Analiza aktywności ludzkich limfocytów T w allogenicznej kokulturze wstępnie leczonych komórek nowotworowych

Komórki nowotworowe zmieniają fenotyp immunologiczny podczas terapii, co może mieć wpływ na wynik, dlatego celem naszych badań jest zbadanie interakcji między limfocytami T a komórkami nowotworowymi, aby lepiej zrozumieć te interakcje.

Zwiększenie wrażliwości radiowej, szczególnie w nowotworach opornych na promieniowanie poprzez połączenie radioterapii z inhibitorami kinaz. Ukierunkowanie na reakcję na uszkodzenia DNA jest obecnie centralnym elementem najnowszych osiągnięć. W dziedzinie radiobiologii opracowuje się obecnie trójwymiarowe modele hodowli komórkowych i modele kokultur w celu zwiększenia porównywalności danych z badań in vitro i in vivo.

[Narrator] Na początek pobierz komórki nowotworowe HSC4 w odpowiedniej objętości pożywki D10. Wysiewaj co najmniej trzy dołki na warunek, z których każdy zawiera 15 000 komórek w 200 mikrolitrach pożywki na 96-dołkowych płytkach. Wyznaczyć jedną płytkę do traktowania próbki, w tym studzienki tylko dla komórek nowotworowych i kontrolnych tylko dla komórek T oraz studzienki do zliczania komórek dla każdego zabiegu w dniu wspólnej hodowli. Drugiego dnia należy potraktować komórki nowotworowe inhibitorami kinazy w wymaganych stężeniach. Napromienić jedną płytkę po trzech do czterech godzinach i to samo po 24 godzinach inkubacji pięcioma szarymi dla napromieniania hipofrakcjonowanego. W przypadku komórek jednojądrzastych krwi obwodowej lub izolacji PBMC należy przenieść zmieszaną krew EDTA pobraną od zdrowego dawcy do dwóch 50-mililitrowych probówek wirówkowych. Napełnij obie probówki wirówkowe do 50 mililitrów PBS i 2% FBS. Następnie przygotuj sześć probówek wirówkowych z plastikowymi wkładkami do separacji PBMC. Napełnij każdy z nich 15 mililitrami podłoża o gradiencie zimnej gęstości. Ostrożnie nałożyć na podłoże gradientu gęstości od 12 do 15 mililitrów rozcieńczonej krwi. Odwirować probówki o stężeniu 1 200 G przez 10 minut bez zwalniania. Po odwirowaniu przenieść supernatant do czterech nowych 50-mililitrowych probówek wirówkowych. Wyrzuć zużyte tuby. Napełnij nowe probówki wirówkowe do 50 mililitrów PBS i 2% FBS i odwiruj przy 120 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze PBS zawierającym 2% FBS i połączyć oba granulki w jedną probówkę sokoła. Ponownie napełnij probówkę wirówkową do 50 mililitrów PBS zawierającym 2% FBS. Odwirować PBMC przy stężeniu 300 G przez 10 minut. Ostrożnie wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad ogniwa w 80 mikrolitrach MACS plus bufor na 10 do mocy siedmiu ogniw. Dodaj 20 mikrolitrów mikrogranulek CD8 na 10 do mocy siedmiu komórek i ostrożnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Inkubować przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji umyj komórki dwoma mililitrami MACS plus bufor na 10 do mocy siedmiu komórek. Odwirować probówkę o stężeniu 300 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić komórki w 1000 mikrolitrach MACS plus bufor. Umieść dwie kolumny MS w magnesie i umieść pod spodem dwie 15-mililitrowe probówki wirówkowe. Zrównoważyć kolumny 500 mikrolitrami MACS plus bufor. Następnie załaduj równą objętość zawiesiny komórek do przygotowanej kolumny MS. Przepłukać kolumny trzykrotnie 500 mikrolitrami MACS plus bufor. Oznacz końcowe zebrane komórki jako przepływowe lub CD8 ujemne i połącz je w jednej probówce wirówkowej. Następnie weź nową 15-mililitrową probówkę wirówkową oznaczoną komórkami T CD8-dodatnimi. Przepłukać obie kolumny zawierające znakowane magnetycznie dodatnie limfocyty T CD8 1000 mikrolitrów MACS plus bufor każda. Przed barwieniem limfocytów T odwiruj je w temperaturze 300 G przez pięć minut. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1000 mikrolitrach PBS. Ponownie odwirować zawiesinę o stężeniu 300 G przez pięć minut. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w 2000 mikrolitrach jednego mikromolowego roztworu barwiącego CFSE. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie odwiruj wybarwione komórki w temperaturze 300 G przez pięć minut. Po umyciu komórek PBS należy je ponownie zawiesić w pożywce z limfocytów T. Wysiewaj komórki na pokrytej CD3 i CD28 sześciodołkowej płytce i inkubuj. Czwartego dnia zbierz limfocyty T i ponownie zawieś je w odpowiednim pożywce. Dodaj żądaną liczbę limfocytów T do studzienek komórek nowotworowych w stosunku jeden do jednego po zliczeniu wyznaczonych dołków. Siódmego dnia wyjmij płytkę hodowlaną z inkubatora w celu ilościowego określenia proliferacji limfocytów T. Po umyciu komórek wybarwić je pożądanymi przeciwciałami i wykonać cytometrię przepływową w celu oceny limfocytów T. Wyklucz populację dubletów na podstawie obszaru rozproszenia z przodu w stosunku do wysokości rozproszenia do przodu, aby uzyskać singlety. Wykreśl podkoszulki, aby zidentyfikować komórki T na podstawie obszaru rozproszenia do przodu w porównaniu z obszarem rozproszenia bocznego. Wykreśl wyrażenie CD3 w stosunku do bocznego obszaru rozproszenia, aby rozróżnić limfocyty T. Ponadto zidentyfikuj limfocyty T CD8 dodatnie po wykreśleniu sygnału CD8 w obszarze bocznego rozproszenia. Wszystkie limfocyty T powinny wyrażać CD3 i CD8. Wykreśl sygnał CFSE wszystkich limfocytów T CD8-dodatnich jako histogram. Po wykonaniu etapów bramkowania wybierz limfocyty T CD8 dodatnie jako dane wejściowe i przeanalizuj ich ekspresję izotypu CD25 lub HLA-DR, wykreślając odpowiednią fluorescencję znacznika powierzchniowego w stosunku do obszaru rozproszenia bocznego. Odsetek proliferacyjnych limfocytów T wzrastał, gdy były hodowane jednocześnie z napromieniowanymi komórkami nowotworowymi HSC4. Radioterapia lub RT i RT plus hamowanie ATR znacznie zwiększały proliferację limfocytów T w porównaniu z hamowaniem RT i ATM. Wśród wysoce proliferacyjnych limfocytów T, hamowanie RT i ATR było najbardziej skuteczne w stymulowaniu proliferacji. Ekspresja CD25 na limfocytach T była obniżona po jednoczesnej hodowli z komórkami nowotworowymi HSC4 traktowanymi RT. Wstępne leczenie komórek nowotworowych samym inhibitorem ATM znacznie zmniejszyło ekspresję CD25 w porównaniu z inhibitorem ATR. Połączenie RT i inhibitora ATM spowodowało zwiększenie ekspresji CD25 w porównaniu z RT i inhibitorem ATR. Ekspresja HLA-DR na limfocytach T była na ogół regulowana w górę przez RT. Hodowla równoległa z komórkami HSC4 wstępnie potraktowanymi inhibitorem RT plus ATR dodatkowo zwiększyła ekspresję HLA-DR w porównaniu z samym RT lub inhibitorem RT plus ATM.