowych równoległych testów reporterowych, znakowaniem komórek do obrazowania na żywo i dostarczaniem narzędzi do edycji epigenomu. W związku z tym elektroporacja pokrojonych w plasterki organoidów korowych człowieka jest potężną metodą, która może ujawnić mechanistyczny wgląd w rozwój kory mózgowej człowieka, zaburzenia neurorozwojowe i ewolucję kory mózgowej.

Kora nowa odnosi się do zewnętrznej powłoki półkul mózgowych i jest strukturą unikalną dla ssaków. Kora nowa reprezentuje siedlisko wyższych funkcji poznawczych1,2,3,4,5. Podczas rozwoju nerwowe komórki macierzyste i progenitorowe dają początek neuronom w procesie zwanym neurogenezą. Badania funkcjonalne badające rozwój ludzkiej kory nowej stanowią podstawę do wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw regulacji ludzkich nerwowych komórek macierzystych, patologii neuronalnych i ewolucji ludzkiego mózgu2,6,7.
Historycznie rzecz biorąc, badania nad rozwojem ludzkiego mózgu opierały się na opisowych metodach histologicznych z wykorzystaniem tkanek pośmiertnych, z nowszymi systemami hodowli tkanek swobodnie pływających, umożliwiającymi badania funkcjonalne na tkance ludzkiego płodu8,9. Ponadto wykazano, że tkanka mózgowa ludzkiego płodu ma zdolność do samoorganizacji w długoterminowo rozwijające się organoidy10. Badania nad tkankami płodowymi dostarczyły ważnych informacji na temat rozwoju człowieka11,12, jednak ograniczona dostępność tkanek i względy etyczne ograniczają ich szerokie zastosowanie w mechanistycznych badaniach rozwoju ludzkiego mózgu. W ciągu ostatniej dekady opracowano protokoły, które pozwalają na generowanie trójwymiarowych organoidów nerwowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), w tym ludzkiego indukowanego PSC (hiPSC)13,14.
Organoidy mózgowe wykazują ważne cechy rozwijającego się mózgu, takie jak tworzenie struktur podobnych do komór, polaryzacja apikopodstawna, cytoarchitektura kory mózgowej, międzykinetyczna migracja jądrowa podczas radialnego podziału gleju i migracja neuronów. Co ważne, te nowe modele ludzkich organoidów podsumowują cechy ludzkiego rozwijającego się mózgu, które nie są dobrze modelowane u myszy, w tym ewolucyjnie istotne kluczowe typy progenitorów nerwowych, w szczególności podstawowy glej promieniowy (lub zewnętrzny glej promieniowy)7,14,15. Kilka ograniczeń wczesnych protokołów organoidów mózgowych - takich jak problemy z heterogenicznością organoidów, ograniczone dostarczanie składników odżywczych do wewnętrznego rdzenia i zróżnicowana tożsamość regionalna - zostało rozwiązanych w ostatnich postępach w protokole i można spodziewać się dalszych ulepszeń w nadchodzących latach15,16,17,18,19. Organoidy mózgowe i korowe człowieka szybko stały się kluczowymi modelami do badania rozwoju kory mózgowej człowieka20, zaburzenia neurologiczne21,22,23,24 i ewolucja mózgu25,26,27,28,29, oraz do przeprowadzania badań przesiewowych na dużą skalę30,31,32.
Dla ostrej manipulacji genetycznej, dwie metody były głównie stosowane w zwierzęcych modelach rozwoju kory nowej: dostarczanie wirusa przez infekcję komórek docelowych33 oraz elektroporacja in utero lub in vitro34,35. Wstrzyknięcie DNA - a ostatnio kompleksów rybonukleoproteinowych (RNP) CRISPR/Cas9 36- do komór bocznych, a następnie elektroporacja, ma tę zaletę, że określone obszary mózgu mogą być celowane w oparciu o orientację elektrod elektroporacyjnych. Elektroporacja polega na krótkich impulsach elektrycznych, które tymczasowo zwiększają przepuszczalność błony komórkowej, umożliwiając wprowadzenie DNA i innych naładowanych cząsteczek do komórek. Elektroporacja in utero została po raz pierwszy przeprowadzona w mouse37, gdzie szybko stała się szeroko stosowaną metodologią w neurobiologii rozwojowej. Metoda ta została następnie zastosowana również do innych gatunków, takich jak rat38,39 i frret40,41,42, gatunek gyrencefaliczny używany do badania ekspansji kory nowej i fałdowania kory mózgowej3,43,44,45.
Elektroporacja stała się również ważną metodą w badaniach organoidów ludzkiego mózgu46. W organoidach mózgowych elektroporacja została zastosowana do wizualizacji morfologii komórek i aksonów neuronalnych14,47, do dostarczania odczynników do knockdownu genów22,48,49, oraz do badania funkcji genów przez nadekspresję50. Metoda ta nie ogranicza się do modeli ludzkich, ale została również zastosowana do modyfikacji genetycznej organoidów mózgowych naczelnych50,51. Ponadto opisano elektroporację organoidów korowych generowanych w bioreaktorze wirującym Spin Ω spinowym52.
W tym protokole opisujemy elektroporację pokrojonych ludzkich organoidów korowych15 do badań funkcji genów w rozwoju kory mózgowej. Organoidy specyficzne dla regionu mózgu zwiększają odtwarzalność i spójność, co ma kluczowe znaczenie dla powodzenia analizy ilościowej, na przykład w modelowaniu chorób. W protokole organoidów kory ludzkiej z warstwami na plasterki15, podczas różnicowania iPSC stosuje się silne wskazówki dotyczące wzorców w celu uzyskania jednorodnej populacji przodków grzbietowej części przodomózgowia, po czym stosuje się pożywki hodowlane, które promują wzrost tkanek z mniejszą liczbą sygnałów instruktażowych53,54. Wykazano, że krojenie organoidów korowych zmniejsza śmierć komórek wynikającą ze zmniejszonej dostępności składników odżywczych i tlenu w rdzeniu organoidu15. Co więcej, krojenie wspomaga rozwój struktur przypominających komory zawierające obfity podstawowy glej promieniowy, z utrzymującą się neurogenezą prowadzącą do powstania rozszerzonego obszaru przypominającego płytkę korową15. Wielokrotne krojenie w tym protokole sprawia również, że te organoidy korowe są szczególnie odpowiednie do elektroporacji, ponieważ światła komór można łatwo zidentyfikować i nacelować przez wstrzyknięcie. Elektroporacja pokrojonych organoidów korowych została zastosowana do badania regionów regulatorowych genów i ewolucji kory mózgowej26,55.
Podczas procedury elektroporacji, mieszanka iniekcyjna jest dostarczana do światła struktur podobnych do komór. Po zastosowaniu pulsacyjnego pola elektrycznego mieszanina jest pobierana przez glej promieniowy wierzchołkowy, który wyściela komorę. Gdy wierzchołkowy promienisty glej dzieli się i daje początek bardziej zaangażowanym typom komórek4, czynniki elektroporowane są przekazywane do podstawowych komórek progenitorowych i neuronów. Elektroporowane potomstwo jest rozprowadzane w strefie komorowej (VZ) i strefie podkomorowej (SVZ) po 3 dniach i obejmuje większość ściany kory mózgowej, w tym obszar podobny do płytki korowej (CP), 7 dni po elektroporacji w środkowych stadiach neurogennych26,55.
Tutaj opisujemy zakłócenia genów za pośrednictwem CRISPR/Cas956 poprzez elektroporację w pokrojonych ludzkich organoidach korowych26. Ponadto metoda elektroporacji może być również stosowana do nadekspresji genów, wizualizacji morfologii komórek i procesów komórkowych poprzez ekspresję białek fluorescencyjnych, dostarczania bibliotek plazmidów do masowych równoległych testów reporterowych (MPRA), dostarczania narzędzi do edycji epigenomu i znakowania komórek do obrazowania na żywo.

<table><tbody><tr><td>Probówki wirówkowe PP 15 mL, stożkowe</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka rdzeniowa 4D-Nucleofector</td><td>Jednostka Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector X</td><td>Rurka okrągłodenna</td><td></td><td></td>z</tr><tr><td>polistyrenu o pojemności 5 ml z nasadką sitkową</td><td>Corning</td><td>Falcon 352235</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa, poddana działaniu nunklonu</td><td>Thermo Fisher</td><td>140675</td><td>Do hiPSC kultura</td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa, bardzo niskie nasadka</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>Do hodowli organoidów</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72022</td><td>Pożywka z przodomózgowia 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Sprężarka powietrza</td><td>Aerotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>703-545-155</td><td>Przeciwciało drugorzędowe, RRID: AB_2340375; rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572</td><td>Przeciwciało drugorzędowe, RRID: AB_162543; rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmol</td><td>Zintegrowane technologie</td><td></td> DNA <td>Niestandardowy projekt (zamów jako 2 nmol)</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>1072532</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>1081060</td><td>100 i mikro; g, ze Streptococcus pyogenes</td></tr><tr><td>Amfoterycyna B (Fungizone)</td><td>Gibco</td><td>15290018</td><td>Podłoże przodomózgowia 2, 3 i 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe anty-GFP (kurczak, poliklonalne)</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>RRID: AB_300798; rozcieńczenie 1:2000</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe anty-PCGF4 (mysie, monoklonalne)</td><td>Milipore</td><td>05-637&nbsp;</td><td>RRID: AB_309865; rozcieńczenie 1:300</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny ApoTome</td><td>Kwas askorbinowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>1043003</td><td>Podłoże Przodomózgowie 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>B27-suplement (+ witamina A)</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Podłoże przodomózgowia 3, 4&nbsp; &nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Zestaw bananowych do mikrochwytaków</td><td>Aparatura Harvarda BTX</td><td>45-0216</td><td></td></tr><tr><td>Biometra TRIO-Thermocycler (maszyna do PCR)</td><td>Analytik Jena</td><td>846-2-070-723</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary, szkło borokrzemianowe z żarnikiem, OD 1,2 mm; średnica wewnętrzna 0,69 mm; 10 cm długości</td><td>Science Products</td><td>BF120-69-10</td><td>Należy pociągnąć do określonej grubości</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72052</td><td>Podłoże przodomózgowie 2&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu IV</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>CRTDi004-A</td><td>Stem Cell Engineering Facility w CMCB DD https://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-A</td><td></td><td>Jednokomórkowa adaptowana linia hiPSC od zdrowego dawcy</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>zapas 1 mg / ml, użyj 1:1000 rozcieńczony dla</td></tr><tr><td>IF Dibutyryl-cAMP</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>73884</td><td>Przodomózgowie średnie 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>31330095</td><td>Podłoże przodomózgowie 1, 2 i 3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72102</td><td>Podłoże przodomózgowia 1&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dumont #55 Kleszcze, proste, 11 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 System elektroporacji fal prostokątnych</td><td>Aparat Harvard BTX</td><td>45-2052</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32205-1L-M</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>SH30070.03&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Płonący / brązowy ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>Do pobierania mikronaczyń włosowatych</td></tr><tr><td>Geneious Prime</td><td>GraphPad Software LLC d.b.a Geneious</td><td>Software wersja 2024.0.5</td><td></td></tr><tr><td>gLACZ</td><td>Kalebic i wsp., 2016; Platt i wsp., 2014</td><td></td><td>5'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; podkreślone nukleotydy = PAM</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050038</td><td>Podłoże przodomózgowia 1, 2, 3 i 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>gPCGF4 KO1</td><td>ten artykuł</td><td></td><td>5'-TGAACTTGGACATCACACAAATAGG (odpowiada obrazom KO na rysunku 3I+J)</td></tr><tr><td>gPCGF4 KO2</td><td>ten artykuł</td><td></td><td>5'-ACAAATAGGACAATACTTGCTGG (odpowiada KO zdjęcia na rysunku 3I+J)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>wykonane w domu</td><td></td><td>1 M zapas</td></tr><tr><td>Surowicy dla koni, inaktywowany termicznie</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie białko rekombinowane GDNF</td><td>Thermo Fisher</td><td>450-10</td><td>Podłoże przodomózgowia 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Human/Mysz/Szczur BDNF Rekombinowane białko</td><td>Thermo Fisher</td><td>450-02</td><td>Podłoże przodomózgowia 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>258148</td><td>Aby zrobić TrisHCl</td></tr><tr><td>ImmEdge (wosk) Pióro</td><td>wektorowe Laboraory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór insuliny ludzkiej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp; I9278</td><td>Przodomózgowie średnie 3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik surowicy nokautującej</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10828-010</td><td>Przodomózgowie średnie 1&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny 980</td><td>Zeiss Agaroza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>o niskiej temperaturze topnienia, ultra czysty</td><td>16520100</td><td>Thermo Fisher</td><td>do osadzania hCOs podczas sekcji wibratomu</td></tr><tr><td>Matrigel Matryca membrany podstawnej o obniżonym czynniku wzrostu (GFR), wolna od LDEV</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Do hodowli</td></tr> <tr><td>organoidówMatrigel Matryca z kwalifikacją hESC, wolna od LDEV</td><td>354277</td><td>Corning do hodowli hiPSC</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2, 1 M</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz PicoPump + przełącznik nożny</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet do mikroładowarek 0,5 do 20 i mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Do napełniania naczyń włosowatych szklanych</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>Pożywka z komórek macierzystych</td></tr><tr><td>N-2 suplement</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>Podłoże przodomózgowia 2 i 3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NEB Next High Fidelity 2x PCR Mastermix&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541S</td><td></td></tr><tr><td>Komora licząca Neubauer</td><td>Marka</td><td>718605</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże neuropodstawowe</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Podłoże przodomózgowia 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11140050</td><td>Pożywka Przodomózgowie 1, 2, 3 i 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr> <tr><td>Beznukleazowy bufor dupleksowy</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>1072570</td><td></td></tr><tr><td>O. C. T.</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Podłoże do zatapiania zamrożonej próbki tkanki</td></tr><tr><td>P3 Pierwotna komórka 4D-Nucleofector X Kit S</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher Chemical</td><td>P/0840/53</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>Forma do osadzania Peel-A-Way TruncatedT12</td><td>Polysciences Inc.</td><td>18986-1</td><td>Do zatapiania hCO do wibratomu i kriosekcji</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Podłoże przodomózgowie 1, 2, 3 i 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 oraz dla pożywki dla komórek macierzystych po nukleofekcji</td></tr><tr><td>Szalka Petriego 60 mm x 15 mm, bez otworu wentylacyjnego, sterylna</td><td>Corning</td><td>BP50-02</td><td></td></tr><tr><td>Platynowa komora elektrody na szalkę Petriego, odstęp 5 mm</td><td>Aparat Harvarda BTX</td><td>45-0504</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td> <td>wyprodukowana we własnym zakresie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2308</td><td>Z albumu Titrachium; 10 mg/ml zapas</td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor szlaku RHO/ROCK (Y-27632)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72308</td><td></td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72232</td><td>Podłoże przodomózgowia 2&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu dwuwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W302600-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza&nbsp;</td><td>Prowadnice adhezyjne Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>SZX10 z KL 300 LED</td><td>Olympus</td><td>SZX10</td><td>Lub alternatywny stereoskop</td></tr><tr><td>Thermo Shaker</td><td>Grant bio</td><td>PSC24N</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X Sigma</td><td>Aldrich</td><td>T9284</td><td>a.k.a. Octoxinol 9</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td>Aby zrobić</td></tr><tr><td>roztwór błękitu trypanowego TrisHCl, 0,4%</td> <td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>12604021</td><td>dysocjacja do wytwarzania zawiesin jednokomórkowych</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>a.k.a. Polisorbat 20</td></tr><tr><td>Sól tyrodowa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2145-10x1l</td><td></td></tr><tr><td>Wibrujący Mikrotom (wibratom)</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>Wide-Bore 1000 &micro; L Uniwersalne końcówki filtracyjne</td><td>Corning</td><td>TF-1005-WB-R-S</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21985-023</td><td>Przodomózgowie średnie 1, 3 i 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr></tbody></table>

elektroporacja pokrojonych w plasterki organoidów korowych człowieka do badań funkcji genów

Electroporation of Sliced Human Cortical Organoids for Studies of Gene Function

Organoidy korowe człowieka stały się ważnymi narzędziami do badania rozwoju ludzkiego mózgu, zaburzeń neurorozwojowych i ewolucji ludzkiego mózgu. Badania analizujące funkcję genów poprzez nadekspresję lub nokaut odegrały zasadniczą rolę w modelach zwierzęcych, dostarczając mechanistycznego wglądu w regulację rozwoju kory nowej. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół ostrego nokautu genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 poprzez elektroporację pokrojonych ludzkich organoidów korowych. Krojenie organoidów korowych pomaga w identyfikacji struktur przypominających komory do wstrzyknięcia, a następnie elektroporacji, co czyni go szczególnie dobrze dopasowanym modelem do ostrych manipulacji genetycznych podczas rozwoju kory mózgowej człowieka. Opisujemy projektowanie przewodników RNA i walidację skuteczności celowania in vitro i w organoidach korowych. Elektroporacja organoidów korowych jest wykonywana w środkowych stadiach neurogennych, co umożliwia celowanie w większość głównych klas komórek w rozwijającej się korze nowej, w tym glej promieniowy wierzchołkowy, podstawowe komórki progenitorowe i neurony. Podsumowując, elektroporacja pokrojonych w plastry ludzkich organoidów korowych stanowi potężną technikę badania funkcji genów, regulacji genów i morfologii komórek podczas rozwoju kory mózgowej.

Ablacja genów za pomocą CRISPR/Cas9 wymaga zaprojektowania gRNA. Zazwyczaj skutecznym podejściem jest celowanie w jeden z pierwszych egzonów genu zainteresowania za pomocą pary gRNA oddalonych od siebie o 7-11 bp (unikając wielokrotności 3 bp) (Rycina 1A). W ramach wstępnego testu wydajność rozpoznawania matrycy przez gRNA można zbadać in vitro, wykorzystując matrycę PCR26,40,62. Skuteczne celowanie i cięcie przez Cas9 są widoczne jako redukcja ilości DNA matrycy oraz pojawienie się produktów cięcia DNA na żelu agarozowym (Rycina 1B). Dalsze testy gRNA można przeprowadzić w linii iPSC wykorzystywanej do generowania organoidów korowych. Wymaga to nukleofekcji iPSC, co można zweryfikować poprzez pomyślną ekspresję fluorescencyjnego reportera (Rycina 1C). Skuteczne celowanie w wybrany locus można potwierdzić za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera, co skutkuje chromatogramem, który nagle się kończy lub nakłada na siebie w obrębie miejsca celowania (Rycina 1D), w wyniku powstania spektrum indeli podczas naprawy pęknięć dwuniciowych poprzez niehomologiczne łączenie końców66. Testy wydajności gRNA in vitro oraz w komórkach iPSC pomagają w wyborze efektywnych par gRNA do ablacji genów w organoidach korowych.
Przed elektroporacją organoidy korowe są przecinane, co ułatwia identyfikację światła komór w celu wstrzyknięcia mieszaniny do elektroporacji (Rycina 2A-C). Następnie wstrzyknięte organoidy przenosi się do komory elektroporacyjnej (Rycina 2D). Do elektroporacji należy używać organoidów korowych z dobrze rozwiniętymi strukturami przypominającymi komory (Rycina 2E), natomiast organoidy korowe pozbawione widocznych struktur należy odrzucić (Rycina 2F). Mieszanina do elektroporacji zawiera barwnik, który umożliwia wizualizację wstrzykniętych komór podczas procedury (Rycina 2G). Po 1-3 dniach hodowli skutecznie ukierunkowane komory są widoczne dzięki natywnemu sygnałowi GFP pod mikroskopem fluorescencyjnym (Rycina 2H).
W celu przeprowadzenia szczegółowej analizy histologicznej można wykonać immunohistochemię w przypadku przekrojów mrożonych. Idealnym scenariuszem jest obecność wielu celowanych komór wewnątrz elektroporowanego organoidu korowego (Rysunek 3A,B). Najbardziej optymalne elektroporacje celują w struktury przypominające komory w zewnętrznym obszarze organoidu, skierowanym na zewnątrz (Rysunek 3C), ponieważ zazwyczaj są to komory najbardziej rozszerzone. W niektórych przypadkach elektroporacja może prowadzić do nadmiernej śmierci komórek (Rysunek 3D,E), na przykład gdy stężenia plazmidów są zbyt wysokie lub parametry elektroporacji są nieoptymalne. Elektroporacje skierowane w stronę wnętrza organoidu (Rysunek 3F) często obejmują mniej rozszerzone obszary struktur przypominających komory w porównaniu z obszarami zewnętrznymi. W naszym doświadczeniu pomocne jest skoncentrowanie analizy ilościowej na określonych regionach organoidu w celu zmniejszenia zmienności. Czasami elektroporacja może spowodować uszkodzenie powierzchni apikalnej (Rysunek 3G), na przykład gdy objętość wtrysku jest zbyt duża, co prowadzi do pęknięcia komór, lub gdy impulsy elektryczne są zbyt silne, co prowadzi do delaminacji komórek. Wreszcie, gdy celowane są dwie sąsiadujące komory (Rysunek 3H), może stać się trudne określenie granic stref korowych oraz pochodzenia celowanych komórek.
Immunohistochemii można użyć do weryfikacji skutecznego nokautu za pomocą CRISPR/Cas9 na poziomie białka w wybranych komórkach (Rysunek 3I), co zilustrowano tutaj poprzez celowanie w białko PCGF4 kompleksu represyjnego Polycomb 1 (PRC1)67. Intensywność sygnału można analizować w komórkach GFP-dodatnich w warunkach kontrolnych i eksperymentalnych (Rysunek 3J). Alternatywnie, w przypadku braku odpowiedniego przeciwciała, komórki docelowe można wyizolować metodą FACS z organoidów korowych60, a następnie poddać dalszej analizie za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera lub sekwencjonowania nowej generacji (NGS)36. Ponadto redukcję poziomu białka można analizować za pomocą techniki Western blotting.
<img alt="Edycja genów CRISPR; wydajność gRNA; elektroforeza w żelu; fluorescencja GFP; analiza danych sekwencjonowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig1v5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Projektowanie i walidacja gRNA dla ostrego knockoutu genu za pomocą systemu CRISPR/Cas9. (A) Schematyczna ilustracja strategii projektowania gRNA, w której dwa gRNA celują w egzon genu zainteresowania. Czarne strzałki wskazują primery PCR do przygotowania matrycy wykorzystanej do walidacji gRNA. (B) Walidacja wydajności gRNA in vitro. Matryce amplifikowane metodą PCR poddano trawieniu kompleksami RNP. Po skutecznym cięciu w elektroforezie żelowej widoczne są dwa prążki o różnych rozmiarach (lewo), natomiast w przypadku gRNA o niskiej wydajności matryca pozostaje niepocięta (prawo). (C) Obraz w świetle przechodzącym (lewo), fluorescencja GFP (środek) oraz obrazy złożone (prawo) ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSCs) 3 dni po nukleofekcji kompleksem RNP i plazmidem GFP. Paski skali: 350 µm. (D) Walidacja wydajności gRNA w hiPSCs poprzez sekwencjonowanie metodą Sangera amplifikowanego DNA z komórek GFP-dodatnich. Po skutecznym cięciu dwuniciowego DNA ślady sekwencjonowania wykazują nałożone sygnały rozpoczynające się od miejsca docelowego gRNA (góra, KO1). W przypadku nieudzielnego celowania ślad sekwencji DNA pozostaje niezmieniony (dół, KO2) w porównaniu z kontrolą LACZ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Kultura ludzkich organoidów mózgowych: sekcjonowanie, wstrzykiwanie, elektroporacja; schemat eksperymentalny i wyniki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig2v5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Elektroporacja pociętych ludzkich organoidów korowych. (A) Schematyczna ilustracja przedstawiająca przebieg procesu elektroporacji ludzkich organoidów korowych (hCOs). Najpierw hCOs są cięte na plastry o grubości 500 µm. Dwa dni później mieszanina RNP zawierająca plazmid ekspresyjny GFP oraz Fast Green jest wstrzykiwana do światła struktur przypominających komory, preferencyjnie w zewnętrznym regionie hCOs. Do elektroporacji hCOs są umieszczane w komorze do elektroporacji. Po kilku dniach hodowli w obszarach poddanych elektroporacji można wykryć sygnał GFP. (B) Zdjęcia sekcjonowania hCOs za pomocą wibrotomu. Organoidy są zatapiane w 3% niskotopliwej agarozie w medium w bloku (lewo). Blok jest cięty na plastry o grubości 500 µm (środek). Pocięte organoidy są przenoszone z powrotem do naczynia hodowlanego za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze (prawo). (C) Zdjęcia przedstawiające wstrzykiwanie mieszaniny zawierającej RNP, pCAG-GFP i 0,1% Fast Green do struktur przypominających komory w organoidach. Organoidy są zanurzone w roztworze Tyrode'a, a cienka kapilara szklana jest wprowadzana do światła w centrum struktur przypominających komory (lewo). Do stabilizacji organoidów używa się pęsety (lewo i środek). Celem są komory znajdujące się na zewnątrz organoidów (środek). Wstrzyknięte organoidy są przenoszone do komory do elektroporacji, a później do naczynia hodowlanego, za pomocą końcówek pipety o szerokim otworze (prawo). (D) Zdjęcia komory do elektroporacji, która składa się ze szklanej płytki Petriego i dwóch metalowych ostrzy przyklejonych do szkła. Metalowe ostrza służą jako elektrody i posiadają otwory do przytwierdzenia kabli łączących z elektroporatorem. Strona hCO, w którą wstrzyknięto preparat, widoczna jako zielony cień, powinna być skierowana w stronę anody (biegun dodatni, czerwony kabel) (prawo). (E) Reprezentatywne zdjęcia hCOs wykazujących dobrze rozwinięte struktury przypominające komory. Jaśniejszy pierścień reprezentuje obszar przypominający strefę komorową. Ciemniejsze koło w centrum struktury przypominającej komorę reprezentuje światło i powinno być celem wstrzykiwania. (F) Reprezentatywne zdjęcia hCOs pozbawionych dobrze rozwiniętych struktur przypominających komory, których nie zaleca się włączać do dalszych eksperymentów. (G) Reprezentatywne zdjęcia hCOs po wstrzyknięciu mieszaniny do elektroporacji, w których obszary docelowe są widoczne dzięki Fast Green (pomarańczowe strzałki). (H) Reprezentatywne zdjęcie hCO wykazujące natywny sygnał GFP 24 h po elektroporacji. Paski skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Fazy wzorca embrionalnego w mikroskopii DAPI/GFP; analiza śmierci komórek i tworzenia komór." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig3v5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Analiza immunohistochemiczna elektroporowanych przekrojów ludzkich organoidów korowych. (A) Schemat przedstawiający elektroporowany ludzki organoid korowy (hCO) z zielonym sygnałem fluorescencyjnym. (B) Barwienie DAPI (szary) i immunofluorescencja dla GFP (zielony) w krioprzekroju hCO z wieloma elektroporowanymi komorami, 7 dni po elektroporacji. (C-H) Przykładowe obrazy różnych wyników elektroporacji, barwione pod kątem GFP (zielony) i jąder komórkowych (DAPI, szary). (C) Optymalna elektroporacja z nienaruszonymi jądrami (patrz wkładka 1, D), niezakłóconą strukturą przypominającą komorę oraz elektroporowanymi komórkami w obszarze skierowanym na zewnątrz organoidu, który zazwyczaj jest najbardziej rozległy. (E) Przykład hCO wykazujący masową śmierć komórek w obszarze elektroporowanym (patrz również wkładka 2, D), charakteryzująca się małymi, gęstymi od DAPI i zniekształconymi jądrami. (F) Udana elektroporacja skierowana do wnętrza organoidu, co często jest trudniejsze do interpretacji ze względu na obszary przypominające blaszkę korową zlewające się z sąsiednimi komorami. (G) Zakłócone struktury przypominające komory w centrum obszaru elektroporowanego (pomarańczowa strzałka). (H) Przykład hCO zawierającego wiele mniejszych komór, które są częściowo zlane i przez to trudne do ilościowego określenia. (I) Barwienie DAPI (szary) i immunofluorescencja dla GFP (zielony) oraz PCGF4 (magenta) 7 dni po elektroporacji kompleksu RNP celującego w LACZ (gLACZ KO, po lewej) lub PCGF4 (gPCGF4 KO, po prawej) w celu nokautu za pomocą CRISPR/Cas9. Obwiedzione komórki wskazują na zmniejszoną intensywność PCGF4, co świadczy o udanej ablacji genu. Jednolity sygnał widoczny jest w kontroli LACZ (po lewej). (J) Wykres przedstawia ilościową intensywność PCGF4 po immunofluorescencji w komórkach GFP-dodatnich dla kontroli (gLACZ KO) i KO PCGF4 (gPCGF4 KO) w stosunku do mediany ekspresji PCGF4 w warunkach gLACZ. Każda kropka reprezentuje jedną komórkę. Dane z 3-4 organoidów z dwóch różnych partii (szare i czarne) tej samej linii hiPSC. **** p &lt; 0.0001, test Manna-Whitneya. Wszystkie obrazy zostały wykonane za pomocą konfokalnego skanującego mikroskopu laserowego (B, C) lub mikroskopu fluorescencyjnego (E-I). Obrazy stanowią projekcje maksymalnej intensywności stosów z (z-stacks) o grubości 10-15 µm. Białe przerywane linie wskazują powierzchnię apikalną skierowaną w stronę światła komory oraz powierzchnie zewnętrzne hCO. Pomarańczowe przerywane linie wskazują granicę VZ/SVZ w zlewających się komorach. Paski skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Przeciwciało/Barwnik</td>
			<td>Rozcieńczanie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>przeciwciało przeciwko GFP z kurczaka</td>
			<td>1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przeciwciało mysie przeciwko PCGF4</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 przeciwkurczakie przeciwciało osle</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 przeciwkrólicze przeciwciało osiołkowe</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>stok 1 mg/ml; 1:1 000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista przeciwciał i barwników oraz ich rozcieńczeń wykorzystanych do barwienia immunofluorescencyjnego.

Tutaj prezentujemy ostrą manipulację genetyczną pokrojonych ludzkich organoidów korowych za pomocą elektroporacji. Te korowe modele organoidów są szczególnie podatne na wstrzykiwanie, ponieważ struktury podobne do komór można łatwo zidentyfikować po pokrojeniu, co umożliwia funkcjonalne badanie rozwoju kory mózgowej człowieka, zaburzeń neurorozwojowych i ewolucji kory mózgowej.

Elektroporacja pokrojonych w plasterki organoidów korowych człowieka do badań funkcji genów

Human cortical organoids have become important tools for studying human brain development, neurodevelopmental disorders, and human brain evolution. ...

Moja grupa interesuje się mechanizmami regulującymi ekspresję genów w nerwowych komórkach progenitorowych rozwijającej się kory nowej. A w szczególności skupiamy się na mechanizmach epigenetycznych. Są one ważne dla potencjału neuronalnych komórek progenitorowych do proliferacji i różnicowania, a tym samym dla prawidłowego rozwoju i funkcjonowania mózgu.Organoidy korowe to nowe, ekscytujące modele, które pozwalają nam badać rozwój ludzkiego mózgu. Pozwalają nam również modelować rozwój innych gatunków naczelnych. W tym protokole opisujemy elektroporację ludzkich organoidów korowych w celu zbadania funkcji genów.Organoidy są krojone za pomocą wibratomu, co czyni je szczególnie dostępnymi do wstrzykiwań i elektroporacji. Elektroporacja ludzkich organoidów korowych stanowi potężną technikę badania funkcji genów. Użyliśmy tej metody do zbadania czynnika wzrostu EPIREGULINY prychów, który jest zaangażowany w rozwój i ewolucję mózgu.Wykorzystaliśmy również tę metodę do zbadania aktywności regionów wzmacniających z różnych gatunków naczelnych. Na początek osadź ludzkie organoidy korowe pochodzące z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych w 3% agarozie o niskiej temperaturze topnienia. Pokrój organoidy na wibratomie na odcinki o grubości 500 mikrometrów.Po pokrojeniu kontynuuj hodowlę organoidów na sześciodołkowej bardzo niskiej płytce mocującej zawierającej cztery pożywki mózgowe, trzy na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 120 obr./min. Następnie ustaw ściągacz mikrokapilarny na określone ustawienia, aby wyciągnąć kapilary ze szkła borokrzemianowego do wstrzykiwań. Po wyciągnięciu przechowuj naczynia włosowate na dużej szalce Petriego i zabezpiecz je taśmą.W dniu elektroporacji podgrzej roztwór Tyrode'a do 37 stopni Celsjusza i przygotuj CRISPR Cas9 RNP o końcowym stężeniu 24 mikromolów. Do końcowej mieszanki iniekcyjnej dodać plazmid pCAG-GFP i 0,1% roztwór Fast Green w wodzie. Wybierz ludzkie organoidy korowe z dobrze rozwiniętymi strukturami przypominającymi komory i odrzuć organoidy, które nie mają tych struktur.Przenieś do 10 organoidów na 6-centymetrową szalkę Petriego zawierającą roztwór Tyrode'a. Za pomocą końcówki do pipet do mikroładowarek napełnić szklaną mikrokapilę 10 mikrolitrami roztworu do wstrzykiwań. Otwórz kapilarę, ściskając cienki koniec pęsetą.Sprawdzić, czy kapilara jest otwarta, uwalniając część mieszanki do wstrzykiwań do roztworu Tyrode'a. Włóż kapilar do środka struktur przypominających komory i naciśnij przełącznik nożny mikrowtryskiwacza, aby wstrzyknąć 0,2-0,5 mikrolitra mieszanki. Użyj cienkich kleszczy, aby popchnąć organoid, aby ograniczyć jego ruch bez chwytania go.Po wstrzyknięciu, używając końcówki pipety o szerokim otworze, przenieść jeden lub dwa wstrzyknięte organoidy do komory elektroporacyjnej zawierającej roztwór Tyrode'a. Ustawić wstrzyknięte organoidy w kierunku elektrod, upewniając się, że wierzchołkowy promieniowy glej i obszary przypominające komory są skierowane na zewnątrz. Podłącz do komory elektroporacyjnej tak, aby wstrzyknięta strona organoidu była skierowana w stronę bieguna dodatniego.Naciśnij przycisk impulsu na elektroporatorze, aby dostarczyć pięć impulsów o napięciu 38 woltów przez 50 milisekund każdy w odstępach 1-sekundowych. Po elektroporacji przywróć ludzkie organoidy korowe do czterech pośrednich mózgów i hoduj je bez wstrząsania przez 24 godziny. Po utrwaleniu i kriosekcji elektroporowanych ludzkich organoidów korowych, należy przeprowadzić pobieranie antygenu w buforze cytrynianowym przez godzinę w temperaturze 70 stopni Celsjusza w łaźni wodnej w celu analizy immunohistochemicznej.Umyj sekcje raz w PBS przez pięć minut. Następnie krótko wysusz szkiełka i użyj pisaka woskowego, aby zakreślić sekcje. Schładzać skrawki za pomocą 0,1 glicyny molowej w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Następnie umyj skrawki dwukrotnie PBS przez pięć minut każda. Dodać bufor blokujący na sekcje i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować sekcję w przeciwciałach pierwszorzędowych przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Następnego dnia umyj skrawki trzy razy PBS przez pięć minut każda. Inkubować skrawki z przeciwciałami drugorzędowymi i DAPI w buforze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po umyciu przekroju PBS zamontuj szkiełko z medium montażowym i zobrazuj skrawki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.Immunohistochemia elektroporowanych organoidów ujawniła wiele docelowych komór w elektroporowanym organoidzie korowym z optymalnymi elektroporacjami ukierunkowanymi na struktury podobne do komór zlokalizowane w zewnętrznych obszarach organoidu. Rozwiązywanie problemów jest konieczne, jeśli obserwuje się nadmierną śmierć komórki. Może to być spowodowane wysokimi stężeniami plazmidów lub nieoptymalnymi ustawieniami elektroporacji.Elektroporacje skierowane do wnętrza organoidu są często trudniejsze do zinterpretowania ze względu na obszary przypominające płytki korowe łączące się z sąsiednimi komorami. Przerwanie powierzchni wierzchołkowej może wystąpić, gdy przyłożona jest nadmierna objętość wstrzyknięcia lub silne impulsy elektryczne, co prowadzi do pęknięć komór i rozwarstwienia komórek. Nokaut białka PCGF4 kompleksu represyjnego Polycomb 1 został potwierdzony przez immunohistochemię, wykazując zmniejszoną intensywność sygnału w komórkach GFP-dodatnich.Analiza intensywności sygnału komórek GFP dodatnich wykazała znaczne obniżenie poziomu białka PCGF4 w próbkach nokautujących w porównaniu z kontrolą.

electroporation-sliced-human-cortical-organoids-for-studies-gene

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejsza procedura opisuje metodę izolacji i hodowli mysiego narządu Cortiego z lub bez listka spiralnego i neuronów zwoju spiralnego. Prezentujemy również metodę ekspresji egzogennego genu reporterowego w eksplantacie narządu Cortiego za pomocą elektroporacji.

Kultura pierwotna i elektroporacja plazmidowa mysiego narządu Cortiego.

In utero elektroporacja jest cenną metodą transfekcji neuronalnych komórek progenitorowych in vivo. W zależności od rozmieszczenia elektrod oraz momentu rozwojowego przeprowadzenia elektroporacji, można ukierunkować proces na określone podgrupy komórek kory mózgowej. Następnie komórki docelowe można analizować in vivo lub in vitro pod kątem efektów modyfikacji genetycznych.

Elektroporacja in utero z następującą po niej pierwotną hodowlą neuronów w celu badania funkcji genów w podzbiorze neuronów korowych

W celu przeprowadzenia szybkiej oceny funkcji genów w rozwoju kory mózgu opisujemy metody obejmujące elektroporację ex vivo plazmidów koekspresujących inhibicyjne RNA (RNAi) i GFP w zarodkowej korze mysiej. Protokół ten nadaje się do badania różnych aspektów neurorozwoju, takich jak neurogeneza, migracja neuronów oraz morfogeneza neuronów, w tym wzrost dendrytów i aksonów.

Metody badania morfogenezy neuronalnej: Elektroporacja RNAi ex vivo w embrionalnej korze mózgu myszy

Ten film demonstruje protokół elektroporacji pojedynczych komórek genów zarówno w neuronach pobudzających, jak i hamujących w różnych kulturach in vitro w warstwach hipokampa. Technika ta jest przydatna do badania specyficznych funkcji molekularnych i fizjologicznych neuronów, w tym autonomicznych mechanizmów komórkowych i interakcji białek transsynaptycznych.

Elektroporacja pojedynczych komórek w organotypowych kulturach wycinków mózgu: technika in vitro dostarczania plazmidów do docelowych neuronów w wycinkach hipokampa mózgu

Ten protokół opisuje ulepszoną procedurę eksplantacji, która obejmuje elektroporację ex utero, sekcję i hodowlę całych półkul mózgowych od embrionalnej myszy. Preparat ułatwia badania farmakologiczne i testy funkcji genów we wczesnym okresie rozwoju kory mózgowej.

Ex utero Elektroporacja i eksplantaty całej półkuli: prosta metoda eksperymentalna do badań nad wczesnym rozwojem kory mózgowej

Podwójna elektroporacja w macicy pozwala na celowanie w populacje komórek, które są przestrzennie i czasowo oddzielone. Technika ta jest przydatna do wizualizacji interakcji między tymi populacjami komórek przy użyciu białek fluorescencyjnych w normalnych warunkach, ale także po eksperymentach funkcjonalnych w celu zakłócenia interesujących genów.

Podwójna elektroporacja in utero w celu ukierunkowania na czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek

Prezentowany tutaj jest protokół elektroporacji pojedynczej komórki, który może dostarczyć geny zarówno w neuronach pobudzających, jak i hamujących w różnych epokach hodowli in vitro w warstwach hipokampa. Nasze podejście zapewnia precyzyjną i wydajną ekspresję genów w poszczególnych komórkach, które można wykorzystać do badania funkcji autonomicznych i międzykomórkowych.

Elektroporacja jednokomórkowa w różnych organotypowych kulturach warstwowych mysich neuronów pobudzających hipokampa i specyficznych dla klasy neuronów hamujących

Elektroporacja organoidów mózgowych naczelnych zapewnia precyzyjne i skuteczne podejście do wprowadzania przejściowych modyfikacji genetycznych do różnych typów progenitorów i neuronów w systemie modelowym zbliżonym do rozwoju (pato)fizjologicznej kory nowej naczelnych. Pozwala to na badanie procesów neurorozwojowych i ewolucyjnych, a także może być stosowane do modelowania chorób.

Ukierunkowana mikroiniekcja i elektroporacja organoidów mózgowych naczelnych w celu modyfikacji genetycznej

Hodowle embrionalnych komórek siatkówki kurcząt stanowią cenne narzędzia do badania biologii fotoreceptorów. Opracowaliśmy skuteczną technikę transferu genów opartą na elektroporacji plazmidowej siatkówki ex ovo przed hodowlą. Technika ta znacznie zwiększa wydajność transfekcji w porównaniu z obecnie dostępnymi protokołami, dzięki czemu manipulacja genetyczna jest możliwa dla tego systemu.

Efektywny transfer genów w siatkówkach piskląt w badaniach pierwotnych hodowli komórkowych: podejście do elektroporacji ex-ovo

Prezentujemy metodę, która opisuje izolację i hodowlę eksplantatów ślimaka z embrionalnego ucha wewnętrznego myszy.  Demonstrujemy również metodę transferu genów do eksplantatów ślimakowych za pomocą elektroporacji fali prostokątnej. Hodowla eksplantatów in vitro w połączeniu z techniką transferu genów umożliwia naukowcom badanie skutków zmiany ekspresji genów podczas rozwoju.

Hodowla embrionalnych eksplantatów ślimakowych myszy i transfer genów za pomocą elektroporacji

Poznaj elektroporację pokrojonych organoidów korowych człowieka do manipulacji genetycznej i badania funkcji genów. Ta metoda umożliwia zrozumienie rozwoju kory mózgowej oraz zaburzeń neurorozwojowych.

Elektroporacja pokrojonych w plasterki organoidów korowych człowieka do badań funkcji genów

Przeglądaj więcej filmów