Name: Znakowanie fluorescencyjne w celu wizualizacji białek o niskiej ekspresji u danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj metodę znakowania fluorescencyjnego białek o niskiej ekspresji u larw Danio rerio. Protokół upraszcza konstrukcję dawcy i usprawnia wizualizację białek w badaniach biotechnologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Lu Zhou (Uniwersytet Xiamen) za korektę i redakcję tego manuskryptu. Prace te były wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (grant 82388201 dla J.H.; grant 31801158 dla Y.Z.), National Key R&D Program of China (2020YFA0803500 dla J.H.), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) (2019-I2M-5-062 dla J.H.), Specjalny Program Centralny dla Lokalnego Rozwoju Nauki i Technologii w prowincji Fujian (2022L3079 dla J.H.), oraz Program Współpracy Dystryktu FuXia-Quan Zi-Chuang (3502ZCQXT2022003 do J.H.). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowywaniu manuskryptów.

Fluorescent Protein Tagging in Zebrafish Larvae Using CRISPR/Cas9 Knock-In

<ol><li>Brittijn, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+development+and+regeneration%3A+new+tools+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research.</a> Int J Dev Biol. 53 (5-6), 835-850 (2009).</li>
<li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).</li>
<li>Haraoka, Y., Miyake, M., Ishitani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+imaging+reveals+hidden+oncogenic-normal+cell+communication+during+primary+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Zebrafish imaging reveals hidden oncogenic-normal cell communication during primary tumorigenesis.</a> Cell Struct Funct. 48 (1), 113-121 (2023).</li>
<li>Gomes, M. C., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+case+for+modeling+human+infection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The case for modeling human infection in zebrafish.</a> Trends Microbiol. 28 (1), 10-18 (2020).</li>
<li>Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+zebrafish+to+understand+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The use of zebrafish to understand immunity.</a> Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).</li>
<li>Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+transparent+zebrafish%3A+a+refined+method+to+improve+detection+of+gene+expression+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Biotechnol+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development.</a> Mar Biotechnol (NY). 3 (6), 522-527 (2001).</li>
<li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li>
<li>Antinucci, P., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+crystal-clear+zebrafish+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging.</a> Sci Rep. 6, 29490(2016).</li>
<li>He, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ligase+3-dependent+microhomology-mediated+end+joining+repair+of+DNA+double-strand+breaks+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient ligase 3-dependent microhomology-mediated end joining repair of DNA double-strand breaks in zebrafish embryos.</a> Mutat Res. 780, 86-96 (2015).</li>
<li>Hisano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+in-frame+integration+of+exogenous+DNA+mediated+by+CRISPR%2FCas9+system+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish.</a> Sci Rep. 5, 8841(2015).</li>
<li>Luo, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-based+genome+engineering+of+zebrafish+using+a+seamless+integration+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-based genome engineering of zebrafish using a seamless integration strategy.</a> FASEB J. 32 (9), 5132-5142 (2018).</li>
<li>Wierson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+integration+directed+by+short+homology+in+zebrafish+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells.</a> Elife. 9, e53968(2020).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+tagging+strategies+for+illuminating+expression+profiles+of+genes+with+different+abundance+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimal tagging strategies for illuminating expression profiles of genes with different abundance in zebrafish.</a> Commun Biol. 6 (1), 1300(2023).</li>
<li>Li, C., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation+independent+cloning+irrespective+of+restriction+site+compatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility.</a> Nucleic Acids Res. 25 (20), 4165-4166 (1997).</li>
<li>Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PCR+based+protocol+for+detecting+indel+mutations+induced+by+TALENs+and+CRISPR%2FCas9+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in zebrafish.</a> PLoS One. 9 (6), e98282(2014).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+39.9+protein+is+necessary+for+coordinated+activation+of+slow-twitch+muscle+and+normal+behavior+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Connexin 39.9 protein is necessary for coordinated activation of slow-twitch muscle and normal behavior in zebrafish.</a> J Biol Chem. 287 (2), 1080-1089 (2012).</li>
<li>Cason, N., White, T. W., Cheng, S., Goodenough, D. A., Valdimarsson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+expression+analysis%2C+and+functional+characterization+of+connexin44.1%3A+a+zebrafish+lens+gap+junction+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, expression analysis, and functional characterization of connexin44.1: a zebrafish lens gap junction protein.</a> Dev Dyn. 221 (2), 238-247 (2001).</li>
<li>Urushibata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+developmental+speed+in+zebrafish+embryos+using+different+incubation+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Control of developmental speed in zebrafish embryos using different incubation temperatures.</a> Zebrafish. 18 (5), 316-325 (2021).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+digestion+and+ligation-mediated+PCR+used+for+flanking+sequence+walking%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cyclic digestion and ligation-mediated PCR used for flanking sequence walking.</a> Sci Rep. 10 (1), 3434(2020).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów w tym artykule.

Aby przeprowadzić ten eksperyment sprawnie i skutecznie, należy zwrócić większą uwagę na kilka ważnych aspektów. Optymalnym etapem rozwojowym danio pręgowanego do wstrzyknięcia powinno być stadium jednokomórkowe. Zakończenie iniekcji na tym etapie może zapewnić, że wszystkie komórki wytworzone w wyniku późniejszego podziału zawierają niezbędne składniki dla KI, zwiększając w ten sposób prawdopodobieństwo jednoczesnego wystąpienia KI we wszystkich komórkach i poprawiając ogólny wskaźnik powodzenia KI. Obniżenie temperatur...

Jako dobrze przyjęty organizm modelowy, danio pręgowany (Danio rerio) jest szeroko stosowany w badaniach naukowych nad rozwojem, regeneracją, nowotworzeniem nowotworów, infekcjami i odpornością, itd1,2,3,4,5. Danio pręgowany jest szczególnie odpowiedni do obrazowania na żywo in vivo, gdy jest traktowany PTU (1-fenyl 2-tiomocznik), toksycznym związkiem chemicznym, który hamuje melanogenezę i sprawia, że larwy danio pręgowanego są przezroczyste przez stosunkowo długi okres czasu6. Dostępne są również genetycznie modyfikowane przezroczyste szczepy danio pręgowanego, takie jak casper7 i crystal8, co pozwala na wizualizację na żywo i śledzenie linii aż do osiągnięcia dorosłości. Oprócz tych wysiłków mających na celu przezwyciężenie pigmentacji w celu lepszej wizualizacji na żywo u dorosłych ryb, nasze badania koncentrują się również na opracowaniu skutecznych strategii edycji genów, aby fluorescencyjne znakowanie białek było bardziej wydajne i mniej sztuczne.
Technologia KI oparta na mikrohomologii (MMEJ) za pośrednictwem CRISPR/Cas9 jest obecnie szeroko stosowana w modyfikacjach genetycznych w wielu organizmach, w tym u danio pręgowanego, ze względu na jej stosunkowo wysoką skuteczność KI9,10,11,12. Aby obrazowanie in vivo zakończyło się sukcesem, należy zmierzyć się z dwoma wyzwaniami. Jednym z nich są indele lub blizny powstałe w procesie rekombinacji; Drugim jest to, że niektóre geny docelowe ulegają endogenicznej ekspresji na niskim poziomie, co prowadzi do słabych sygnałów koeksprymowanego znacznika fluorescencyjnego i niepowodzenia wykrywania in vivo. Dążąc do wydajnego i dokładnego znakowania białek oraz minimalizacji zakłóceń endogennych poziomów ekspresji genów, w ramach niedawnych prac opisano zoptymalizowaną strategię łączącą metodę znakowania "VH" wzmacniającą sygnał fluorescencyjny i udoskonalony przepływ pracy przesiewowej linii zarodkowej13, która jest bardziej odpowiednia do znakowania fluorescencyjnego genów o niskiej ekspresji i bardziej wydajna niż poprzednie metody poprzez optymalizację szkieletu dawcy i połączenie reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i Weryfikacje fluorescencyjne w celu wdrożenia badań przesiewowych linii zarodkowej przy najniższych kosztach czasu i wysiłku. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół krok po kroku dla zgłoszonej metody, w tym etapy przygotowania zarodków i hodowli danio pręgowanego, projektowanie sgRNA, transkrypcję sgRNA in vitro, transkrypcję mRNA Cas9 in vitro, mikroiniekcję zarodka danio pręgowanego, badanie przesiewowe in vivo pod kątem sgRNA o najwyższej wydajności, projektowanie i budowę plazmidu dawcy, genotypowanie danio pręgowanego KI, badanie przesiewowe linii zarodkowej KI oraz obrazowanie i fenotypowanie danio pręgowanego KI. Ten kompleksowy protokół, zapewniający najnowocześniejszą metodę znakowania fluorescencyjnego, bez wątpienia promowałby badania z wykorzystaniem danio pręgowanego w różnych dziedzinach nauki i przyniósłby korzyści czytelnikom z różnych środowisk akademickich.

<table><tbody><tr><td>1000 &mikro; L&nbsp; końcówki</td><td>Dowolna marka</td><td>Nie dotyczy</td><td>Do wszystkich manipulacji</td></tr><tr><td>Probówki 1,5 ml</td><td>Dowolna marka</td><td>Nie dotyczy Do</td><td>przechowywania i wirowania różnych roztworów</td></tr><tr><td>Probówki 1,5 ml (bez RNaz)</td><td>Dowolna marka</td><td>Nie</td> dotyczy <td>Do przechowywania i odwirowywania roztworów wolnych od RNaz</td></tr><tr><td>10 i mikro; L końcówki</td><td>Dowolna marka</td><td>Nie dotyczy Do</td><td>wszystkich manipulacji</td></tr><tr><td>10 i mikro; Końcówki L (bez RNaz)</td><td>Dowolna marka</td><td>Nie dotyczy Do</td><td>manipulacji bez RNaz</td></tr><tr><td>1000 i mikro; L&nbsp; wskazówki (bez RNaz)</td><td>Dowolna marka</td><td>Nie dotyczy Do</td><td>manipulacji bez RNaz</td></tr><tr><td>1-fenylo 2-tiomocznik (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>Aby zahamować melanogenezę i utrzymać przezroczystość larw</td></tr><tr><td>200 &mikro; L końcówki</td><td>Dowolna marka</td><td>Nie dotyczy Do</td><td>wszystkich manipulacji</td></tr><tr><td>200 i mikro; Końcówki L (bez RNaz)</td><td>Dowolna marka</td><td>Nie</td> dotyczy <td>Do manipulacji bez RNaz</td></tr><tr><td>2x Taq Plus Master Mix II (Dye Plus)</td><td>Vazyme</td><td>P213-03</td><td>PCR do testów wydajności sgRNA</td></tr><tr><td>Szalki 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>Do</td></tr><tr><td>obrazowania płytek 6-dołkowych</td><td>Dowolna marka</td><td>Nie</td> dotyczy <td>Do indywidualnego i tymczasowego chowu danio pręgowanego</td></tr><tr><td>Acc65I</td><td>NEB</td><td>R0599S</td><td>Dla trawienie enzymatyczne</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma 695092</td><td></td><td>Do przygotowania buforu TAE</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Biofroxx</td><td>8211GR500</td><td>Do płytek LB</td></tr><tr><td>Ampicylina, sól sodowa</td><td>Sangon</td><td>A610028</td><td>Do płytek LB</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>Do przygotowania buforu zarodka</td></tr><tr><td>Rurki kapilarne</td><td>Aparat</td> <td>Harvarda30-0016</td><td>Do igieł do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>Rurki kapilarne</td><td>Dowolny</td><td>identyfikator marki (średnica wewnętrzna) = 0,1 mm</td><td>Do ilościowego oznaczania kropli 1-nL</td></tr><tr><td>CRISPRscan</td><td></td><td>&nbsp; http://www.crisprscan.org/</td> <td>Do projektu sgRNA</td></tr><tr><td>DH5 i alfa;</td><td>TIANGEN</td><td>CB101</td><td>Do transformacji</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>Do przygotowania buforu do lizy i buforu TAE</td></tr><tr><td>Ensembl Ensembl</td><td></td><td>&nbsp; https://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index</td><td>Aby znaleźć informacje o genach</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>HUSHI</td><td>64-17-5</td><td>Do oczyszczania i ekstrakcji DNA</td></tr><tr><td>Egzonukleaza III</td><td>Takara</td><td>2170A</td><td>LIC</td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz zasilany gazem</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-100A</td><td>Do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>System elektroforezy żelowej</td><td>WIX</td><td>WIX-EP3000</td><td>Do żelu Rękawice do elektroforezy</td></tr><tr><td></td><td>Dowolna marka</td><td>Nie dotyczy Do</td><td>wszystkich manipulacji</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>sgdbio</td><td>10010518</td><td>Do płytek LB</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sangon</td><td>A501745</td><td>Do płytek LB</td></tr><tr><td>gRNA-pMD19-T</td><td>Chińskie Centrum Zasobów Zebry (CZRC)</td><td>CZP3</td><td>plazmid sgRNA zawierający rusztowanie sgRNA</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Dla zarodka przygotowanie buforu</td></tr><tr><td>Roztwór do wytrącania chlorku litu</td><td>Thermofisher</td><td>AM9480</td><td>Wytrącanie sgRNA, wolne od RNaz</td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>A600015 Sangon</td><td></td><td>Do przygotowania 4% żeli agarozowych</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>sgdbio</td><td>20025118</td><td>Do płyt LB</td></tr><tr><td>Wanna metalowa</td><td>Dowolna marka</td><td>Nie</td> dotyczy <td>Do inkubacji w stałej temperaturze</td></tr><tr><td>Błękit metylenowy</td><td>Sigma</td><td>M9140</td><td>Do przygotowania bufora zarodków</td></tr><tr><td>Forma mikroinekcyjna</td><td>Domowej roboty</td><td>Nie dotyczy</td><td>Do generowania rowków do przechowywania zarodków podczas mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Mikroładowarka, końcówka do napełniania Femtotips i innych mikrokapilar szklanych, sterylna, 0,5 &ndash; 20 &micro; L, 100 mm, jasnoszary, 192 szt. (2 stojaki i czasy; 96 szt.)</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Do ładowania roztworu do mikroiniekcji do igły iniekcyjnej, Ściągacz do mikropipet bez RNaz</td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>Do generowania igieł do</td></tr><tr><td>wstrzykiwań Mikropipety</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Do wszystkich manipulacji</td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td>Dowolna marka</td><td>Nie dotyczy</td><td>Do odlewania płytki iniekcyjnej i żeli agarozowych</td></tr><tr><td>MinElute PCR Zestaw do oczyszczania (50)</td><td>QIAGEN</td><td>28004</td><td>Do oczyszczania produktów PCR i produktów trawienia, mMESSAGE mMESSAGE T3 bez RNaz</td></tr><tr><td>Zestaw do transkrypcji</td><td>Invitrogen</td><td>AM1348</td><td>Transkrypcja in vitro mRNA Cas9, bez RNaz</td></tr><tr><td>N2</td><td>Any</td> marki <td>Do</td><td>mikroiniekcji</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma S5886</td><td></td><td>Do przygotowania buforu zarodka i buforu do lizy</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Do przygotowania buforu zarodków</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sangon</td><td>A100173</td><td>Do przygotowania buforu TAE</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Thermofisher</td><td>R0581</td><td>Manipulacje związane z RNA, wolne od RNaz</td></tr><tr><td>PciI</td><td>NEB</td><td>R0655S</td><td>Do maszyny PCR do trawienia enzymatycznego</td></tr><tr><td></td><td>Dowolna marka</td><td>Nie dotyczy</td><td>Amplifikacja PCR</td></tr><tr><td>Probówki paskowe PCR</td><td>Dowolna marka</td><td>Nie dotyczy Do</td><td></td></tr><tr><td>probówek PCR PCR</td><td>FEITONGKANG</td><td>BLP-200</td><td>Do PCR</td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Dowolna marka</td><td>Nie dotyczy</td><td>Do hodowli larw danio pręgowanego itp.</td></tr><tr><td>Czerwień fenolowa</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>Do mikroiniekcji, bez RNaz</td></tr><tr><td>Uchwyt na pipety</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-PH1</td><td>Do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>PrimeStar (Premix)</td> <td>Takara</td><td>DR040A</td><td>Do klonowania molekularnego</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Merck</td><td>539480</td><td>Do ekstrakcji genomowego DNA</td></tr><tr><td>pT3TS (T3: zCas9-UTRglobin)</td> <td>Centrum zasobów dla danio pręgowanego w Chinach (CZRC)</td><td>Szablon plazmidu</td> <td>CZP11</td> Cas9</tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>Dowolna marka</td><td>Nie dotyczy</td><td>Do wirowania związanego z RNA</td></tr><tr><td>Skala</td><td>Sartorius</td><td>BCE124-1CCN</td><td>Do odlewania płytek iniekcyjnych i żeli agarozowych</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Dowolna marka</td><td>Nie dotyczy Do</td><td>przycinania ogonów dorosłych ryb</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sangon</td><td>A600485</td><td>Do przygotowania</td></tr> <tr><td>buforu do lizyMałe pędzle</td><td>Dowolna marka</td><td>Nie dotyczy Do</td><td>delikatnie poruszających się zarodków na płytkach do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Thermofisher</td><td>NanoDrop 2000</td><td>Do pomiarów stężenia DNA/RNA</td></tr><tr><td>Mikrometr stolikowy</td><td>Dowolna marka</td><td>DIV (Podział) = 0,01 mm</td><td>Do ilościowego oznaczania kropli 1-nL</td></tr><tr><td>Stereoskopowy mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>Do obserwacji ekspresji genów</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>Do obserwacji i mikroiniekcji</td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express System produkcji RNA na dużą skalę</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td>Transkrypcja in-vitro sgRNA, bez RNaz</td></tr><tr><td>Inkubator z kontrolowaną temperaturą</td><td>Dowolna marka</td><td>Nie dotyczy</td><td>Do inkubacji zarodków</td></tr><tr><td>TIDE</td><td></td><td>https://tide.nki.nl/</td> <td>Do analizy wydajności sgRNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Metanosulfonian trikainy</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>Do przygotowania roztworu trikainy</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sangon</td><td>A600194</td><td>Do roztworu trikainy, buforu do lizy i preparatu buforu TAE</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td>Do płytek LB</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Dowolna marka</td><td>Nie</td> dotyczy <td>Do cięcia igieł iniekcyjnych</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td>Do enzymatycznego trawienie</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td>Do płyt LB</td></tr><tr><td>System akwariowy dla danio pręgowanego</td><td>ESEN</td><td>ESEN-AW-S1</td><td>Do hodowli dorosłych ryb</td></tr><tr><td>Zbiorniki godowe danio pręgowanego (z przegrodą)</td><td>Dowolna marka</td><td>Nie dotyczy Do</td><td>krycia ryb</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 900+Airyscan2</td><td>ZEISS</td><td>Zeiss LSM900</td><td>Do obrazowania konfokalnego ryb znakowanych fluorescencyjnie i analizy danych</td></tr><tr><td>Strona internetowa ZFIN</td><td>ZFIN</td><td>http://zfin.org/</td> <td>Aby znaleźć informacje o genach</td></tr></tbody></table>

znakowanie fluorescencyjne w celu wizualizacji białek o niskiej ekspresji u danio pręgowanego

Fluorescence Labeling to Visualize Low-Expressed Proteins in Zebrafish

Technologia KI, w której pośredniczy CRISPR/Cas9, pozwala na łatwiejsze znakowanie białkami fluorescencyjnymi u danio pręgowanego (Danio rerio), preferowanego organizmu modelowego do obrazowania in vivo ze względu na jego przezroczystość we wczesnej fazie rozwoju. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół wykonywania wysokowydajnego genu fluorescencji KI, szybkich badań przesiewowych dla założycieli KI oraz śledzenia białek o niskiej liczebności u larw danio pręgowanego, który położy kluczowe podstawy dla późniejszych badań fizjo-patologicznych na danio pręgowanym. Obecny protokół obejmuje kompletne kroki projektowania sgRNA dla genu będącego przedmiotem zainteresowania, transkrypcji sgRNA in vitro, transkrypcji mRNA Cas9 in vitro, badania przesiewowego sgRNA in vivo dla genu o najwyższej wydajności, projektowania i budowy plazmidu dawcy, mikroiniekcji larw danio pręgowanego, badania przesiewowego założyciela KI i obrazowania na żywo danio pręgowanego. Uwzględniono i omówiono krytyczne kroki, wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów, metody kontroli jakości oraz zalety i zastosowania tego protokołu. Protokół ten zapewnia szybkie i dokładne wyniki przy niskich kosztach i został potwierdzony w wielu badaniach.

Złącza szczelinowe składające się z białek polimerycznych zwanych koneksynami są niezbędne do wymiany jonów i metabolitów o niskiej masie cząsteczkowej pomiędzy kontaktującymi się komórkami. Opisana powyżej metoda znakowania białkami fluorescencyjnymi została wykorzystana odpowiednio do znakowania connexin 39.9 (Rysunek 5A) oraz connexin 44.1 (Rysunek 5B). Prawidłowość wstawienia (KI) zweryfikowano za pomocą PCR złączy (Rys...

Tutaj prezentujemy protokół oznaczania białek znacznikiem białka fluorescencyjnego u larw danio pręgowanego, nowo opracowany i zmodyfikowany system in vivo, szczególnie przydatny do wizualizacji białek o niskiej obfitości u danio pręgowanego.

Znakowanie fluorescencyjne w celu wizualizacji białek o niskiej ekspresji u danio pręgowanego

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in ...

Ten produkt jest zoptymalizowany pod kątem wyrównywania białek za pomocą znacznika białka fluorescencyjnego oraz wizualizacji lokalizacji i ekspresji białka interesującego osobnika laboratoryjnego danio pręgowanego. Jest to szczególnie przydatne do obrazowania białek ulegających ekspresji w niskiej obfitości. Nasza metoda upraszcza i przyspiesza proces budowy dawcy.Komponenty te, z wyjątkiem CDS, są wcześniej włączane do sieci szkieletowej. Dawca został również zoptymalizowany w celu zwiększenia wydajności. Przepływ pracy ekranu transmisji gromadzi dziedziczne jądro przy najniższym koszcie czasu i wysiłku.Danio pręgowany jest organizmem modelowym szeroko stosowanym w badaniach nad infekcjami i odpornością. Szczególnie interesują nas mechanizmy leżące u podstaw sepsy. Ponieważ jesteśmy teraz w stanie łatwo wykonać znakowanie fluorescencyjne za pomocą naszego protokołu, postaramy się oznaczyć obraz, białka i komórki sepsy u danio pręgowanego.Na początek umieść jedną samicę danio pręgowanego i dwa zdrowe samce danio pręgowanego w zbiorniku godowym. Użyj przegrody, aby oddzielić samce od samic, aby przygotować je do krycia. W dniu mikroiniekcji należy przygotować mieszankę do mikroiniekcji na lodzie w środowisku wolnym od RNaz.Za pomocą końcówki pipety niezawierającej rnazy wsypać roztwór do mikroiniekcji do igły. Umieść załadowaną igłę w mikromanipulatorze podłączonym do mikrowtryskiwacza. Pod mikroskopem użyj spiczastej pęsety, aby przeciąć końcówkę igły, delikatnie ściskając ją, aż pęknie.Dostosuj ciśnienie wstrzykiwania, aż igła będzie konsekwentnie wyrzucać kroplę o wielkości jednego nanolitra. Następnie wyjmij przegrodę ze zbiornika godowego i pozwól rybom rozmnażać się przez sześć minut. Zebrać i przenieść zarodki w jednym stadium komórkowym na szalkę Petriego zawierającą bufor zarodka.Zbadaj stan zdrowia zarodków pod mikroskopem świetlnym i usuń niezapłodnione jaja lub szczątki. Odłóż 20 zdrowych zarodków na osobną szalkę Petriego jako niewstrzyknięte grupy kontrolne i oznacz szalkę. Za pomocą małej szczoteczki przenieś i delikatnie ułóż zdrowe zarodki w jednym stadium komórkowym na rowkach płytki do mikroiniekcji ogrzanej do temperatury pokojowej.Usuń nadmiar buforu z płytki. Za pomocą końcówki igły delikatnie dostosuj położenie każdego zarodka tak, aby kij zwierzęcia był skierowany w stronę igły. Wstrzyknąć jeden nanolitr zmieszanego roztworu do bieguna zwierzęcego.Po wstrzyknięciu delikatnie przepłukać zarodki do 6-dołkowej płytki z buforem do zarodków. Umieść płytkę w inkubatorze o stałej temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza. Po 10 godzinach od zapłodnienia zbadaj rozwój zarodka pod mikroskopem stereoskopowym i usuń martwe zarodki.Po 24 godzinach od zapłodnienia zbierz zarodki do 1,5-mililitrowych probówek do genotypowania i ostrożnie wylej nadmiar wody. Do każdej probówki dodać 100 mikrolitrów buforu do lizy zawierającego proteinazę K. Inkubować probówki w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez godzinę, a następnie w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 minut.Po inkubacji dodaj 200 mikrolitrów etanolu i dobrze wymieszaj. Odwirować probówkę o sile 19 000 G przez 10 minut i wyrzucić supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu z 500 mikrolitrami 70% etanolu. Ponownie odwirować i wysuszyć granulkę na powietrzu przed rozpuszczeniem jej w 50 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody.Użyj jednego mikrolitra ekstraktu do przygotowania mieszaniny reakcyjnej do PCR. Po PCR uruchom żele agarozowe z dwoma mikrolitrami produktów PCR, aby potwierdzić pomyślną amplifikację. Przeprowadź trawienie enzymatyczne, aby ocenić wydajność sgRNA.Delikatnie wymieszać roztwór wytrawiający i inkubować w temperaturze pokojowej, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Uruchom żele agarozowe dla strawionych produktów wraz z niestrawionymi kontrolami PCR, aby potwierdzić trawienie. Aby przeanalizować wydajność sgRNA, otwórz stronę internetową TIDE i kliknij przycisk Start TIDE.Wprowadź sekwencję prowadzącą sgRNA do ramki sekwencji prowadzącej. Kliknij przycisk Przeglądaj, aby przesłać wynik sekwencjonowania kontrolki typu dzikiego do pola chromatogramu próbki kontrolnej. Podobnie, prześlij wynik sekwencjonowania edytowanej próbki do pola chromatogramu próbki testowej.Kliknij przycisk Aktualizuj widok, aby przeanalizować wyniki. Na początek użyj klonowania niezależnego od ligacji lub LIC z egzonukleazą III, aby skonstruować plazmid dawcy. Zaprojektuj podkład F1 z nakładającą się sekwencją z elementem wektorowym 1 i częścią elementu 2.Zaprojektuj podkład R2 z częścią elementu 1, elementu 2 i elementu 3. Zaprojektuj starter F2 tak, aby zawierał pierwiastki 3 i 4 oraz 5 sekwencję główną CDS podążającą za miejscem docelowym sgRNA. Zaprojektuj podkład R1 z trzema sekwencjami głównymi sekwencji powlekania i sekwencją nakładającą się z wektorem.Użyj danio pręgowanego CDNA jako szablonu i wykonaj PCR z zaprojektowanymi starterami. Oczyść produkty PCR za pomocą wytrącania etanolu. Trawić wektor dawcy za pomocą enzymów restrykcyjnych, takich jak pCI i Acc65I, i oczyszczać strawiony wektor donorowy.Określ ilościowo oczyszczone fragmenty PCR i strawiony wektor dawcy za pomocą elektroforezy żelowej DNA. Następnie przygotuj mieszankę LIC z oczyszczonym wektorem dawcy i inkubuj na lodzie przez 60 minut. Dodaj jeden mikrolitr 0,5 molowego EDTA, aby zatrzymać reakcję.Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać roztwór. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez pięć minut. Schłodzić produkty LIC na lodzie.Następnie przekształć kompetentne komórki DH5-Alpha za pomocą produktów LIC. Umieść przekształcone komórki na płytkach Luria-Bertani zawierających ampicylinę i hoduj je przez 16 godzin. Po inkubacji wybierz pojedyncze kolonie z płytek LIC do analizy trawienia enzymatycznego i sekwencjonowania DNA.Ekstrahuj i oczyść prawidłowe plazmidy dawcy za pomocą zestawu do oczyszczania. Wstrzyknąć zarodki danio pręgowanego mieszanką mikroiniekcyjną dla genu knockin' 12 do 48 godzin po mikrowstrzyknięciu, pod mikroskopem stereofluorescencyjnym, obserwować fluorescencję larw danio pręgowanego. Stosując ustaloną metodę przesiewową, wybierz larwy fluorescencyjne i hoduj je oddzielnie.W wieku jednego miesiąca należy pobrać mały kawałek płetwy dorszowej z każdego znieczulonego danio pręgowanego do oznakowanej probówki PCR. Umieść odpowiedniego znieczulonego danio pręgowanego na 6-dołkowej płytce wypełnionej przefiltrowaną wodą sterylizowaną promieniami UV, zgodnie z etykietą na probówce. Ekstrakcja genomowego DNA metodą lizy alkalicznej.Zaprojektuj starter do przodu przed lewym ramieniem homologii i starter odwrotny na wkładce. Wykonaj PCR, celując w pięć głównych połączeń sekwencji. Zbadaj zarodki F1 uzyskane przez skrzyżowanie danio pręgowanego F poddanego badaniom przesiewowym z danio pręgowanym typu dzikiego pod kątem wzorców ekspresji GFP.Genotyp zarodków F1 za pomocą PCR ze złączem. Dziedziczną swoistą fluorescencję zaobserwowano w mięśniach wszystkich potomków F1, co wskazuje na pomyślne znakowanie GFP connexonu 39.9. Dziedziczną specyficzną fluorescencję wykryto w soczewce całego potomstwa F2, co sugeruje udane znakowanie mCherry koneksonu 44.1.Poprawność knockin'of connexonów 39.9 i 44.1 zweryfikowano za pomocą reakcji łańcuchowych polimerazy złączowej.

fluorescence-labeling-to-visualize-low-expressed-proteins-in-zebrafish

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Hybrydyzacja in situ w preparatach całych jest jedną z najszerzej stosowanych technik w biologii rozwoju. Przedstawiamy tutaj protokół podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości, służący do analizy precyzyjnego wzorca ekspresji pojedynczego genu oraz określania nakładania się domen ekspresji dwóch genów. Włączyliśmy barwienie jąder jodkiem propidyny w celu uwydatnienia organizacji tkanki.

Wysokorozdzielcza podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całych embrionach ryby danio-ostrobłysku

Kluczem do zrozumienia procesów morfogenetycznych kształtujących wczesny embrion jest możliwość obrazowania komórek w wysokiej rozdzielczości. Opisujemy tutaj technikę znakowania pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek w całych embrionach ryby danio pręgowanej za pomocą białka GFP skierowanego do błony komórkowej.

Znakowanie i obrazowanie komórek w rdzeniu przedłużonym rybki danio

Niniejszy protokół opisuje metodę znakowania i śledzenia losów niewielkich grup komórek w embrionach ryb danio pręgowany poprzez UV-odblokowanie uwięzionej fluoresceiny, a następnie immunoznakowanie całego preparatu w celu wzmocnienia sygnału z odblokowanej fluoresceiny.

Znakowanie linii komórkowych ryb danio-pręgowanych za pomocą dekstranu fluoresceiny uwalnianego laserowo

Obumierające komórki są usuwane z tkanek nabłonkowych poprzez skoordynowany skurcz komórek sąsiednich, bez naruszania funkcji barierowej. Przejrzystość optyczna rozwijających się rybek danio przymrużonych stanowi doskonały system do wizualizacji procesu ekstruzji w żywych nabłonkach. W niniejszej pracy opisujemy metody indukcji i obrazowania ekstruzji w naskórku larw rybek danio przymrużonych z rozdzielczością komórkową.

Obrazowanie na żywo ekstruzji komórek z naskórka rozwijającego się danio pręgowanego

Opisano metodę fotoaktywacji pojedynczych komórek zawierających „uwięzione” (caged) białko fluorescencyjne z wykorzystaniem absorpcji dwufotonowej z femtosekundowego oscylatora laserowego Ti:Szafir. W celu mapowania losu fotoaktywowanej komórki zastosowano immunohistochemię. Technikę tę można zastosować do każdego typu komórek.

Mapowanie losów pojedynczych komórek u danio przeznaczonego (zebrafish)

Opisany tutaj jest protokół półautomatycznego obrazowania specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego.

Półautomatyczne obrazowanie specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego

Zarodek danio pręgowanego jest doskonałym modelem do badań nad biologią rozwojową. Podczas embriogenezy danio pręgowany rozwija się z masą żółtka, co stanowi trójwymiarowe wyzwanie dla obserwacji i analizy próbek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób tworzyć dwuwymiarowe preparaty do montażu płaskiego całych próbek zarodków danio pręgowanego barwionych metodą montażu in situ (WISH).

Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca

Poziomy białka w komórkach i tkankach są często ściśle regulowane przez równowagę produkcji białka i jego usuwania. Korzystając z rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP), kinetykę klirensu białek można eksperymentalnie zmierzyć in vivo.

Pomiar stabilności białek w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP)

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Ukierunkowane manipulacje mające na celu wywołanie ukierunkowanego stresu lub śmierci w poszczególnych komórkach były stosunkowo trudne do osiągnięcia. W tym artykule opisano metodę ablacji w rozdzielczości pojedynczej komórki, polegającą na selektywnym stresowaniu i zabijaniu pojedynczych komórek w hodowli komórkowej i żywych zwierzętach, w oparciu o standardowy konfokalny laser UV.

Wyzwalanie stresu i śmierci komórek za pomocą konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej z laserem UV

Ten protokół demonstruje sekwencyjną immunofluorescencję i immunohistochemię na kriosekcjach z wczesnych stadiów zarodków danio pręgowanego, umożliwiając precyzyjne analizy kolokalizacji w określonych populacjach komórek.

Sekwencyjna immunofluorescencja i immunohistochemia na kriowyciętych zarodkach danio pręgowanego

Poznaj metodę znakowania fluorescencyjnego białek o niskiej ekspresji u larw Danio rerio. Protokół upraszcza konstrukcję dawcy i usprawnia wizualizację białek w badaniach biotechnologicznych.

Znakowanie fluorescencyjne w celu wizualizacji białek o niskiej ekspresji u danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów