Name: Analiza aktywności ludzkich limfocytów T w allogenicznej kokulturze wstępnie leczonych komórek nowotworowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj metodę analizy aktywności limfocytów T w allogenicznej kokulturze z napromieniowanymi komórkami nowotworowymi. Protokół wykorzystuje cytometrię przepływową do oceny proliferacji i ekspresji markerów powierzchniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało częściowo sfinansowane przez Interdyscyplinarne Centrum Badań Klinicznych w Erlangen (IZKF Erlangen) oraz Bayerisches Zentrum für Krebsforschung (BZKF).

<ol><li>Hiam-Galvez, K. J., Allen, B. M., Spitzer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+immunity+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Systemic immunity in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 21 (6), 345-359 (2021).</li>
<li>Mantovani, A., Allavena, P., Marchesi, F., Garlanda, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+as+tools+and+targets+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Macrophages as tools and targets in cancer therapy.</a> Nat Rev Drug Discov. 21 (11), 799-820 (2022).</li>
<li>Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+cancer+immunotherapy%3A+From+t+cell+basic+science+to+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">A guide to cancer immunotherapy: From t cell basic science to clinical practice.</a> Nat Rev Immunol. 20 (11), 651-668 (2020).</li>
<li>Dunn, G. P., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunobiology+of+cancer+immunosurveillance+and+immunoediting%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The immunobiology of cancer immunosurveillance and immunoediting.</a> Immunity. 21 (2), 137-148 (2004).</li>
<li>Mittal, D., Gubin, M. M., Schreiber, R. D., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+cancer+immunoediting+and+its+three+component+phases--elimination%2C+equilibrium+and+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">New insights into cancer immunoediting and its three component phases--elimination, equilibrium and escape.</a> Curr Opin Immunol. 27, 6-25 (2014).</li>
<li>Irianto, T., Gaipl, U. S., Ruckert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+modulation+during+anti-cancer+radio%28immuno%29therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immune modulation during anti-cancer radio(immuno)therapy.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 382, 239-277 (2024).</li>
<li>Burtness, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+alone+or+with+chemotherapy+versus+cetuximab+with+chemotherapy+for+recurrent+or+metastatic+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck+%28keynote-048%29%3A+A+randomized%2C+open-label%2C+phase+3+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab alone or with chemotherapy versus cetuximab with chemotherapy for recurrent or metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck (keynote-048): A randomized, open-label, phase 3 study.</a> Lancet. 394 (10212), 1915-1928 (2019).</li>
<li>Hecht, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+single+cycle+induction+treatment+with+cisplatin%2Fdocetaxel%2F+durvalumab%2Ftremelimumab+in+locally+advanced+HNSCC%3A+First+results+of+checkered-CD8%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of single cycle induction treatment with cisplatin/docetaxel/ durvalumab/tremelimumab in locally advanced HNSCC: First results of checkered-CD8.</a> J Immunother Cancer. 8 (2), e001378(2020).</li>
<li>Chen, J. A., Ma, W., Yuan, J., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+biomarkers+and+rationale+strategies+to+overcome+resistance+to+immune+checkpoint+inhibitors+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Res%22%5BJournal%5D)">Translational biomarkers and rationale strategies to overcome resistance to immune checkpoint inhibitors in solid tumors.</a> Cancer Treat Res. 180, 251-279 (2020).</li>
<li>Solomon, B., Young, R. J., Rischin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%3A+Genomics+and+emerging+biomarkers+for+immunomodulatory+cancer+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Head and neck squamous cell carcinoma: Genomics and emerging biomarkers for immunomodulatory cancer treatments.</a> Semin Cancer Biol. 52 (Pt 2), 228-240 (2018).</li>
<li>Meidenbauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+atm+or+atr+in+combination+with+hypo-fractionated+radiotherapy+leads+to+a+different+immunophenotype+on+transcript+and+protein+level+in+HNSCC%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of atm or atr in combination with hypo-fractionated radiotherapy leads to a different immunophenotype on transcript and protein level in HNSCC.</a> Front Oncol. 14, 1460150(2024).</li>
<li>Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+effects+of+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory effects of radiotherapy.</a> Int J Mol Sci. 21 (21), 8151(2020).</li>
<li>Wimmer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypofractionated+radiotherapy+upregulates+several+immune+checkpoint+molecules+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cells+independently+of+the+HPV+status+while+icos-l+is+upregulated+only+on+HPV-positive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Hypofractionated radiotherapy upregulates several immune checkpoint molecules in head and neck squamous cell carcinoma cells independently of the HPV status while icos-l is upregulated only on HPV-positive cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (17), 9114(2021).</li>
<li>Derer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoradiation+increases+pd-l1+expression+in+certain+melanoma+and+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemoradiation increases pd-l1 expression in certain melanoma and glioblastoma cells.</a> Front Immunol. 7, 610(2016).</li>
<li>Schatz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normofractionated+irradiation+and+not+temozolomide+modulates+the+immunogenic+and+oncogenic+phenotype+of+human+glioblastoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlenther+Onkol%22%5BJournal%5D)">Normofractionated irradiation and not temozolomide modulates the immunogenic and oncogenic phenotype of human glioblastoma cell lines.</a> Strahlenther Onkol. 199 (12), 1140-1151 (2023).</li>
<li>Xu, M. M., Pu, Y., Zhang, Y., Fu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+adaptive+immunity+in+the+efficacy+of+targeted+cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of adaptive immunity in the efficacy of targeted cancer therapies.</a> Trends Immunol. 37 (2), 141-153 (2016).</li>
<li>Olivo Pimentel, V., Yaromina, A., Marcus, D., Dubois, L. J., Lambin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+co-culture+assay+to+assess+anti-tumor+cd8%28%2B%29+t+cell+cytotoxicity+via+luminescence+and+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel co-culture assay to assess anti-tumor cd8(+) t cell cytotoxicity via luminescence and multicolor flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 487, 112899(2020).</li>
<li>Kulp, M., Diehl, L., Bonig, H., Marschalek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+primary+human+t+cells+with+leukemia+cells+to+measure+regulatory+t+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Co-culture of primary human t cells with leukemia cells to measure regulatory t cell expansion.</a> STAR Protoc. 3 (3), 101661(2022).</li>
<li>Ruckert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+modulatory+effects+of+radiotherapy+as+basis+for+well-reasoned+radioimmunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlenther+Onkol%22%5BJournal%5D)">Immune modulatory effects of radiotherapy as basis for well-reasoned radioimmunotherapies.</a> Strahlenther Onkol. 194 (6), 509-519 (2018).</li>
<li>Samstein, R. M., Riaz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response+in+immunotherapy+and+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Radiat+Oncol%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response in immunotherapy and radiation.</a> Adv Radiat Oncol. 3 (4), 527-533 (2018).</li>
<li>Meeren, A. V., Bertho, J. M., Vandamme, M., Gaugler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation+enhances+il-6+and+il-8+production+by+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation enhances il-6 and il-8 production by human endothelial cells.</a> Mediators Inflamm. 6 (3), 185-193 (1997).</li>
<li>Zimmerman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ifn-gamma+upregulates+survivin+and+ifi202+expression+to+induce+survival+and+proliferation+of+tumor-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ifn-gamma upregulates survivin and ifi202 expression to induce survival and proliferation of tumor-specific T cells.</a> PLoS One. 5 (11), e14076(2010).</li>
<li>Saraiva, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+HLA-dr+in+cytotoxic+t+lymphocytes%3A+A+validated+predictive+biomarker+and+a+potential+therapeutic+strategy+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Expression of HLA-dr in cytotoxic t lymphocytes: A validated predictive biomarker and a potential therapeutic strategy in breast cancer.</a> Cancers (Basel). 13 (15), (2021).</li>
<li>Dillon, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atr+inhibition+potentiates+the+radiation-induced+inflammatory+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Atr inhibition potentiates the radiation-induced inflammatory tumor microenvironment.</a> Clin Cancer Res. 25 (11), 3392-3403 (2019).</li>
<li>Geiger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Arginine+modulates+T+cell+metabolism+and+enhances+survival+and+anti-tumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">L-Arginine modulates T cell metabolism and enhances survival and anti-tumor activity.</a> Cell. 167 (3), 829-842.e13 (2016).</li>
<li>Rodriguez, P. C., Quiceno, D. G., Ochoa, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Arginine+availability+regulates+t-lymphocyte+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">L-Arginine availability regulates t-lymphocyte cell-cycle progression.</a> Blood. 109 (4), 1568-1573 (2007).</li>
<li>Lozano-Ojalvo, D., López-Fandiño, R., López-Expósito, I., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLozano-Ojalvo%2C+D+%22The+impact+of+food+bioactives+on+health%3A+In+vitro+and+ex+vivo+models%22">The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo models</a>. Verhoeckx, K., et al. , Springer International Publishing. Cham. 169-180 (2015).</li>
<li>Gronholm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+for+precision+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy.</a> Cancer Res. 81 (12), 3149-3155 (2021).</li>
<li>Perez, C., Gruber, I., Arber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-the-shelf+allogeneic+t+cell+therapies+for+cancer%3A+Opportunities+and+challenges+using+naturally+occurring+%26%2334%3Buniversal%26%2334%3B+donor+t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Off-the-shelf allogeneic t cell therapies for cancer: Opportunities and challenges using naturally occurring &#34;universal&#34; donor t cells.</a> Front Immunol. 11, 583716(2020).</li>
<li>Martinez Bedoya, D., Dutoit, D., Migliorini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+car+t+cells%3A+An+alternative+to+overcome+challenges+of+car+t+cell+therapy+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Allogeneic car t cells: An alternative to overcome challenges of car t cell therapy in glioblastoma.</a> Front Immunol. 12, 640082(2021).</li>
<li>Schnellhardt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prognostic+value+of+FOXP3%2B+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+rectal+cancer+depends+on+immune+phenotypes+defined+by+CD8%2B+cytotoxic+T+cell+density%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The prognostic value of FOXP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in rectal cancer depends on immune phenotypes defined by CD8+ cytotoxic T cell density.</a> Front Immunol. 13, 781222(2022).</li>
<li>Zitvogel, L., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+W+%22Oncoimmunology%3A+A+practical+guide+for+cancer+immunotherapy%22">Oncoimmunology: A practical guide for cancer immunotherapy</a>. , Springer International Publishing. Cham. 23-39 (2018).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Przedstawiony tutaj protokół oferuje szybką i łatwą metodę analizy zdolności proliferacyjnych limfocytów T wraz z ich statusem aktywacji w warunkach kohodowli ze wstępnie leczonymi komórkami nowotworowymi. W ten sposób można łatwo badać wpływ różnych metod leczenia, takich jak RT, CT lub TT, na aktywność i proliferację limfocytów T, budując podstawy do dalszych głębszych analiz immunologicznych obiecujących podejść. Reprezentatywne wyniki przedstawione w tym manuskrypcie dowodzą, że ten allogeniczny test kohodowli limfocytów T działa dobrze. Znaczące różnice w proliferacji limfocytów T, a także w aktywności limfocytów T, zaobserwowano w przypadku kohodowli z inaczej traktowanymi ludzkimi komórkami HSC4 (HNSCC) (Figura 4 i Figura 5). Stwierdzono, że leczenie HSC4 samą RT lub w połączeniu z TT spowodowało zwiększoną proliferację limfocytów T, w szczególności w odniesieniu do wysoce proliferacyjnej frakcji limfocytów T (ryc. 4). Zgodnie z ilościowym określeniem szybkości proliferacji, na stan aktywacji limfocytów T również w różny sposób wpływały różne schematy leczenia. Podsumowując, zastosowanie RT spowodowało silną regulację w dół ekspresji CD25 na limfocytach T, podczas gdy ekspresja HLA-DR była regulowana w górę. RT indukuje uszkodzenia DNA w napromieniowanych komórkach nowotworowych, co z kolei prowadzi do komórkowych reakcji na stres, które obejmują uwalnianie cząsteczek i cytokin związanych ze stresem i uszkodzeniem, a także ekspresję modulujących immunologicznie ligandów powierzchniowych komórek19. 
Połączenie RT z TT w postaci inhibitorów naprawy DNA dodatkowo wzmacnia i utrzymuje te efekty, ponieważ komórki nowotworowe nie są w stanie skutecznie naprawić uszkodzeń DNA wywołanych przez RT. Może to dodatkowo promować i utrzymywać wydzielanie czynników immunogennych i ekspresję immunogennych ligandów powierzchniowychkomórek 20. W związku z tym wykazaliśmy wcześniej, że leczenie komórek nowotworowych (HNSCC) inhibitorami RT i uszkodzeń DNA zmienia fenotyp immunologiczny na powierzchni komórki nowotworowej. Modulacja fenotypu immunologicznego obejmowała regulację cząsteczki stymulującej układ odpornościowy ICOS-L, a także cząsteczki immunosupresyjnej PD-L111. W odpowiedzi na tę modulację fenotypu immunologicznego komórek nowotworowych, limfocyty T mogą również regulować ekspresję markerów aktywacji na powierzchni komórki. Co więcej, RT jest dobrze znany z tego, że stymuluje uwalnianie cytokin prozapalnych, takich jak IFNγ lub IL-6, które z kolei wpływają na proliferację i aktywność limfocytów T21. Ekspresja markerów aktywacji na limfocytach T jest procesem bardzo dynamicznym. Dane z Zimmerman i wsp.22 wykazały, że CD25 ulega wysokiej ekspresji 24 godziny po stymulacji, ale jest ponownie obniżony po 96 godzinach po stymulacji. Jest to zgodne z naszymi ustaleniami. Natomiast HLA-DR jest markerem aktywacji późnej fazy i jest na ogół poprzedzony wzrostem CD25 i CD6923. Zauważalnie połączenie RT + ATRi prowadzi do znacznej regulacji w górę HLA-DR na limfocytach T w porównaniu z RT + ATMi. Odkrycie to jest zgodne z pracami Dilliona i wsp., którzy wykazali synergistyczne działanie ATRi + RT w indukowaniu stanu zapalnego TME24. Mniej wyraźną modulację aktywności i proliferacji limfocytów T osiągnięto dzięki leczeniu komórek nowotworowych samymi inhibitorami kinazy (ryc. 5). Może to wynikać z faktu, że inhibitory naprawy DNA ATMi i ATRi działają jako wzmacniacz uszkodzeń DNA wywołanych przez RT i w związku z tym nie są bardzo immunogenne, gdy są stosowane w monoterapii. Wykazaliśmy już minimalną toksyczność ATMi lub samego ATRi11. Podsumowując, wyniki potwierdzają potencjał immunogenny RT (i TT z inhibitorami uszkodzeń DNA) i dodatkowo wskazują, że ten eksperymentalny system jest odpowiedni do badań przesiewowych zdolności immunostymulacyjnych różnych metod leczenia w ludzkich komórkach raka głowy i szyi.
Mimo że przedstawiona tutaj metoda jest łatwa i solidna, w protokole należy wcześniej rozważyć kilka krytycznych kroków. Konieczna jest obecność wysokich stężeń EDTA podczas procesu izolacji, a także podczas analizy cytometrycznej przepływowej limfocytów T. Dlatego zaleca się pobranie krwi dawcy do probówek pobranych pokrytych EDTA i użycie buforu MACS uzupełnionego 10 mM EDTA w celu zapewnienia skutecznej izolacji limfocytów T i wytworzenia jednorodnej zawiesiny pojedynczej komórki do oceny cytometrii przepływowej. Ponadto skład pożywki limfocytów T ma duże znaczenie dla zdolności proliferacyjnej limfocytów T. Po przetestowaniu różnych składów pożywek hodowlanych, pożywka o niskich stężeniach L-argininy i L-lizyny daje najlepszy sygnał proliferacji limfocytów T, ponieważ L-arginina ma kluczowe znaczenie dla metabolizmu i przeżycia komórek T i powinna być dostarczana w odpowiednim stężeniu25,26. Należy jednak pamiętać, że roztwory L-argininy i L-lizyny nie są stabilne przez długi czas i dlatego należy je zużyć w ciągu 3 miesięcy. Aby uzyskać optymalną stymulację, pożywka z limfocytów T uzupełniona aminokwasami musi być przygotowywana na świeżo do każdego eksperymentu z hodowlą limfocytów T. Co więcej, liczba komórek limfocytów T, a także komórek nowotworowych, są krytycznymi czynnikami, które należy wziąć pod uwagę, ponieważ wpływają one na odczyt eksperymentu.
W przypadku komórek nowotworowych, z jednej strony, pożądana jest zbieżność komórek od 70% do 80% pod koniec eksperymentu z kokulturą. Przerost komórek nowotworowych może powodować wydzielanie czynników, które hamują wzrost komórek, a następnie wpływa również na tempo proliferacji limfocytów T. Ponieważ wzrost komórek nowotworowych jest w dużym stopniu zależny od pojedynczej linii komórkowej, zalecamy dokładne przetestowanie zachowania wzrostu odpowiedniej linii komórek nowotworowych w różnych płytkach dołkowych i dla różnych schematów leczenia. Ponadto komórki nowotworowe i limfocyty T powinny być hodowane wspólnie w stosunku 1:1. W związku z tym obowiązkowe jest wysiewanie dodatkowej studzienki komórek nowotworowych dla każdego warunku leczenia, która może być wykorzystana do określenia liczby komórek w dniu rozpoczęcia kohodowli. W ten sposób można zapewnić, że odpowiednia liczba limfocytów T zostanie wysiana dla różnych warunków leczenia. Jeśli chodzi o liczbę komórek limfocytów T, należy wziąć pod uwagę, że ilość limfocytów T, które można wyizolować od zdrowego dawcy, jest bardzo indywidualna. Limfocyty T stanowią około 45% do 70% PBMC zdrowego dawcy27. W związku z tym wymagana ilość limfocytów T powinna być już ogólnie oszacowana w momencie pobrania krwi. Ponadto gęstość limfocytów T jest ważna dla skuteczności aktywacji limfocytów T i ich przeżycia. W związku z tym limfocyty T należy wysiać w stężeniu co najmniej 1,5 miliona komórek na studzienkę 6-dołkowej płytki w 3 ml pożywki z komórek T w celu wstępnej stymulacji przed rozpoczęciem kohodowli. Możliwa jest wyższa gęstość limfocytów T, ale należy unikać mniejszej gęstości. Aktywację limfocytów T można również ocenić morfologicznie pod mikroskopem, ponieważ aktywowane limfocyty T mają tendencję do tworzenia klastrów komórek.
Ponieważ metoda ta jest uproszczonym systemem eksperymentalnym do badania zdolności immunostymulacyjnych różnych linii komórek nowotworowych i metod leczenia, ma pewne ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę. Po pierwsze, test ten opiera się na systemie allogenicznym, co oznacza, że limfocyty T dawcy nie są dopasowane do HLA z odpowiednią linią komórek nowotworowych. Tak więc to niedopasowanie HLA może już indukować stymulację limfocytów T, a następnie proliferację limfocytów T bez dalszej stymulacji ze strony leczenia komórkami nowotworowymi28. Aby określić ilościowo ten niepożądany efekt, wyizolowane limfocyty T hodowano wspólnie z linią komórkową HSC4 bez wcześniejszej stymulacji przeciwciałami CD28 i CD3. Stwierdzono, że w tym otoczeniu prawie nie indukowano proliferacji, co wskazuje, że niedopasowanie HLA ma tylko niewielki wpływ na aktywację limfocytów T w tym konkretnym środowisku eksperymentalnym. Poza tym stwierdzono istotne różnice w proliferacji i aktywacji limfocytów T w oparciu o leczenie komórkami nowotworowymi pomimo ustawienia allogenicznego. Niemniej jednak, w celu ustanowienia tego testu, potencjalna proliferacja limfocytów T indukowana przez allogeny powinna zostać przetestowana i określona ilościowo raz na początku doświadczeń. Zalecane kontrole "tylko limfocyty T" i "tylko komórki nowotworowe" są potrzebne do wystarczającego bramkowania i są obowiązkowe w każdej powtórzeniu eksperymentów. Niemniej jednak należy pamiętać, że allogeniczny system kohodowli nie rozpoznaje antygenu specyficznego dla nowotworu. W związku z tym system ten może nie odzwierciedlać dokładnie specyficznej odpowiedzi przeciwnowotworowej, tak jak miałoby to miejsce in vivo u pacjentów29,30. W celu dalszej poprawy bardziej wyrafinowanym otoczeniem byłoby autologiczne podejście oparte na współkulturze. W tym ustawieniu biopsje guza pochodzące od pacjenta muszą być hodowane i wprowadzane do hodowli z limfocytami T wyizolowanymi z krwi obwodowej tego samego pacjenta28. To eksperymentalne podejście może być jednak wyzwaniem nie tylko pod względem hodowli pierwotnych komórek nowotworowych, ale także pod względem dostępności biomateriału pochodzącego od pacjenta. Kolejnym ograniczeniem, które należy wziąć pod uwagę, jest stosunek komórek nowotworowych do limfocytów T w kohodowli. Ponieważ zalecany stosunek komórek wynosi 1:1, stosunek ten nie odzwierciedla fizjologicznej sytuacji TME u pacjentów31. Należy jednak zaakceptować to ograniczenie, ponieważ przy niższej liczbie limfocytów T zmiany w szybkości proliferacji i statusie aktywacji nie są mierzalne.
W dziedzinie immunologii nowotworów test ten daje możliwość przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem immunogenności różnych metod leczenia w łatwym i szybkim eksperymentalnym warunkach in vitro . W związku z tym można zaoszczędzić czas nie tylko poprzez wstępne badania przesiewowe najbardziej obiecujących metod pod względem immunogenności, ale także poprzez eksperymenty in vivo . Modele zwierzęce można ograniczyć, ponieważ tylko obiecujące schematy leczenia mogą być dalej realizowane w modelach zwierzęcych, aby odzwierciedlić układ odpornościowy jako całość w organizmie. Ponadto, ponieważ test ten opiera się na ludzkich komórkach pierwotnych i ludzkich liniach komórek rakowych, wyniki mogą być bardziej przekładalne na praktykę kliniczną niż testy oparte na innych systemach modelowych i gatunkach. 
W przyszłości test ten może być modulowany i dostosowywany, aby odpowiadał na bardziej szczegółowe pytania badawcze. Na przykład, można uwzględnić leczenie limfocytami T, aby odzwierciedlić scenariusz leczenia, który jest bliższy sytuacji u pacjentów. Ponieważ limfocyty T reagujące z nowotworem znajdują się głównie w TME, są one w równym stopniu dotknięte terapiami miejscowymi, takimi jak RT, i prawdopodobnie są również dotknięte terapiami ogólnoustrojowymi, takimi jak CT lub TT32. Kolejnym ulepszeniem testu jest współhodowla limfocytów T ze sferoidami guza z linii komórek nowotworowych, a nawet współhodowla z organoidami nowotworowymi pochodzącymi od pacjenta. Te trójwymiarowe hodowle są bardziej porównywalne ze strukturą guza u pacjenta28. Wreszcie, również odczyt eksperymentu za pomocą cytometrii przepływowej może być łatwo dostosowany w celu zbadania dalszych cząsteczek na powierzchni limfocytów T lub poprzez analizę ekspresji cząsteczek immunologicznego punktu kontrolnego na komórkach nowotworowych. Oprócz określenia fenotypu immunologicznego limfocytów T, można wykorzystać supernatanty z hodowli komórkowych z eksperymentów z kokulturą do ilościowego określenia wydzielanych cytokin lub chemokin, aby uzyskać więcej informacji na temat aktywności limfocytów T. Podsumowując, protokół ten zapewnia kompleksowy, solidny i łatwy test kohodowli limfocytów T i komórek nowotworowych, który umożliwia badania przesiewowe pod kątem immunogenności różnych metod leczenia raka. Ponieważ test ten można dostosować do określonych pytań badawczych, doskonale nadaje się do zastosowania w szerokiej dziedzinie immunologii nowotworów.

Obecnie staje się coraz bardziej oczywiste, że wzrost i postęp nowotworów są silnie zależne od skutecznej manipulacji i tłumienia układu odpornościowego gospodarza. Przekształcone komórki pojawiają się każdego dnia, nawet w zdrowym organizmie. Jednak powstawanie makroskopowych guzów jest raczej rzadkim zjawiskiem, ponieważ powstające przekształcone komórki są usuwane z organizmu z dużą wydajnością. Do usuwania komórek nowotworowych wkraczają różne typy komórek odpornościowych, takie jak cytotoksyczne limfocyty T, limfocyty T NK (NK), komórki NK lub makrofagi1,2,3. Niemniej jednak czasami mogą pojawić się przekształcone klony komórek, które przetrwają w stanie równowagi z układem odpornościowym gospodarza, który charakteryzuje się różnymi strategiami immunosupresyjnymi klonu komórek nowotworowych4. W końcu niektóre przekształcone komórki nabywają dalsze funkcje, które umożliwiają komórkom nowotworowym aktywne tłumienie odpowiedzi immunologicznej, co w konsekwencji prowadzi do wyrostka guza. Ta immunosupresja jest pośredniczona przez liczne mechanizmy, które obejmują ekspresję ligandów immunosupresyjnych na komórkach nowotworowych lub aktywną rekrutację lub pobudzanie immunoregulacyjnych lub immunosupresyjnych populacji komórek odpornościowych. Ta tak zwana koncepcja edycji immunologicznej pokazuje kluczową rolę modulacji immunologicznej podczas tworzenia i wzrostu nowotworu5.
Nie jest więc zaskakujące, że układ odpornościowy jest obecnie głównym celem nie tylko w terapii raka, ale także jako czynnik predykcyjny i prognostyczny w wielu jednostkach nowotworowych i warunkach terapeutycznych. W ciągu ostatnich lat inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych (ICI) okazały się obiecującymi opcjami terapeutycznymi w różnych jednostkach raka litego, takich jak rak płaskonabłonkowy głowy i szyi (HNSCC) lub niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC) w celu modulacji mikrośrodowiska guza (TME) w kierunku bardziej efektywnej przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej i zmniejszonej immunosupresji komórek nowotworowych6. Inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych mają na celu zwiększenie zabijania komórek nowotworowych za pośrednictwem limfocytów T poprzez celowanie w cząsteczki immunologicznych punktów kontrolnych, takie jak cząsteczki białka programowanej śmierci 1 (PD-1) i jego oś liganda 1 (PD1 / PD-L1). Fakt ten podkreśla kluczową rolę limfocytów T w odporności przeciwnowotworowej. Na przykład w HNSCC ICI zostały z powodzeniem zatwierdzone jako terapia pierwszego rzutu w nawrotach i przerzutach HNSCC7. W związku z tym obecność cytotoksycznych limfocytów T w TME, a także ekspresja PD1 i PD-L1 na komórkach nowotworowych i limfocytach T, mogą służyć jako biomarkery predykcyjne w HNSCC8,9,10.
Mimo że limfocyty T odgrywają kluczową rolę w immunologii nowotworów i terapii nowotworów, wiele otwartych pytań dotyczących ich interakcji z nowotworem nadal wymaga rozwiązania. Obecnie dobrze wiadomo, że odpowiedź immunologiczna guza jest procesem dynamicznym i że immunogenność nowotworów może się zmieniać w trakcie trwania choroby i leczenia. Różne metody leczenia, takie jak chemioterapia (CT), radioterapia (RT) lub terapia celowana (TT), są szczególnie znane z modulowania fenotypu immunologicznego komórek nowotworowych. RT może napędzać regulację w górę cząsteczek immunologicznego punktu kontrolnego w tkance nowotworowej i zmieniać częstotliwość komórek naciekających nowotwór11,12. Z drugiej strony TT może również popierać korzystne zmiany w obrębie guza i TME poprzez bezpośrednią modulację adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej13,14,15,16. Jednak modulacje te są trudne do zbadania u pacjentów, ponieważ wymagałoby to powtarzalnego badania tkanki nowotworowej w trakcie leczenia. W związku z tym potrzebne są rozstrzygające eksperymentalne systemy modelowe do badania dynamicznego fenotypu immunologicznego komórek nowotworowych i limfocytów T oraz, co ważniejsze, ich interakcji.
Stąd, w celu analizy aktywności komórek T i interakcji komórek nowotworowych i limfocytów T, potrzebny jest kompleksowy test kohodowli ex vivo, który jest łatwy do wdrożenia w każdym laboratorium w oparciu o proste prace hodowlane i powszechnie stosowane analizy cytometrii przepływowej. Na podstawie istniejącego i dostępnego piśmiennictwa nie opublikowano dotychczas łatwego w użyciu i powszechnie stosowanego protokołu dotyczącego kohodowli limfocytów T i komórek nowotworowych. Mimo że ostatnio opublikowano kilka testów kohodowlanych dla limfocytów T i organoidów nowotworowych, technika hodowli komórkowych 3D nadal nie jest wdrażana jako standardowa technika w każdym laboratorium. W związku z tym udostępniamy protokół do stosowania w hodowli komórkowej 2D, który równie dobrze może zostać ustanowiony dla hodowli komórek 3D w przyszłości. Inne protokoły kohodowli 2D są często bardziej złożone, ponieważ wymagają na przykład transdukcji komórek nowotworowych za pomocą lucyferazy17 lub są odpowiednie tylko dla nowotworów hematologicznych (kokultura niedopasowanych limfocytów T z komórkami białaczkowymi)18. W opisanym tutaj teście limfocyty T od normalnych zdrowych dawców są izolowane z krwi obwodowej i stymulowane przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28. Następnie limfocyty T są hodowane wspólnie z (wstępnie) leczonymi komórkami nowotworowymi w celu analizy zdolności proliferacyjnej limfocytów T, a także ich aktywności za pomocą cytometrii przepływowej. W ten sposób wpływ różnych metod leczenia na fenotyp immunologiczny komórek nowotworowych, takich jak RT, CT lub TT, co z kolei wpływa na aktywność i proliferację limfocytów T, można łatwo przebadać i wykorzystać jako podstawę do głębszych analiz mechanistycznych i kolejnych wybranych analiz przedklinicznych in vivo. Opisany tutaj test oferuje łatwą w użyciu konfigurację, ponieważ nie są potrzebne żadne niekonwencjonalne urządzenia, techniki ani materiały. Ponadto test można łatwo dostosować do różnych linii komórek nowotworowych lub określonych podzbiorów limfocytów T (np. Limfocyty T CD4 +). Dzięki tej technice uzyskuje się wysoką standaryzację i powtarzalność.

<table><tbody><tr><td>Probówki Cellstar 15 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Cellstar 50 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowych sterylna, z pokrywką</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli komórkowej sterylna, z dnem F, z pokrywką</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>AZD0156</td><td>Selleck Chemicals GmbH</td><td>S8375</td><td></td></tr><tr><td>Berzosertib (VE-822)</td><td>Selleck Chemicals GmbH</td><td>S7102</td><td></td></tr><tr><td>CASYcups</td><td>OMNI Life Science GmbH & Co KG&nbsp;</td><td></td><td></td>5651794</tr><tr><td>CASYton</td><td>OMNI Life Science GmbH & Co KG&nbsp;</td><td></td><td></td>5651808</tr><tr><td>CD25a, PE-Dazzle594, Mysz IgG1</td><td>Biolegend</td><td>356126</td><td></td></tr><tr><td>CD28-UNLB</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>IM1376</td><td></td></tr><tr><td>CD3a, Krome Pomarańczowy, Mysz IgG1</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>B00068</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne CD3e</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td>MA1-10176</td><td></td></tr><tr><td>CD4, APC, Mysi anty-ludzki mysz IgG1</td><td>BD Pharmingen</td><td>555349</td><td></td></tr><tr><td>CD8 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-045-201</td><td></td></tr><tr><td>CD8a, PerCP-Cy5.5, Mysz IgG1</td><td>Biolegend</td><td>300924</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Ciemnoczerwony barwnik</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>C34565</td><td></td></tr><tr><td>CFSE&</td><td>nbsp; Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&acute; s Zmodyfikowany orzeł i ostry; s Medium)</td><td>PAN-Biotech GmbH</td><td>P04-02500</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy DxFlex (z automatyczną ładowarką)</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>C44326, C02846</td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa EDTA dwuwodna</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>FBS superior&nbsp;</td><td>&nbsp; Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>S0615-500ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS superior&nbsp;</td><td>&nbsp; Merck KGaA (Sigma-Aldrich)&nbsp;</td><td>S0615-100ML</td><td>Do produkcji FBS inaktywowanego termicznie. Podgrzewać przez 30 min w temperaturze 56 stopni; C z mieszaniem w celu inaktywacji białek dopełniacza.</td></tr><tr><td>Graph Pad Prism (wersja numer 9)</td><td>Oprogramowanie GraphPad-HLA-DR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, DP, DQ Przeciwciało, anty-ludzkie, APC-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-123-550</td><td></td></tr><tr><td>Kaluza (numer wersji 2.1)</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>L-arginina</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>A8094-25G</td><td></td></tr><tr><td>Monochlorowodorek L-lizyny</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>L5626-100G</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Roztwór podstawowy</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny MS</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Ulepszona komora licząca Neubauer</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG&nbsp;</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>D8537-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td>1514-122</td><td></td></tr><tr><td>ROTISep 1077</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0642.2</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>R1790</td><td></td></tr><tr><td>SepMate 50mL probówki</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85450</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>T6146-25G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td>15400054</tr></tbody></table>

analiza aktywności ludzkich limfocytów t w allogenicznej kokulturze wstępnie leczonych komórek nowotworowych

Analysis of Human T Cell Activity in an Allogeneic Co-Culture Setting of Pre-Treated Tumor Cells

Cytotoksyczne limfocyty T odgrywają kluczową rolę w eliminacji komórek nowotworowych i dlatego są intensywnie badane w immunologii nowotworów. Częstość i aktywność cytotoksycznych limfocytów T w obrębie guzów i ich mikrośrodowiska guza (TME) są obecnie dobrze znanymi biomarkerami prognostycznymi i predykcyjnymi dla wielu typów nowotworów. Jednak dobrze wiadomo, że różne metody leczenia nowotworów, w tym radioterapia, chemioterapia, immunoterapia i terapia celowana, modulują nie tylko immunogenność guza, ale także sam układ odpornościowy. W związku z tym interakcja między komórkami nowotworowymi a limfocytami T wymaga bardziej intensywnych badań w różnych kontekstach terapeutycznych, aby w pełni zrozumieć złożoną rolę limfocytów T podczas terapii nowotworów. Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowano protokół do analizy aktywności i zdolności proliferacyjnej ludzkich cytotoksycznych (CD8+) limfocytów T w kohodowli ze wstępnie leczonymi komórkami nowotworowymi. W szczególności limfocyty T CD8 + od zdrowych dawców są barwione nietoksycznym markerem proliferacji estru sukcynimidylu dioctanu karboksyfluoresceiny (CFSE) i stymulowane za pomocą płytek pokrytych CD3 / CD28. Następnie limfocyty T są hodowane wspólnie z wcześniej leczonymi komórkami nowotworowymi. Jako odczyt, proliferacja limfocytów T jest określana ilościowo poprzez pomiar rozkładu sygnału CFSE i ocenę ekspresji markerów aktywacji powierzchniowej za pomocą cytometrii przepływowej. Można to dodatkowo uzupełnić poprzez ilościowe określenie uwalniania cytokin za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA). Metoda ta ułatwia ocenę wywołanych leczeniem zmian w interakcji między komórkami nowotworowymi a limfocytami T, stanowiąc podstawę do bardziej szczegółowych analiz metod leczenia nowotworów i ich immunogenności w warunkach ex vivo u ludzi. Dodatkowo przyczynia się do zmniejszenia liczby przedklinicznych analiz in vivo.

Komórki nowotworowe HSC4 pochodzące z HNSCC zostały wysiane i inkubowane przez noc. Po 24 h komórki poddano działaniu inhibitora kinazy. Po 3 h zastosowano dwie pierwsze dawki po 5 Gy na frakcję. Po 24 h podano drugą dawkę, a następnie komórki ponownie inkubowano przez noc. Równolegle, na 48 h przed rozpoczęciem kokultury, wyizolowano limfocyty T z krwi zdrowego dawcy. Najpierw PBMC wyizolowano przy użyciu probówek do centryfugowania w gradiencie gęstości oraz sterylnego medium separacyjnego. PBMC policzono za pomocą komory do liczenia komórek, a limfocyty T CD8+ wyizolowano przy użyciu zestawu do izolacji limfocytów T CD8+. Wyizolowane limfocyty T CD8+ zabarwiono CFSE (1 µM), a następnie przeliczono. Limfocyty T wysiano na płytki z dołkami uprzednio powleczonymi CD3/CD28 z gęstością 1,5 x 106 komórek/3 mL. Po 48 h stymulacji limfocyty T zebrano, policzono i resuspendowano do gęstości 10 000 komórek/10 µL. Dodatkowo zebrano i policzono reprezentatywne dołki z wysianymi komórkami nowotworowymi, a w pozostałych dołkach wymieniono medium. Limfocyty T dodano do komórek nowotworowych w stosunku 1:1. Kokulturę zebrano po 96 h, supernatant przechowywano w temperaturze -20 °C, a komórki zabarwiono i zmierzono za pomocą cytometrii przepływowej (Rycina 1).
Limfocyty T zidentyfikowano na podstawie wykluczenia wielkościowego oraz pozytywności dla CD3/CD8. Sygnał CFSE komórek CD3+/CD8+ wykazał rozkład nieproliferujących limfocytów T (wysoki sygnał CFSE) oraz wyraźne subpopulacje proliferujących limfocytów T (spadek intensywności sygnału CFSE). Proporcję proliferujących limfocytów T zmierzono przykładowo dla linii komórkowej HSC4 HNSCC (Rysunek 4A). Wszystkie limfocyty T, które przeszły co najmniej jeden podział, zdefiniowano jako „proliferujące”. Limfocyty T, które przeszły więcej niż 3 podziały, zdefiniowano jako „silnie proliferujące” (Rysunek 4B). W przypadku linii komórkowej HSC4 ujemnej pod kątem HPV wykryto niewielki wzrost tempa proliferacji, gdy limfocyty T były współhodowane z napromieniowanymi komórkami nowotworowymi. RT oraz RT wraz z inhibicją ATR doprowadziły do istotnie zwiększonej następczej proliferacji limfocytów T w porównaniu do współhodowli limfocytów T z komórkami HSC4 traktowanymi RT wraz z inhibicją ATM. W odniesieniu do frakcji „silnie proliferującej” limfocytów T, najskuteczniejszą metodą stymulowania proliferacji limfocytów T było wcześniejsze traktowanie komórek HSC4 za pomocą RT wraz z inhibicją ATR (Rysunek 4B).
<img alt="Wykres słupkowy proliferacji limfocytów T HSC4; pokazuje efekty inhibicji ATM i ATR; zaznaczono istotność statystyczną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67643/67643fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Proliferacja limfocytów T barwionych CFSE w celu analizy zmian w proliferacji limfocytów T zależnych od traktowania komórek HSC4. (A) Odsetek proliferujących limfocytów T po 96h kokultury z uprzednio potraktowanymi, HPV-ujemnymi komórkami nowotworu HSC4. Proliferacja limfocytów T była znacząco niższa po kokulturze z komórkami nowotworu HSC4 traktowanymi RT+ATMi w porównaniu do traktowania RT lub RT plus ATRi. (B) RT komórek nowotworu HSC4 indukowała wyższą frakcję silnie proliferujących limfocytów T (więcej niż trzy podziały komórkowe). Po kokulturze uprzednio potraktowanych RT+ATRi komórek nowotworu HSC4 z limfocytami T, odsetek silnie proliferujących limfocytów T był najwyższy. Słupki przedstawiają dane z czterech niezależnych eksperymentów z limfocytami T od czterech niezależnych, zdrowych dawców (n = 4; średnia ± SD). (*p≤ 0.05, **p≤ 0.01, ***p≤ 0.001, ****p≤ 0.0001; istotność statystyczną przetestowano poprzez porównanie wszystkich warunków eksperymentalnych ze sobą przy użyciu dwustronnego testu U Manna-Whitneya dla danych o rozkładzie nieprawidłowym). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67643/67643fig04largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Utratę CFSE w zależności od proliferacji można wykorzystać do ilościowego określenia tempa proliferacji limfocytów T. Ponadto opisano kilka markerów powierzchniowych komórek, które są powiązane z aktywnością limfocytów T, takich jak CD25 i HLA-DR. W związku z tym przeprowadzono analizę CD25 i HLA-DR na powierzchni wszystkich limfocytów T CD3+ i CD8+ za pomocą cytometrii przepływowej (Rycina 5). Ekspresję można określić ilościowo, jeśli możliwe jest wykrycie wyraźnych subpopulacji CD25high lub HLA-DRhigh, które można wydzielić poprzez gating tych silnie pozytywnych komórek (Rycina 3B). W przypadku braku wyraźnych subpopulacji można zmierzyć średnią intensywność fluorescencji (MFI) całej populacji i określić ilościowo przesunięcia MFI zależne od warunków (Rycina 3C).
Przykładowo, ekspresję CD25 i HLA-DR, określoną za pomocą MFI, przeanalizowano po 96 h kokultury z uprzednio potraktowanymi komórkami nowotworowymi HSC4 (Rysunek 5). Po kokulturze limfocytów T z komórkami nowotworowymi HSC4 poddanymi RT, ekspresja CD25 na limfocytach T była silnie obniżona. Warto zauważyć, że potraktowanie komórek nowotworowych jedynie ATMi doprowadziło do znaczącego zmniejszenia ekspresji CD25 w porównaniu z potraktowaniem ATRi. W układzie łączonym z RT, mimo że RT spowodowała zmniejszenie ekspresji CD25 na limfocytach T, kombinacja RT z ATMi doprowadziła do zwiększenia ekspresji CD25 w porównaniu z RT plus ATRi (Rysunek 5A). W odniesieniu do ekspresji HLA-DR na limfocytach T, RT ogólnie prowadziła do upregulacji HLA-DR, lecz ponownie w kombinacji z ATMi lub ATRi zaobserwowano odmienne zachowanie (Rysunek 5B). Limfocyty T w kokulturze z komórkami HSC4 potraktowanymi kombinacją RT+ATRi wykazały zwiększoną ekspresję HLA-DR w porównaniu z samą RT lub RT+ATMi.
<img alt="Wykres pudełkowy porównujący ekspresję HLA-DR i CD25 na limfocytach T; analiza MFI w kokulturze komórek nowotworowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67643/67643fig05v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Ekspresja markerów aktywacji CD25 i HLA-DR na powierzchni limfocytów T po 96 h kokultury z wstępnie potraktowanymi komórkami nowotworowymi HSC4. Ekspresję CD25 i HLA-DR analizowano na podstawie przesunięcia MFI całej populacji limfocytów T. RT komórek HSC4 spowodowało zmniejszenie ekspresji CD25 na limfocytach T oraz zwiększenie ekspresji HLA-DR. Połączenie RT z ATMi doprowadziło do znacznie odmiennych wzorców ekspresji w porównaniu do RT i ATRi. Wykresy pudełkowe przedstawiają dane z czterech niezależnych eksperymentów z użyciem limfocytów T od czterech niezależnych, zdrowych dawców (n = 4; średnia ± SD). Dane analizowano poprzez porównanie wszystkich warunków eksperymentalnych między sobą, stosując dwustronny test U Mann-Whitneya dla danych o rozkładzie nieparametrycznym (*p≤ 0.050). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67643/67643fig05largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Dane te egzemplarycznie wskazują, że traktowanie komórek nowotworowych, w tym przypadku komórek HSC4 HNSCC, wpływa na immunogenność komórek nowotworowych. Można to monitorować poprzez kokultywację komórek nowotworowych z wcześniej stymulowanymi limfocytami T, co prowadzi do zróżnicowanego zachowania proliferacyjnego i ekspresji markerów aktywacji na ludzkich limfocytach T, w zależności od zastosowanego schematu traktowania komórek nowotworowych.

Obecny protokół opisuje eksperymentalny przebieg pracy, który pozwala na analizę ex vivo stymulacji ludzkich limfocytów T w allogenicznym systemie kohodowli z wcześniej leczonymi komórkami nowotworowymi.

Analiza aktywności ludzkich limfocytów T w allogenicznej kokulturze wstępnie leczonych komórek nowotworowych

Cytotoxic T cells play a key role in the elimination of tumor cells and are, therefore, intensively studied in cancer immunology. The frequency and ...

Komórki nowotworowe zmieniają fenotyp immunologiczny podczas terapii, co może mieć wpływ na wynik, dlatego celem naszych badań jest zbadanie interakcji między limfocytami T a komórkami nowotworowymi, aby lepiej zrozumieć te interakcje.Zwiększenie wrażliwości radiowej, szczególnie w nowotworach opornych na promieniowanie poprzez połączenie radioterapii z inhibitorami kinaz. Ukierunkowanie na reakcję na uszkodzenia DNA jest obecnie centralnym elementem najnowszych osiągnięć. W dziedzinie radiobiologii opracowuje się obecnie trójwymiarowe modele hodowli komórkowych i modele kokultur w celu zwiększenia porównywalności danych z badań in vitro i in vivo.[Narrator] Na początek pobierz komórki nowotworowe HSC4 w odpowiedniej objętości pożywki D10. Wysiewaj co najmniej trzy dołki na warunek, z których każdy zawiera 15 000 komórek w 200 mikrolitrach pożywki na 96-dołkowych płytkach. Wyznaczyć jedną płytkę do traktowania próbki, w tym studzienki tylko dla komórek nowotworowych i kontrolnych tylko dla komórek T oraz studzienki do zliczania komórek dla każdego zabiegu w dniu wspólnej hodowli. Drugiego dnia należy potraktować komórki nowotworowe inhibitorami kinazy w wymaganych stężeniach. Napromienić jedną płytkę po trzech do czterech godzinach i to samo po 24 godzinach inkubacji pięcioma szarymi dla napromieniania hipofrakcjonowanego. W przypadku komórek jednojądrzastych krwi obwodowej lub izolacji PBMC należy przenieść zmieszaną krew EDTA pobraną od zdrowego dawcy do dwóch 50-mililitrowych probówek wirówkowych. Napełnij obie probówki wirówkowe do 50 mililitrów PBS i 2% FBS. Następnie przygotuj sześć probówek wirówkowych z plastikowymi wkładkami do separacji PBMC. Napełnij każdy z nich 15 mililitrami podłoża o gradiencie zimnej gęstości. Ostrożnie nałożyć na podłoże gradientu gęstości od 12 do 15 mililitrów rozcieńczonej krwi. Odwirować probówki o stężeniu 1 200 G przez 10 minut bez zwalniania. Po odwirowaniu przenieść supernatant do czterech nowych 50-mililitrowych probówek wirówkowych. Wyrzuć zużyte tuby. Napełnij nowe probówki wirówkowe do 50 mililitrów PBS i 2% FBS i odwiruj przy 120 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze PBS zawierającym 2% FBS i połączyć oba granulki w jedną probówkę sokoła. Ponownie napełnij probówkę wirówkową do 50 mililitrów PBS zawierającym 2% FBS. Odwirować PBMC przy stężeniu 300 G przez 10 minut. Ostrożnie wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad ogniwa w 80 mikrolitrach MACS plus bufor na 10 do mocy siedmiu ogniw. Dodaj 20 mikrolitrów mikrogranulek CD8 na 10 do mocy siedmiu komórek i ostrożnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Inkubować przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji umyj komórki dwoma mililitrami MACS plus bufor na 10 do mocy siedmiu komórek. Odwirować probówkę o stężeniu 300 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić komórki w 1000 mikrolitrach MACS plus bufor. Umieść dwie kolumny MS w magnesie i umieść pod spodem dwie 15-mililitrowe probówki wirówkowe. Zrównoważyć kolumny 500 mikrolitrami MACS plus bufor. Następnie załaduj równą objętość zawiesiny komórek do przygotowanej kolumny MS. Przepłukać kolumny trzykrotnie 500 mikrolitrami MACS plus bufor. Oznacz końcowe zebrane komórki jako przepływowe lub CD8 ujemne i połącz je w jednej probówce wirówkowej. Następnie weź nową 15-mililitrową probówkę wirówkową oznaczoną komórkami T CD8-dodatnimi. Przepłukać obie kolumny zawierające znakowane magnetycznie dodatnie limfocyty T CD8 1000 mikrolitrów MACS plus bufor każda. Przed barwieniem limfocytów T odwiruj je w temperaturze 300 G przez pięć minut. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1000 mikrolitrach PBS. Ponownie odwirować zawiesinę o stężeniu 300 G przez pięć minut. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w 2000 mikrolitrach jednego mikromolowego roztworu barwiącego CFSE. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie odwiruj wybarwione komórki w temperaturze 300 G przez pięć minut. Po umyciu komórek PBS należy je ponownie zawiesić w pożywce z limfocytów T. Wysiewaj komórki na pokrytej CD3 i CD28 sześciodołkowej płytce i inkubuj. Czwartego dnia zbierz limfocyty T i ponownie zawieś je w odpowiednim pożywce. Dodaj żądaną liczbę limfocytów T do studzienek komórek nowotworowych w stosunku jeden do jednego po zliczeniu wyznaczonych dołków. Siódmego dnia wyjmij płytkę hodowlaną z inkubatora w celu ilościowego określenia proliferacji limfocytów T. Po umyciu komórek wybarwić je pożądanymi przeciwciałami i wykonać cytometrię przepływową w celu oceny limfocytów T. Wyklucz populację dubletów na podstawie obszaru rozproszenia z przodu w stosunku do wysokości rozproszenia do przodu, aby uzyskać singlety. Wykreśl podkoszulki, aby zidentyfikować komórki T na podstawie obszaru rozproszenia do przodu w porównaniu z obszarem rozproszenia bocznego. Wykreśl wyrażenie CD3 w stosunku do bocznego obszaru rozproszenia, aby rozróżnić limfocyty T. Ponadto zidentyfikuj limfocyty T CD8 dodatnie po wykreśleniu sygnału CD8 w obszarze bocznego rozproszenia. Wszystkie limfocyty T powinny wyrażać CD3 i CD8. Wykreśl sygnał CFSE wszystkich limfocytów T CD8-dodatnich jako histogram. Po wykonaniu etapów bramkowania wybierz limfocyty T CD8 dodatnie jako dane wejściowe i przeanalizuj ich ekspresję izotypu CD25 lub HLA-DR, wykreślając odpowiednią fluorescencję znacznika powierzchniowego w stosunku do obszaru rozproszenia bocznego. Odsetek proliferacyjnych limfocytów T wzrastał, gdy były hodowane jednocześnie z napromieniowanymi komórkami nowotworowymi HSC4. Radioterapia lub RT i RT plus hamowanie ATR znacznie zwiększały proliferację limfocytów T w porównaniu z hamowaniem RT i ATM. Wśród wysoce proliferacyjnych limfocytów T, hamowanie RT i ATR było najbardziej skuteczne w stymulowaniu proliferacji. Ekspresja CD25 na limfocytach T była obniżona po jednoczesnej hodowli z komórkami nowotworowymi HSC4 traktowanymi RT. Wstępne leczenie komórek nowotworowych samym inhibitorem ATM znacznie zmniejszyło ekspresję CD25 w porównaniu z inhibitorem ATR. Połączenie RT i inhibitora ATM spowodowało zwiększenie ekspresji CD25 w porównaniu z RT i inhibitorem ATR. Ekspresja HLA-DR na limfocytach T była na ogół regulowana w górę przez RT. Hodowla równoległa z komórkami HSC4 wstępnie potraktowanymi inhibitorem RT plus ATR dodatkowo zwiększyła ekspresję HLA-DR w porównaniu z samym RT lub inhibitorem RT plus ATM.

analysis-human-t-cell-activity-an-allogeneic-co-culture-setting-pre

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano wydajny protokół ekspansji ex vivo limfocytów T reaktywnych przeciwko nowotworowi, izolowanych z węzłów chłonnych drenujących guz lub innych wtórnych tkanek limfatycznych organizmów z nowotworem. Protokół ten pozwala na selektywną ekspansję swoistych dla nowotworu limfocytów T do zastosowania w adoptywnej immunoterapii raka piersi.

Ex vivo ekspansja limfocytów T reaktywnych przeciwko nowotworowi za pomocą bryostatyny 1/ionomycyny oraz formulacji cytokin wspólnego łańcucha gamma

Niniejsza praca opisuje prostą technikę indukowania anergii specyficznej dla alloantygenów w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej. Technikę tę można zastosować klinicznie w celu generowania niealloreaktywnych komórek dawcy. Infuzja tych komórek mogłaby poprawić rekonstrukcję immunologiczną i zmniejszyć toksyczność po allogenicznej transplantacji hematopoetycznych komórek macierzystych.

Indukcja anergii specyficznej dla alloantygenu w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej poprzez stymulację alloantygenem z blokadą sygnału kostymulującego

Test uwalniania chromu, powszechnie stosowana metoda wykrywania aktywności cytotoksycznych limfocytów T, posiada kilka ograniczeń. W niniejszym artykule, wykorzystując antygenowo specyficzne limfocyty T CD8 oraz linię komórkową raka piersi u ludzi SKBR3, zbadano podejście oparte na impedancji pod kątem zdolności do wykrywania śmierci komórek.

Wyznaczenie optymalnej aktywności cytotoksycznej ludzkich limfocytów T CD8 specyficznych dla Her2neu poprzez porównanie testu uwalniania Cr51 z systemem xCELLigence

Ten film demonstruje test in vitro w celu sprawdzenia aktywności limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR). Komórki chłoniaka z komórek B eksprymujące antygen CD19 i lucyferazy cytoplazmatycznej są hodowane wspólnie z komórkami CAR T specyficznymi dla CD19. Wiązanie CAR z CD19 na guzie indukuje limfocyty CAR T do uwalniania cytokin i toksyn, które powodują cytotoksyczność komórek nowotworowych. Aktywność limfocytów CAR T ocenia się poprzez ilościowe określenie uwolnionej cytokiny...

Test in vitro w celu oceny aktywności przeciwnowotworowej komórek CAR T specyficznych dla nowotworu

Ten artykuł opisuje metodę generowania i rozmnażania klonów ludzkich limfocytów T, które specyficznie reagują na zdefiniowany alloantygen. Protokół ten można dostosować do klonowania ludzkich limfocytów T specyficznych dla różnych ligandów peptyd-MHC.

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T specyficznych dla alloantygenu z krwi obwodowej

Ten artykuł opisuje metodę pomiaru alloreaktywności w mieszanej populacji limfocytów T za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej.

Pomiar alloreaktywności limfocytów T za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej

Tutaj opisany jest protokół izolacji i charakterystyki podzbiorów limfocytów T CD4+ z ludzkiej krwi obwodowej. Oczyszczone limfocyty T CD4 + są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia proporcji podzbiorów komórek pomocniczych mieszków T.

Izolacja limfocytów T CD4 + i analiza podzbiorów komórek krążących komórek T-pęcherzyków obojętnych (cTfh) z krwi obwodowej przy użyciu 6-kolorowej cytometrii przepływowej

Opisujemy tutaj protokół badania cytotoksyczności wstępnie aktywowanych limfocytów T CD8+ przeciwko komórkom rakowym poprzez wykrywanie apoptotycznych komórek rakowych za pomocą mikroskopii w czasie rzeczywistym. Protokół ten może badać mechanizmy stojące za supresją limfocytów T indukowaną przez komórki szpikowe i oceniać związki mające na celu uzupełnienie limfocytów T poprzez blokadę immunologicznych komórek szpikowych.

Wykrywanie w czasie rzeczywistym apoptozy komórek nowotworowych in vitro indukowanej przez limfocyty T CD8 + w celu zbadania funkcji immunosupresyjnych komórek szpikowych naciekających nowotwór

Tutaj opisujemy metodę wspólnej hodowli in vitro do rekurencyjnego wyzwania limfocytów T ukierunkowanych na nowotwór, co pozwala na fenotypową i funkcjonalną analizę aktywności przeciwnowotworowych limfocytów T.

Ponowne badanie komórek nowotworowych in vitro w celu predykcyjnej oceny funkcji przeciwnowotworowej komórek T receptora antygenu chimerycznego

Ten protokół opisuje chirurgiczne generowanie ortotopowych guzów trzustki i szybkie trawienie świeżo wyizolowanych mysich guzów trzustki. Po trawieniu żywotne populacje komórek odpornościowych można wykorzystać do dalszej analizy, w tym stymulacji ex vivo limfocytów T do wewnątrzkomórkowego wykrywania cytokin za pomocą cytometrii przepływowej.

Generowanie ortotopowych guzów trzustki i charakterystyka ex vivo cytotoksyczności limfocytów T naciekających nowotwór

Tutaj szczegółowo opisujemy prosty, szybki i niezawodny protokół wspomagany wieloparametryczną cytometrią przepływową i nowotworem na chipie, aby monitorować i charakteryzować etapy składające się na cykl rak-odporność. Rzeczywiście, dogłębne zrozumienie wzajemnych zależności między rakiem a komórkami odpornościowymi dostarcza kluczowych informacji, które pozwalają przechytrzyć nowotwory i kierować opieką kliniczną.

Systemy kohodowli in vitro w celu odtworzenia cyklu rak-odporność

Poznaj metodę analizy aktywności limfocytów T w allogenicznej kokulturze z napromieniowanymi komórkami nowotworowymi. Protokół wykorzystuje cytometrię przepływową do oceny proliferacji i ekspresji markerów powierzchniowych.

Analiza aktywności ludzkich limfocytów T w allogenicznej kokulturze wstępnie leczonych komórek nowotworowych

Przeglądaj więcej filmów