Wydajna transdukcja retrowirusowa i konkurencyjne naprowadzanie do badania lokalizacji limfocytów T za pośrednictwem GPCR w różnych mikrośrodowiskach tkankowych

Nasze badania badają, w jaki sposób GPCR wpływają na transport i pozycjonowanie komórek odpornościowych w różnych mikrośrodowiskach tkankowych. Korzystając z tego protokołu i innych protokołów uzupełniających, nasze laboratorium zidentyfikowało specyficzną dla narządu oś chemoatraktantu w tkankach błony śluzowej poza jelitami. Teraz dowiedzieliśmy się, w jaki sposób limfocyty, w których znajdują się żołądek, płuca, tchawica i przewód pokarmowy. Przedstawiam skuteczną i ulepszoną metodę testowania, jak poszczególne GPCR wpływają na ruch limfocytów T in vivo. Opracowaliśmy niezawodny sposób wprowadzania tych receptorów do limfocytów T, które teraz umożliwiają bezpośrednie porównanie obok siebie w konkurencyjnych testach naprowadzania. Teraz, gdy wiemy, w jaki sposób GPCR kierują komórkami T in vivo, naukowcy mogą lepiej połączyć ekspresję receptora z funkcją immunologiczną. Pomogłoby to naukowcom w podstawowej immunologii, a także w badaniach terapeutycznych. Dzięki takiemu podejściu możemy teraz zapytać, w jaki sposób mniej znane lub niescharakteryzowane GPCR są zaangażowane w prowadzenie limfocytów T do określonych tkanek. Możemy dowiedzieć się, w jaki sposób sygnalizacja GPCR może być dostrojona do leczenia raka lub autoimmunizacji. Możemy pomóc limfocytom T dotrzeć we właściwe miejsce we właściwym czasie dla podejść terapeutycznych.

[Narrator] Na początek, pierwszego dnia, pokryj 10-centymetrowe płytki do hodowli tkankowych pięcioma mililitrami 50 mikrogramów na mililitr roztworu poli-D-lizyny przygotowanego w sterylnej wodzie. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 45 minut, a następnie umyć je dwa razy sterylnym PBS bez wapnia i magnezu, aby upewnić się, że nie pozostały żadne pozostałości. Następnie odłącz komórki Plat-E za pomocą dwóch mililitrów 0,05% trypsyny i 0,5 milimolowego EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Aby zapewnić żywotność komórek przy użyciu testu wykluczania błękitu trypanowego, należy zmieszać równą objętość zawiesiny komórek z roztworem błękitu trypanowego. Następnie wysiewaj 3 miliony żywych komórek na 10-centymetrowej szalce Petriego z pożywką Plat-E bez antybiotyków. Drugiego dnia zastąp pożywkę w hodowlach komórkowych Plat-E 6,5 mililitra pożywki o zredukowanej surowicy. Przygotuj mieszankę do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta. Na każdą płytkę należy zmieszać 45 mikrolitrów Lipofectaminy 2000 z 210 mikrolitrami pożywki o zredukowanej surowicy w jednej probówce i 15 mikrogramów DNA z 235 mikrolitrami pożywki o obniżonej surowicy w drugiej probówce. Połączyć zawartość probówek, pipetując trzy do czterech razy i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby ułatwić tworzenie kompleksu. Teraz dodaj mieszaninę kroplami na płytki i inkubuj przez 16 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie pokryj 24-dołkowe płytki do aktywacji limfocytów T anty-mysimi CD28 i CD3 w 375 mikrolitrach na studzienkę PBS. Inkubować płytki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub przez trzy do czterech godzin w inkubatorze ustawionym na cztery stopnie Celsjusza. Trzeciego dnia użyj tłoka strzykawki, aby delikatnie zetrzeć izolowane śledziony myszy na 100-mikrometrowym sitku do komórek z nylonowej siatki umieszczonym w sześciodołkowej płytce zawierającej pożywkę RPMI. Przenieś zawiesinę komórek przez 40-mikrometrowe sitko z siatki nylonowej do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Odwirować roztwór o stężeniu 450 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umyj komórki PBS bez wapnia i magnezu. Następnie należy przeprowadzić magnetyczną selekcję ujemną za pomocą mysiego zestawu izolacyjnego T-cell CD4 zgodnie z instrukcjami producenta. Policz izolowane limfocyty T za pomocą licznika komórek. Umieść limfocyty T w powlekanych studzienkach aktywacyjnych limfocytów T o gęstości od jednego do 1,5 miliona komórek na studzienkę w jednym mililitrze pożywki RPMI 10. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla w wilgotnym inkubatorze przez 24 do 48 godzin. Czwartego dnia zbierz około 12 mililitrów supernatantu wirusa z 10-centymetrowych płytek do stożkowej probówki. Zastąp pożywkę w płytkach hodowlanych Plat-E 10 mililitrami pożywki Plat-E bez antybiotyków, aby wytworzyć więcej supernatantu wirusa do drugiej transdukcji następnego dnia. Aby przefiltrować zebrany supernatant wirusa, przepuść go przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,45 mikrometra. Dodać osiem mikrogramów na mililitr polibrenu i rozcieńczenie buforu HEPES w rozcieńczeniu od 1 do 100 do przefiltrowanego supernatantu. Wiruj 24-dołkową płytkę z limfocytów T przez siedem minut w temperaturze 950g. Następnie ostrożnie zbierz i zachowaj supernatant bez usuwania limfocytów T. Aby przeprowadzić infekcję, dodaj jeden mililitr supernatantu wirusowego do każdej studzienki. Uszczelnij płytki folią spożywczą i obracaj płytki z maską 1 150 g przez cztery godziny w temperaturze 32 stopni Celsjusza. Po infekcji ostrożnie zastąp pożywkę w każdej studzience wcześniej zapisanym supernatantem limfocytów T. Szóstego dnia zbierz limfocyty T z płytki do stożkowej probówki i odwiruj. Przemyć osad PBS zawierającym wapń i magnez. Przenieś komórki na nową płytkę hodowlaną zawierającą 130 jednostek na mililitr mysiej interleukiny-2 i 10 nanogramów na mililitr mysiej interleukiny-7. Inkubować komórki przez co najmniej dwa dni lub do momentu, gdy osiągną pożądany poziom ekspansji w oparciu o liczbę komórek potrzebnych do wstrzyknięcia. Ósmego dnia odwiruj przy 450 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby granulować komórki. Dodaj pięć mililitrów Histopaque-1077 do 15-mililitrowej probówki. Ponownie zawiesić osad komórek T w pięciu mililitrach PBS zawierających wapń i magnez. Ostrożnie ułóż zawiesinę komórkową na wierzchu pięciu mililitrów Histopaque-1077 w probówce wirówkowej. Odwirować próbkę o masie od 400 do 500 g przez 20 minut w temperaturze pokojowej, upewniając się, że przerwa wirówki lub przyspieszenie jest ustawione na 0. Po odwirowaniu obserwuj tworzenie się wyraźnych warstw komórek. Ostrożnie zbierz warstwę graniczną zawierającą pożądane komórki za pomocą pipety, unikając zanieczyszczenia innymi warstwami. Limfocyty T transdukowane GPR25 wykazywały zwiększoną migrację w kierunku hCXCL17 i mCXCL17 w porównaniu z kontrolami transdukowanymi nadziewaczem, co potwierdza funkcjonalną ekspresję receptora. Komórki transdukowane GPR25 preferencyjnie lokalizowały się w tkankach błony śluzowej niejelitowej, takich jak drogi moczowo-płciowe, żołądek i tchawica, ze znacznym wzbogaceniem obserwowanym po siedmiu tygodniach, ale nie po tygodniu od wstrzyknięcia. Krótkoterminowe testy naprowadzania wykazały, że limfocyt T transdukowany przez GPR25 preferencyjnie umieszczał się w narządach bogatych w Cxcl17, takich jak tchawica, żołądek, język, pęcherzyk żółciowy i błona śluzowa macicy, podczas gdy nie gromadził się u myszy z niedoborem Cxcl17. Komórki transdukowane GPR25 były zlokalizowane głównie w oskrzelach, podczas gdy komórki kontrolne częściej znajdowały się w pobliżu żył.