Name: Test cytotoksyczności oparty na kropelkach w celu oceny limfocytów T receptora antygenu chimerycznego na poziomie pojedynczej komórki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-14T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Poznaj metodę oceny cytotoksyczności limfocytów T CAR na poziomie pojedynczej komórki przy użyciu mikrofluidycznej enkapsulacji w kropelkach. Technika ta pozwala analizować heterogeniczność odpowiedzi komórek i poprawia projektowanie terapii przeciwnowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować członkom i pracownikom CITCO i Samplix za pomocne dyskusje i sugestie. M.B.B. jest wspierany przez stypendium Early-Career Clinician Scientists' fellowship od Fundacji Lundbeck (R381-2021-1278). Prace te są wspierane przez elitarny grant badawczy ze Szpitala Uniwersyteckiego w Odense. Ponadto badania te zostały wsparte grantem z projektu 190144395 Europejskiej Rady ds. Innowacji dla Samplix ApS.

<ol><li>Pasqui, D. M., Latorraca, C. D. O. C., Pacheco, R. L., Riera, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cell+therapy+for+patients+with+hematological+malignancies.+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">CAR-T cell therapy for patients with hematological malignancies. A systematic review.</a> Eur J Haematol. 109 (6), 601-618 (2022).</li>
<li>Krejcik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+immune+system+to+fight+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Harnessing the immune system to fight multiple myeloma.</a> Cancers. 13 (18), 4546(2021).</li>
<li>Tokarew, N., Ogonek, J., Endres, S., von Bergwelt-Baildon, M., Kobold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+an+old+dog+new+tricks%3A+next-generation+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22British+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Teaching an old dog new tricks: next-generation CAR T cells.</a> British J Cancer. 120 (1), 26-37 (2019).</li>
<li>Bogetofte Barnkob, M., Vitting-Seerup, K., Rønn Olsen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+isoforms+are+an+overlooked+challenge+and+opportunity+in+chimeric+antigen+receptor+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunother+Adv%22%5BJournal%5D)">Target isoforms are an overlooked challenge and opportunity in chimeric antigen receptor cell therapy.</a> Immunother Adv. 2 (1), ltac009(2022).</li>
<li>Daei Sorkhabi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+landscape+of+CAR+T-cell+therapy+for+solid+tumors%3A+Mechanisms%2C+research+progress%2C+challenges%2C+and+counterstrategies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The current landscape of CAR T-cell therapy for solid tumors: Mechanisms, research progress, challenges, and counterstrategies.</a> Front Immunol. 14, 1113882(2023).</li>
<li>Considerations for the Development of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Products. , Center for Biologics Evaluation and Research. 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/considerations-development-chimeric-antigen-receptor-car-t-cell-products">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/considerations-development-chimeric-antigen-receptor-car-t-cell-products</a> (2024).</li>
<li>Roddie, C., O'Reilly, M., Dias Alves Pinto, J., Vispute, K., Lowdell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manufacturing+chimeric+antigen+receptor+T+cells%3A+issues+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Manufacturing chimeric antigen receptor T cells: issues and challenges.</a> Cytotherapy. 21 (3), 327-340 (2019).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+in+vitro+potency+assays+by+a+resting+step+for+clinical-grade+chimeric+antigen+receptor+engineered+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Improvement of in vitro potency assays by a resting step for clinical-grade chimeric antigen receptor engineered T cells.</a> Cytotherapy. 21 (5), 566-578 (2019).</li>
<li>Burrows, S. R., Fernan, A., Argaet, V., Suhrbier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bystander+apoptosis+induced+by+CD8%2B+cytotoxic+T+cell+%28CTL%29+clones%3A+implications+for+CTL+lytic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bystander apoptosis induced by CD8+ cytotoxic T cell (CTL) clones: implications for CTL lytic mechanisms.</a> Int Immunol. 5 (9), 1049-1058 (1993).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+full+effector+function+in+vitro+paradoxically+impairs+the+in+vivo+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells.</a> J Clin Invest. 115 (6), 1616-1626 (2005).</li>
<li>Chen, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+bulk+and+single-cell+profiling+of+premanufacture+T-cell+populations+reveals+factors+mediating+long-term+persistence+of+CAR+T-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Dis%22%5BJournal%5D)">Integrative bulk and single-cell profiling of premanufacture T-cell populations reveals factors mediating long-term persistence of CAR T-cell therapy.</a> Cancer Dis. 11 (9), 2186-2199 (2021).</li>
<li>Frazer, G. L., Gawden-Bone, C. M., Dieckmann, N. M. G., Asano, Y., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+strength+controls+the+rate+of+polarization+within+CTLs+during+killing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signal strength controls the rate of polarization within CTLs during killing.</a> J Cell Biol. 220 (10), e202104093(2021).</li>
<li>Hermans, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VITAL+assay%3A+a+versatile+fluorometric+technique+for+assessing+CTL-+and+NKT-mediated+cytotoxicity+against+multiple+targets+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Meth%22%5BJournal%5D)">The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo.</a> J Immunol Meth. 285 (1), 25-40 (2004).</li>
<li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Vaccines%22%5BJournal%5D)">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).</li>
<li>Piccinini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+CAR-T+cell+killing%3A+validation+of+the+potency+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother+CII%22%5BJournal%5D)">In vitro CAR-T cell killing: validation of the potency assay.</a> Cancer Immunol Immunother CII. 73 (9), 168(2024).</li>
<li>Martinez, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+flow+cytometric+method+for+the+simultaneous+measurement+of+CAR-T+cell+characterization+and+cytotoxicity+against+solid+tumor+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Disc+Adv+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">High-throughput flow cytometric method for the simultaneous measurement of CAR-T cell characterization and cytotoxicity against solid tumor cell lines.</a> SLAS Disc Adv Life Sci. 23 (7), 603-612 (2018).</li>
<li>Jedema, I., van der Werff, N. M., Barge, R. M. Y., Willemze, R., Falkenburg, J. H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+CFSE-based+assay+to+determine+susceptibility+to+lysis+by+cytotoxic+T+cells+of+leukemic+precursor+cells+within+a+heterogeneous+target+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population.</a> Blood. 103 (7), 2677-2682 (2004).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+imaging+of+CAR-T+cell-based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Delivery+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular imaging of CAR-T cell-based immunotherapy.</a> Adv Drug Delivery Rev. 203, 115135(2023).</li>
<li>Liadi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+potency+of+CAR%2B+T+cells%3A+Fast+and+furious+or+slow+and+steady%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Defining potency of CAR+ T cells: Fast and furious or slow and steady.</a> Oncoimmunology. 8 (10), e1051298(2019).</li>
<li>Xhangolli, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+CAR-T+cell+activation+reveals+a+mixed+TH1%2FTH2+response+independent+of+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Proteom+Bioinfo%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of CAR-T cell activation reveals a mixed TH1/TH2 response independent of differentiation.</a> Genom Proteom Bioinfo. 17 (2), 129-139 (2019).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+single-cell+cytokine+secretion+and+cell-cell+interactions+with+a+hierarchical+loading+microwell+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Evaluation of single-cell cytokine secretion and cell-cell interactions with a hierarchical loading microwell chip.</a> Cell Rep. 31 (4), 107574(2020).</li>
<li>LaBelle, C. A., Zhang, R. J., Hunsucker, S. A., Armistead, P. M., Allbritton, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microraft+arrays+for+serial-killer+CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+and+single+cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+J+Int+Soc+Anal+Cytol%22%5BJournal%5D)">Microraft arrays for serial-killer CD19 chimeric antigen receptor T cells and single cell isolation.</a> Cytometry J Int Soc Anal Cytol. 103 (3), 208-220 (2023).</li>
<li>Hellmann, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneously+deacetylated+chitosans+possess+an+unexpected+regular+pattern+favoring+acetylation+at+every+third+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Heterogeneously deacetylated chitosans possess an unexpected regular pattern favoring acetylation at every third position.</a> Nat Comm. 15 (1), 6695(2024).</li>
<li>Wong, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+chimeric+antigen+receptor+T+cytotoxicity+by+droplet+microfluidics+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Antibody+Therapeut%22%5BJournal%5D)">Assessment of chimeric antigen receptor T cytotoxicity by droplet microfluidics in vitro.</a> Antibody Therapeut. 5 (2), 85-99 (2022).</li>
<li>Antona, S., Platzman, I., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+cytotoxicity+assay%3A+Implementation+of+time-efficient+screening+of+antitumor+activity+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+omega%22%5BJournal%5D)">Droplet-based cytotoxicity assay: Implementation of time-efficient screening of antitumor activity of natural killer cells.</a> ACS omega. 5 (38), 24674-24683 (2020).</li>
<li>Subedi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+real-time+microfluidic+platform+to+probe+single+NK+cell+heterogeneity+and+cytotoxicity+on-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An automated real-time microfluidic platform to probe single NK cell heterogeneity and cytotoxicity on-chip.</a> Sci Rep. 11 (1), 17084(2021).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+CRISPR%2FCas12a-based+quantitative+detection+of+nucleic+acids+using+double+emulsion+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelect%22%5BJournal%5D)">Enhanced CRISPR/Cas12a-based quantitative detection of nucleic acids using double emulsion droplets.</a> Biosens Bioelect. 257, 116339(2024).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+preclinical+evaluation+of+an+anti-CD19+chimeric+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Construction and preclinical evaluation of an anti-CD19 chimeric antigen receptor.</a> J Immunother. 32 (7), 689-702 (2009).</li>
<li>Michaels, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+tuning+of+gene+expression+levels+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells.</a> Nat Comm. 10 (1), 818(2019).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+encapsulation+improves+accuracy+of+immune+cell+cytokine+capture+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet encapsulation improves accuracy of immune cell cytokine capture assays.</a> Lab on a Chip. 20 (8), 1513-1520 (2020).</li>
<li>Brower, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+emulsion+flow+cytometry+with+high-throughput+single+droplet+isolation+and+nucleic+acid+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Double emulsion flow cytometry with high-throughput single droplet isolation and nucleic acid recovery.</a> Lab on a Chip. 20 (12), 2062-2074 (2020).</li>
<li>Kirouac, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconvolution+of+clinical+variance+in+CAR-T+cell+pharmacology+and+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Deconvolution of clinical variance in CAR-T cell pharmacology and response.</a> Nat Biotechnol. 41 (11), 1606-1617 (2023).</li>
</ol>

Autorzy deklarują następujące konkurencyjne interesy: M.B.B. otrzymał honoraria konsultacyjne od Janssen, Roche i Kite/Gilead, niezwiązane z niniejszą pracą. D.L.P. i P.M. są pracownikami firmy Samplix.

W tym miejscu przedstawiamy metodę badania potencjału cytotoksycznego limfocytów T na poziomie pojedynczej komórki przy użyciu łatwego w użyciu komercyjnie dostępnego urządzenia do mikropłynów do oceny potencjału cytotoksycznego limfocytów T CAR CD19-CD28-CD3z po kokapsułkowaniu z linią komórkową chłoniaka z komórek płaszcza CD19-dodatnich JeKo-1. 
W tym protokole jest kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, zalecamy usunięcie kulek stymulacyjnych z limfocytów T co najmniej 48 godzin przed wykonaniem jakichkolwiek testów, aby uniknąć fałszywie dodatnich wyników. Po drugie, wydajność transdukcji limfocytów T z konstruktami takimi jak CAR lub receptory limfocytów T może się znacznie różnić. Bez późniejszego etapu oczyszczania transdukowanych limfocytów T wyniki mogą być trudne do interpretacji. W tym przypadku wykorzystano czystą populację limfocytów CAR T, a zatem można oczekiwać wysokiego stopnia pewności przy charakteryzowaniu komórek CAR T jako zabójców lub niezabójców w każdym punkcie czasowym. Alternatywnie, znakowanie CAR za pomocą białka fluorescencyjnego lub znacznika genetycznego może być zastosowane w celu wskazania komórek, które są CAR-dodatnie, a następnie bramkowane podczas analizy kropel. Jeżeli stosuje się znakowanie, wybrane cząsteczki fluorescencyjne nie powinny zakłócać emisji fluorescencyjnych z żadnego z pozostałych fluoroforów testowych. Na przykład użycie znakowania GFP kolidowałoby z substratem GzmB znakowanym FAM zastosowanym w przeprowadzonych tutaj eksperymentach i dlatego nie jest zalecane.
Główną zaletą przedstawionego tutaj protokołu jest to, że samo generowanie kropel jest uproszczone i zautomatyzowane. Jednakże, aby zapewnić hermetyzację pojedynczych komórek, ważne jest, aby ogniwa zostały dokładnie zawieszone przed załadowaniem wkładu. Z tego powodu zaleca się pracę w odpowiednim tempie podczas przygotowań do załadowania wkładu. Podobna uwaga dotyczy dodawania substratu GzmB, ponieważ niektóre komórki są wysokimi wydzielaczami GzmB. Ponowne zawieszenie komórek zapobiegnie również zatykaniu się małych kanałów mikroprzepływowych wkładów. Prawidłowa enkapsulacja komórek jest łatwa do sprawdzenia za pomocą mikroskopii, jak opisano powyżej. 
Ponieważ kropelka otacza pożywkę komórkową i zatrzymuje produkty komórkowe wydzielane z komórek, można analizować inne cytokiny, przeciwciała i związki. Rzeczywiście, przetestowaliśmy inne istotne cząsteczki wydzielane przez komórki odpornościowe, takie jak IFN-γ i TNF-α, które wymagają modyfikacji obecnego protokołu. Do wykrywania cytokin można zastosować inny rodzaj formatu testu niż ten, którego używamy tutaj dla GzmB, taki jak generowanie kanapki ELISA na powierzchni komórki efektorowej32. Ponadto można zmieniać barwienie komórek i kolory testów, np. ester sukcynimidylowy karboksyfluoresceiny (CFSE), ale ważne jest, aby zapewnić minimalne lub żadne przesiąkanie w różnych kombinacjach kolorów, tak jak miałoby to miejsce w standardowej cytometrii przepływowej. 
Co więcej, protokół ten nie ogranicza się do analizy limfocytów CAR T. Można go również rozszerzyć w celu zbadania innych interakcji limfocytów T / celu lub innych komórek odpornościowych, takich jak komórki CAR NK. Można również przewidzieć bardziej zaawansowane eksperymenty, na przykład znakowanie podzbiorów limfocytów T CD4 i CD8 dodatkowymi fluoroforami w celu przeprowadzenia szerszego funkcjonalnego immunofenotypowania. Rzeczywiście, tutaj pokazujemy, że CD4 i CD8 można wykryć w kropelkach, umożliwiając w ten sposób dalszą charakterystykę efektorowych limfocytów T i ich zdolności cytotoksycznej.
Optymalizując ten protokół, dążyliśmy do tego, aby działał on na standardowych instrumentach cytometrii przepływowej. Chociaż cytometria przepływu kropelek nie jest skomplikowana, zauważyliśmy, że nagromadzenie oleju może wystąpić, jeśli cytometr przepływowy nie jest odpowiednio płukany w określonych odstępach czasu lub zgodnie z zaleceniami tutaj, po analizie próbek w każdym przedziale czasowym. Najlepszy protokół płukania może być specyficzny dla każdego cytometru przepływowego.
Jedną z istotnych zalet tej metody jest jej wysoka przepustowość, co pozwala na monitorowanie cytotoksyczności pojedynczej komórki za pośrednictwem efektorów w stosunku do komórek docelowych bez konieczności posiadania rozległej wiedzy specjalistycznej lub wysoce specjalistycznego sprzętu. Test można łatwo wykonać przy użyciu istniejących narzędzi, takich jak cytometria przepływowa lub mikroskopia. Podwójne kropelki emulsji są również podatne na sortowanie za pomocą sortowników komórkowych30,31, które mogą umożliwić izolację komórek o określonych funkcjach, np. limfocytów CAR T z potencjałem cytotoksycznym i bez niego, a następnie analizę transkryptomu pojedynczej komórki.
Technologia nie jest pozbawiona ograniczeń. Podczas gdy niektóre linie komórkowe tolerują hodowlę kropelkową przez 24 godziny i dłużej, komórki pierwotne mogą mieć znacznie niższą żywotność po 24 godzinach. Stanowi to ograniczenie czasowe dla testów w ogóle, ale w przypadku obecnego testu zauważalne GzmB i aktywność zabijania komórek można zaobserwować w ciągu 4-6 godzin, prawdopodobnie dlatego, że mały przedział kropelkowy zapewnia szybkie spotkanie efektora i komórek docelowych. Podobnie, mała objętość kropli zapewni szybki wzrost stężenia do wykrywalnych poziomów wydzielanego substratu rozszczepionego przez GzmB. Kolejnym ograniczeniem technologii jest brak możliwości wykrycia seryjnego zabijania przez komórki efektorowe przy użyciu standardowych cytometrów przepływowych. Jednak może to być możliwe do osiągnięcia za pomocą cytometrów przepływowych lub technologii cytometrii obrazowej, które będą musiały zostać zbadane.
Adoptywny transfer limfocytów T CD19 CAR okazał się niezwykły sukces w leczeniu pacjentów z nowotworami hematologicznymi. Mimo to u pacjentów występuje duże zróżnicowanie odpowiedzi i nieprzewidywalna toksyczność32, co może częściowo wynikać z niejednorodności produktu infuzyjnego CAR T. W związku z tym rośnie zainteresowanie analizą składu fenotypowego i zdolności cytotoksycznych poszczególnych komórek CAR T w populacji. Będzie to szczególnie ważne, ponieważ terapia CAR jest coraz częściej testowana w chorobach autoimmunologicznych i innych postaciach raka. Opisane tutaj urządzenie i protokół mikrofluidyczny oferują solidne i wszechstronne podejście do badania heterogeniczności limfocytów CAR T i innych terapii opartych na komórkach.

Terapia limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) to szybko rozwijająca się dziedzina immunoterapii komórkowej nowotworów, która okazała się skuteczna przeciwko różnym formom białaczki, chłoniaka1, oraz szpiczakowi mnogiemu2. Limfocyty CAR T są generowane przez modyfikację limfocytów T za pomocą syntetycznego receptora antygenowego, który może selektywnie wiązać się z białkami powierzchniowymi, takimi jak CD19 lub antygen dojrzewania komórek B (BCMA), ulegający ekspresji na komórkach B, komórkach plazmatycznych i ich złośliwych odpowiednikach. Ostatnie postępy w projektowaniu CAR umożliwiły celowanie w wiele antygenów jednocześnie3, opierając się na wielu sygnałach wejściowych lub wiążąc się wyłącznie z antygenami związanymi z nowotworem, takimi jak specyficzne izoformy białek4. Dodatkowo, kilka CAR jest obecnie testowanych pod kątem docelowych nowotworów niehematologicznych5.
Testy cytotoksyczności są niezbędne zarówno dla rozwoju CAR, jak i kontroli jakości przed wydaniem produktów klinicznych6,7,8. Jednak większość obecnych testów zależy od dużych populacji efektorowych komórek CAR T dodanych w nadmiarze do linii komórek rakowych, co może prowadzić do wyników fałszywie dodatnich z powodu efektów osób postronnych9 i powodować słabą korelację między wynikami in vitro i in vivo10. Ponieważ proliferacja limfocytów T i długotrwała trwałość zależą od sygnałów odbieranych podczas początkowych zdarzeń aktywacji11,12, dokładne zbadanie zdarzeń cytotoksycznych na poziomie pojedynczej komórki jest bardzo interesujące.
Aby rozwiązać problemy metodologii masowych, badania cytotoksyczności na poziomie pojedynczej komórki mogą być przeprowadzane za pomocą cytometrii przepływowej13,14,15,16,17 i testy oparte na obrazowaniu18. Jednakże, mimo że standardowa cytometria przepływowa oferuje rozdzielczość pojedynczej komórki do ilościowego określania i charakteryzowania zarówno komórek efektorowych, jak i docelowych, nie może bezpośrednio określić specyficznej zdolności cytotoksycznej poszczególnych komórek CAR T w stosunku do komórek docelowych. Ponadto obrazowanie pojedynczych limfocytów CAR T oddziałujących masowo z odpowiednimi celami jest trudne i czasochłonne ze względu na stałą ruchliwość komórek. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowano nowatorskie narzędzia do analizy pojedynczych komórek, które polegają na parowaniu komórek efektorowych i docelowych w przestrzennie ograniczonych przestrzeniach za pomocą macierzy mikrostudzienek19,20,21, microraft arrays22, microchips23, and droplet microfluidics24,25,26. Narzędzia te zapewniają zwiększoną czułość pomiaru, umożliwiając badanie mniejszej liczby komórek przy użyciu zmniejszonych objętości odczynników. Pozostaje jednak kilka wyzwań, w tym efektywne parowanie komórek, ograniczona liczba próbek, które można analizować, poleganie wyłącznie na analizie opartej na obrazowaniu oraz trudności w pozyskiwaniu żywotnych populacji komórek do dalszych analiz.
Tutaj korzystamy z dostępnego na rynku urządzenia mikrofluidycznego, które pozwala na znacznie uproszczone podejście do mikrofluidyki opartej na kropelkach. Urządzenie to umożliwia zaawansowaną analizę pojedynczych komórek i przeprowadzanie testów przy użyciu wysoce stabilnych kropel podwójnej emulsji (DE). W porównaniu z testami mikrostudzienkowymi i tradycyjnymi testami mikroprzepływowymi kropelkowymi, przedstawiony tutaj protokół nie wymaga rozległej wiedzy specjalistycznej w zakresie mikrofludykacji.
DE kropelki to małe kuliste komory składające się z olejowej skorupy z wodnym rdzeniem zawieszonym w roztworze wodnym. Kropelka wodnista zawiera i zatrzymuje komórki, sekretom komórkowy, pożywkę komórkową i odczynniki do oznaczania, co pozwala na wykonywanie złożonych testów w każdym przedziale. Za pomocą urządzenia mikrofluidycznego kropelki DE są generowane o ustalonej objętości (około 100 pL) odpowiedniej do testów interakcji jednokomórkowych lub interakcji komórka-komórka ssaków, które mogą być generowane w bardzo dużych ilościach (około 750 000 kropel na próbkę) i w krótkim czasie (około 10 minut dla 8 próbek) przez ogólnych użytkowników laboratoryjnych bez specjalistycznej wiedzy z zakresu mikrofluidyki. Wygenerowane kropelki mogą być zawieszone w pożywce komórkowej, umożliwiając w ten sposób dyfuzję O2 i CO2 przez powłokę oraz buforowanie wnętrza, jednocześnie zachowując hydrofilowe i większe cząsteczki, takie jak cząsteczki efektorowe wydzielane przez komórkę. Badane komórki są więc odpowiednio buforowane, co pozwala na badanie w czasie interakcji komórka-komórka i dynamiki czasowej. W przeciwieństwie do pojedynczych kropelek emulsji (np. kropelek wody w oleju)27, kropelki DE są wytrzymałymi strukturami, które nie łączą się ani nie łączą w standardowych inkubatorach komórkowych. Ze względu na ich stabilność i wodną fazę zewnętrzną są one również kompatybilne z dalszymi procedurami analizy, takimi jak tradycyjna cytometria przepływowa. Te pikolitrowe kropelki generowane przez urządzenie mikroprzepływowe mogą być zatem wykorzystywane do wysokoprzepustowej analizy funkcji komórek jednokomórkowych w celu wyjaśnienia funkcjonalnej niejednorodności ukrytej w tradycyjnych testach masowych.
Tutaj przedstawiamy protokół, który wykorzystuje kropelki DE do zbadania potencjału cytotoksycznego CAR specyficznych dla CD19 w stosunku do komórek chłoniaka. Nasz protokół pozwala na jednokomórkową analizę zabijania celu i wydzielania Granzyme B (GzmB) i ujawnia, że około 20% badanych tutaj limfocytów CAR T ma natychmiastowy potencjał zabijania.

<table><tbody><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blocker BSA (BSA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>37525</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Far Red Proliferation Kit (barwnik dalekiej czerwieni)</td><td>Invitrogen</td><td>C34564</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Violet Cell Proliferation Kit (fioletowy barwnik fluorescencyjny)</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>DE Roztwór stabilizujący ( roztwór stabilizujący)</td><td>Samplix</td><td>REDIVSTABSOL1500</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (dPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (dPBS)</td><td>Capricorn Scientific</td><td>PBS-1A</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Ludzki aktywator T (kulki aktywujące CD3/CD28)</td><td>Gibco</td><td>11132D</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Capricorn Scientific</td><td>FBS-HI-12A</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator Lenti-X (odczynnik na bazie PEG)</td><td>Takara Bio 631232</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACSelect LNGFR Microbeads (kulki magnetyczne anty-NGFR)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-330</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka o gradiencie gęstości OptiPrep (pożywka gradientowa)</td><td>Stemcell</td><td>7820</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (P/S)</td><td>Capricorn Scientific</td><td>PS-B</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny (PI)</td><td>Invitrogen</td><td>BMS500PI</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki IL-2 (IL-2)</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 ze stabilną glutaminą ( RPMI-1640)</td><td>Capricorn Scientific</td><td>RPMI-STA</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 bez L-glutaminy i czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>32404-014</td><td></td></tr><tr><td>Xdrop DE oil I (olej)</td><td>Podłoże Samplix</td><td>REOILDEC1900</td><td></td></tr><tr><td>Xdrop Granzyme B (podłoże GzmB)</td><td>Barwnik żywotności Samplix</td><td>REGRB100</td><td></td></tr><tr><td>Zombie-NIR (barwnik żywotności)</td><td>BioLegend</td><td>423106</td><td></td></tr><tr><td><mocne>Wyroby z tworzyw sztucznych itp.</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-komorowe szkiełko szkiełkowe</td><td>Chemometec</td><td>942-0003</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli komórkowych, 12-dołkowa</td> TH Probówka <td>Geyera</td><td>7696791</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind, 2 ml (probówka DNA)</td><td>Probówka Eppendorf</td><td>30108078</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf, 1,5 ml (probówka 1,5 ml)</td><td>Probówka Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>Falcon, 15 ml ( Probówka 15 ml)</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Probówka Falcon, 5 ml (probówka 5 ml)</td><td>Falcon (VWR)</td><td>734-0443</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do zawieszania zielonych komórek do inkubacji komórek (kolba T75)</td><td>Sarstedt</td><td>148.19.22</td><td></td></tr><tr><td>Płytki zawiesinowe z zielonymi komórkami do inkubacji komórek (płytka 96-dołkowa)</td><td>Sarstedt</td><td>148.32.20</td><td></td></tr><tr><td>LS Kolumny separacyjne (kolumna separacyjna)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Xdrop DE Uszczelki (uszczelki)</td><td>Samplix</td><td>#GADEA100</td><td></td></tr><tr><td>Xdrop DE50 Cartridge (wkład do kapsułkowania)</td><td>Samplix</td><td>#CADE50A100</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-CCR7 PE-Dazzle 594</td><td>BioLegend</td><td>353236</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD19 CAR FMC63 Przeciwciało idiotypowe, PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-127-342</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD3 APC</td><td>Biolegend</td><td>300439</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD3 BV480</td><td>BD Biosciences</td><td>566105</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD3 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>345763</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD4 BUV661</td><td>BD Biosciences</td><td>612962</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD4 StarBright Violet 760</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1267SBV760T</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD45RA BUV395</td><td>BD Biosciences</td><td>740298</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD8 PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>344712</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD8 StarBright Violet</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1226SBV760</td><td></td></tr><tr><td>anty-NGFR FITC</td><td>BioLegend</td><td>345106</td><td></td></tr><tr><td>anty-NGFR PE</td><td>BioLegend</td><td>345106</td><td></td></tr><tr><td>Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>JeKo-1 Linia komórkowa chłoniaka z komórek płaszcza (JeKo-1)</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td></td></tr><tr><td>Pierwotne komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< silne>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 Automatyczny licznik komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A50298</td><td></td></tr><tr><td>Magnes DynaMag-2</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy NovoCyte Quanteon (cytometr przepływowy)</td><td>Agilent</td><td>2010011AA</td><td></td></tr><tr><td>Xdrop (urządzenie mikroprzepływowe)</td><td>Samplix</td><td>IN00110-EU</td><td></td></tr></tbody></table>

test cytotoksyczności oparty na kropelkach w celu oceny limfocytów t receptora antygenu chimerycznego na poziomie pojedynczej komórki

Droplet-based Cytotoxicity Assay to Assess Chimeric Antigen Receptor T cells at the Single-cell Level

Ocena potencjału cytotoksycznego terapii opartych na limfocytach T, takich jak leczenie limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR), jest kluczowa w ocenie ich skuteczności i jest warunkiem wstępnym dla zastosowania klinicznego. Jednak tradycyjne testy cytotoksyczności są przeprowadzane jako testy zbiorcze i nie dostarczają szczegółowych informacji na temat funkcjonalnej heterogeniczności populacji komórek CAR T. W tym badaniu opisujemy metodę opartą na kropelkach podwójnej emulsji, która pozwala na kokapsułkowanie na dużą skalę pojedynczych efektorowych komórek T CAR z pojedynczymi komórkami docelowymi, umożliwiając jednocześnie podwójną kwantyfikację zarówno cytotoksycznych cząsteczek efektorowych z limfocytów T, jak i śmierci komórki docelowej. Protokół przedstawia metodę generowania i oczyszczania limfocytów CAR T specyficznych dla CD19, a następnie ich kokapsułkowania w kropelkach z linią komórkową CD19 + JeKo-1, wraz z odczynnikami do wizualizacji wydzielania cytotoksycznych cząsteczek efektorowych (Granzyme B) i śmierci komórki (przy użyciu jodku propidyny, PI). Pokazujemy, jak generować kropelki zawierające pojedynczy CAR T i komórki docelowe za pomocą dostępnego na rynku urządzenia mikroprzepływowego do generowania podwójnych kropel emulsji. Dodatkowo podajemy przykłady, jak oznaczać funkcjonalną różnorodność limfocytów CAR T w kropelkach przy użyciu standardowego sprzętu do cytometrii przepływowej. Na koniec pokrótce opisujemy kinetykę czasową i niejednorodność zabijania limfocytów T CAR specyficznych dla CD19. Chociaż metoda ta koncentruje się na śmierci komórki po ataku limfocytów CAR T, można ją również dostosować do badania innych typów limfocytów T, cytotoksycznych komórek odpornościowych i funkcji komórek efektorowych, takich jak wydzielanie cytokin.

Po transdukcji komórki T poddano analizie w celu oceny ekspresji CAR za pomocą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem przeciwciał anty-CD3 i anty-NGFR. Następnie populację komórek CAR-T wzbogacono przy użyciu magnetycznych kulek anty-NGFR, co pozwoliło uzyskać czystość powyżej 98% dla obu dawców (Rysunek 1A-B). Ilościowo określono również stosunek CD4/CD8 oraz fenotyp pamięci posortowanych komórek CAR, stosując standardową strategię bramkowania z wykorzystaniem przeciwciał CCR7 i CD45RA. Dane te pokazują, że stosunek CD4/CD8 w użytych komórkach CAR-T wynosił 0,73, a komórki posiadały głównie fenotyp pamięci typu naiwnego (Rysunek 1C-E).
Komórki CAR T oraz komórki JeKo-1 zabarwiono odpowiednio barwnikami fioletowym i daleką czerwienią, a następnie enkapsulowano w kropelkach DE50 wraz z odczynnikami do analizy: substratem GzmB oraz PI (Rysunek 2). Alternatywnie komórki CAR T można również znakować za pomocą przeciwciał, takich jak anty-CD4 lub anty-CD8 (Rysunek 3), co umożliwia bardziej szczegółową charakterystykę limfocytów T. Każda zawiesina komórek T (CAR T lub NTD) była mieszana z zawiesiną komórek JeKo-1 bezpośrednio przed enkapsulacją w stosunku komórek efektorowych do komórek docelowych 1:3 (0,5 x 106 limfocytów T i 1,5 x 106 JeKo-1). Po enkapsulacji każdą partię kropelek (komórki CAR T + JeKo-1 oraz NTD + JeKo-1) podzielono na trzy probówki inkubacyjne w celu inkubacji przez odpowiednio 2 h, 4 h i 6 h. Komórki inkubowano wewnątrz kropelek w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2, a następnie analizowano za pomocą mikroskopii i cytometrii przepływowej we wskazanych punktach czasowych.
Przeprowadziliśmy mikroskopię fluorescencyjną kropli podwójnej emulsji po 4 h inkubacji (Rysunek 4). Intensywność zielonego sygnału fluorescencji (FITC) ilustruje poziom wydzielonej aktywności GzmB komórek CAR T lub NTD wewnątrz kropli DE50. Rysunek 4B przedstawia obrazy z mikroskopii fazokontrastowej i fluorescencyjnej pojedynczej kropli dodatniej pod kątem GzmB, zawierającej komórkę CAR T oraz komórkę docelową JeKo-1 w bliskim kontakcie.
Następnie krople DE50 poddano analizie za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia procentowego udziału komórek CAR T wykazujących wczesną sekrecję GzmB oraz cytotoksyczną aktywność zabijania komórek (Rysunek 5). Barwienie komórek docelowych JeKo-1 barwnikiem dalekoczerwonym oraz efektorowych komórek T barwnikiem fioletowym przed enkapsulacją ułatwiło identyfikację trzech odrębnych populacji kropel zawierających komórki, ponieważ komórki są rozdzielane w kroplach zgodnie z rozkładem Poissona. Zidentyfikowane populacje kropel to krople zawierające wyłącznie komórki T, wyłącznie komórki JeKo-1 oraz krople zawierające wspólnie komórki T i komórki JeKo-1 (Rysunek 5A). Krople zawierające wspólnie komórki T oraz komórki JeKo-1 zostały poddane bramkowaniu i analizie pod kątem sygnałów wskazujących na aktywność GzmB (Rysunek 5B) oraz śmierć komórkową, wskazaną przez PI (Rysunek 5C).
Enkapsulacja komórek w kropelkach przebiega zgodnie z rozkładem Poissona, w wyniku czego otrzymuje się cztery różne populacje kropelek (Rycina 6A). Rycina 6B przedstawia poziom kropelek dodatnich pod kątem GzmB we wszystkich populacjach kropelek po 6 h inkubacji, na podstawie czego można określić procent spontanicznie wydzielających GzmB limfocytów T. Dane te wskazują na wysoką swoistość metody, ponieważ GzmB wydzielają wyłącznie limfocyty CAR-T.
Na koniec ilościowo określono poziomy GzmB i PI w różnych punktach czasowych, po 2 h, 4 h i 6 h wspólnej inkubacji. Jako punkt odniesienia przeanalizowano kropelki zawierające wyłącznie limfocyty T oraz wyłącznie komórki JeKo-1, aby zbadać tło obumierania komórek w każdej z populacji (Rysunek 6C). Tło obumierania komórek wykorzystano do wyznaczenia odsetka żywych limfocytów T wydzielających GzmB oraz zabijających komórki docelowe w populacji komórek efektorowych (Rysunek 7), zgodnie z opisem w kroku 3.3. Limfocyty CAR T od dwóch dawców wykazały zależny od czasu wzrost zarówno wydzielania GzmB indukowanego przez komórki docelowe, jak i aktywności cytotoksycznej. Niemal 36% żywych limfocytów CAR T od Dawcy 1 i 31% od Dawcy 2 wydzieliło GzmB po 6 h wspólnej enkapsulacji z komórką docelową, co stanowi znaczący wzrost w porównaniu z kontrolnymi limfocytami T NTD (Rysunek 7A). Odpowiednio, około 21% żywych limfocytów CAR T od Dawcy 1 i 22% od Dawcy 2 zabiło komórki docelowe, co wskazano za pomocą pozytywnego sygnału PI (Rysunek 7B). Odsetek limfocytów CAR T, które wydzieliły GzmB, przekraczał odsetek zabitych komórek docelowych w każdym punkcie czasowym, co jest zgodne z oczekiwaną sekwencją zdarzeń w cytotoksyczności pośredniczonej przez GzmB. Podsumowując, dane te pokazują, że zaprezentowana tutaj metoda pozwala na charakteryzację heterogeniczności cytotoksyczności pojedynczych limfocytów T w obrębie populacji komórek, a także na porównania między różnymi populacjami.
<img alt="Analiza cytometryczna CAR T-komórek; wykresy kropkowe, strategia bramkowania i wykresy procentowe komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Reprezentatywne wykresy z cytometrii przepływowej po sortowaniu NGFR. (A) Po około 10 dniach ekspansji CAR T-komórki zostały posortowane przy użyciu mikrokulek specyficznych dla NGFR i sortowania magnetycznego, co pozwoliło na uzyskanie populacji składającej się w &gt;98% z CAR T-komórek. (B) Ilościowe oznaczenie CAR T-komórek od dwóch dawców wykorzystanych w niniejszym badaniu przed i po sortowaniu. (C) Strategia bramkowania zastosowana do badania stosunku CD4/CD8 i fenotypu pamięci T-komórek. (D) Ilościowe oznaczenie CD4 i CD8 wykorzystanych T-komórek. (E) Ilościowe oznaczenie fenotypu pamięci wykorzystanych T-komórek. Skróty: CM = pamięć centralna, EM = pamięć efektorowa, NTD = nieprzetransdukowane, TEMRA = terminalnie zróżnicowane komórki efektorowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat barwienia komórek z substratem GzmB; cytometria przepływowa; analiza śmierci komórek metodą mikroskopową." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat połączonego testu sekrecji GzmB i cytotoksyczności z rozdzielczością pojedynczej komórki w kropelkach. Przed enkapsulacją w kropelkach DE, komórki docelowe i efektorowe są barwione osobno przy użyciu barwników do komórek w kolorze fioletowym i dalekiej czerwieni. Przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego i wkładu do enkapsulacji, komórki efektorowe są współenkapsulowane z komórkami docelowymi w kropelkach wraz z medium hodowlanym, PI oraz substratem peptydowym GzmB znakowanym FAM. Test i inkubacja odbywają się wewnątrz kropelek. Aktywność wydzielonego GzmB jest sygnalizowana emisją zielonej fluorescencji, która występuje po rozszczepieniu substratu przez GzmB. Śmierć komórek jest sygnalizowana przez PI. Po inkubacji kropelki DE50 są analizowane metodą mikroskopową i/lub za pomocą cytometrii przepływowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza kropli metodą cytometrii przepływowej; barwienie CD4/CD8; bramkowanie fluorescencji; identyfikacja komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Analiza kropli zawierających PBMC uprzednio znakowane przeciwciałami anty-CD3, anty-CD4 i anty-CD8. (A) Obrazy mikroskopowe kropli z enkapsulowanymi PBMC uprzednio znakowanymi przeciwciałami anty-CD3 (APC) i anty-CD4 (NIR). Pasek skali = 100 µm. (B) Analogicznie jak w (A), lecz z zastosowaniem znakowania CD3 (FITC) i anty-CD8 (NIR). Pasek skali = 100 µm. (C) Analiza tych samych kropli metodą cytometrii przepływowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza granzymu B, obrazy mikroskopowe komórek T znakowanych FITC, aktywacja komórek CAR-T, fluorescencja." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Obrazy mikroskopowe kropel z komórkami efektorowymi i docelowymi. Obrazy wykonano po 4 h inkubacji w standardowym wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2. (A) Krople z próbki z enkapsulowanymi komórkami NTD i JeKo-1 (lewo) lub komórkami CAR-T i JeKo-1 (prawo) obrazowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z wykorzystaniem kanału FITC do wykrywania kropel dodatnich pod kątem GzmB (zielone). Pasek skali = 500 µm. (B) Pojedyncza kropla obrazowana w kontraście fazowym, FITC (GzmB), APC (komórka JeKo-1) i DAPI (komórka CAR-T). Pasek skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Cytometria przepływowa, wykres kropkowy i histogram oddziaływania limfocytów T z komórkami JeKo-1, GzmB-FITC, PI-PE." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Strategia bramkowania do analizy kropel metodą cytometrii przepływowej po inkubacji. (A) Bramkowanie wykonano na podstawie rozproszenia światła przedniego (forward scatter) i bocznego (side-scatter) w celu identyfikacji kropel, a następnie wybrano bramkę zawierającą krople. Zdarzenia poza bramką reprezentują krople oleju powstające jako produkt uboczny podczas produkcji kropel w technice podwójnej emulsji. Następna analiza fluorescencji kropel w kanałach odpowiadających zastosowanym barwnieniom komórkowym identyfikuje cztery populacje kropel: krople zawierające zarówno limfocyty T, jak i komórki JeKo-1 (czerwony kwadrat); krople zawierające wyłącznie komórki JeKo-1; krople zawierające wyłącznie limfocyty T oraz krople puste. (B) Reprezentatywne histogramy sygnału GzmB w kroplach podwójnie dodatnich w różnych punktach czasowych oraz w porównaniu między limfocytami NTD a CAR T. (C) Reprezentatywne histogramy sygnału PI w kroplach podwójnie dodatnich w różnych punktach czasowych oraz w porównaniu między limfocytami NTD a CAR T. Wszystkie pomiary kropel są wykonywane jako pomiary wysokości intensywności (H). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki cytometrii przepływowej, komórki CAR T vs. JeKo-1; wykres kropelek GzmB+ i śmierci komórek w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Kontrola wewnętrzna i populacje referencyjne. (A) Wybrano każdą z czterech ćwiartek z Ryciny 5A i w każdej z nich zmierzono poziom GzmB oraz PI. Ten rodzaj kwantyfikacji pozwala na pomiar sygnałów tła i ich odjęcie przed przeprowadzeniem końcowej analizy skuteczności limfocytów T. (B) Wykres przedstawiający częstość występowania kropelek dodatnich pod kątem GzmB po 6 h inkubacji dla każdej z czterech populacji kropelek, zilustrowany danymi z próbki CAR T od Donora 1. (C) Śmierć komórek w tle określono w populacjach kropelek kontrolnych zawierających wyłącznie komórki JeKo-1 oraz wyłącznie limfocyty T w każdym z mierzonych punktów czasowych, przy użyciu danych od donora 1. Śmierć komórek w tle jest wykorzystywana do obliczenia częstości występowania żyjących, wydzielających GzmB i zabijających komórki efektorowych, przedstawionych na Rycini 7 i wyjaśnionych w kroku 3.3. Skróty: Pre = enkapsulacja. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Aktywność limfocytów T; wykresy słupkowe, CAR T vs NTD, godziny współinkubacji, istotność statystyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Ilościowe oznaczenie limfocytów T zdolnych do wydzielania GzmB i zabijania komórek JeKo-1 w kropelkach podwójnie dodatnich. Kropelki podwójnie dodatnie wyselekcjonowane z dwóch dawców badano po 2 h, 4 h i 6 h współinkubacji w kropelkach. (A) Częstość występowania limfocytów T w kontakcie z komórką docelową, wydzielających GzmB, oraz porównanie pomiędzy limfocytami T NTD a CAR T. (B) Częstość występowania limfocytów T w kontakcie z komórką docelową, które zabijają współinkapsulowaną komórkę docelową. Skróty: GzmB = granzym B, NTD = nietransdukowane, PI = jodek propidyny. * = wartość P &lt; 0,05, ** = wartość P &lt; 0,005, **** = wartość P &lt; 0,0001 przy zastosowaniu dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj opisujemy metodę tworzenia kropelek podwójnej emulsji otaczających jedną limfocyt T i komórkę docelową raka, aby zbadać zabijanie komórek na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta pozwala na podwójną kwantyfikację zarówno cząsteczek cytotoksycznych, jak i apoptozy komórek docelowych w dużej populacji limfocytów T.

Test cytotoksyczności oparty na kropelkach w celu oceny limfocytów T receptora antygenu chimerycznego na poziomie pojedynczej komórki

The assessment of the cytotoxic potential of T cell-based therapies, such as chimeric antigen receptor (CAR) T cell treatments, is instrumental in ...

Nasze badania koncentrują się na ocenie różnorodności funkcjonalnej limfocytów T CAR poprzez enkapsulację pojedynczych efektorowych limfocytów T CAR z komórkami docelowymi, aby lepiej zrozumieć ich potencjał cytotoksyczny na poziomie pojedynczej komórki. Obecne testy cytotoksyczności są ograniczone, ponieważ często są wykonywane masowo. Pomija to różnice między poszczególnymi limfocytami T CAR i nie identyfikuje odrębnych subpopulacji o różnych reakcjach na cele.Nasza technologia umożliwia multipleksowe testy zabijania komórek w formacie pojedynczej komórki przy użyciu standardowych cytometrów przepływowych i kolejności komórek. Daje to bardziej precyzyjne wyniki niż protokoły zbiorcze, ponieważ nie ma zakłóceń ze strony sąsiednich komórek. Mamy nadzieję, że tego typu badania pozwolą nam i innym naukowcom lepiej przyjrzeć się najdrobniejszym szczegółom naszych CAR i temu, jak funkcjonują one na poziomie pojedynczej komórki.Na początek rozcieńczyć roztwory podstawowe dwóch barwników fluorescencyjnych w stosunku 1:5 000 w PBS firmy Dulbecco. Przenieś komórki do oddzielnych 15-mililitrowych probówek. Odwirować probówki o masie 300 g przez pięć minut.Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek efektorowych w roztworze roboczym fioletowego barwnika fluorescencyjnego. Zawiesić osady komórek docelowych w roztworze roboczym dalekiej czerwieni barwnika fluorescencyjnego. Inkubuj wybarwione komórki przez 20 minut w inkubatorze z dwutlenkiem węgla nawilżanym o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po inkubacji odwiruj komórki o masie 300 g przez pięć minut, aby je otulić. Ponownie zawiesić granulki ogniw w 15 mililitrach kompletnego podłoża RPMI 1640, aby je umyć. Umyj i ponownie odwiruj.Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek efektorowych w 225 mikrolitrach kompletnego podłoża RPMI 1640, a granulki komórek docelowych w 450 mikrolitrach tego samego podłoża. Dodać 30 mikrolitrów pożywki gradientowej do zawiesin komórek efektorowych i 60 mikrolitrów do zawiesin komórek docelowych. Przed pipetowaniem należy dobrze wymieszać roztwór podstawowy o gradiencie.Następnie należy wstępnie rozcieńczyć substrat Granzyme B kompletnym podłożem RPMI 1640. Odpipetować roztwór podstawowy jodku perydium i rozcieńczony substrat Granzyme B do zawiesin komórek efektorowych i zawiesin komórek docelowych. Następnie pipetą, aby dobrze wymieszać roztwory.Aby hermetyzować komórki, należy podgrzać wkład do kapsułkowania i roztwór stabilizujący do temperatury pokojowej. Dodaj kompletne podłoże RPMI 1640 33% roztwór stabilizujący do komórek i 10% podłoże gradientowe. I wymieszaj je, aby przygotować bulion z zewnętrznego podłoża.Dla każdej próbki enkapsulacji wymieszać 65 mikrolitrów przygotowanej zawiesiny komórek efektorowych z 65 mikrolitrami przygotowanej zawiesiny komórek docelowych w probówce o pojemności 1,5 mililitra. Ponownie dobrze zawiesić komórki za pomocą pipety. Załaduj wskazane dołki wkładu enkapsulacyjnego odczynnikami w podanej kolejności.Reese dobrze zawiesza komórki za pomocą pipety tuż przed załadowaniem. Ostrożnie uszczelnij uszczelkę na wkładzie. Przenieś wkład do urządzenia mikroprzepływowego, a następnie rozpocznij enkapsulację zgodnie z instrukcją obsługi.Po zakończeniu cyklu wyjmij wkład i zbierz kropelki ze studzienki D, ponownie zawieszając je w pożywce nakładającej i przenosząc do dwumililitrowej probówki o niskim poziomie wiązania DNA z pokrywką. Przemyć studzienkę D pozostałym zewnętrznym podłożem ze studzienki A, aby zebrać pozostałe kropelki. Gdy kropelki osiądą w probówkach zbiorczych, przed badaniem mikroskopowym należy potwierdzić dwie wyraźnie odrębne fazy w probówkach.Napełnij około jednej trzeciej końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów kropelkami z powierzchni warstwy kropli. Następnie napełnij pozostałe około dwóch trzecich końcówki pipety pożywką nakładającą. Natychmiast załadować próbkę na ośmiokomorowe szkiełko podstawowe.Zbadaj kropelki pod mikroskopem przy 4-krotnym i 20-krotnym powiększeniu, aby potwierdzić obciążenie kropelkami komórek. Do inkubacji użyj igły strzykawkowej o rozmiarze 21, aby ostrożnie przekłuć pokrywkę wymaganej liczby dwóch mililitrowych probówek o niskim poziomie wiązania DNA. Dodać jeden mililitr pożywki zewnętrznej do każdej probówki inkubacyjnej.Ponownie zawiesić kropelki wytworzone w pożywce nakładającej i podzielić każdą produkcję na trzy przygotowane probówki inkubacyjne. Umieść probówki pionowo w inkubatorze na dwie, cztery lub sześć godzin inkubacji po wytworzeniu kropel. Po inkubacji przenieść niewielką liczbę kropel na szkiełko mikroskopowe.Analizuj kropelki za pomocą mikroskopii jasnego pola i mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu standardowego mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednią konfiguracją lasera i filtrów. Zawiesić ponownie każdą próbkę kropel w pożywce. Przenieś zawieszone próbki do pięciu mililitrowych probówek FAC.Przeanalizować kropelki za pomocą standardowego cytometru przepływowego. Rejestruj sygnały wysokości intensywności dla rozproszenia do przodu, rozproszenia bocznego i badanych fluoroforów. Przemyć cytometr przepływowy przez port iniekcji próbki Po każdym zestawie pobierania kropel przy użyciu standardowych roztworów do czyszczenia i płukania.Limfocyty T CAR zostały z powodzeniem wzbogacone do czystości ponad 98% u obu dawców przy użyciu kulek magnetycznych anty NGFR, a ich stosunek CD4-CD8 określono ilościowo na poziomie 0,73 z zaobserwowanym naiwnym fenotypem pamięci. Nietransdukowane limfocyty T użyto jako kontroli w eksperymencie. Mikroskopia fluorescencyjna po czterech godzinach inkubacji wykazała wydzielanie Granzymu B w kropelkach z komórkami JeKo-1 współkapsułkowanymi z limfocytami T CAR, podczas gdy nie wykryto wydzieliny w przypadku limfocytów T bez transdukcji.Cytometria przepływowa pozwoliła zidentyfikować odrębne populacje kropelek w oparciu o typy komórek zamkniętych w kapsułkach, potwierdzając, że wyraźne wydzielanie Granzymu B i aktywność cytotoksyczna występowały w kropelkach zawierających limfocyty T CAR i komórki docelowe JeKo-1. Wydzielanie granzymu B i zabijanie komórek docelowych przez limfocyty T CAR wykazywało wzrost zależny od czasu, przy czym ponad 30% limfocytów T CAR wydzielało Granzyme B po sześciu godzinach, a ponad 20% limfocytów T CAR zabijało komórki docelowe, na co wskazuje dodatni wynik jodku propidyny.

droplet-based-cytotoxicity-assay-to-assess-chimeric-antigen-receptor

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje metodę monitorowania aktywności komórek CAR T przeciwko komórkom nowotworowym poprzez pomiary impedancji elektrycznej w czasie rzeczywistym. Śledzenie zmian impedancji ocenia skuteczność limfocytów CAR T w indukowaniu cytolizy komórek nowotworowych, dostarczając informacji na temat ich zdolności cytotoksycznych.

Test cytolizy in vitro w czasie rzeczywistym w celu oceny siły działania limfocytów CAR T

Opisujemy jednokomórkowy test wysokoprzepustowy do pomiaru cytotoksyczności limfocytów T podczas inkubacji z komórkami docelowymi nowotworu. Metoda ta wykorzystuje gęsty, elastomerowy układ dołków sub-nanolitrowych (~ 100 000 dołków / tablicę) w celu przestrzennego ograniczenia limfocytów T i komórek docelowych w określonych proporcjach i jest sprzężona z mikroskopią fluorescencyjną w celu monitorowania koniugacji efektor-cel i późniejszej apoptozy.

Ilościowy, wysokoprzepustowy test cytotoksyczności pojedynczej komórki dla limfocytów T

Opisujemy ilościowy system testów cytolizy in vitro w czasie rzeczywistym, aby ocenić siłę działania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenu ukierunkowanych na płynne i lite komórki nowotworowe. Protokół ten można rozszerzyć w celu oceny innych komórek efektorowych układu odpornościowego, a także leczenia skojarzonego.

Test siły działania w czasie rzeczywistym dla chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego ukierunkowanych na stałe i hematologiczne komórki nowotworowe

Tutaj opisujemy metodę wspólnej hodowli in vitro do rekurencyjnego wyzwania limfocytów T ukierunkowanych na nowotwór, co pozwala na fenotypową i funkcjonalną analizę aktywności przeciwnowotworowych limfocytów T.

Ponowne badanie komórek nowotworowych in vitro w celu predykcyjnej oceny funkcji przeciwnowotworowej komórek T receptora antygenu chimerycznego

Tutaj opisujemy protokół, w którym model ksenoprzeszczepu uzyskany od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną jest używany jako strategia oceny i monitorowania toksyczności związanej z receptorem chimerycznego antygenu T ukierunkowanym na CD19.

Ocena toksyczności związanej z chimerycznym receptorem antygenowym limfocytów T przy użyciu mysiego modelu ksenoprzeszczepu pobranego od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną

Protokół do oceny ilościowego zabijania komórek nowotworowych przez komórki Jurkata wyrażające chimeryczny receptor antygenowy (CAR) ukierunkowany na pojedynczy antygen nowotworowy. Protokół ten może być wykorzystany jako platforma przesiewowa do szybkiej optymalizacji konstrukcji zawiasów CAR przed potwierdzeniem w limfocytach T pochodzących z krwi obwodowej.

Szybka ocena cytotoksyczności in vitro receptora antygenu chimerycznego z ekspresją Jurkata przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę generowania przejściowych limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) przy użyciu nieintegrującego mRNA do immunoterapii nowotworów i dostarcza wiarygodnych metod oceny komórek CAR-T i ich funkcji cytotoksycznej.

Niewirusowe podejście do generowania przejściowych limfocytów T receptora chimerycznego antygenu przy użyciu mRNA do immunoterapii nowotworów

Ten protokół zapewnia zstandaryzowany in vitro przepływ pracy dla spójnego pomiaru naturalnej, chimerycznej receptora antygenowego–pośredniczonej i zależnej od przeciwciał cytotoksyczności ludzkich naturalnych komórek zwanych zbójcami przy użyciu żywego obrazu komórkowego i cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórek NK potencjowanej przez chimeryczne receptory antygenowe i przeciwciała terapeutyczne z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek i cytometrii przepływowej

Niniejszy artykuł opisuje procedurę przygotowania znakowanej fluorescencyjnie wersji bakteriofaga lambda, zakażania bakterii E. coli, obserwowania efektów zakażenia pod mikroskopem oraz analizy wyników infekcji.

Śledzenie losów komórek E. coli po infekcji fagiem lambda

Patogeneza HIV-1 jest definiowana zarówno przez cechy wirusa, jak i czynniki genetyczne gospodarza. W tym miejscu opisujemy solidną metodę, która pozwala na powtarzalne pomiary w celu oceny wpływu zmienności sekwencji genu gag na zdolność replikacji wirusa in vitro.

Metoda klonowania oparta na enzymach restrykcyjnych w celu oceny zdolności replikacji in vitro chimerycznych wirusów HIV-1 podtypu C Gag-MJ4

Poznaj metodę oceny cytotoksyczności limfocytów T CAR na poziomie pojedynczej komórki przy użyciu mikrofluidycznej enkapsulacji w kropelkach. Technika ta pozwala analizować heterogeniczność odpowiedzi komórek i poprawia projektowanie terapii przeciwnowotworowych.

Test cytotoksyczności oparty na kropelkach w celu oceny limfocytów T receptora antygenu chimerycznego na poziomie pojedynczej komórki (Wideo) | JoVE Journal

Test cytotoksyczności oparty na kropelkach w celu oceny limfocytów T receptora antygenu chimerycznego na poziomie pojedynczej komórki

Przeglądaj więcej filmów