Znakowanie fluorescencyjne w celu wizualizacji białek o niskiej ekspresji u danio pręgowanego
24 stycznia 2025
Tutaj prezentujemy protokół oznaczania białek znacznikiem białka fluorescencyjnego u larw danio pręgowanego, nowo opracowany i zmodyfikowany system in vivo, szczególnie przydatny do wizualizacji białek o niskiej obfitości u danio pręgowanego.
Ten produkt jest zoptymalizowany pod kątem wyrównywania białek za pomocą znacznika białka fluorescencyjnego oraz wizualizacji lokalizacji i ekspresji białka interesującego osobnika laboratoryjnego danio pręgowanego. Jest to szczególnie przydatne do obrazowania białek ulegających ekspresji w niskiej obfitości. Nasza metoda upraszcza i przyspiesza proces budowy dawcy.
Komponenty te, z wyjątkiem CDS, są wcześniej włączane do sieci szkieletowej. Dawca został również zoptymalizowany w celu zwiększenia wydajności. Przepływ pracy ekranu transmisji gromadzi dziedziczne jądro przy najniższym koszcie czasu i wysiłku.
Danio pręgowany jest organizmem modelowym szeroko stosowanym w badaniach nad infekcjami i odpornością. Szczególnie interesują nas mechanizmy leżące u podstaw sepsy. Ponieważ jesteśmy teraz w stanie łatwo wykonać znakowanie fluorescencyjne za pomocą naszego protokołu, postaramy się oznaczyć obraz, białka i komórki sepsy u danio pręgowanego.
Na początek umieść jedną samicę danio pręgowanego i dwa zdrowe samce danio pręgowanego w zbiorniku godowym. Użyj przegrody, aby oddzielić samce od samic, aby przygotować je do krycia. W dniu mikroiniekcji należy przygotować mieszankę do mikroiniekcji na lodzie w środowisku wolnym od RNaz.
Za pomocą końcówki pipety niezawierającej rnazy wsypać roztwór do mikroiniekcji do igły. Umieść załadowaną igłę w mikromanipulatorze podłączonym do mikrowtryskiwacza. Pod mikroskopem użyj spiczastej pęsety, aby przeciąć końcówkę igły, delikatnie ściskając ją, aż pęknie.
Dostosuj ciśnienie wstrzykiwania, aż igła będzie konsekwentnie wyrzucać kroplę o wielkości jednego nanolitra. Następnie wyjmij przegrodę ze zbiornika godowego i pozwól rybom rozmnażać się przez sześć minut. Zebrać i przenieść zarodki w jednym stadium komórkowym na szalkę Petriego zawierającą bufor zarodka.
Zbadaj stan zdrowia zarodków pod mikroskopem świetlnym i usuń niezapłodnione jaja lub szczątki. Odłóż 20 zdrowych zarodków na osobną szalkę Petriego jako niewstrzyknięte grupy kontrolne i oznacz szalkę. Za pomocą małej szczoteczki przenieś i delikatnie ułóż zdrowe zarodki w jednym stadium komórkowym na rowkach płytki do mikroiniekcji ogrzanej do temperatury pokojowej.
Usuń nadmiar buforu z płytki. Za pomocą końcówki igły delikatnie dostosuj położenie każdego zarodka tak, aby kij zwierzęcia był skierowany w stronę igły. Wstrzyknąć jeden nanolitr zmieszanego roztworu do bieguna zwierzęcego.
Po wstrzyknięciu delikatnie przepłukać zarodki do 6-dołkowej płytki z buforem do zarodków. Umieść płytkę w inkubatorze o stałej temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza. Po 10 godzinach od zapłodnienia zbadaj rozwój zarodka pod mikroskopem stereoskopowym i usuń martwe zarodki.
Po 24 godzinach od zapłodnienia zbierz zarodki do 1,5-mililitrowych probówek do genotypowania i ostrożnie wylej nadmiar wody. Do każdej probówki dodać 100 mikrolitrów buforu do lizy zawierającego proteinazę K. Inkubować probówki w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez godzinę, a następnie w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 minut.
Po inkubacji dodaj 200 mikrolitrów etanolu i dobrze wymieszaj. Odwirować probówkę o sile 19 000 G przez 10 minut i wyrzucić supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu z 500 mikrolitrami 70% etanolu. Ponownie odwirować i wysuszyć granulkę na powietrzu przed rozpuszczeniem jej w 50 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody.
Użyj jednego mikrolitra ekstraktu do przygotowania mieszaniny reakcyjnej do PCR. Po PCR uruchom żele agarozowe z dwoma mikrolitrami produktów PCR, aby potwierdzić pomyślną amplifikację. Przeprowadź trawienie enzymatyczne, aby ocenić wydajność sgRNA.
Delikatnie wymieszać roztwór wytrawiający i inkubować w temperaturze pokojowej, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Uruchom żele agarozowe dla strawionych produktów wraz z niestrawionymi kontrolami PCR, aby potwierdzić trawienie. Aby przeanalizować wydajność sgRNA, otwórz stronę internetową TIDE i kliknij przycisk Start TIDE.
Wprowadź sekwencję prowadzącą sgRNA do ramki sekwencji prowadzącej. Kliknij przycisk Przeglądaj, aby przesłać wynik sekwencjonowania kontrolki typu dzikiego do pola chromatogramu próbki kontrolnej. Podobnie, prześlij wynik sekwencjonowania edytowanej próbki do pola chromatogramu próbki testowej.
Kliknij przycisk Aktualizuj widok, aby przeanalizować wyniki. Na początek użyj klonowania niezależnego od ligacji lub LIC z egzonukleazą III, aby skonstruować plazmid dawcy. Zaprojektuj podkład F1 z nakładającą się sekwencją z elementem wektorowym 1 i częścią elementu 2.
Zaprojektuj podkład R2 z częścią elementu 1, elementu 2 i elementu 3. Zaprojektuj starter F2 tak, aby zawierał pierwiastki 3 i 4 oraz 5 sekwencję główną CDS podążającą za miejscem docelowym sgRNA. Zaprojektuj podkład R1 z trzema sekwencjami głównymi sekwencji powlekania i sekwencją nakładającą się z wektorem.
Użyj danio pręgowanego CDNA jako szablonu i wykonaj PCR z zaprojektowanymi starterami. Oczyść produkty PCR za pomocą wytrącania etanolu. Trawić wektor dawcy za pomocą enzymów restrykcyjnych, takich jak pCI i Acc65I, i oczyszczać strawiony wektor donorowy.
Określ ilościowo oczyszczone fragmenty PCR i strawiony wektor dawcy za pomocą elektroforezy żelowej DNA. Następnie przygotuj mieszankę LIC z oczyszczonym wektorem dawcy i inkubuj na lodzie przez 60 minut. Dodaj jeden mikrolitr 0,5 molowego EDTA, aby zatrzymać reakcję.
Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać roztwór. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez pięć minut. Schłodzić produkty LIC na lodzie.
Następnie przekształć kompetentne komórki DH5-Alpha za pomocą produktów LIC. Umieść przekształcone komórki na płytkach Luria-Bertani zawierających ampicylinę i hoduj je przez 16 godzin. Po inkubacji wybierz pojedyncze kolonie z płytek LIC do analizy trawienia enzymatycznego i sekwencjonowania DNA.
Ekstrahuj i oczyść prawidłowe plazmidy dawcy za pomocą zestawu do oczyszczania. Wstrzyknąć zarodki danio pręgowanego mieszanką mikroiniekcyjną dla genu knockin' 12 do 48 godzin po mikrowstrzyknięciu, pod mikroskopem stereofluorescencyjnym, obserwować fluorescencję larw danio pręgowanego. Stosując ustaloną metodę przesiewową, wybierz larwy fluorescencyjne i hoduj je oddzielnie.
W wieku jednego miesiąca należy pobrać mały kawałek płetwy dorszowej z każdego znieczulonego danio pręgowanego do oznakowanej probówki PCR. Umieść odpowiedniego znieczulonego danio pręgowanego na 6-dołkowej płytce wypełnionej przefiltrowaną wodą sterylizowaną promieniami UV, zgodnie z etykietą na probówce. Ekstrakcja genomowego DNA metodą lizy alkalicznej.
Zaprojektuj starter do przodu przed lewym ramieniem homologii i starter odwrotny na wkładce. Wykonaj PCR, celując w pięć głównych połączeń sekwencji. Zbadaj zarodki F1 uzyskane przez skrzyżowanie danio pręgowanego F poddanego badaniom przesiewowym z danio pręgowanym typu dzikiego pod kątem wzorców ekspresji GFP.
Genotyp zarodków F1 za pomocą PCR ze złączem. Dziedziczną swoistą fluorescencję zaobserwowano w mięśniach wszystkich potomków F1, co wskazuje na pomyślne znakowanie GFP connexonu 39.9. Dziedziczną specyficzną fluorescencję wykryto w soczewce całego potomstwa F2, co sugeruje udane znakowanie mCherry koneksonu 44.1.
Poprawność knockin'of connexonów 39.9 i 44.1 zweryfikowano za pomocą reakcji łańcuchowych polimerazy złączowej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół znakowania białek za pomocą znacznika białka fluorescencyjnego w larwach danio pręgowanego, co ułatwia wizualizację białek o niskiej liczności. Metoda ta usprawnia obrazowanie białek ekspresyjnych u danio pręgowanego, optymalizując proces konstrukcji donora.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biotechnologia
- Obrazowanie białek
Wprowadzenie
- Markowanie fluorescencyjne jest kluczowe dla badania lokalizacji białek.
- Danio przebrany jest cennym organizmem modelowym w badaniach biologicznych.
- Białka o niskiej obfitości stanowią wyzwanie w zakresie wizualizacji.
- Efektywna konstrukcja donora jest niezbędna dla pomyślnego markowania.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnego protokołu znakowania białek u rybek danio przeżebrowanych.
- Udoskonalenie technik wizualizacji białek występujących w niskim stężeniu.
- Uproszczenie procesu konstrukcji donora dla badaczy.
Zastosowane metody
- Optymalizacja znakowania białkami fluorescencyjnymi.
- Wprowadzanie komponentów do szkieletu w celu zwiększenia wydajności.
- Przepływ pracy w przesiewaniu transmisji w celu uzyskania dziedzicznej akumulacji w jądrze komórkowym.
- Ocena ekspresji i lokalizacji białek u rybek zebrafish.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie znakuje białka w larwach danio pręgowanego.
- Osiągnięto lepszą wizualizację białek o niskiej zawartości.
- Zwalidowano usprawniony proces konstruowania donora.
- Metoda wykazuje potencjał do szerszych zastosowań w badaniach nad białkami.
Wnioski
- Niniejszy protokół stanowi wartościowe narzędzie dla badaczy zajmujących się analizą białek u rybek danio-pręgopłetwych.
- Odpowiada on na wyzwania związane z wizualizacją białek występujących w niskich stężeniach.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie w ramach różnorodnych zastosowań.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokowydajne znakowanie fluorescencyjne u rybek zebra pozwala na bezpośrednią wizualizację białek o niskiej obfitości, co rozwiązuje krytyczny problem w fazie wczesnego odkrywania i walidacji celów. Protokół ten wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego i zwiększa pewność prognostyczną, umożliwiając precyzyjną lokalizację i kwantyfikację białek w żywym modelu istotnym dla danej choroby. Usprawniony schemat postępowania przyspiesza przejście od sformułowania hipotezy do uzyskania praktycznych wniosków biologicznych, usprawniając selekcję i priorytetyzację projektów w portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację ekspresji i lokalizacji endogennych białek in vivo.
- Wspiera walidację funkcjonalną potencjalnych celów w przejrzystym, podatnym na analizę systemie modelowym.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez potwierdzenie obecności i rozmieszczenia białek o niskiej obfitości.
- Zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do dalszych hipotez biologicznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane, fluorescencyjnie znakowane linie danio-pruzełkowatego do ilościowych analiz obrazowych.
- Umożliwia powtarzalne i skalowalne przesiewanie zmian w lokalizacji i ekspresji białek.
- Wspiera standaryzację testów i ponowne wykorzystanie platformy dla wielu celów molekularnych.
- Dostarcza wiarygodne wyniki do oceny związków w systemach żywych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne ze ścieżkami istotnymi dla przebiegu chorób, takimi jak infekcje i odporność, w kontekście całego organizmu.
- Zapewnia ciągłość od fazy odkrywania do walidacji przedklinicznej poprzez śledzenie dynamiki białek in vivo.
- Wspiera decyzje o rozwoju projektu, dostosowane do poziomu ryzyka, w oparciu o biologiczne dane w czasie rzeczywistym.
- Ułatwia rozwój biomarkerów translacyjnych w sytuacjach, gdy lokalizacja białek jest powiązana z fenotypami chorobowymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół znakowania fluorescencyjnego wpisuje się w proces badawczy, od wczesnej walidacji celu po badania przedkliniczne, stanowiąc uniwersalną platformę do weryfikacji hipotez i badań mechanistycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotezy zerowej poprzez umożliwienie bezpośredniej obserwacji ekspresji i lokalizacji białek.
- Przesiewanie: Dostarcza ustandaryzowane, ilościowe wyniki obrazowania do analizy porównawczej.
- Analityka: Zapewnia wiarygodne odczyty fluorescencji oraz dane genotypowania w celu wsparcia procesów decyzyjnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość badań poprzez umożliwienie śledzenia białek związanych z chorobą in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Ustanawia skalowalny, zwalidowany schemat postępowania w celu znakowania różnych białek docelowych u danio pręgowanego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje konstrukcję i przesiewanie donorów, zwiększając powtarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji go/no-go oraz efektywne pod względem kapitałowym zarządzanie portfolio.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zwalidowanych celów.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w klonowaniu molekularnym, mikroiniekcji oraz hodowli rybek zebrafish.
- Wymagany jest dostęp do mikroskopii fluorescencyjnej i infrastruktury do genotypowania.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności przesiewania założycieli i obrazowania.
- Możliwa może być konieczność adaptacji metody dla różnych białek docelowych lub etapów rozwoju.
- Wydajność i swoistość zależą od projektu sgRNA oraz optymalizacji konstruktu donora.
