Name: Rozdzielanie i frakcjonowanie białek filtratu kulturowego (CFP) z Mycobacterium tuberculosis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Poznaj metody rozdzielania białek filtratu kulturowego Mycobacterium tuberculosis w celu identyfikacji frakcji immunogennych. Techniki elektroforetyczne umożliwiają analizę proteomiczną i rozwój diagnostyki gruźlicy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu używanego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Wzrost Mycobacterium tuberculosis i przygotowanie białek filtratu kulturowego (CFP)
<ol>
	<li>Przygotowanie płynnego podłoża Saautona<ol>
		<li>Połącz następujące składniki w 950 ml wody destylowanej: Glicerol, 30,0 ml; Diwodorofosforan potasu (KH2PO4), 0,5 g; Siarczan magnezu, 0,5 g; Kwas cytrynowy, 2,0 g; Hydrolizat kazeiny, 0,5 g; Siarczan żelazowo-amonowy, 0,05 g; Glutaminian sodu, 4,0 g.</li>
		<li>Dostosuj pH do 7,2 za pomocą 40% wodorotlenku potasu (około 5 ml/l).</li>
		<li>Uzupełnić objętość do 1 l i sterylizować w autoklawie pod ciśnieniem 15 psi przez 20 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zawiesiny prątków<ol>
		<li>Przenieść kolonie Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) wyhodowane na zboczach Lowensteina-Jensena (LJ) do 2 ml płynnej pożywki Saautona.</li>
		<li>Rozbij grudki prątków przez energiczne potrząsanie szklanymi kulkami w sterylnych warunkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inicjowanie wzrostu prątków<ol>
		<li>Przenieś zawiesinę bakteryjną do butelki McCartneya zawierającej 10 ml płynnego podłoża Sauton.</li>
		<li>Inkubować butelkę w temperaturze 37 °C przez 2 tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zwiększanie skali kultury<ol>
		<li>Przenieś wyhodowaną kulturę do 200 ml pożywki Saauton w butelce o pojemności 1 l.</li>
		<li>Inkubować na wytrząsarce w temperaturze 37 °C przez 4 tygodnie.</li>
		<li>Przenieść kulturę w fazie logarytmicznej do 4-litrowej kolby zawierającej 2 litry pożywki Saautona.</li>
		<li>Hodować kulturę w temperaturze 37 °C w warunkach stacjonarnych przez dodatkowe 4 tygodnie, aż utworzy się błonka powierzchniowa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbiór białek filtratu kulturowego (CFP)<ol>
		<li>Zbierz kulturę przez odwirowanie przy 1,000-1,500 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przefiltrować supernatant przez system filtracji próżniowej 0,45 μm.</li>
		<li>Zagęścić filtrat zawierający CFP, stosując system filtracji o przepływie stycznym z punktem odcięcia 10 kDa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przechowywanie zebranego CFP<ol>
		<li>Oszacuj zawartość białka przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do oznaczania BCA.</li>
		<li>Podzielić białka na porcje, dodać azydek sodu do końcowego stężenia 0,2% i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Preparatywne ogniskowanie izoelektryczne w fazie ciekłej (IEF)
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki białka<ol>
		<li>Rozpuścić Mycobacterium tuberculosis CFP w 60 ml buforu separacyjnego IEF zawierającego 8 M mocznika, 1 mM ditiotreitolu (DTT), 5% glicerolu, 2% digitoniny, 2% amfolitów (pH 3,0-10,0 i pH 4,0-6,0 w stosunku 1:4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja systemu IEF<ol>
		<li>Napełnij komorę anodową 0,1 M kwasem fosforowym, a komorę katodową 0,1 M wodorotlenkiem sodu.</li>
		<li>Preparatywną komórkę IEF należy zmontować zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonywanie IEF<ol>
		<li>Załaduj do 350 mg białka do systemu IEF.</li>
		<li>Skupić białka w temperaturze 4 °C za pomocą chłodzącego systemu wody krążącej.</li>
		<li>Zastosuj stałą moc 12 W, aż napięcie ustabilizuje się na poziomie około 1400 V, a następnie kontynuuj przez dodatkowe 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieranie i analizowanie ułamków<ol>
		<li>Zbierz frakcje IEF i określ ich pH.</li>
		<li>Przeanalizuj każdą podwielokrotność za pomocą SDS-PAGE i wizualizuj białka za pomocą barwienia srebrem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Preparatywna SDS-PAGE i elucja w całym żelu
<ol>
	<li>Przygotowanie próbek do SDS-PAGE<ol>
		<li>Wymieszaj frakcje IEF z dostępnym na rynku buforem próbki 6x SDS-PAGE.</li>
		<li>Podgrzewać mieszaninę w temperaturze 95 °C przez 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchamianie preparatywnej SDS-PAGE<ol>
		<li>Załaduj do 10 mg białka do żelu poliakrylamidowego o długości 16 cm × 20 cm z 4% żelem do układania w stosy i 12,5% żelem rozdzielczym.</li>
		<li>Uruchom elektroforezę przy stałym prądzie 50 mA, aż czoło barwnika znajdzie się 2 cm od dołu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elucja białek z żelu<ol>
		<li>Równoważyć żel w buforze elucyjnym (60 mM Tris, 40 mM CAPS, pH 9,4) przez 10 minut.</li>
		<li>Przenieś żel do instrumentu eluter z całego żelu.</li>
		<li>Eluować białka, przykładając stały prąd 250 mA przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieranie i analizowanie ułamków<ol>
		<li>Oddzielone białka należy rozdzielić na 30 pojedynczych frakcji, każda o objętości 2,5 ml.</li>
		<li>Oznaczyć stężenie białka za pomocą metody szacowania białka BCA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Przeanalizuj 10 μg białka z każdej frakcji za pomocą SDS-PAGE i wizualizuj za pomocą barwienia srebrem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gomez, M., Johnson, S., Gennaro, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+secreted+proteins+of+Mycobacterium+tuberculosis+by+a+bioinformatic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Identification of secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis by a bioinformatic approach.</a> Infect Immun. 68 (4), 2323-2327 (2000).</li>
<li>de Souza, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-accuracy+mass+spectrometry+analysis+as+a+tool+to+verify+and+improve+gene+annotation+using+Mycobacterium+tuberculosis+as+an+example%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">High-accuracy mass spectrometry analysis as a tool to verify and improve gene annotation using Mycobacterium tuberculosis as an example.</a> BMC Genomics. 9, 316(2008).</li>
<li>Lim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+new+T-cell-stimulating+antigens+from+Mycobacterium+tuberculosis+culture+filtrate%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate.</a> FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).</li>
<li>Covert, B. A., Spencer, J. S., Orme, I. M., Belisle, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+proteomics+in+defining+the+T+cell+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The application of proteomics in defining the T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 1 (5), 574-586 (2001).</li>
<li>Tucci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+proteomic+and+glycoproteomic+profiling+of+Mycobacterium+tuberculosis+culture+filtrate%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Integrative proteomic and glycoproteomic profiling of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate.</a> PLoS One. 15 (3), e0221837(2020).</li>
<li>Deenadayalan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoproteomic+identification+of+human+T+cell+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis+that+differentiate+healthy+contacts+from+tuberculosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunoproteomic identification of human T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis that differentiate healthy contacts from tuberculosis patients.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (3), 538-549 (2010).</li>
<li>Yasuda, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cytokine+profiles+related+to+Mycobacterium+tuberculosis+latent+antigens+using+a+whole-blood+assay+in+the+Philippines%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cytokine profiles related to Mycobacterium tuberculosis latent antigens using a whole-blood assay in the Philippines.</a> Front Immunol. 15, 1330796(2024).</li>
<li>Målen, H., Søfteland, T., Wiker, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+analysis+of+Mycobacterium+tuberculosis+H37Rv+culture+filtrate+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen analysis of Mycobacterium tuberculosis H37Rv culture filtrate proteins.</a> Scand J Immunol. 67 (3), 245-252 (2008).</li>
<li>Bekmurzayeva, A., Sypabekova, M., Kanayeva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberculosis+diagnosis+using+immunodominant%2C+secreted+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Tuberculosis diagnosis using immunodominant, secreted antigens of Mycobacterium tuberculosis.</a> Tuberculosis (Edinb). 93 (4), 381-388 (2013).</li>
<li>Rodríguez-Hernández, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+antigenic+biomarkers+for+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Zhejiang+Univ+Sci+B%22%5BJournal%5D)">Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis.</a> J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).</li>
<li>Mustafa, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+biological+characterization+of+Mycobacterium+tuberculosis-specific+ESAT6-like+proteins+and+their+potentials+in+the+prevention+of+tuberculosis+and+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Princ+Pract%22%5BJournal%5D)">Chemical and biological characterization of Mycobacterium tuberculosis-specific ESAT6-like proteins and their potentials in the prevention of tuberculosis and asthma.</a> Med Princ Pract. 32 (4-5), 217-224 (2023).</li>
<li>Rosenkrands, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+proteome+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Towards the proteome of Mycobacterium tuberculosis.</a> Electrophoresis. 21 (17), 3740-3756 (2000).</li>
<li>Jungblut, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteome+analysis+of+Mycobacterium+tuberculosis+and+Mycobacterium+bovis+BCG+strains%3A+Towards+functional+genomics+of+microbial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative proteome analysis of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG strains: Towards functional genomics of microbial pathogens.</a> Mol Microbiol. 33 (6), 1103-1117 (1999).</li>
<li>Lim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+new+T-cell-stimulating+antigens+from+Mycobacterium+tuberculosis+culture+filtrate%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate.</a> FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).</li>
<li>Rodríguez-Hernández, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+antigenic+biomarkers+for+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Zhejiang+Univ+Sci+B%22%5BJournal%5D)">Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis.</a> J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).</li>
<li>Deenadayalan, A., Sundaramurthi, J. C., Raja, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+proteomic+analysis+of+preparative+isoelectric-focusing+separated+culture+filtrate+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Immunological and proteomic analysis of preparative isoelectric-focusing separated culture filtrate antigens of Mycobacterium tuberculosis.</a> Exp Mol Pathol. 88 (1), 156-162 (2010).</li>
</ol>

Białka filtratu kulturowego (CFP) Mycobacterium tuberculosis stanowią złożoną mieszaninę różnych składników białkowych obecnych w różnych stężeniach. Badania proteomiczne zidentyfikowały do 1314 białek w CFP 4,5. Liczne badania podkreśliły kluczową rolę CFP w modulowaniu odpowiedzi immunologicznej. W szczególności CFP odgrywają niezastąpioną rolę zarówno w odporności komórkowej, charakteryzującej się odpowiedziami limfocytów T<sup...

Szeroko zakrojone badania wykazały istotną rolę wydzielanych białek we wzroście i interakcjach immunologicznych Mycobacterium tuberculosis1. Filtrat hodowlany M. tuberculosis zawiera złożony zestaw składników białkowych i niebiałkowych, co czyni go cennym źródłem dla zrozumienia jego biologii i właściwości immunogennych. Wczesne badania proteomiczne zidentyfikowały prawie 450 białek w filtraciehodowlanym 2, z których wiele odgrywa kluczową rolę w wywoływaniu odpowiedzi immunologicznej przeciwko gruźlicy. Identyfikacja tych immunologicznie istotnych antygenów ma zasadnicze znaczenie dla opracowania innowacyjnej diagnostyki i szczepionek przeciwko gruźlicy. Postęp w tej dziedzinie jest jednak kwestionowany ze względu na złożoność odpowiedzi immunologicznej na zakażenie M. tuberculosis oraz ograniczenia techniczne metod oczyszczania biochemicznego stosowanych do izolowania białek prątków.
Zastosowano różne techniki separacji w celu rozdzielenia białek M. tuberculosis, ułatwiając wykrywanie mniejszych, ale funkcjonalnie istotnych białek i rozszerzając zakres badań proteomicznych. Idealna metoda separacji skutecznie rozkłada złożone mieszaniny białek na ograniczoną liczbę odrębnych frakcji. Dwa szeroko stosowane podejścia do rozdzielania białek prątkowych to metody oparte na chromatografii i elektroforezie 1,2.
Techniki chromatograficzne, w tym powinowactwo, wymiana jonowa i chromatografia z odwróconymi fazami, są podstawą frakcjonowania białek od ponad dekady. Metody te są szeroko stosowane do rozdzielania białek M. tuberculosis 3. Są one jednak ograniczone przez takie czynniki, jak niska wydajność białka i zakłócenia ze strony składników niebiałkowych, co może komplikować późniejsze analizy immunologiczne. Te wady ograniczają użyteczność chromatografii do identyfikacji antygenów istotnych immunologicznie.
Aby zaradzić tym ograniczeniom, zastosowano dwuwymiarową metodę separacji opartą na elektroforezie. W pierwszym wymiarze białka są rozdzielane na podstawie ich ogniskowania izoelektrycznego (IEF) za pomocą preparatywnego systemu IEF, który segreguje białka według ich punktów izoelektrycznych. W drugim wymiarze białka są dalej rozdzielane na podstawie masy cząsteczkowej za pomocą preparatywnego SDS-PAGE, a następnie elucja za pomocą narzędzia eluterującego z całego żelu.
To dwuwymiarowe podejście ma kilka zalet. Znacznie zmniejsza złożoność białek filtratu hodowlanego (CFP) poprzez frakcjonowanie ich na 600 odrębnych frakcji. Dodatkowo frakcje nadają się do bezpośredniej analizy immunologicznej, ponieważ w procesie elucji nie wprowadzane są składniki, które zakłócają komórkowe testy immunologiczne 4,5,6.
Protokół ten szczegółowo opisuje przygotowanie i separację białek filtratu hodowlanego do analizy immunologicznej6.

<table><tbody><tr><td>&Auml; System filtracji strumienia stycznego KTA&nbsp;</td><td>CYTIVA (CYTIWA)</td><td>29038437</td><td></td></tr><tr><td>Amfoliity (pH od 3,0 do 10,0 )</td><td>BIO-RAD</td><td>1632094</td><td></td></tr><tr><td>Amfoliity (pH 4,0 do 6,0 )</td><td>BIO-RAD</td><td>1631143</td><td></td></tr><tr><td>Test białka BCA&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>71285-M</td><td></td></tr><tr><td>CZAPKI</td><td>MERCK</td><td>Zobacz materiał C2632</td><td></td></tr><tr><td>Hydrolizat kazeiny</td><td>MERCK</td><td>65072-00-6</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>MERCK</td><td>Zobacz materiał C0759 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>MERCK</td><td>300410</td><td></td></tr><tr><td>Naziemna telewizja cyfrowa</td><td>MERCK</td><td>Zobacz materiał D9779</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan żelazowo-amonowy</td><td>HIMEDIA</td><td>GRM10944</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>MERCK</td><td>Zobacz materiał G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Skosy Lowensteina-Jensena&nbsp;</td><td>HIMEDIA</td><td>SL001 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>MERCK</td><td>Zobacz materiał M7506</td><td></td></tr><tr><td>System filtracji próżniowej Millipore Stericup Quick Release</td><td>MERCK</td><td>S2HVU11RE</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fosforowy&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>695017</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorortofosforan potasu</td><td>MERCK</td><td>Zobacz materiał P0662</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>484016</td><td></td></tr><tr><td>Preparatywna komórka IEF (Rotofor)&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>170-2986&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Glutaminian sodu</td><td>MERCK</td><td>49621</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>HIMEDIA</td><td>MB095 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>MERCK</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>MERCK</td><td>U5128 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Cała aparatura Gel Eluter&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1651250</td><td></td></tr></tbody></table>

rozdzielanie i frakcjonowanie białek filtratu kulturowego (cfp) z mycobacterium tuberculosis

Separation and Fractionation of Culture Filtrate Proteins (CFPs) from Mycobacterium tuberculosis

Wydzielane białka Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) odgrywają kluczową rolę w patogenezie gruźlicy, modulacji immunologicznej i postępie choroby. Zrozumienie ich składu i funkcji jest niezbędne do identyfikacji nowych biomarkerów, które mogą pomóc w diagnozowaniu gruźlicy, opracowywaniu szczepionek i interwencjach terapeutycznych. Badanie to koncentruje się na systematycznej izolacji, frakcjonowaniu i charakterystyce białek filtratu kulturowego (CFP), aby umożliwić kompleksowe analizy immunologiczne i proteomiczne. CFP uzyskano z kultur M. tuberculosis H37Rv hodowanych w warunkach określonych chemicznie, aby zapewnić kontrolowaną ekspresję białek. Supernatant hodowli oczyszczono przez filtrację i zagęszczono przy użyciu systemu pustych włókien w celu zatrzymania białek powyżej 10 kDa. Frakcjonowanie osiągnięto poprzez ogniskowanie izoelektryczne w fazie ciekłej, rozdzielając białka na podstawie ich punktów izoelektrycznych na 20 odrębnych frakcji. Dalszą rozdzielczość przeprowadzono za pomocą preparatywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), a następnie elektroelucji, otrzymując 30 frakcji białkowych. Frakcjonowane białka uzyskane w ten sposób stanowią cenne źródło do profilowania immunologicznego i analiz proteomicznych opartych na spektrometrii mas. Poprzez systematyczne izolowanie i charakteryzowanie wydzielanych białek, badanie to przyczynia się do identyfikacji biomarkerów białkowych specyficznych dla gruźlicy, co może poprawić dokładność diagnostyczną i pogłębić naszą wiedzę na temat patogenezy M. tuberculosis .

Rysunek 1 ilustruje złożoność przygotowanych białek z filtratu hodowli (CFP). Początkowo 100 µg CFP poddano analizie 2D-SDS PAGE w celu oceny stopnia złożoności. Analiza ta wykazała obecność prawie 100 odrębnych plamek białkowych w CFP (Rysunek 1).
20 frakcji zebranych z każdego przebiegu przeanalizowano metodą SDS-PAGE. Z nich trzy reprezentatywne frakcje z trzech różnych przebiegów przedstawiono na Ryc. 2</stron...

Protokół ten opisuje hodowlę, zbiór i koncentrację wydzielanych białek Mycobacterium tuberculosis. Białka filtratu kulturowego (CFP) są oznaczane ilościowo, rozdzielane na 20 frakcji przez ogniskowanie izoelektryczne, a następnie rozdzielane na 30 frakcji za pomocą preparatywnego SDS-PAGE i systemu elektroelucji.

Rozdzielanie i frakcjonowanie białek filtratu kulturowego (CFP) z Mycobacterium tuberculosis

Secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) play a crucial role in tuberculosis pathogenesis, immune modulation, and disease ...

Badanie to ma na celu oddzielenie białek filtratu kulturowego Mycobacterium tuberculosis, aby poznać kluczowe frakcje białek zaangażowane w odpowiedź immunologiczną i chorobę, co może pomóc w opracowaniu lepszej diagnostyki lub szczepionek. Staramy się dowiedzieć, które frakcje są najbardziej immunogenne i w jaki sposób mogą przyczyniać się do zdolności bakterii do wywoływania i podtrzymywania infekcji. Niedawny postęp w technice elektroforezy umożliwia nam obecnie rozdzielanie wysoce złożonych proteomów na proste frakcje, takie jak kationowe białka dwu- lub czterokationowe, co pozwala na precyzyjną analizę proteomiczną i immunologiczną w stanie niższym.Jednym z głównych wyzwań związanych z proteomiką jest ograniczona obciążalność podczas elektroforezy. Ładowanie zbyt dużej ilości białka, powiedzmy około 350 miligramów białka lub więcej, może prowadzić do wytrącania się, wpływając na jakość separacji. Ponadto proces elektroforetyczny może denaturować białka, co sprawia, że nie nadają się one do dalszych badań funkcjonalnych lub testów, które wymagają białek w ich stanie naturalnym.Korzystając z naszej metody supresji białek, udało nam się zidentyfikować 27 nowych antygenów limfocytów T specyficznych dla Mycobacterium tuberculosis. Antygeny te są bardzo obiecujące dla rozwoju dokładniejszych narzędzi diagnostycznych i szczepionek przeciw gruźlicy nowej generacji. Protokół ten rozwiązuje lukę w rozwiązywaniu złożonych białek, umożliwiając separację na dobrze zdefiniowane i uproszczone frakcje białkowe.Frakcje te mogą być bezpośrednio wykorzystywane do badań proteomicznych i immunologicznych, pomagając w szybszej identyfikacji biomarkerów specyficznych dla choroby bez konieczności dalszego oczyszczania. Na początek przygotuj płynne podłoże Saautona, łącząc podane odczynniki w 950 mililitrach wody destylowanej. Uzupełnić objętość do jednego litra i sterylizować w autoklawie pod ciśnieniem 15 PSI przez 20 minut.Teraz przenieś kolonie Mycobacterium tuberculosis wyhodowane na zboczach Lowenstein-Jensen lub LJ do dwóch mililitrów płynnego podłoża Saautona. Za pomocą szklanych kulek energicznie wstrząsnąć zawiesiną w sterylnych warunkach, aby rozbić grudki prątków. Aby zainicjować wzrost prątków, przenieś zawiesinę bakteryjną do butelki McCartneya zawierającej 10 mililitrów płynnej pożywki Sauton.Inkubuj butelkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwa tygodnie. Zwiększ skalę kultury, przenosząc wyhodowaną kulturę do 200 mililitrów pożywki Saauton w litrowej butelce. Umieść butelkę na shakerze i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery tygodnie.Przenieść kulturę w fazie logarytmicznej do czterolitrowej kolby zawierającej dwa litry pożywki Sauton. Hoduj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w warunkach stacjonarnych przez dodatkowe cztery tygodnie, aż utworzy się błonka powierzchniowa. Przenieść kulturę do probówek wirówkowych i zebrać ją przez odwirowanie w temperaturze od 1 000 do 1 500 G przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Przefiltrować supernatant przez system filtracji próżniowej o wielkości 0,45 mikrometra. Następnie, stosując system filtracji o przepływie stycznym z odcięciem 10 kilodaltonów, zagęścić filtrat zawierający białka filtratu hodowlanego. Oszacuj zawartość białka przy użyciu dostępnego w handlu zestawu do oznaczania kwasu bicynkowego.Podamy białka, dodamy azydek sodu do końcowego stężenia 0,2% i przechowujemy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Rozpuścić białko filtratu kulturowego mycobacterium tuberculosis w 60 mililitrach ogniskowania izoelektrycznego lub buforu separacyjnego IEF, zawierającego osiem molowych moczników, jeden milimolowy ditiotreitol, 5% glicerolu, 2% digitoniny i 2% amfolitów. Napełnij komorę anodową 0,1 molowym kwasem fosforowym, a komorę katodową 0,1 molowym wodorotlenkiem sodu.Zmontuj preparatywną izoelektryczną komórkę ogniskującą zgodnie z instrukcjami producenta. Załaduj do 350 miligramów białka do systemu IEF. Skoncentruj białka w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą chłodzącego systemu wody krążącej.Zastosuj stałą moc 12 watów, aż napięcie ustabilizuje się na poziomie około 1 400 woltów, a następnie kontynuuj przez dodatkowe 30 minut. Zbierz frakcje IEF i określ ich pH. Przeanalizuj każdą podwielokrotność za pomocą SDS-PAGE.Przygotuj próbki do SDS-PAGE, mieszając frakcje IEF z dostępnym w handlu buforem próbek 6X SDS-PAGE. Podgrzej mieszaninę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Załaduj do 10 miligramów białka do żelu poliakrylamidowego o wymiarach 16 na 20 centymetrów z 4% żelem do układania w stos i żelem o rozdzielczości 12,5%.Uruchom elektroforezę przy stałym prądzie 50 miliamperów, aż przód barwnika znajdzie się dwa centymetry od dna. Teraz zrównoważ żel w buforze elucyjnym przez 10 minut. Przenieś żel na cały instrument eluter żelowy.Elute białka, przykładając stały prąd o natężeniu 250 miliamperów przez jedną godzinę. Następnie zbierz około 30 frakcji po 2,5 mililitra każda. Oznaczyć stężenie białka metodą kwasu bicynkowego, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.Przeanalizuj 10 mikrogramów białka z każdej frakcji za pomocą SDS-PAGE. Obraz ten przedstawia dwuwymiarową analizę SDS-PAGE, w której 100 mikrogramów białek filtratu hodowlanego wytworzyło prawie 100 odrębnych plamek białkowych, co wskazuje na bardzo złożony skład białka. Analiza SDS-PAGE trzech reprezentatywnych frakcji z różnych serii separacji wykazała wyraźne wzorce prążków, potwierdzając zmienność składu białek w próbkach.Wartości pH oddzielonych frakcji stopniowo wzrastały od 2,54 do 12,9, przy czym większość białek była skoncentrowana we frakcjach o pH od czterech do sześciu. Analiza SDS-PAGE całej eluowanej frakcji izoelektrycznej 12 wykazała, że każda frakcja zawierała od jednego do trzech prążków białkowych, co potwierdza pomyślne rozdzielenie i rozdzielenie białek na odrębne prążki.

separation-fractionation-culture-filtrate-proteins-cfps-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez prątki z ograniczoną ilością żelaza. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje stopniową izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z Mycobacterium tuberculosis hodowanych w warunkach ograniczających żelazo, które naśladują środowisko gospodarza. Przedstawiono w nim zastosowanie ultrafiltracji, wirowania różnicowego i separacji gradientu gęstości w celu wzbogacenia i...

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych zawierających syderofory z Mycobacterium tuberculosis

Ten film demonstruje rozdzielanie kwasów mykolowych metodą chromatografii cienkowarstwowej. Technika ta oddziela różne kwasy mykolowe - długołańcuchowe lipidy obecne w ścianie komórkowej prątków - na podstawie ich polarności.

Separacja wariantów kwasu mykolowego oparta na chromatografii cienkowarstwowej: metoda rozdzielania lipidów ściany komórkowej prątków na podstawie polarności

Ten film demonstruje izolację i koncentrację białek filtratu kultur bakteryjnych, w tym pęcherzyków zewnątrzkomórkowych bakterii, przy użyciu ultrafiltracji. Skoncentrowane pęcherzyki zewnątrzkomórkowe służą jako markery diagnostyczne do wykrywania choroby.

Zagęszczenie białka filtratu kultur bakteryjnych za pomocą urządzenia do ultrafiltracji

Ten film demonstruje technikę chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC) do oczyszczania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z filtratu hodowlanego Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Technika ta wykorzystuje porowatą kolumnę wypełnioną żywicą w celu uzyskania oczyszczonych frakcji EV. Porowate cząsteczki selektywnie pozwalają mniejszym białkom wnikać do porów, co skutkuje wolniejszą elucją. Jednocześnie pojazdy elektryczne są wykluczone z wnikania do porów ze względu na ich większy...

Technika chromatografii wykluczającej wielkość do oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Celem jest frakcjonowanie i izolowanie bioaktywnych małych cząsteczek, peptydów z złożonego ekstraktu roślinnego oraz białek z drobnoustrojów chorobotwórczych za pomocą metody ogniskowania izoelektrycznego w fazie ciekłej (IEF). Ponadto zidentyfikowano oddzielone cząsteczki i potwierdzono ich bioaktywność.

Separacja bioaktywnych małych cząsteczek, peptydów ze źródeł naturalnych i białek od drobnoustrojów metodą preparatywnego ogniskowania izoelektrycznego (IEF)

Szybkie i skuteczne oznaczanie wzrostu wewnątrzkomórkowego M. tuberculosis jest kluczowe dla poszukiwania lepszych terapii przeciwko gruźlicy (TB). Protokół ten opisuje test detekcji kolorymetrycznej na bazie bulionu przy użyciu zautomatyzowanego systemu hodowli płynów do ilościowego określenia wzrostu Mtb w makrofagach traktowanych potencjalnymi terapiami kierowanymi przez gospodarza.

Zautomatyzowany system hodowli do stosowania w badaniach przedklinicznych terapii gruźlicy ukierunkowanych na gospodarza

Bakterie wydzielają nanometrowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przenoszące bioaktywne cząsteczki biologiczne. Badania nad EV koncentrują się na zrozumieniu ich biogenezy, roli w interakcjach i chorobach między drobnoustrojami a gospodarzem-mikroorganizmem, a także na ich potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. Przedstawiono proces pracy do skalowalnej izolacji pojazdów elektrycznych od różnych bakterii, aby ułatwić standaryzację badań nad pojazdami elektrycznymi.

Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii

Ten protokół opisuje chromatografię wykluczania rozmiaru, łatwą i powtarzalną technikę wzbogacania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Mycobacterium tuberculosis z supernatantów hodowli.

Mycobacterium tuberculosis (prątki gruźlicy) Wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczania wielkości

Ten protokół szczegółowo opisuje wzbogacanie natywnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków (mEV) z aksonicznych kultur Mycobacterium smegmatis (Msm) oraz jak można projektować i wzbogacać rekombinowane MsmEV zawierające mCherry (czerwony fluorescencyjny reporter). Na koniec zweryfikowano nowatorskie podejście polegające na wzbogaceniu MsmEV zawierających białko EsxA Mycobacterium tuberculosis.

Wzbogacanie natywnych i rekombinowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Tutaj demonstrujemy przygotowanie filtratu kulturowego Mtb (CF), który jest pożywką do wzrostu bakterii, która składa się z białek wydzielanych przez bakterie. Mtb wydziela białka modulujące sygnalizację gospodarza i odpowiedź immunologiczną, które mają kluczowe znaczenie dla patogenezy. Przygotowane CF są analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu zidentyfikowania wszystkich czynników wydzielniczych.

Przygotowanie filtratu z hodowli Mycobacterium tuberculosis w celu zrozumienia patogenezy gruźlicy

Protokół ten rozdziela nierozpuszczalne białka ściany komórkowej i błony na proste frakcje (1-5 białek) za pomocą preparatywnego ogniskowania izoelektrycznego (IEF) opartego na punkcie izoelektrycznym, a następnie rozdzielania według masy cząsteczkowej. Otrzymane frakcje można wykorzystać bezpośrednio do analizy immunologicznej i proteomicznej bez dalszego oczyszczania.

Separacja i frakcjonowanie białek ściany komórkowej i błony komórkowej z Mycobacterium tuberculosis do dalszej analizy białek

Poznaj metody rozdzielania białek filtratu kulturowego Mycobacterium tuberculosis w celu identyfikacji frakcji immunogennych. Techniki elektroforetyczne umożliwiają analizę proteomiczną i rozwój diagnostyki gruźlicy.

Rozdzielanie i frakcjonowanie białek filtratu kulturowego (CFP) z Mycobacterium tuberculosis

Przeglądaj więcej filmów