Kwantyfikacja zachowań pielęgnacyjnych Drosophila melanogaster w celu oceny nadmiernych fenotypów pielęgnacyjnych

Nasze badania oceniają zachowania pielęgnacyjne u Drosophila melanogaster po knockdown Atg8a za pośrednictwem RNAi, aby modelować deficyty GABARAP obserwowane u pacjentów z zespołem Tourette'a. Naszym celem jest zrozumienie roli aAtg8a w rozwoju behawioralnym, zapewniając wgląd w funkcje regulacyjne jej ludzkiego odpowiednika w procesach neurobehawioralnych. Obecne wyzwania eksperymentalne związane z metodą ręcznej adnotacji obejmują złożony proces analityczny, taki jak dodawanie adnotacji i przeglądanie materiału filmowego, oraz subiektywność związaną z ręczną adnotacją.

Zautomatyzowane metody również stoją przed wyzwaniami, w tym wymogiem znacznej wiedzy z zakresu informatyki w celu skutecznego wdrożenia i wykonania. Odkryliśmy, że gen Atg8a odgrywa rolę w rozwoju zachowania muszek owocowych wykraczającą poza to, co wcześniej ustalono. Mówiąc dokładniej, odkryliśmy, że reguluje on zarówno pielęgnację, jak i uczenie się, co sugeruje, że ortologi Atg8a mogą odgrywać podobne role w innych organizmach.

Technika ta pozwala na bezpośrednie ilościowe określenie częstotliwości i rozmieszczenia pielęgnacji u Drosophila. Jest to szczególnie przydatne w laboratoriach, które nie są w stanie wykorzystać metod zautomatyzowanych i pozwala na bardziej szczegółową analizę niż metody pośrednie, oparte na barwnikach. Ogólnie rzecz biorąc, nasze badania naprzód wykorzystanie Drosophila jako organizmu modelowego do badania zaburzeń neurorozwojowych, które wykazują zachowania obsesyjno-kompulsywne, takie jak zespół Tourette'a.

Dodaje to również do coraz większej liczby dowodów na to, że białka związane z autofagią odgrywają rolę w rozwoju behawioralnym. Na początek umieść cztery trzydołkowe naczynia obok siebie na białej powierzchni i przykryj każde naczynie szklanym szkiełkiem. Umieść kamerę nad naczyniami.

Upewnij się, że na szkiełkach nie ma odblasków, które mogłyby ograniczać widoczność much w naczyniu i dostosuj położenie talerza lub przyciemnij światła w razie potrzeby, aby wyeliminować odblaski. Teraz zaznacz położenie naczyń i kamery na ławce, na której odbywa się nagrywanie. Umieść cztero- lub dziewięciodniowe muchy na bloku lodu pokrytym parafilmem i ręcznikiem papierowym, aby lekko je znieczulić.

Po znieczuleniu przenieś muchy do komór obserwacyjnych tak szybko, jak to możliwe, za pomocą pędzla. Umieść jedną muchę w każdym dołku trzydołkowego naczynia, zapewniając minimalne zakłócenia, aby uniknąć sprowokowania zmian w zachowaniu wywołanych stresem. Po aklimatyzacji muszek 30 minut po znieczuleniu, nagraj muchy za pomocą kamery, a następnie otwórz terminal i wpisz cd PiSpy.

Wpisz python3 PiSpy. py, a następnie wprowadź żądaną długość nagrania i liczbę klatek na sekundę. Wybierz żądaną rozdzielczość i kliknij Szybkie przechwytywanie.

Teraz użyj funkcji podglądu kamery w Pi Spy, aby upewnić się, że muchy są ostre i wystarczająco widoczne. Nagrywaj muchy przez 10 minut z zalecaną szybkością 24 klatek na sekundę i zapisz plik. Aby przeanalizować wideo, zaimportuj plik do oprogramowania ELAN 6.8 w celu szczegółowej adnotacji i dogłębnej analizy zachowań związanych z uwodzeniem.

Wybierz Poziom, Dodaj nowy poziom, wpisz lokalizację w naczyniu w nazwie poziomu i dodaj, aby przypisać każdy wiersz, aby ręcznie dodać adnotacje do materiału filmowego osób. Aby dodać adnotacje do zachowań, kliknij dwukrotnie poziom, który ma zostać opisany, kliknij prawym przyciskiem myszy i przeciągnij kursor wzdłuż wybranego poziomu przez okres, w którym wyświetlany jest pojedynczy atak pielęgnacji. Kliknij lewym przyciskiem myszy, aby wybrać nową adnotację i kliknij dwukrotnie nowo podświetlony okres, aby wpisać skrót zachowania zaobserwowanego w tym punkcie czasu.

Gdy film zostanie całkowicie opisany, uzyskaj zestawienie każdego zachowania, klikając Widok, a następnie Statystyki adnotacji. Zidentyfikuj pielęgnację przednią jako pielęgnację wykonywaną w przedniej części ciała muchy. Zidentyfikuj pielęgnację tylną jako pielęgnację wykonywaną na przednim i tylnym końcu ciała muchy.

Napady pielęgnacyjne znacznie wzrosły w mutantach RNAi Atg8a w porównaniu z grupami kontrolnymi. Czas spędzony na pielęgnacji był również znacznie wydłużony u mutantów RNAi Atg8a w porównaniu z grupą kontrolną. Nie zaobserwowano istotnych różnic w rozkładzie zachowań związanych z pielęgnacją w przedniej i tylnej części ciała.