Name: Kwantyfikacja zachowań pielęgnacyjnych Drosophila melanogaster w celu oceny nadmiernych fenotypów pielęgnacyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T13:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji zachowań pielęgnacyjnych Drosophila melanogaster przy użyciu RNAi Atg8a. Technika umożliwia precyzyjną analizę częstotliwości grooming u mutantów, dostarczając wgląd w mechanizmy rozwoju behawioralnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podziękowania dla Johna Younga za opinie na temat eksperymentalnego projektu, Erica Lutha za korektę manuskryptu i Madeleine Hatfield za pomoc w projektowaniu figur. Praca ta została sfinansowana przez Uniwersytet Simmonsa i Wydział Biologii.

UWAGA: Przegląd protokołu jest przedstawiony w Rysunek 1.
1. Przygotowanie do filmowania
<ol>
	<li>Umieść cztery trzydołkowe naczynia obok siebie na białej powierzchni, przykrywając każdą szklanym szkiełkiem.</li>
	<li>Umieść kamerę (w tym przypadku system Raspberry Pi, ale wystarczy dowolna kamera zdolna do nagrywania wideo w wysokiej rozdzielczości) nad naczyniami.
	<ol>
		<li>Sprawdź, czy wszystkie naczynia są w kadrze i są ostre.</li>
		<li>Sprawdź, czy na szkiełkach nie ma odblasków, które ograniczą widoczność much w naczyniu. Wyeliminuj odblaski, dostosowując położenie płyty lub przyciemniając światła w przestrzeni nagrywania.</li>
		<li>Użyj wysokiej rozdzielczości (minimum 1920 x 1080 pikseli), aby dokładnie zobrazować kończyny muchy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaznacz położenie naczyń i kamery na stole, na którym odbywa się nagrywanie. 
	UWAGA: Ograniczy to czas spędzony na kroku 2 w przyszłym korzystaniu z urządzenia. Wykonywanie testów w tym samym czasie i w tej samej przestrzeni ograniczy zmienność zachowania w oparciu o czynniki wykraczające poza zamierzone manipulacje.</li>
	<li>Lekko znieczul 4-9 dniowe muchy zimnem na bloku lodu pokrytym parafilmem i ręcznikiem papierowym (znieczulenie CO2 będzie miało znaczący wpływ na zachowanie).
	<ol>
		<li>Przyłóż muchy do bloku, a po znieczuleniu przenieś muchy do komór obserwacyjnych tak szybko, jak to możliwe, za pomocą pędzla. 
		UWAGA: Ten transfer powinien nastąpić tak szybko, jak to możliwe, ponieważ nadmierna ekspozycja na znieczulenie jakiegokolwiek rodzaju może negatywnie wpłynąć na muchy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść pojedynczą muchę w każdym dołku.</li>
	<li>Pozwól plikom zaaklimatyzować się w nowym środowisku przez 30 minut po znieczuleniu. Po tym momencie nie dotykaj ani nie przeszkadzaj studniom zawierającym muchy, ponieważ dodatkowe czynniki stresogenne wpłyną na zachowanie.</li>
</ol>
2. Nagrywanie much
<ol>
	<li>Po 30-minutowej aklimatyzacji nagraj muchy za pomocą kamery.</li>
	<li>Użyj kamery Raspberry Pi przepuszczonej przez PiSpy11 do zbierania danych behawioralnych. 
	UWAGA: Oprogramowanie jest bezpłatne i dostępne na GitHub (https://github.com/gpask/PiSpy), a system Pi można łatwo skonfigurować za mniej niż 300 USD. Inne kamery, jeśli są już dostępne, również wystarczą do nagrywania materiału</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie za pomocą liczby Pi za pomocą następującego przepływu poleceń.
	<ol>
		<li>Otwórz terminal i wpisz cd PiSpy. Następnie wpisz python3 PiSpy.py, wprowadź żądaną długość nagrania i wprowadź żądaną liczbę klatek na sekundę. Wybierz żądaną rozdzielczość i kliknij przycisk Szybkie przechwytywanie.</li>
		<li>Użyj funkcji podglądu kamery, aby upewnić się, że muchy są ostre i wystarczająco widoczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nagrywaj muchy przez 10 minut z zalecaną liczbą klatek na sekundę 24 kl./s i zapisz plik (PiSpy automatycznie zapisuje w folderze wideo).</li>
</ol>
3. Analiza wideo (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
<ol>
	<li>Aby przeanalizować wideo, zaimportuj plik do oprogramowania Elan 6.812. 
	UWAGA: To oprogramowanie, choć pierwotnie opracowane dla łoju psycholingwistycznego do szczegółowego opisywania filmów i dogłębnej analizy zachowań związanych z uwodzeniem</li>
	<li>Przypisz każdy wiersz, jak pokazano poniżej, aby ręcznie dodać adnotacje do materiału filmowego poszczególnych osób.
	<ol>
		<li>Zrób to za pomocą następującego przepływu poleceń: Poziom > Dodaj nowy poziom > Wpisz lokalizację w naczyniu na Nazwa poziomu > Dodaj.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W zależności od potrzeb badania, zanotuj i określ ilościowo różne specyficzne zachowania (pielęgnacja z przodu i z tyłu, chodzenie, spanie i stanie).
	<ol>
		<li>Twórz adnotacje, wykonując poniższe czynności.
		<ol>
			<li>Kliknij dwukrotnie warstwę, do której chcesz dodać adnotację. Kliknij prawym przyciskiem myszy i przeciągnij kursor wzdłuż wybranego poziomu przez okres, w którym wyświetlany jest pojedynczy atak pielęgnacyjny. Kliknij lewym przyciskiem myszy, wybierz opcję Nowa adnotacja i kliknij dwukrotnie nowo podświetlony okres. Wpisz skrót zachowania wyświetlanego w tym punkcie czasu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Obserwuj filmy powoli, przewijaj je myszą i dodawaj adnotacje. Powiększ pojedynczy obszar lotu podczas adnotacji, aby zapobiec fałszywej identyfikacji zachowań. Mogą one obejmować stukanie w krawędź szklanki przez rozporek lub przesuwanie nóg, co początkowo może wyglądać jak pielęgnacja.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy film zostanie całkowicie opisany, uzyskaj zestawienie każdego zachowania. Upewnij się, że w filmach jest używany ten sam skrót lub adnotacja, aby korzystać z tej funkcji. 
	UWAGA: Elan 6.8 poda liczbę wystąpień danego zachowania, całkowity czas trwania zachowań oraz średni czas spędzony na każdym zachowaniu.
	<ol>
		<li>Zdefiniuj napady pielęgnacyjne jako 2 sekundy nieprzerwanej pielęgnacji. Zidentyfikuj każde zaobserwowane zachowanie w następujący sposób. Zdefiniuj parametry dla obszarów anatomicznych przed przeprowadzeniem testu.
		<ol>
			<li>Pielęgnacja przednia: Zidentyfikuj pielęgnację wykonywaną w przedniej części ciała muchy jako pielęgnację przednią. 
			UWAGA: To zachowanie prawie zawsze będzie obejmowało ruch pocierania przedniej części, takiej jak głowa lub trąba, przednimi dwiema nogami muchy.</li>
			<li>Pielęgnacja tylna: Zidentyfikuj pielęgnację wykonywaną na przednim i tylnym końcu ciała muchy jako pielęgnację tylną. 
			UWAGA: Dodatkowo dla uproszczenia skrzydła zostały włączone do tylnej części. To zachowanie prawie zawsze będzie obejmowało ruch pocierania centralnym i najbardziej tylnym zestawem nóg w locie. Dobrym wskaźnikiem, że ma miejsce pielęgnacja tylna, będzie to, że na pierwszy rzut oka mucha może wyglądać tak, jakby brakowało jej najbardziej tylnych nóg, jak pokazano na Rysunek 2D.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mueller, J. M., Zhang, N., Carlson, J. M., Simpson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+and+variability+in+Drosophila+grooming+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Variation and variability in Drosophila grooming behavior.</a> Front Behav Neurosci. 15, 769372(2022).</li>
<li>Szebenyi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleaning+behaviour+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Behav%22%5BJournal%5D)">Cleaning behaviour in Drosophila melanogaster.</a> Anim Behav. 17 (4), 641-651 (1969).</li>
<li>Seeds, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suppression+hierarchy+among+competing+motor+programs+drives+sequential+grooming+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila.</a> Elife. 3, e02951(2014).</li>
<li>Ringo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+flies+keep+clean%3F+Head+grooming+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethol%22%5BJournal%5D)">How do flies keep clean? Head grooming in Drosophila.</a> J Ethol. 38, 167-172 (2020).</li>
<li>Feusner, J. D., Hembacher, E., Phillips, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+who+couldn%27t+stop+washing%3A+pathologic+grooming+in+animals+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Spectr%22%5BJournal%5D)">The mouse who couldn't stop washing: pathologic grooming in animals and humans.</a> CNS Spectr. 14 (9), 503-513 (2009).</li>
<li>Berridge, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+super-stereotypy+of+an+instinctive+fixed+action+pattern+in+hyper-dopaminergic+mutant+mice%3A+a+model+of+obsessive+compulsive+disorder+and+Tourette%27s%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequential super-stereotypy of an instinctive fixed action pattern in hyper-dopaminergic mutant mice: a model of obsessive compulsive disorder and Tourette's.</a> BMC Biol. 3, 4(2005).</li>
<li>Russo, A., Diantonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnd%2FDLK+is+a+critical+target+of+FMRP+responsible+for+neurodevelopmental+and+behavior+defects+in+the+Drosophila+model+of+Fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Wnd/DLK is a critical target of FMRP responsible for neurodevelopmental and behavior defects in the Drosophila model of Fragile X syndrome.</a> Cell Rep. 28, 2581-2593.e5 (2019).</li>
<li>Andrew, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+motor-behavior+abnormalities+in+two+Drosophila+models+of+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders.</a> J Neurogenet. 35 (1), 1-22 (2021).</li>
<li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA-+and+acetylcholine-related+gene+expression+in+blood+correlate+with+tic+severity+and+microarray+evidence+for+alternative+splicing+in+Tourette+syndrome%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">GABA- and acetylcholine-related gene expression in blood correlate with tic severity and microarray evidence for alternative splicing in Tourette syndrome: a pilot study.</a> Brain Res. 1381, 228-236 (2011).</li>
<li>Barradale, F., Sinha, K., Lebestky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Drosophila+grooming+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantification of Drosophila grooming behavior.</a> J Vis Exp. 125, e55231(2017).</li>
<li>Morris, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiSpy%3A+an+affordable%2C+accessible%2C+and+flexible+imaging+platform+for+the+automated+observation+of+organismal+biology+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PiSpy: an affordable, accessible, and flexible imaging platform for the automated observation of organismal biology and behavior.</a> PLoS One. 17 (10), e0276652(2022).</li>
<li>ELAN (Version 6.8) [Computer software]. Nijmegen: Max Planck Institute for Psycholinguistics, The Language Archive. , Nijmegen: Max Planck Institute for Psycholinguistics, The Language Archive. At 
 <a target="_blank" href="https://archive.mpi.nl/tla/elan&#34">https://archive.mpi.nl/tla/elan&#34</a> (2024).</li>
<li>Müller, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tourette%27s+syndrome%3A+clinical+features%2C+pathophysiology%2C+and+therapeutic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Dialogues+Clin+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tourette's syndrome: clinical features, pathophysiology, and therapeutic approaches.</a> Dialogues Clin Neurosci. 9 (2), 161-171 (2007).</li>
<li>Southall, T. D., Elliott, D. A., Brand, A. H. The GAL4 system: a versatile toolkit for gene expression in Drosophila. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSouthall%2C+TD+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22">Cold Spring Harb Protoc</a>. 2008, (2008).</li>
<li>Hatfield, T., Johnson, S. Knockdown of the GABARAP ortholog Atg8a elicits deficits in learning and promotes obsessive behaviors in Drosophila melanogaster. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHatfield%2C+T+%22MicroPubl+Biol%22">MicroPubl Biol</a>. 2024, (2024).</li>
<li>Bartholomew, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+climbing+and+flight+behaviour+in+Drosophila+melanogaster+following+carbon+dioxide+anaesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia.</a> Sci Rep. 5, 15298(2015).</li>
<li>Sindhurakar, A., Butensky, S. D., Carmel, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+forelimb+tasks+for+rodents%3A+current+advantages+and+limitations%2C+and+future+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Automated forelimb tasks for rodents: current advantages and limitations, and future promise.</a> Neurorehabil Neural Repair. 33 (7), 503-512 (2019).</li>
<li>Qiao, B., Li, C., Allen, V. W., Shirasu-Hiza, M., Syed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+long-term+grooming+behavior+in+Drosophila+using+a+k-nearest+neighbors+classifier%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of long-term grooming behavior in Drosophila using a k-nearest neighbors classifier.</a> Elife. 7, e34497(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ogólnie rzecz biorąc, ten łatwy do wykonania i opłacalny test pozwala na solidną charakterystykę zachowań pielęgnacyjnych Drosophila melanogaster . Technika ta daje wgląd w częstotliwość, czas spędzony na angażowaniu się i anatomiczny rozkład dużej liczby wcześniej zidentyfikowanych zachowań pielęgnacyjnych. Dobrym wskaźnikiem, że pielęgnacja będzie miała miejsce lub jest w toku, są zmiany w ułożeniu nóg, w szczególności podniesienie dowolnej z 6 nóg. Zwrócenie uwagi na zachowania po ruchu nóg może pomóc w ident...

Drosophila melanogaster jest dobrze znanym organizmem modelowym w badaniach behawioralnych i neurobiologicznych, dostarczającym wglądu w mechanizmy napędzające analogiczne zachowania ludzkie. Samopielęgnacja w tym organizmie jest wysoce regulowanym i dobrze zdefiniowanym zachowaniem, podążającym za stereotypowymi wzorcami, które łatwo od siebie odróżnić1. Poszczególne zachowania pielęgnacyjne wykazywane przez muchę można ogólnie sklasyfikować według regionu anatomicznego2, najłatwiej zdefiniować jako tylny lub przedni. Pielęgnacja Drosophila początkowo skupi się na odcinku przednim, a następnie przejdzie do końca tylnego3. W typowych warunkach muchy wykazują zachowania pielęgnacyjne w celu utrzymania czystości (np. poprzez usuwanie kurzu) i występują w odpowiedzi na ekspozycję na potencjalnie szkodliwe bodźce zewnętrzne, takie jak drobnoustroje chorobotwórcze4.
Nieprawidłowości w zachowaniu uwodzenia, szczególnie spontaniczne obsesyjne uwodzenie, były używane w różnych systemach modelowych jako wskaźnik obsesyjnego i/lub kompulsywnego zachowania. Wyniki badań translacyjnych obserwujących obsesyjne zachowania pielęgnacyjne u organizmów takich jak gryzonie, ptaki i psy dały wgląd w warunki wywołujące podobne kompulsywne zachowania u ludzi5. Należą do nich stany takie jak trichotillomania, zaburzenie obsesyjno-kompulsywne i zespół Tourette'a6. Nadmierne zachowania związane z pielęgnacją zostały również wykorzystane jako punkt odniesienia w ocenie fenotypów behawioralnych w modelach podobnych warunków neurorozwojowych u Drosophila melanogaster. Obsesyjne zachowania pielęgnacyjne zaobserwowano w modelach muchowych zespołu kruchego chromosomu X (FSX) i związanego z nim zaburzenia ze spektrum autyzmu (ASD). Nadmierna spontaniczna pielęgnacja występuje w przypadku mutacji dfmr1, ortologa genu związanego z ASD i FSX FMR17. Istnieje również zauważalna zmiana w rozkładzie pielęgnacji między tylnymi i przednimi końcami u tych mutantów8. Zmiany te są interpretowane jako odzwierciedlenie obsesyjnych i kompulsywnych zachowań skoncentrowanych na ciele wykazywanych przez niektórych pacjentów z tymi schorzeniami. Korzystając z opisanego tutaj testu uwodzenia, zaobserwowaliśmy zachowania pielęgnacyjne u much po powaleniu za pośrednictwem RNAi genu Drosophila Atg8a wytwarzanego przez komercyjnie dostępne sterowniki GAL4 i linie UAS-RNAi9 .
Ta metoda polega na ręcznym dodawaniu adnotacji do nagrań z muchami pod kątem określonych zachowań związanych z pielęgnacją. Wcześniejsze badania mające na celu ocenę zachowań związanych z uwodzeniem, takie jak te wykorzystujące metody pośrednie, takie jak barwniki, chociaż skuteczne w ilościowym określaniu skuteczności pielęgnacji, nie pozwalają na pomiar czasu trwania lub częstotliwości pielęgnacji10. Test ten pozwala jednak na ilościowe określenie częstotliwości i czasu trwania pielęgnacji Drosophila, zarówno ogólnie, jak i według regionu anatomicznego. Opisana tutaj metoda ma pewne zalety w porównaniu z obecnymi metodami automatycznymi, ponieważ można ją łatwo modyfikować i może być przeprowadzana przez osoby bez zaplecza obliczeniowego. Dysponując sprzętem łatwo dostępnym w większości laboratoriów, przedstawiamy opłacalny sposób oceny obecności nadmiernego fenotypu samooczyszczania (patrz Tabela Materiałów). To sprawia, że metoda jest łatwo dostępna głównie dla instytucji licencjackich i można ją łatwo dostosować do środowisk szkoleniowych lub laboratoriów dydaktycznych.

<table><tbody><tr><td>Karta Micro SD 16 GB</td><td>Adafruit</td><td>1294</td><td>Do użycia przy wprowadzaniu wyświetlacza systemu operacyjnego</td></tr><tr><td></td><td>Adafruit</td><td>3578</td><td>Wystarczy dowolny wyświetlacz, który można podłączyć za pomocą HDMI lub elastycznego</td></tr><tr><td>Linia Drosophila Atg8a-RNAi UAS</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>34340</td><td>Linia używana w danych reprezentatywnych</td></tr><tr><td>Sterownik Drosophila Ok6</td><td>Nie dotyczy</td><td></td><td>Linia używana w reprezentatywnych danych</td></tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>Utrzymuje muchy w osłonie</td></tr><tr><td>Radiatory</td><td>Adafruit</td><td></td><td>Zapobiega przegrzaniu komputera</td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Adafruit</td><td>4563</td><td>Używany tylko z kamerą HD</td></tr><tr><td>PiCamera</td><td>Adafruit</td><td>4561</td><td>Zastosowano tutaj wersję HD, ale w ramach ograniczeń budżetowych można użyć standardowej kamery</td></tr><tr><td>Raspberry pi 4</td><td>Adafruit</td><td>4292</td><td>Computer PiSpy jest uruchomiony na</td></tr><tr><td>Ribbion</td><td>Adafruit</td><td>1648</td><td>Do użycia w podłączaniu komponentów SB kamery i wyświetlacza</td></tr><tr><td>Etui</td><td>Adafruit</td><td>4301</td><td>Chroni komputer</td></tr><tr><td>Płyta punktowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>S99406</td><td>Wersje Pyrex były już dostępne do naszego użytku, ale wystarczą również naczynia do hodowli komórkowych lub plastikowe płytki punktowe</td></tr><tr><td>Statyw</td><td>Best Buy</td><td>6355959</td><td>Do zawieszenia i ustawienia kamery wystarczy dowolne urządzenie zdolne do tego</td></tr><tr><td>Zasilacz USB C</td><td>Adafruit</td><td>1995</td><td>Dostarcza zasilanie do komputera</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja zachowań pielęgnacyjnych drosophila melanogaster w celu oceny nadmiernych fenotypów pielęgnacyjnych

Quantification of Drosophila melanogaster Grooming Behavior for Evaluation of Excessive Grooming Phenotypes

Obserwowalne zmiany w stereotypowym uwodzeniu są stosowane translacyjnie w organizmach modelowych. Zmiany te są reprezentatywne dla patologii, które wywołują podobne odchylenia w ludzkim zachowaniu; na przykład nadmierna pielęgnacja działa jako wskaźnik obsesyjnych i kompulsywnych zachowań obecnych w stanach takich jak zespół Tourette'a lub zaburzenie obsesyjno-kompulsywne. Przedstawiony test pielęgnacji pozwala na ocenę nieprawidłowych fenotypów samopielęgnacji u Drosophila melanogaster. Muchy są rejestrowane przez okres 10 minut, a nagrania te są obserwowane i opisywane na ślepo pod kątem wcześniej zdefiniowanych zachowań pielęgnacyjnych. Miary ilościowe zarówno częstotliwości zabiegów pielęgnacyjnych, jak i czasu spędzonego na samodzielnej pielęgnacji można uzyskać, ręcznie dodając adnotacje do materiału filmowego. Test jest stosunkowo niedrogi, wymaga niewielu materiałów, które nie są jeszcze dostępne w środowiskach laboratoryjnych, i można go łatwo dostosować do specyficznych potrzeb danego badania mającego na celu obserwację pielęgnacji. Ponadto niski poziom umiejętności potrzebnych do przeprowadzenia testu, w porównaniu z metodami zautomatyzowanymi opartymi na informatyce, sprawia, że protokół dobrze nadaje się dla małych laboratoriów i studentów. Szczegółowo omawiamy kroki wymagane do wykonania tego testu i jego obecne ograniczenia.

Analiza ta dostarcza danych ilościowych określających czas i częstotliwość zachowań pielęgnacyjnych na podstawie adnotowanych nagrań. Reprezentacyjny obraz układu oraz sposób definiowania zachowań przedstawiono na Rysunku 2. Ze względu na subiektywizm wprowadzany przez analizę wideo, wszystkie adnotacje nagrań powinny być wykonywane w sposób zaślepiony względem badacza przeprowadzającego analizę.
Metoda ta została zastosowana w celu oceny roli genu Atg8a ...

Metoda przedstawiona tutaj polega na ręcznym dodawaniu adnotacji do materiału filmowego pozyskanego z Drosophila melanogaster pod kątem określonych zachowań pielęgnacyjnych. Pozwala to na ilościowe określenie zarówno liczby napadów pielęgnacji, jak i całkowitego czasu spędzonego na pielęgnacji w celu oceny nietypowych fenotypów samodzielnej pielęgnacji.

Kwantyfikacja zachowań pielęgnacyjnych Drosophila melanogaster w celu oceny nadmiernych fenotypów pielęgnacyjnych

Observable changes in stereotyped grooming are applied translationally in model organisms. These changes are representative of pathologies that elicit ...

Nasze badania oceniają zachowania pielęgnacyjne u Drosophila melanogaster po knockdown Atg8a za pośrednictwem RNAi, aby modelować deficyty GABARAP obserwowane u pacjentów z zespołem Tourette'a. Naszym celem jest zrozumienie roli aAtg8a w rozwoju behawioralnym, zapewniając wgląd w funkcje regulacyjne jej ludzkiego odpowiednika w procesach neurobehawioralnych. Obecne wyzwania eksperymentalne związane z metodą ręcznej adnotacji obejmują złożony proces analityczny, taki jak dodawanie adnotacji i przeglądanie materiału filmowego, oraz subiektywność związaną z ręczną adnotacją.Zautomatyzowane metody również stoją przed wyzwaniami, w tym wymogiem znacznej wiedzy z zakresu informatyki w celu skutecznego wdrożenia i wykonania. Odkryliśmy, że gen Atg8a odgrywa rolę w rozwoju zachowania muszek owocowych wykraczającą poza to, co wcześniej ustalono. Mówiąc dokładniej, odkryliśmy, że reguluje on zarówno pielęgnację, jak i uczenie się, co sugeruje, że ortologi Atg8a mogą odgrywać podobne role w innych organizmach.Technika ta pozwala na bezpośrednie ilościowe określenie częstotliwości i rozmieszczenia pielęgnacji u Drosophila. Jest to szczególnie przydatne w laboratoriach, które nie są w stanie wykorzystać metod zautomatyzowanych i pozwala na bardziej szczegółową analizę niż metody pośrednie, oparte na barwnikach. Ogólnie rzecz biorąc, nasze badania naprzód wykorzystanie Drosophila jako organizmu modelowego do badania zaburzeń neurorozwojowych, które wykazują zachowania obsesyjno-kompulsywne, takie jak zespół Tourette'a.Dodaje to również do coraz większej liczby dowodów na to, że białka związane z autofagią odgrywają rolę w rozwoju behawioralnym. Na początek umieść cztery trzydołkowe naczynia obok siebie na białej powierzchni i przykryj każde naczynie szklanym szkiełkiem. Umieść kamerę nad naczyniami.Upewnij się, że na szkiełkach nie ma odblasków, które mogłyby ograniczać widoczność much w naczyniu i dostosuj położenie talerza lub przyciemnij światła w razie potrzeby, aby wyeliminować odblaski. Teraz zaznacz położenie naczyń i kamery na ławce, na której odbywa się nagrywanie. Umieść cztero- lub dziewięciodniowe muchy na bloku lodu pokrytym parafilmem i ręcznikiem papierowym, aby lekko je znieczulić.Po znieczuleniu przenieś muchy do komór obserwacyjnych tak szybko, jak to możliwe, za pomocą pędzla. Umieść jedną muchę w każdym dołku trzydołkowego naczynia, zapewniając minimalne zakłócenia, aby uniknąć sprowokowania zmian w zachowaniu wywołanych stresem. Po aklimatyzacji muszek 30 minut po znieczuleniu, nagraj muchy za pomocą kamery, a następnie otwórz terminal i wpisz cd PiSpy.Wpisz python3 PiSpy. py, a następnie wprowadź żądaną długość nagrania i liczbę klatek na sekundę. Wybierz żądaną rozdzielczość i kliknij Szybkie przechwytywanie.Teraz użyj funkcji podglądu kamery w Pi Spy, aby upewnić się, że muchy są ostre i wystarczająco widoczne. Nagrywaj muchy przez 10 minut z zalecaną szybkością 24 klatek na sekundę i zapisz plik. Aby przeanalizować wideo, zaimportuj plik do oprogramowania ELAN 6.8 w celu szczegółowej adnotacji i dogłębnej analizy zachowań związanych z uwodzeniem.Wybierz Poziom, Dodaj nowy poziom, wpisz lokalizację w naczyniu w nazwie poziomu i dodaj, aby przypisać każdy wiersz, aby ręcznie dodać adnotacje do materiału filmowego osób. Aby dodać adnotacje do zachowań, kliknij dwukrotnie poziom, który ma zostać opisany, kliknij prawym przyciskiem myszy i przeciągnij kursor wzdłuż wybranego poziomu przez okres, w którym wyświetlany jest pojedynczy atak pielęgnacji. Kliknij lewym przyciskiem myszy, aby wybrać nową adnotację i kliknij dwukrotnie nowo podświetlony okres, aby wpisać skrót zachowania zaobserwowanego w tym punkcie czasu.Gdy film zostanie całkowicie opisany, uzyskaj zestawienie każdego zachowania, klikając Widok, a następnie Statystyki adnotacji. Zidentyfikuj pielęgnację przednią jako pielęgnację wykonywaną w przedniej części ciała muchy. Zidentyfikuj pielęgnację tylną jako pielęgnację wykonywaną na przednim i tylnym końcu ciała muchy.Napady pielęgnacyjne znacznie wzrosły w mutantach RNAi Atg8a w porównaniu z grupami kontrolnymi. Czas spędzony na pielęgnacji był również znacznie wydłużony u mutantów RNAi Atg8a w porównaniu z grupą kontrolną. Nie zaobserwowano istotnych różnic w rozkładzie zachowań związanych z pielęgnacją w przedniej i tylnej części ciała.

quantification-drosophila-melanogaster-grooming-behavior-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Drosophila melanogaster to genetycznie i behawioralnie podatny system modelowy, który od ponad wieku jest wykorzystywany do zrozumienia molekularnych i komórkowych podstaw wielu ważnych procesów biologicznych 1. Drosophila została szeroko wykorzystana w celu uzyskania wglądu w genetyczne podstawy zachowania much.

Metody oceny zachowania Drosophila

Aby zidentyfikować nowe mutacje wpływające na mechanosensację, zaprojektowaliśmy test, który mierzy reakcję behawioralną na stymulację dotykową szczeciny muchy u zmutowanych klonów generowanych metodą MARCM. Połączenie technik pozwala na identyfikację mutacji mechanowrażliwych, które w przeciwnym razie byłyby śmiertelne.

Test behawioralny do mechanosensacji klonów opartych na MARCM u Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje skalowalną technikę indywidualnego testowania pielęgnacji u Drosophila, która dostarcza solidnych, ilościowych danych do pomiaru zachowań związanych z uwodzeniem. Metoda opiera się na porównaniu różnicy w akumulacji barwnika na ciałach zwierząt niepielęgnowanych i pielęgnowanych w określonym czasie.

Kwantyfikacja zachowań pielęgnacyjnych Drosophila

Ta praca przedstawia metodę szybkiego i precyzyjnego ilościowego określenia pigmentacji brzucha Drosophila melanogaster za pomocą cyfrowej analizy obrazu. Metoda ta usprawnia procedury między akwizycją fenotypu a analizą danych i obejmuje montowanie próbek, akwizycję obrazu, ekstrakcję wartości pikseli i pomiar cech.

Kwantyfikacja pigmentacji jamy brzusznej u Drosophila melanogaster

Tutaj udostępniamy protokoły do przeprowadzenia trzech prostych testów degeneracji aksonów (śmierci aksonów) wywołanych urazem u Drosophila melanogaster, aby ocenić morfologiczne i funkcjonalne zachowanie odciętych aksonów i ich synaps.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna aksonów i ich synaps podczas śmierci aksonów u Drosophila melanogaster

Ta praca opisuje prosty paradygmat behawioralny, który pozwala na analizę awersyjnego uczenia się asocjacyjnego u dorosłych muszek owocowych. Metoda opiera się na tłumieniu wrodzonego negatywnego zachowania geotaksji ze względu na związek powstały między określonym kontekstem środowiskowym a porażeniem prądem.

Drosophila Pasywne zachowanie unikające jako nowy paradygmat badania awersyjnego uczenia się awersyjnego

Zaburzenie ze spektrum autyzmu (ASD) wiąże się z zaburzeniami zachowań społecznych i komunikacyjnych oraz pojawieniem się powtarzających się zachowań. W celu zbadania wzajemnych relacji między genami ASD a deficytami behawioralnymi w modelu Drosophila, w tym artykule opisano pięć paradygmatów behawioralnych do oceny odstępów społecznych, agresji, zalotów, pielęgnacji i zachowań habituacyjnych.

Paradygmaty oceny behawioralnej w modelu zaburzenia ze spektrum autyzmu Drosophila

Modele gryzoni są cennymi narzędziami do badania podstawowych zachowań związanych z zaburzeniami ze spektrum autyzmu (ASD). W tym artykule wyjaśniamy dwa testy behawioralne do modelowania podstawowych cech ASD u myszy: samopielęgnację, który ocenia powtarzające się zachowanie, oraz trzykomorowy test interakcji społecznych, który dokumentuje upośledzenia społeczne.

Strategie oceny zachowań podobnych do autystycznych u myszy

System oczu Drosophila jest użytecznym narzędziem do badania różnych procesów biologicznych, szczególnie chorób neurodegeneracyjnych u ludzi. Jednak ręczna kwantyfikacja fenotypów szorstkiego oka może być stronnicza i niewiarygodna. Tutaj opisujemy metodę, za pomocą której ilastik i Flynotyper są używane do ilościowego określania fenotypu oka w bezstronny sposób.

Kwantyfikacja fenotypów oczu Drosophila melanogaster: podejście obliczeniowe integrujące ilastik i Flynotyper

Tutaj prezentujemy szybki, tani proces obrazowania w wysokiej rozdzielczości oczu dorosłego Drosophila w celu ilościowego określenia wzorców i wad wzrostu. Opisujemy nasz protokół przygotowania próbek poprzez montaż punktowy, akwizycję obrazu w wysokiej rozdzielczości i analizę obrazu.

Szybki i prosty proces oznaczania ilościowego zewnętrznych struktur dorosłego osobnika Drosophila

Poznaj metodę kwantyfikacji zachowań pielęgnacyjnych Drosophila melanogaster przy użyciu RNAi Atg8a. Technika umożliwia precyzyjną analizę częstotliwości grooming u mutantów, dostarczając wgląd w mechanizmy rozwoju behawioralnego.

Kwantyfikacja zachowań pielęgnacyjnych Drosophila melanogaster w celu oceny nadmiernych fenotypów pielęgnacyjnych

Przeglądaj więcej filmów