Name: Wykrywanie pęcherzyków jądrowych i wycieku DNA w komórkach ssaków za pomocą immunofluorescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Poznaj metodę immunofluorescencji do wykrywania pęcherzyków jądrowych i wycieku DNA w komórkach HeLa. Technika ta pozwala badać związki między laminopatią a uszkodzeniami DNA w zespole Hutchinsona-Gilforda.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant R03AG064525 dla ASW przez National Institute on Aging. Chcielibyśmy podziękować dr Jasonowi A. Stewartowi za pomoc w mentoringu technicznym oraz laboratorium Hui Chen za udostępnienie używanego mikroskopu. Chcielibyśmy również podziękować Fabio Martinonowi za linie komórkowe HeLa użyte w tych eksperymentach.

Szczegóły dotyczące używanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie materiałów
<ol>
	<li>Umieścić w autoklawie co najmniej dziesięć kwadratowych szkiełek nakrywkowych i kleszczyków o wymiarach 22 mm x 22 mm przed nałożeniem komórek galwanicznych na szkiełka nakrywkowe.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Uzupełnione podłoża: Przygotuj 500 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 jednostkami/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.</li>
	<li>Bufor do rozcieńczania przeciwciał (ADB): Rozpuścić 2 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 1 g żelatyny rybnej w 80 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Doprowadzić do 100 ml z PBS po rozpuszczeniu BSA i żelatyny rybnej.</li>
	<li>1x PBS-Tween (PBS-T): Przygotuj 500 ml PBS i 0,5 ml Tween. Umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż Tween będzie można łatwo wymieszać z roztworem.</li>
</ol>
3. Hodowla pożądanych komórek
UWAGA: Komórki HeLa były hodowane w tym protokole do konfluencji w kolbie T75.
<ol>
	<li>Spryskaj sześć szkiełek nakrywkowych 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu na niestrzępiącej się chusteczce. Umieść szkiełka nakrywkowe na sterylnej 6-dołkowej płytce za pomocą kleszczyków, po jednym szkiełku nakrywkowym na studzienkę.</li>
	<li>Dodaj 2 ml uzupełnionego DMEM do każdego dołka na płytce 6-dołkowej.</li>
	<li>Odessać pożywkę z komórek i umyć komórki, dodając 15 ml PBS do kolby, delikatnie obracając. Odessać PBS i dodać 2 ml trypsyny-EDTA (trypsyny).
	<ol>
		<li>Pokryć komórki trypsyną i umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze z wilgotnością o temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 2 minuty, aby umożliwić oderwanie komórek od kolby.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 8 ml uzupełnionego DMEM do kolby, aby zebrać trypsynizowane komórki. Pipetuj kilka razy w górę i w dół, aby oddzielić zlepiające się komórki. Zebrać zawiesinę komórek do kolby i umieścić ją w probówce z polistyrenu o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Dodaj 500 000 komórek, kropla po kropli, bezpośrednio na każde z szkiełek nakrywkowych w płytce 6-dołkowej. Pozostawić komórki do wzrostu przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.</li>
</ol>
4. Utrwalanie i przenikanie komórek
<ol>
	<li>Przygotuj 4% roztwór formaldehydu na świeżo przed użyciem: Dodaj 2 ml 37,5% roztworu formaldehydu do 18 ml PBS. Dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Przygotować roztwór do permeabilizacji na świeżo przed użyciem: Dodać 100 μl Triton-X do 20 ml PBS. Pozostawić do inkubacji w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez kilka minut, aż Triton-X rozpuści się w roztworze. Dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Zassać pożywkę w dołkach płytki. Umyj komórki raz 2 ml PBS. Odessać wszystkie PBS ze studzienek.</li>
	<li>Dodaj 2 ml 4% roztworu formaldehydu do każdej studzienki. Pozostawić na 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). Całkowicie odessać 4% formaldehydu ze studzienek.</li>
	<li>Umyj komórki 3 razy 2 ml PBS. Całkowicie usuń PBS ze studzienek po każdym myciu.</li>
	<li>Dodaj 2 ml roztworu przepuszczalnego do każdej studzienki. Pozostawić na 10 minut w temperaturze pokojowej. Całkowicie odessać roztwór przepuszczalny.</li>
	<li>Umyj komórki 3 razy 2 ml PBS. Całkowicie odessać PBS po pierwszych dwóch płukaniach, pozostawiając PBS w studzienkach po trzecim płukaniu. 
	UWAGA: Komórki można przechowywać w ostatnim praniu PBS w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni po tym etapie, upewniając się, że płytka jest uszczelniona folią parafinową, aby uniknąć parowania cieczy. Jeśli procedurę można kontynuować, ten krok można pominąć.</li>
</ol>
5. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Usuń wszystkie PBS ze studzienek. Blokuj komórki, dodając 2 ml ADB do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej, kołysząc przez 30 minut.</li>
	<li>Pod koniec 30-minutowego czasu blokowania wymieszać rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego z ADB (rozcieńczenie 1:1,000 zarówno dla przeciwciał Laminy B1, jak i dsDNA, Tabela 1). Na każde szkiełko nakrywkowe potrzeba 75 μl, dlatego 600 μl ADB, 0,6 μl pierwszorzędowego przeciwciała Laminy B i 0,6 μl przeciwciała dsDNA należy zmieszać na sześć szkiełek nakrywkowych. Dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Usuń ADB ze studzienek. Na płaskiej powierzchni przyklej taśmą kawałek folii parafinowej, który ma wystarczająco dużą powierzchnię, aby położyć wszystkie przetwarzane szkiełka nakrywkowe.</li>
	<li>Do każdego szkiełka nakrywkowego dodać 75 μl rozcieńczenia przeciwciał pierwotnych na błonę parafinową, upewniając się, że w ADB nie są pipetowane żadne pęcherzyki. Następnie umieść szkiełka nakrywkowe komórką do dołu na kropli ADB za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Przykryć szkiełka nakrywkowe z inkubacji pokrywką płytki dołkowej i pozostawić do inkubacji na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń szkiełka nakrywkowe z folii parafinowej za pomocą kleszczy i umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem w płytce 6-dołkowej, stroną z komórką skierowaną do góry.</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy 2 ml PBS-T, kołysząc za każdym razem przez 3-5 minut. Usuń cały PBS-T ze studzienek po każdym myciu.</li>
	<li>Podczas ostatniego płukania należy przygotować rozcieńczenie przeciwciał drugorzędowych (1:1 000 dla obu odpowiednich przeciwciał drugorzędowych, tabela 1). Na każde szkiełko nakrywkowe potrzeba 75 μl, dlatego należy zmieszać 600 μl ADB i 0,6 μl obu drugorzędowych przeciwciał oznaczonych Alexa Fluor na sześć szkiełek nakrywkowych. Dokładnie wymieszaj. Przykryj wtórne rozcieńczenie przeciwciał przed światłem tak bardzo, jak to możliwe.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">Przeciwciało</td>
			<td>źródło</td>
			<td>firma</td>
			<td>odniesienie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">dsDNA Marker Przeciwciało (HYB331-01)</td>
			<td>Mysz monoklonalna</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-58749</td> powiedział:
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>koza</td>
			<td>Rybak termiczny </td>
			<td>A32723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor Plus 405</td>
			<td>koza</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A31553</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Przeciwciało poliklonalne Laminy B1</td>
			<td>królik</td>
			<td>Technologia białkowa</td>
			<td>12987-1-AP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor 594</td>
			<td>koza</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Nr kat. A11037</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Przeciwciała. Lista wszystkich przeciwciał użytych w tym protokole.
<ol start="9">
	<li>Usuń cały PBS-T z ostatniego prania. Szkiełka nakrywkowe inkubować w drugorzędowym rozcieńczeniu przeciwciał na folii parafinowej, jak w kroku 5, przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Chronić przed światłem na tym etapie i we wszystkich pozostałych etapach. Małe pudełko może służyć do osłaniania światła. Upewnij się, że pracujesz szybko, gdy zajdzie taka potrzeba, aby dodać lub usunąć roztwory ze studzienek.</li>
	<li>Usuń szkiełka nakrywkowe z folii parafinowej za pomocą kleszków i umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem na płytce 6-dołkowej, komórką do góry.</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy 2 ml PBS-T. Usuń cały PBS-T ze studzienek po każdym myciu.</li>
	<li>Odwodnić szkiełka serią etanolu (70%, 90%, 100%). Zacznij od dodania 2 ml 70% etanolu do każdej studzienki. Pozostaw na 1-2 minuty i usuń cały etanol z studzienek. Powtórz z pozostałą zawartością procentową etanolu.</li>
	<li>Usuń szkiełka nakrywkowe ze studzienek za pomocą kleszczy i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu, chronione przed światłem, na niestrzępiącej się ściereczniku.</li>
	<li>Zamontuj szkiełko nakrywkowe stroną z komórką do dołu na szklanych szkiełkach mikroskopowych, używając 20 μl podłoża mocującego na szkiełko nakrywkowe. Pozostawić do wyschnięcia na noc, chronić przed światłem.</li>
</ol>
6. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Przed obrazowaniem pokryj krawędzie szkiełek nakrywkowych cienką warstwą przezroczystego lakieru do paznokci (wystarczy dowolna marka lub rodzaj). Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu, chronić przed światłem. 
	UWAGA: Instrukcje dotyczące używania mikroskopu do obrazowania będą się różnić w zależności od używanego mikroskopu. Rozdzielczość kamery w użytym tutaj mikroskopie wynosi 1280 x 960 pikseli. Wystarczy podobna lub lepsza rozdzielczość.</li>
	<li>Przed umieszczeniem szkiełka na stoliku mikroskopu należy dostosować ustawienia zapisywania plików. Włącz mikroskop i włóż dysk USB. Dostosuj ustawienia zapisywania w ustawieniach mikroskopu i upewnij się, że wszystkie kanały (GFP i RFP) zostaną zapisane osobno i że obrazy trafiają do właściwej lokalizacji na dysku USB. 
	UWAGA: Utwórz folder na dysku USB i nadaj każdemu szkiełku nakrywkowemu własną nazwę do wykorzystania w przyszłości.</li>
	<li>Przed obrazowaniem spryskaj niestrzępiącą się chusteczką z 70% etanolem i delikatnie wyczyść tylną część szkiełek. Delikatnie wyczyść przód prowadnic, upewniając się, że wywierany jest bardzo minimalny nacisk.</li>
	<li>Umieść czysty szkiełko podstawowe na mikroskopie, szkiełkami nakrywkowymi skierowanymi w dół. Przykryj pudełkiem z osłoną świetlną.</li>
	<li>Używając soczewki obiektywowej 40x, użyj odpowiedniego kanału (RFP dla zastosowanego tutaj przeciwciała laminy B1), aby zlokalizować jądra na ekranie mikroskopu. Na początek dostosuj natężenie światła do około 50%.</li>
	<li>Aby sprawdzić, czy nie ma przesyconych obszarów, wybierz opcję Color Off (Wyłącz kolor) i upewnij się, że żadne obszary na szkiełku nakrywkowym nie mają czerwonego sygnału w trybie czarno-białym. Jeśli jest dużo czerwonego sygnału, zmniejsz natężenie światła, aż pojawi się minimalny czerwony sygnał. 
	UWAGA: Czerwony sygnał oznacza przesycenie. Jeśli jądra wydają się ledwo widoczne, zwiększaj intensywność o 10% przyrosty, aż do uzyskania odpowiedniej intensywności bez przesycenia.</li>
	<li>Sprawdź wszystkie inne szkiełka nakrywkowe z taką samą intensywnością, aby upewnić się, że nie są przesycone. Sprawdź wszystkie szkiełka nakrywkowe z drugim kanałem, korzystając z tego samego procesu, co powyżej (GFP dla zastosowanego tutaj przeciwciała dsDNA).</li>
	<li>Nagrywaj natężenie światła dla każdego kanału. Upewnij się, że wszystkie natężenia światła dla każdego kanału są utrzymywane na stałym poziomie przez cały proces obrazowania.</li>
	<li>Zobrazuj każde szkiełko nakrywkowe z osobna. Zacznij od pierwszego kanału, skup jądra i uchwyć obraz.</li>
	<li>Ostrożnie przełącz kanały i ponownie ustaw ostrość komórek. Po ustawieniu ostrości uchwyć obraz.</li>
	<li>Po przechwyceniu obrazów w odpowiednich kanałach (GFP i RFP) wybierz opcję Nakładka, aby obserwować scalony obraz i upewnić się, że slajd nie porusza się podczas robienia obrazu. Jeśli kanały nie nakładają się na siebie, powtórz wymagany kanał, aż obrazy się wyrównają.</li>
	<li>Zapisz obraz, klikając ikonę dysku flash. Przenieś się w inne miejsce na szkiełku nakrywkowym, aby kontynuować obrazowanie. 
	UWAGA: Upewnij się, że za każdym razem obrazowany jest inny obszar szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć wielokrotnego rejestrowania tego samego obszaru. Zaleca się rozpoczęcie obrazowania od lewego górnego rogu szkiełka nakrywkowego i przesuwanie w układzie "S", aby zapewnić pełne pokrycie bez duplikacji.</li>
</ol>
7. Analiza danych
<ol>
	<li>Dane uzyskane tą metodą mają charakter wizualny. Zbadaj obrazy pod kątem oznak wycieku DNA lub pęcherzyków jądrowych. Przykłady pęcherzyków i wycieków przedstawiono w sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników.</li>
</ol>

<ol><li>Navarro, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+ZMPSTE24+%28FACE1%29+mutations+in+patients+affected+with+restrictive+dermopathy+or+related+progeroid+syndromes+and+mutation+update%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">New ZMPSTE24 (FACE1) mutations in patients affected with restrictive dermopathy or related progeroid syndromes and mutation update.</a> Eur J Hum Genet. 22 (8), 1002-1011 (2014).</li>
<li>Dittmer, T. A., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lamin+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">The lamin protein family.</a> Genome Biol. 12 (222), 1-16 (2011).</li>
<li>Gruenbaum, Y., Margalit, A., Goldman, R. D., Shumaker, D. K., Wilson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+lamina+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The nuclear lamina comes of age.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 21-31 (2005).</li>
<li>Navarro, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A+and+ZMPSTE24+%28FACE-1%29+defects+cause+nuclear+disorganization+and+identify+restrictive+dermopathy+as+a+lethal+neonatal+laminopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Lamin A and ZMPSTE24 (FACE-1) defects cause nuclear disorganization and identify restrictive dermopathy as a lethal neonatal laminopathy.</a> Hum Mol Genet. 13 (20), 2493-2503 (2004).</li>
<li>Barrowman, J., Wiley, P. A., Hudon-Miller, S. E., Hrycyna, C. A., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ZMPSTE24+disease+mutations%3A+Residual+proteolytic+activity+correlates+with+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Human ZMPSTE24 disease mutations: Residual proteolytic activity correlates with disease severity.</a> Hum Mol Genet. 21 (18), 4084-4093 (2012).</li>
<li>Richards, S., Muter, J., Ritchie, P., Lattanzi, G., Hutchison, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+accumulation+of+un-repairable+DNA+damage+in+laminopathy+progeria+fibroblasts+is+caused+by+ROS+generation+and+is+prevented+by+treatment+with+N-acetyl+cysteine%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The accumulation of un-repairable DNA damage in laminopathy progeria fibroblasts is caused by ROS generation and is prevented by treatment with N-acetyl cysteine.</a> Hum Mol Genet. 20 (20), 3997-4004 (2011).</li>
<li>Davies, B. S., Fong, L. G., Yang, S. H., Coffinier, C., Young, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+post-translational+processing+of+prelamin+A+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">The post-translational processing of prelamin A and disease.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 10, 153-174 (2009).</li>
<li>Barrowman, J., Hamblet, C., George, C. M., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+prelamin+A+biogenesis+reveals+the+nucleus+to+be+a+CaaX+processing+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Analysis of prelamin A biogenesis reveals the nucleus to be a CaaX processing compartment.</a> Mol Biol Cell. 19, 5398-5408 (2008).</li>
<li>Young, S., Meta, M., Yang, S. H., Fong, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prelamin+A+farnesylation+and+progeroid+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Prelamin A farnesylation and progeroid syndromes.</a> J Biol Chem. 281 (52), 39741-39745 (2006).</li>
<li>Houthaeve, G., Robijns, J., Braeckmans, K., De Vos, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bypassing+border+control%3A+Nuclear+envelope+rupture+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol%22%5BJournal%5D)">Bypassing border control: Nuclear envelope rupture in disease.</a> Physiol. 33 (1), 39-49 (2017).</li>
<li>Schreiber, K. H., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+lamins+go+bad%3A+Nuclear+structure+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">When lamins go bad: Nuclear structure and disease.</a> Cell. 152 (6), 1365-1375 (2013).</li>
<li>Fong, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterozygosity+for+Lmna+deficiency+eliminates+the+progeria-like+phenotypes+in+Zmpste24-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Heterozygosity for Lmna deficiency eliminates the progeria-like phenotypes in Zmpste24-deficient mice.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (52), 18111-18116 (2004).</li>
<li>Pendas, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+prelamin+A+processing+and+muscular+and+adipocyte+alterations+in+Zmpste24+metalloproteinase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Defective prelamin A processing and muscular and adipocyte alterations in Zmpste24 metalloproteinase-deficient mice.</a> Nat Genet. 31, 94-99 (2002).</li>
<li>Goldman, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+mutant+lamin+A+causes+progressive+changes+in+nuclear+architecture+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Accumulation of mutant lamin A causes progressive changes in nuclear architecture in Hutchinson-Gilford progeria syndrome.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 8963-8968 (2004).</li>
<li>Eriksson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+de+novo+point+mutations+in+lamin+A+cause+Hutchinson%E2%80%93Gilford+progeria+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recurrent de novo point mutations in lamin A cause Hutchinson–Gilford progeria syndrome.</a> Nature. 423, 293-298 (2003).</li>
<li>Young, S. G., Fong, L. G., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+review+series%3A+Lipid+post-translational+modifications.+Prelamin+A%2C+Zmpste24%2C+misshapen+cell+nuclei%2C+and+progeria%E2%80%94new+evidence+suggesting+that+protein+farnesylation+could+be+important+for+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Thematic review series: Lipid post-translational modifications. Prelamin A, Zmpste24, misshapen cell nuclei, and progeria—new evidence suggesting that protein farnesylation could be important for disease pathogenesis.</a> J Lipid Res. 46 (12), 2531-2558 (2005).</li>
<li>Worman, H. J., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prelamin+A+and+ZMPSTE24+in+premature+and+physiological+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Prelamin A and ZMPSTE24 in premature and physiological aging.</a> Nucleus. 14 (1), 1-17 (2023).</li>
<li>Pande, S., Ghosh, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+proteostasis+imbalance+in+laminopathy-associated+premature+aging+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Nuclear proteostasis imbalance in laminopathy-associated premature aging diseases.</a> FASEB J. 37 (8), 1025-1035 (2023).</li>
<li>Odell, I. D., Cook, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence techniques.</a> J Invest Dermatol. 133 (4), 1-12 (2013).</li>
<li>Kumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+and+enzyme+immunomicroscopy+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunoassay+Immunochem%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence and enzyme immunomicroscopy methods.</a> J Immunoassay Immunochem. 21 (2-3), 235-253 (2000).</li>
<li>Tjaden, A., Giessmann, R. T., Knapp, S., Schroder, M., Muller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+live-cell+multiplex+screen+for+chemogenomic+compound+annotation+based+on+nuclear+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-content live-cell multiplex screen for chemogenomic compound annotation based on nuclear morphology.</a> STAR Protoc. 3 (101791), 1-15 (2022).</li>
<li>Gunn, A. L., Yashchenko, A. I., Dubrulle, J., Johnson, J., Hatch, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-content+screen+reveals+new+regulators+of+nuclear+membrane+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A high-content screen reveals new regulators of nuclear membrane stability.</a> Sci Rep. 14, 6013(2024).</li>
<li>Yu, L., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+DNA+sensing+by+cGAS%3A+Regulation%2C+function%2C+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytosolic DNA sensing by cGAS: Regulation, function, and human diseases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (170), 1-14 (2021).</li>
<li>Odinammadu, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+farnesyl+transferase+inhibitor+%28FTI%29+lonafarnib+improves+nuclear+morphology+in+ZMPSTE24-deficient+fibroblasts+from+patients+with+the+progeroid+disorder+MAD-B%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">The farnesyl transferase inhibitor (FTI) lonafarnib improves nuclear morphology in ZMPSTE24-deficient fibroblasts from patients with the progeroid disorder MAD-B.</a> Nucleus. 14 (1), 1-14 (2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony protokół zawiera kilka krytycznych etapów, z których najważniejszym jest leczenie utrwalonych komórek przeciwciałami pierwszorzędowymi i wtórnymi. Zapewnienie użycia dobrej jakości przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko badanemu celowi z odpowiednim odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym z fluoroforami w zakresie użytego mikroskopu przyniesie optymalne wyniki19. Jakość przeciwciała może mieć duży wpływ na wyniki tej techniki, ponieważ wadliwe przeciwciała mogą wchodzić w interakcj...

Lamina jądrowa to sieć włókien znajdująca się pod błoną jądrową, składająca się z białek zwanych laminami. Lamina jądrowa odgrywa kluczową rolę w architekturze jądra, rozmieszczeniu porów jądrowych, regulacji ekspresji genów, organizacji chromatyny, replikacji DNA oraz naprawie DNA1,2,3. Mutacje w genach biorących udział w ekspresji białek lamin prowadzą do zaburzeń genetycznych nazywanych laminopatiami3.
Restrykcyjna dermopatia (RD) to ciężkie zaburzenie z grupy laminopatii, wywoływane głównie przez złożone mutacje heterozygotyczne, które tworzą przedwczesne kodony stop w genie ZMPSTE244, co prowadzi do braku metaloproteazy ZMPSTE24. Laminopatia ta charakteryzuje się pozłodziejowym opóźnieniem wzrostu, napiętą i sztywną skórą, małą jamą ustną, rzadkimi włosami oraz wadami mineralizacji kości1. Pacjenci z RD zazwyczaj nie przeżywają pierwszego tygodnia życia z powodu niewydolności oddechowej1. Dwa inne zaburzenia z grupy laminopatii, znane jako atypowy zespół progerii Hutchinsona-Gilforda (AT-HGPS) oraz dysplazja żuchwowo-akralna typu B (MAD-B), wiążą się z obniżoną ekspresją ZMPSTE24, prowadzą do skrócenia długości życia i wykazują podobieństwo do zaburzeń przyspieszonego starzenia5. Proteaza ZMPSTE24, której aktywność jest zaburzona w tych laminopatiach, odgrywa kluczową rolę w modyfikacji potranslacyjnej laminy A, będącej krytycznym elementem blaszki jądrowej. Niedobór ZMPSTE24 skutkuje akumulacją niecałkowicie przetworzonej, farnesylowanej formy laminy A, znanej jako prelaminy A2.
<img alt="Schemat przetwarzania laminy A; stan prawidłowy a niedobór ZMPSTE24; ścieżka farnesylacji i metylacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67719/67719fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1Przetwarzanie laminy A w warunkach prawidłowych kontrakomórki RD. Szlak przetwarzania laminy A w komórkach prawidłowych (po lewej) oraz zaburzone przetwarzanie laminy A w komórkach z RD lub niedoborem ZMPSTE (po prawej). Oznaczono grupy farnesylowe (Fa) i metylowe (Me). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67719/67719fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
Jak pokazano na Rysunku 1, w prawidłowym procesowaniu laminy A grupa farnesylowa (lipidowa) zostaje przyłączona do reszty cysteiny w pobliżu końca C-końcowego, po czym następuje proteolityczne odcięcie trzech aminokwasów z końca C-końcowego3,6. Następnie reszta cysteiny ulega metylacji. Te dwie modyfikacje umożliwiają ukierunkowanie prelaminy A do wewnętrznej błony jądrowej2. Następnie ZMPSTE24 przeprowadza reakcję cięcia, w wyniku której ostatnie 15 aminokwasów z końca C-końcowego, wraz z grupami farnesylowymi i metylowymi, zostaje usuniętych, tworząc dojrzałe białko Lamin A, które jest dostarczane do laminy jądrowej6,7,8. W przypadku RD, AT-HGPS oraz MAD-B ostatni etap procesowania nie zachodzi efektywnie, ponieważ metaloproteinaza ZMPSTE24 jest nieobecna lub nie jest w pełni funkcjonalna8,9. Prowadzi to do akumulacji prelaminy A, która pozostaje trwale sfarnesylowana i zmetylowana9. Grupy te powodują, że prelaminy A przylega do wewnętrznej błony jądrowej zamiast lokalizować się w laminie jądrowej, gdzie ostatecznie powinna znajdować się dojrzała lamina A, co przedstawiono na Rysunku 1. W związku z tym niedobór ZMPSTE ma głęboki wpływ na strukturę jądra oraz szereg funkcji jądrowych10,11,12,13,14,15. Zmiany w strukturze jądra mogą obejmować pęcherzykowanie jądra (blebbing), a nawet przerwanie błony jądrowej, co może prowadzić do wycieku DNA do cytozolu oraz przenikania cytozolu do jądra. Nieprawidłowy kształt jąder jest rzeczywiście cechą charakterystyczną dla laminopatii, podobnie jak wiele innych fenotypów wywołanych wadliwym procesowaniem prelaminy A16,17. Defekty laminy jądrowej prowadzą do wielu niekorzystnych skutków, w tym do błędnej lokalizacji białek kontroli jakości białek jądrowych oraz białek naprawy DNA w nukleoplazmie, co z kolei skutkuje licznymi zaburzeniami funkcji jądra18. Ważne jest opracowanie prostej techniki, która pomogłaby identyfikować i monitorować te cechy laminopatii, aby ułatwić badania nad rozwojem podejść terapeutycznych mających na celu łagodzenie fenotypów tych schorzeń. W przypadku myszy z laminopatiami wykazano, że eliminacja pęcherzykowania jądra koreluje z ogólną eliminacją fenotypów laminopatii16. Technika umożliwiająca monitorowanie integralności jądra w ludzkich komórkach mogłaby usprawnić badania nad potencjalnymi metodami leczenia zmierzającymi do eliminacji lub znacznej poprawy fenotypów chorobowych.
Pośrednia immunofluorescencja (IF) jest czułą i powszechnie stosowaną techniką, która wykorzystuje zarówno nieznakowane przeciwciało pierwotne, jak i znakowane fluorochromem przeciwciało wtórne rozpoznające przeciwciało pierwotne w celu wykrycia interesującego celu19. Metody IF mogą stanowić potężne narzędzie do wizualizacji specyficznych wewnątrzkomórkowych komponentów i struktur. Istnieje również możliwość, że więcej niż jedna cząsteczka przeciwciała wtórnego wejdzie w interakcję z przeciwciałem pierwotnym, co prowadzi do wzmocnienia sygnału19. Pośrednia IF jest wszechstronną techniką, która pozwala również na wykrycie wielu przeciwciał pierwotnych przy użyciu stosunkowo niewielkiego zestawu przeciwciał wtórnych, ponieważ przeciwciała wtórne są wytwarzane przeciwko domenie Fc przeciwciała pierwotnego, która jest konserwatywna w obrębie gatunków19.
Niniejszy artykuł opisuje pośrednią metodę immunofluorescencji (IF) do oceny pęcherzykowania jądrowego (blebbing) i wycieku DNA w komórkach z niedoborem ZMPSTE24, z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko dwuniciowemu DNA (dsDNA) oraz laminie B1 w celu wykrycia odpowiednio DNA i błony jądrowej. Aby zademonstrować użyteczność tego podejścia, procedurę zastosowano do linii komórkowej HeLa z wyłączoną ekspresją ZMPSTE24, a także do linii komórkowej HeLa wykazującej ekspresję ZMPSTE24, a następnie porównano wyniki dla obu linii komórkowych.

<table><tbody><tr><td>Szkiełka nakrywkowe kwadratowe 22 mm</td><td>Propper Manufacturing Company</td><td>M8710</td><td>Można użyć dowolnego rozmiaru lub kształtu, o ile można je przymocować do standardowego szkiełka mikroskopowego.</td></tr><tr><td>36,5% Formaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td>Odczynnik utrwalający.&nbsp;</td></tr><tr><td>75 cm 2 kolby</td><td>Corning</td><td>430725U</td><td>Do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albinum (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>9048-46-8</td><td>Bufor do rozcieńczania przeciwciał.&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM z 1 g/L glukozy, L-glutaminą i pirogronianem sodu</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td>Do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>Etanol (200 Proof)</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>Do odwadniania próbek przed montażem, rozcieńczony w celu uzyskania wielu stężeń.&nbsp;</td></tr><tr><td>EVOS FL Cyfrowy mikroskop odwróconej fluorescencji</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-563-460</td><td>Obrazowanie.&nbsp;</td></tr><tr><td>Żelatyna rybna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7041</td><td>Bufor do rozcieńczania przeciwciał.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Podłoże montażowe zapobiegające fotowybielaniu.&nbsp;</td></tr><tr><td>Parafilm (4 cale)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td>Można zastąpić dowolny rozmiar, o ile używane szkiełka nakrywkowe mogą pasować.</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td>Do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Wytwarzana i sterylizowana w laboratorium do hodowli tkankowych i roztworów.</td></tr><tr><td>Premium Płodowa Surowica Bydlęca (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>Do hodowli komórkowych.&nbsp;</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost Premium</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td>Można używać dowolnych standardowych szkiełek mikroskopowych.</td></tr><tr><td>Hodowla tkankowa 6-dołkowe płytki z płaskim dnem</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>Do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A16046. AP</td><td>Do prania.</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,5%)</td><td>Gibco</td><td>15-400-054</td><td>Do hodowli komórkowych.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>9005-64-5</td><td>Odczynnik do przenikania komórek.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

wykrywanie pęcherzyków jądrowych i wycieku dna w komórkach ssaków za pomocą immunofluorescencji

Detection of Nuclear Blebbing and DNA Leakage in Mammalian Cells by Immunofluorescence

Blaszka jądrowa to sieć włókien leżących pod błoną jądrową, złożona z lamin i białek związanych z laminą. Odgrywa kluczową rolę w architekturze jądrowej, pozycjonowaniu porów jądrowych, regulacji ekspresji genów, organizacji chromatyny, replikacji DNA i naprawie DNA. Mutacje w genach biorących udział w ekspresji lub przetwarzaniu potranslacyjnym białek laminy skutkują zaburzeniami genetycznymi znanymi jako laminopatie. W szczególności mutacje w genach LMNA lub ZMPSTE24 mogą prowadzić do akumulacji niecałkowicie przetworzonych form laminy A, które zachowują grupy farnezylowe i metylowe, których nie ma w pełni przetworzonej laminie A. Te niecałkowicie przetworzone białka laminy A lokalizują się w wewnętrznej błonie jądrowej zamiast w blaszce jądrowej, w której znajduje się dojrzała lamina A. Nieprawidłowo zlokalizowane białka laminy głęboko zaburzają funkcję i strukturę jądra, często powodując pęcherzenie jądrowe. W ciężkich przypadkach może dojść do pęknięcia jądra, powodując utratę kompartmentacji i wyciek genomowego DNA do cytozolu. Nieprawidłową strukturę jądrową i utratę kompartmentalizacji można zidentyfikować za pomocą immunofluorescencji pośredniej (IF) na utrwalonych komórkach. Niniejsze badanie przedstawia taką metodę, wykorzystując specyficzne przeciwciała przeciwko białku laminy i dwuniciowemu DNA (dsDNA) do jednoczesnej wizualizacji otoczki jądrowej i DNA. Takie podejście umożliwia szybką ocenę integralności strukturalnej jądra i potencjalnego wycieku jądrowego DNA do cytozolu.

Niniejsza praca przedstawia metodę immunofluorescencji (IF) do wizualizacji blaszki jądrowej wraz z dwuniciowym DNA (dsDNA). Po przeprowadzeniu metody IF, uzyskane obrazy mogą zostać poddane analizie pod kątem występowania pęcherzykowania jądra komórkowego oraz wycieku DNA.
<img alt="Badanie jądra komórkowego HeLa; obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej i wykres słupkowy różnic w pęcherzykowaniu." class="xfigimg" src="/files/ftp_...

Zaburzenia laminopatii często prowadzą do zmian w otoczce jądrowej, co może powodować pęcherzyki jądrowe i wycieki. W badaniu przedstawiono metodę immunofluorescencji do wizualizacji blaszki jądrowej wraz z dwuniciowym DNA (dsDNA), zapewniając środki do oceny struktury i integralności jądra w komórkach ssaków.

Wykrywanie pęcherzyków jądrowych i wycieku DNA w komórkach ssaków za pomocą immunofluorescencji

The nuclear lamina is a network of filaments underlying the nuclear membrane, composed of lamins and lamin-associated proteins. It plays critical roles in ...

Nasze badania koncentrują się przede wszystkim na związku między naprawą DNA a starzeniem się. W szczególności przyglądamy się różnym zaburzeniom laminopatii i chcemy dowiedzieć się, jak mogą one wpływać na naprawę DNA. Wykazaliśmy, że zaburzenie laminopatii związane z przedwczesnym starzeniem się i krótką długością życia, znane jako zespół progerii Hutchinsona-Gilforda, jest w rzeczywistości związane ze zwiększoną ilością uszkodzeń DNA i nieprecyzyjną naprawą DNA.Nasze laboratorium chciałoby zbadać wpływ potencjalnych terapii dla pacjentów z laminopatią, aby dowiedzieć się, czy te podejścia będą miały również pozytywny wpływ na naprawę i uszkodzenie DNA. Na początek umieść jedno szkiełko nakrywkowe w każdym dołku sterylnej płytki 6-dołkowej za pomocą kleszczy. Dodaj dwa mililitry uzupełnionego Dulbecco's Modified Eagle Medium lub DMEM do każdego dołka na 6-dołkowej płytce.Odessać pożywkę z komórek HeLa hodowanych w kolbie i umyć komórki, dodając 15 mililitrów PBS. Delikatnie zakręć kolbą, aby umyć komórki, odessać PBS i dodać dwa mililitry trypsyny-EDTA, aby pokryć komórki. Umieść kolbę pokrytą trypsyną w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% wilgotności dwutlenku węgla na dwie minuty, aby umożliwić odłączenie komórek.Następnie dodaj osiem mililitrów uzupełnionego DMEM do kolby zawierającej trypsynizowane komórki i kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół, aby oddzielić zlepiające się komórki. Zebrać zawiesinę komórek z kolby do 15-mililitrowej rurki z polistyrenu. Po zliczeniu komórek dodaj 500 000 komórek kropla po kropli bezpośrednio na każde z szkiełek nakrywkowych w płytce 6-dołkowej.Umieść płytkę w inkubatorze nawilżanym dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5%, aby umożliwić komórkom wzrost przez noc. W celu utrwalenia komórek następnego dnia odessać pożywkę z dołków płytki 6-dołkowej. Dodaj dwa mililitry PBS do każdej studzienki, aby umyć komórki i całkowicie odessać cały PBS ze studzienek.Następnie dodaj dwa mililitry 4% roztworu formaldehydu do każdej studzienki na 10 minut w temperaturze pokojowej i całkowicie odessaj roztwór z dołków. Następnie dodaj dwa mililitry roztworu przepuszczalnego do każdej studzienki. Pozostaw roztwór na 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie całkowicie go odessać.Umyj komórki trzy razy dwoma mililitrami PBS w każdym dołku. Całkowicie zassać po każdym praniu. Gdy cały PBS zostanie odessany z dołków, dodaj dwa mililitry buforu rozcieńczalnika przeciwciał lub ADB do każdej studzienki, aby zablokować komórki do barwienia immunofluorescencyjnego.Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut z delikatnym wytrząsaniem orbitalnym. Pod koniec okresu blokady. Przygotować rozcieńczenie przeciwciała pierwotnego, mieszając światło B1 i przeciwciała dwuniciowego DNA w ADB.Pod koniec inkubacji odessać ADB ze studzienek. Przyklej kawałek folii parafinowej do płaskiej powierzchni, upewniając się, że obszar jest wystarczająco duży, aby pomieścić wszystkie przetwarzane szkiełka nakrywkowe. Na każde szkiełko nakrywkowe odpipetować 75 mikrolitrów pierwotnego rozcieńczenia przeciwciał na folię parafinową, unikając pęcherzyków.Za pomocą kleszczy umieść każdą komórkę szkiełka nakrywkowego stroną do dołu na kropli przeciwciała. Przykryć szkiełka nakrywkowe z inkubacji pokrywką płytki 6-dołkowej i pozostawić szkiełka nakrywkowe do inkubacji przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie za pomocą kleszczy ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe z folii parafinowej i umieść je z powrotem w płytce 6-dołkowej stroną z komórką skierowaną do góry.Umyj szkiełka nakrywkowe, potrząsając nimi trzy razy przez pięć minut dwoma mililitrami PBST. Podczas końcowego płukania przygotuj wtórne rozcieńczenie przeciwciał. Po ostatnim praniu całkowicie odessać PBST.Dodaj przeciwciało wtórne do folii para, a następnie umieść szkiełka nakrywkowe na folii parafinowej stroną z komórkami do dołu. Następnie umieść lekką osłonę ochronną na szkiełkach nakrywkowych, aby chronić komórki przed światłem i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe z folii parafinowej i umieść je z powrotem na płytce 6-dołkowej, upewniając się, że strona komórki jest skierowana do góry, a następnie odwodnić szkiełka nakrywkowe, dodając kolejno po dwa mililitry 70% 90% i 100% etanolu do studzienek, pozwalając każdemu roztworowi siedzieć przez jedną do dwóch minut przed usunięciem.Za pomocą kleszczy usuń szkiełka pokrywy ze studzienek i umieść je na niestrzępiącej się chusteczce do wyschnięcia na powietrzu, chronionej przed światłem. Zamontuj szkiełka nakrywkowe komórką do dołu na szklanych szkiełkach mikroskopowych za pomocą 20 mikrolitrów materiału montażowego na szkiełko nakrywkowe. Bąbelki jądrowe były bardziej rozpowszechnione w komórkach nokautujących HeLa ZMPST24, przy czym około 50% jąder wykazywało pęcherzyki, w porównaniu do 17% w komórkach kontrolnych HeLa.Wyciek DNA zaobserwowano głównie w komórkach nokautujących HeLa ZMPSTE24, podczas gdy nie zaobserwowano wycieku DNA w komórkach kontrolnych HeLa, wyciek DNA wystąpił w niektórych ZMPSTE24 komórkach nokautowych, nawet przy braku widocznego pęcherzyka jądrowego.

detection-nuclear-blebbing-dna-leakage-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano metodę obserwacji pojedynczych cząsteczek DNA w żywych komórkach. Technika ta opiera się na wiązaniu białka represora lac znakowanego fluorescencyjnie do miejsc wiążących wprowadzonych do badanego DNA. Metodę tę można dostosować do śledzenia wielu rekombinowanych cząsteczek DNA w żywych komórkach w czasie.

Monitorowanie replikacji plazmidów w żywych komórkach ssaków na przestrzeni wielu pokoleń za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

W tym filmie opisujemy metodę immunofluorescencji, aby zobrazować lokalizację białek naprawy DNA γH2AX i 53BP1 w miejscach pęknięć dwuniciowego DNA w napromieniowanych jądrach komórkowych.

Oparta na immunofluorescencji wizualizacja interakcji białek naprawy DNA

W tym filmie opisujemy technikę mikroskopii immunofluorescencyjnej do wykrywania specyficznych białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA zlokalizowanych w miejscach pęknięć dwuniciowych DNA w ludzkich komórkach jednojądrzastych. Białka są rozpoznawane przez specyficzne przeciwciała pierwszorzędowe, które z kolei wiążą się z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi fluoroforem, które fluoryzują podczas wizualizacji mikroskopowej, umożliwiając wizualizację białek jako odrębnych ognisk...

Mikroskopia immunofluorescencyjna do analizy pęknięć dwuniciowych DNA

Ten manuskrypt opisuje nowatorską technikę, która pozwala na wykrywanie wewnątrzkomórkowej ekspresji genów po endocytozie nanocząstek znakowanych fluorescencyjnie bezpośrednio w żywych komórkach. Metoda nie wymaga manipulacji komórkami i nie jest ograniczona w odniesieniu do docelowego genu lub gatunku.

Wykrywanie wewnątrzkomórkowej ekspresji genów w żywych komórkach pochodzenia mysiego, ludzkiego i świńskiego za pomocą nanocząstek znakowanych fluorescencyjnie

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Mikronaświetlanie laserowe jest użytecznym narzędziem do badań nad naprawą DNA w żywych komórkach. Przedstawiono metodologiczne podejście do stosowania laserów UVA do wywoływania różnych zmian w DNA. Zoptymalizowaliśmy metodę miejscowego mikronapromieniowania, która utrzymuje normalny cykl komórkowy; W ten sposób napromieniowane komórki przechodzą przez mitozę.

Zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA

Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna i mikropromieniowanie laserowe oferują narzędzia do indukowania uszkodzeń DNA i monitorowania odpowiedzi białek naprawy DNA w wybranych obszarach subjądrowych. Technika ta znacznie poszerzyła naszą wiedzę na temat wykrywania uszkodzeń, sygnalizacji i rekrutacji. Niniejszy manuskrypt demonstruje te technologie do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych.

Zastosowanie mikronapromieniania laserowego do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych w komórkach ssaków

Obrazowanie żywych komórek dostarcza bogactwa informacji o pojedynczych komórkach lub całych populacjach, które są nieosiągalne przez samo obrazowanie komórek stałych. W tym miejscu opisano protokoły obrazowania żywych komórek w celu oceny decyzji dotyczących losu komórek po leczeniu lekiem antymitotycznym paklitakselem.

Długoterminowe obrazowanie żywych komórek w celu oceny losu komórek w odpowiedzi na paklitaksel

Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Reakcja na uszkodzenia DNA wywołana promieniowaniem, aktywowana przez wiązkę neutronów używaną w terapii wychwytywania neutronów borowych (BNCT), nie została w pełni ustalona. Protokół ten zapewnia procedurę krok po kroku do wykrywania ognisk indukowanych promieniowaniem (RIF) białek naprawczych poprzez barwienie immunofluorescencyjne w liniach komórkowych ludzkiego raka jelita grubego po napromieniowaniu wiązką zmieszaną z neutronami.

Obrazowanie immunofluorescencyjne uszkodzeń DNA i ognisk naprawczych w ludzkich komórkach raka jelita grubego

W obecnym protokole pokazujemy, jak wizualizować dwuniciową resekcję końca DNA podczas fazy S/G2 cyklu komórkowego przy użyciu metody opartej na immunofluorescencji.

Ocena globalnej resekcji końca dwuniciowego DNA przy użyciu znakowania BrdU-DNA w połączeniu z obrazowaniem dyskryminacji cyklu komórkowego

Poznaj metodę immunofluorescencji do wykrywania pęcherzyków jądrowych i wycieku DNA w komórkach HeLa. Technika ta pozwala badać związki między laminopatią a uszkodzeniami DNA w zespole Hutchinsona-Gilforda.

Wykrywanie pęcherzyków jądrowych i wycieku DNA w komórkach ssaków za pomocą immunofluorescencji

Przeglądaj więcej filmów