Name: Wydajna transdukcja retrowirusowa i konkurencyjne naprowadzanie do badania lokalizacji limfocytów T za pośrednictwem GPCR w różnych mikrośrodowiskach tkankowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj ulepszone protokoły transdukcji retrowirusowej i konkurencyjnego naprowadzania limfocytów T do badania lokalizacji komórek immunologicznych w różnych mikrośrodowiskach tkankowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez NIH przyznaje AI178113 R01 i R01 AI047822, grant 1903-03787 z The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust oraz granty Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) T31IP1880 i T33IR6609 dla ECB; Y.B. był wspierany przez Research Fellows Award przyznawaną przez Crohn's and Colitis Foundation of America (835171). B.O. był wspierany przez stypendium podoktorskie Fundacji Ramona Arecesa (Madryt, Hiszpania) oraz nagrodę Research Fellows Award przyznawaną przez Crohn's and Colitis Foundation of America (574148). AA było wspierane przez Kalifornijski Instytut Medycyny Regeneracyjnej (CIRM) - EDUC2-12677.

<ol><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function+and+drug+discovery+of+GPCR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22MolBiomed%22%5BJournal%5D)">Structure, function and drug discovery of GPCR signaling.</a> MolBiomed. 4 (1), 46(2023).</li>
<li>Lammermann, T., Kastenmuller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concepts+of+GPCR-controlled+navigation+in+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Concepts of GPCR-controlled navigation in the immune system.</a> Immunol Rev. 289 (1), 205-231 (2019).</li>
<li>Fu, H., Ward, E. J., Marelli-Berg, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+t+cell+organotropism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of t cell organotropism.</a> Cell Mol Life Sci. 73 (16), 3009-3033 (2016).</li>
<li>Cinalli, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+homeostasis+requires+g+protein-coupled+receptor-mediated+access+to+trophic+signals+that+promote+growth+and+inhibit+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell homeostasis requires g protein-coupled receptor-mediated access to trophic signals that promote growth and inhibit chemotaxis.</a> Eur J Immunol. 35 (3), 786-795 (2005).</li>
<li>Wu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+the+onco-GPCRome%3A+Novel+g+protein-coupled+receptor-driven+oncocrine+networks+and+targets+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Illuminating the onco-GPCRome: Novel g protein-coupled receptor-driven oncocrine networks and targets for cancer immunotherapy.</a> J Biol Chem. 294 (29), 11062-11086 (2019).</li>
<li>Wu, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GPCR-alpha%28s%29-pka+signaling+axis+promotes+T-cell+dysfunction+and+cancer+immunotherapy+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The GPCR-alpha(s)-pka signaling axis promotes T-cell dysfunction and cancer immunotherapy failure.</a> Nat Immunol. 24 (8), 1318-1330 (2023).</li>
<li>Ramezani, A., Hawley, T. S., Hawley, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+gammaretroviral+vector+expression+during+embryonic+stem+cell-derived+in+vitro+hematopoietic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Stable gammaretroviral vector expression during embryonic stem cell-derived in vitro hematopoietic development.</a> Mol Ther. 14 (2), 245-254 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Plat-E+retroviral+packaging+cells+%28RV-101%29+user+manual%22">Plat-E retroviral packaging cells (RV-101) user manual</a>. , Cell Biolabs. https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/RV-101-plat-e-retroviral-packaging-cells.pdf (2024).</li>
<li>Anderson, J., Hope, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+trafficking+of+retroviral+vectors%3A+obstacles+and+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Intracellular trafficking of retroviral vectors: obstacles and advances.</a> Gene Ther. 12, 1667-1678 (2005).</li>
<li>Kim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+analyses+of+lamina+propria+lymphocytes+from+mouse+intestines%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and analyses of lamina propria lymphocytes from mouse intestines.</a> STAR Protoc. 3 (2), 101366(2022).</li>
<li>Steinert, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Memory+CD8+T+Cells+Reveals+Regionalization+of+Immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance.</a> Cell. 161 (4), 737-749 (2015).</li>
<li>Miltenyi Biotec. CD90.1 MicroBeads mouse and rat. , https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_3ea1u0fdf5423ci3qg8mc8rl4c?content-disposition=inline accessed (2024).</li>
<li>Ocón, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lymphocyte+chemoaffinity+axis+for+lung%2C+non-intestinal+mucosae+and+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A lymphocyte chemoaffinity axis for lung, non-intestinal mucosae and CNS.</a> Nature. 635, 736-745 (2024).</li>
<li>Sumida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gpr55+regulates+intraepithelial+lymphocyte+migration+dynamics+and+susceptibility+to+intestinal+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Gpr55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage.</a> Sci Immunol. 2 (18), eaao1135(2017).</li>
<li>Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistep+navigation+and+the+combinatorial+control+of+leukocyte+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis.</a> J. Cell Biol. 139 (5), 1349-1360 (1997).</li>
<li>Alawar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+solution+for+highly+efficient+electroporation+of+primary+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A solution for highly efficient electroporation of primary cytotoxic T lymphocytes.</a> BMC Biotechnol. 24 (1), 16(2024).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wewnętrznie kontrolowany test naprowadzania przedstawiony w tym badaniu jest kompleksową metodą badania transportu i pozycjonowania limfocytów T za pośrednictwem GPCR w różnych mikrośrodowiskach narządów i tkanek. Takie podejście integruje kilka krytycznych optymalizacji w celu zwiększenia odtwarzalności, dokładności i wydajności.
Krytycznym aspektem tego protokołu jest skuteczna transdukcja limfocytów T za pomocą wektorów retrowirusowych MSCV, co jest ułatwione dzięki zastosowaniu komórek Pla...

Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) mają zasadnicze znaczenie w regulacji różnych procesów komórkowych, w tym transdukcji sygnału, neurotransmisji, regulacji hormonów i migracji komórek odpornościowych1. Odgrywają one kluczową rolę w czasoprzestrzennej kontroli migracji i lokalizacji limfocytów2. Podczas fazy pobudzania odpowiedzi immunologicznej, lokalne mikrośrodowisko i interakcje komórkowe skłaniają limfocyty T do ekspresji unikalnego zestawu cząsteczek adhezyjnych i receptorów chemokinowych znanych jako receptory naprowadzające. Ta adaptacja umożliwia limfocytom T doświadczonym w antygenach angażowanie się w komórki śródbłonka specyficzne dla narządu (EC) i migrację do odrębnych tkanek docelowych. Zdolność limfocytów T do nabywania tropizmu tkankowego ma kluczowe znaczenie dla skutecznych odpowiedzi przypominających, szczególnie w kontekście nawracających infekcji dotykających tego samego narządu 3,4.
GPCR kierują komórki odpornościowe do określonych tkanek i narządów, w których pełnią krytyczne funkcje - takie jak kierowanie komórek T i NK CD8 + do miejsc guza w celu działania cytotoksycznego lub wspomaganie limfocytów T CD4 + w koordynowaniu odpowiedzi immunologicznej poprzez wspieranie aktywacji innych komórek odpornościowych. Zrozumienie, w jaki sposób GPCR kierują limfocyty T do ich precyzyjnych lokalizacji, jest niezbędne do rozwoju celowanych immunoterapii 5,6. Wyzwanie polega jednak na modelowaniu tych złożonych interakcji in vitro, ponieważ jednoczesne replikowanie zarówno ograniczonych przestrzennie sygnałów, jak i kierunkowych sygnałów chemotaktycznych jest trudne.
Wyjaśnienie ról określonych receptorów leukocytów jest również często trudne ze względu na ich ograniczoną częstotliwość ekspresji w populacjach endogennych oraz fakt, że receptory te zazwyczaj zdobią różne typy komórek. Ta złożoność sprawia, że trudno jest wyizolować rolę określonego receptora od innych mechanizmów specyficznych dla podzbioru komórki. Idealnie byłoby, gdyby metody porównywały podobne populacje, różniące się jedynie receptorem będącym przedmiotem zainteresowania, aby zapewnić jasny wgląd.
Aby przezwyciężyć te wyzwania, przyjęliśmy konkurencyjny test naprowadzania, który wykorzystuje rekombinowaną transdukcję retrowirusową MSCV w celu efektywnej ekspresji GPCR w limfocytach T. Wektory retrowirusowe MSCV, które łączą elementy wektorów MESV opartych na wirusie mięsaka mieloproliferacyjnego (PCMV) i wektorów LN opartych na wirusie białaczki mysiej Moloneya (MMLV), zawierają rozszerzony sygnał pakowania hybrydowego pochodzący z wektorów LN7. Modyfikacja ta zwiększa efektywność dostarczania genów, umożliwiając zarówno krótko-, jak i długoterminowe badania lokalizacji limfocytów T in vivo. Dzięki wykorzystaniu cząstek retrowirusowych o wysokim mianie i mikroskopii konfokalnej, podejście to pozwala na precyzyjną wizualizację położenia limfocytów T i interakcji w złożonych środowiskach tkankowych. Przedstawiamy szczegółowe protokoły transdukcji retrowirusowej receptorów transportowych oraz wykonywania wewnętrznie kontrolowanych (tzw. konkurencyjnych) testów naprowadzania w celu zbadania lokalizacji limfocytów specyficznych dla narządów i mikrośrodowiska, w których pośredniczy receptor. Ogólnym celem tej metody jest dostarczenie cennych informacji na temat mechanizmów transportu komórek odpornościowych oraz umożliwienie przyszłych zastosowań zarówno w badaniach podstawowych, jak i w rozwoju terapeutycznym.

<table><tbody><tr><td>AF647 anty myszy CD90.1-Thy1.1 (OX-7)</td><td>Legenda biologiczna&nbsp;</td><td>202507</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD31 (DyLight 633, klon 390)</td><td>InvivoMab&nbsp;</td><td>BE0377 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysz CD28 37.51</td><td>eNauki biologiczne&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anty-mysz CD3 145-2C11</td><td>eNauki biologiczne&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>APCCy7 anty myszy CD3 (145-2C11)</td><td>Legenda biologiczna&nbsp;</td><td>100329</td><td></td></tr><tr><td>BV421 anty myszy CD8b&nbsp; (Ły-3)</td><td>Legenda biologiczna&nbsp;</td><td>126629</td><td></td></tr><tr><td>BV711 anty mysz CD4 (RM4-5)&nbsp;</td><td>Legenda biologiczna&nbsp;</td><td>100549</td><td></td></tr><tr><td>Mikrogranulki CD90.1&nbsp;</td><td>Miltenyi&nbsp;</td><td>130-121-273</td><td></td></tr><tr><td>Międzynarodowa Organizacja Inwestycyjna&nbsp;</td><td>Termonauka&nbsp;</td><td>Zobacz materiał C34554</td><td></td></tr><tr><td>Anty mysz FITC CD45.2 (104)</td><td>BD</td><td>AB_395041</td><td></td></tr><tr><td>mysz IL2&nbsp;</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-02-50UG</td><td></td></tr><tr><td>mysz IL7&nbsp;</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>&nbsp; 217-17-10UG</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw izolacyjny Mouse T CD4&nbsp;</td><td>Technologie STEMCELL&nbsp;</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>MSCV-IRES- Ty1.1 GPR25</td><td>Kreator wektorów&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSCV-IRES- Nadziewarka Thy1.1</td><td>Kreator wektorów&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało PE-CD45 (30-F11)&nbsp;</td><td>Legenda biologiczna&nbsp;</td><td>103105</td><td></td></tr><tr><td>PECy7 przeciw myszom TCRb&nbsp; (H57-597)</td><td>Tonbo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anty mysz PercpCy5.5 CD45.1 (A20)</td><td>eNauki biologiczne&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platyna-E (Platyna-E)&nbsp;</td><td>biolaboratoria komórkowe. Inc&nbsp;</td><td>Samochód RV-101</td><td></td></tr><tr><td>Żółty barwnik fluorescencyjny&nbsp;</td><td>Termonauka&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wydajna transdukcja retrowirusowa i konkurencyjne naprowadzanie do badania lokalizacji limfocytów t za pośrednictwem gpcr w różnych mikrośrodowiskach tkankowych

Efficient Retroviral Transduction and Competitive Homing for Investigating GPCR-Mediated T-Cell Localization in Diverse Tissue Microenvironments

Zrozumienie, w jaki sposób ekspresja receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR) wpływa na pozycjonowanie komórek w różnych mikrośrodowiskach tkankowych, jest niezbędne do wyjaśnienia mechanizmów transportu komórek odpornościowych. Przedstawiamy konkurencyjny test naprowadzania przeznaczony do badania lokalizacji limfocytów T za pośrednictwem GPCR w narządach wyrażających ich pokrewne ligandy chemoatraktantu, mający zastosowanie zarówno w badaniach krótkoterminowych, jak i długoterminowych. Podejście to obejmuje ulepszony protokół transdukcji rekombinowanego wirusa mysich komórek macierzystych (MSCV) limfocytów T w celu ekspresji GPCR będącego przedmiotem zainteresowania lub konstruktu kontrolnego, a następnie konkurencyjnego naprowadzania u myszy biorców. Rozmieszczenie komórek w różnych narządach jest analizowane za pomocą cytometrii przepływowej i/lub mikroskopii konfokalnej. W krótkoterminowych eksperymentach (10-12 godzin) mikroskopia konfokalna ujawniła wyraźne wzorce lokalizacji komórek, w tym pęcherzyków płucnych, błony podśluzowej oskrzeli, miejsc żylnych i śródmiąższu w płucach, a także nabłonka wyściełającego tchawicę, żołądek i róg macicy. W badaniach długoterminowych (1-7 tygodni) cytometria przepływowa dostarczyła informacji na temat preferencyjnej akumulacji komórek, ujawniając dynamiczne zmiany i potencjalne dojrzewanie lub repozycjonowanie w tkankach w czasie. Ten konkurencyjny test naprowadzania jest solidnym narzędziem do badania pozycjonowania komórek za pośrednictwem GPCR, oferując cenne informacje na temat dystrybucji specyficznej dla tkanek i potencjalnych zastosowań w immunologii i badaniach terapeutycznych.

W niniejszym badaniu przedstawiamy szczegółowy protokół służący do badania zdolności specyficznych receptorów do kierowania lokalizacją limfocytów T in vivo. W celu zademonstrowania tego protokołu wykorzystaliśmy GPR25.13Stosując ten protokół, jesteśmy w stanie osiągnąć wydajność transdukcji na poziomie 30%–40%, co oceniono poprzez barwienie Thy1.1 z wykorzystaniem cytometrii przepływowej. Wykonaliśmy in vitro testy chemotaksji w układzie Transwell z użyciem komórek transdukowanych GPR25 ...

Przedstawiamy ulepszone protokoły transdukcji retrowirusowej receptorów transportowych i konkurencyjnego naprowadzania w celu zbadania lokalizacji limfocytów specyficznych dla narządów i mikrośrodowisk za pośrednictwem receptorów. Metoda ta dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów transportu komórek odpornościowych i ma potencjalne zastosowania w przyszłych badaniach podstawowych i terapeutycznych.

Wydajna transdukcja retrowirusowa i konkurencyjne naprowadzanie do badania lokalizacji limfocytów T za pośrednictwem GPCR w różnych mikrośrodowiskach tkankowych

Understanding how G-protein coupled receptor (GPCR) expression affects cell positioning within diverse tissue microenvironments is essential for ...

Nasze badania badają, w jaki sposób GPCR wpływają na transport i pozycjonowanie komórek odpornościowych w różnych mikrośrodowiskach tkankowych. Korzystając z tego protokołu i innych protokołów uzupełniających, nasze laboratorium zidentyfikowało specyficzną dla narządu oś chemoatraktantu w tkankach błony śluzowej poza jelitami. Teraz dowiedzieliśmy się, w jaki sposób limfocyty, w których znajdują się żołądek, płuca, tchawica i przewód pokarmowy. Przedstawiam skuteczną i ulepszoną metodę testowania, jak poszczególne GPCR wpływają na ruch limfocytów T in vivo. Opracowaliśmy niezawodny sposób wprowadzania tych receptorów do limfocytów T, które teraz umożliwiają bezpośrednie porównanie obok siebie w konkurencyjnych testach naprowadzania. Teraz, gdy wiemy, w jaki sposób GPCR kierują komórkami T in vivo, naukowcy mogą lepiej połączyć ekspresję receptora z funkcją immunologiczną. Pomogłoby to naukowcom w podstawowej immunologii, a także w badaniach terapeutycznych. Dzięki takiemu podejściu możemy teraz zapytać, w jaki sposób mniej znane lub niescharakteryzowane GPCR są zaangażowane w prowadzenie limfocytów T do określonych tkanek. Możemy dowiedzieć się, w jaki sposób sygnalizacja GPCR może być dostrojona do leczenia raka lub autoimmunizacji. Możemy pomóc limfocytom T dotrzeć we właściwe miejsce we właściwym czasie dla podejść terapeutycznych.[Narrator] Na początek, pierwszego dnia, pokryj 10-centymetrowe płytki do hodowli tkankowych pięcioma mililitrami 50 mikrogramów na mililitr roztworu poli-D-lizyny przygotowanego w sterylnej wodzie. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 45 minut, a następnie umyć je dwa razy sterylnym PBS bez wapnia i magnezu, aby upewnić się, że nie pozostały żadne pozostałości. Następnie odłącz komórki Plat-E za pomocą dwóch mililitrów 0,05% trypsyny i 0,5 milimolowego EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Aby zapewnić żywotność komórek przy użyciu testu wykluczania błękitu trypanowego, należy zmieszać równą objętość zawiesiny komórek z roztworem błękitu trypanowego. Następnie wysiewaj 3 miliony żywych komórek na 10-centymetrowej szalce Petriego z pożywką Plat-E bez antybiotyków. Drugiego dnia zastąp pożywkę w hodowlach komórkowych Plat-E 6,5 mililitra pożywki o zredukowanej surowicy. Przygotuj mieszankę do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta. Na każdą płytkę należy zmieszać 45 mikrolitrów Lipofectaminy 2000 z 210 mikrolitrami pożywki o zredukowanej surowicy w jednej probówce i 15 mikrogramów DNA z 235 mikrolitrami pożywki o obniżonej surowicy w drugiej probówce. Połączyć zawartość probówek, pipetując trzy do czterech razy i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby ułatwić tworzenie kompleksu. Teraz dodaj mieszaninę kroplami na płytki i inkubuj przez 16 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie pokryj 24-dołkowe płytki do aktywacji limfocytów T anty-mysimi CD28 i CD3 w 375 mikrolitrach na studzienkę PBS. Inkubować płytki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub przez trzy do czterech godzin w inkubatorze ustawionym na cztery stopnie Celsjusza. Trzeciego dnia użyj tłoka strzykawki, aby delikatnie zetrzeć izolowane śledziony myszy na 100-mikrometrowym sitku do komórek z nylonowej siatki umieszczonym w sześciodołkowej płytce zawierającej pożywkę RPMI. Przenieś zawiesinę komórek przez 40-mikrometrowe sitko z siatki nylonowej do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Odwirować roztwór o stężeniu 450 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umyj komórki PBS bez wapnia i magnezu. Następnie należy przeprowadzić magnetyczną selekcję ujemną za pomocą mysiego zestawu izolacyjnego T-cell CD4 zgodnie z instrukcjami producenta. Policz izolowane limfocyty T za pomocą licznika komórek. Umieść limfocyty T w powlekanych studzienkach aktywacyjnych limfocytów T o gęstości od jednego do 1,5 miliona komórek na studzienkę w jednym mililitrze pożywki RPMI 10. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla w wilgotnym inkubatorze przez 24 do 48 godzin. Czwartego dnia zbierz około 12 mililitrów supernatantu wirusa z 10-centymetrowych płytek do stożkowej probówki. Zastąp pożywkę w płytkach hodowlanych Plat-E 10 mililitrami pożywki Plat-E bez antybiotyków, aby wytworzyć więcej supernatantu wirusa do drugiej transdukcji następnego dnia. Aby przefiltrować zebrany supernatant wirusa, przepuść go przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,45 mikrometra. Dodać osiem mikrogramów na mililitr polibrenu i rozcieńczenie buforu HEPES w rozcieńczeniu od 1 do 100 do przefiltrowanego supernatantu. Wiruj 24-dołkową płytkę z limfocytów T przez siedem minut w temperaturze 950g. Następnie ostrożnie zbierz i zachowaj supernatant bez usuwania limfocytów T. Aby przeprowadzić infekcję, dodaj jeden mililitr supernatantu wirusowego do każdej studzienki. Uszczelnij płytki folią spożywczą i obracaj płytki z maską 1 150 g przez cztery godziny w temperaturze 32 stopni Celsjusza. Po infekcji ostrożnie zastąp pożywkę w każdej studzience wcześniej zapisanym supernatantem limfocytów T. Szóstego dnia zbierz limfocyty T z płytki do stożkowej probówki i odwiruj. Przemyć osad PBS zawierającym wapń i magnez. Przenieś komórki na nową płytkę hodowlaną zawierającą 130 jednostek na mililitr mysiej interleukiny-2 i 10 nanogramów na mililitr mysiej interleukiny-7. Inkubować komórki przez co najmniej dwa dni lub do momentu, gdy osiągną pożądany poziom ekspansji w oparciu o liczbę komórek potrzebnych do wstrzyknięcia. Ósmego dnia odwiruj przy 450 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby granulować komórki. Dodaj pięć mililitrów Histopaque-1077 do 15-mililitrowej probówki. Ponownie zawiesić osad komórek T w pięciu mililitrach PBS zawierających wapń i magnez. Ostrożnie ułóż zawiesinę komórkową na wierzchu pięciu mililitrów Histopaque-1077 w probówce wirówkowej. Odwirować próbkę o masie od 400 do 500 g przez 20 minut w temperaturze pokojowej, upewniając się, że przerwa wirówki lub przyspieszenie jest ustawione na 0. Po odwirowaniu obserwuj tworzenie się wyraźnych warstw komórek. Ostrożnie zbierz warstwę graniczną zawierającą pożądane komórki za pomocą pipety, unikając zanieczyszczenia innymi warstwami. Limfocyty T transdukowane GPR25 wykazywały zwiększoną migrację w kierunku hCXCL17 i mCXCL17 w porównaniu z kontrolami transdukowanymi nadziewaczem, co potwierdza funkcjonalną ekspresję receptora. Komórki transdukowane GPR25 preferencyjnie lokalizowały się w tkankach błony śluzowej niejelitowej, takich jak drogi moczowo-płciowe, żołądek i tchawica, ze znacznym wzbogaceniem obserwowanym po siedmiu tygodniach, ale nie po tygodniu od wstrzyknięcia. Krótkoterminowe testy naprowadzania wykazały, że limfocyt T transdukowany przez GPR25 preferencyjnie umieszczał się w narządach bogatych w Cxcl17, takich jak tchawica, żołądek, język, pęcherzyk żółciowy i błona śluzowa macicy, podczas gdy nie gromadził się u myszy z niedoborem Cxcl17. Komórki transdukowane GPR25 były zlokalizowane głównie w oskrzelach, podczas gdy komórki kontrolne częściej znajdowały się w pobliżu żył.

efficient-retroviral-transduction-competitive-homing-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiamy protokół otrzymywania swoistych dla antygenu limfocytów T myszy z wykorzystaniem transdukcji...

Retrowirusowa transdukcja receptorów limfocytów T w limfocytach T myszy

Eksperymenty z konkurencyjnym homingiem pozwalają na bezpośrednią ocenę właściwości migracyjnych dwóch różnych populacji komórek u jednej myszy. W niniejszym materiale ilustrujemy tę procedurę, porównując migrację limfocytów T o tropizmie jelitowym i nietropowym generowanych ex vivo.

Konkurencyjne testy homingu w celu badania migracji limfocytów T tropujących do jelit

Transfer genu adenowirusowego do naiwnych limfocytów T CD4 z transgeniczną ekspresją receptora adenowirusa Coxsackie umożliwia molekularną analizę różnicowania regulatorowych limfocytów T in vitro.

Transdukcja adenowirusowa naiwnych limfocytów T CD4 w celu zbadania różnicowania limfocytów Treg

Opisujemy protokół monitorowania ruchliwości radialnej nieprzylegających komórek odpornościowych in vitro za pomocą kolektora sedymentacyjnego/suwaka komórkowego. Migracja komórek jest śledzona na monowarstwach komórek nowotworowych lub na białkach macierzy zewnątrzkomórkowej. Badanie za pomocą mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej pozwala na obserwację ruchliwości komórek i funkcjonalności cytotoksycznej.

Ruchliwość promieniowa i funkcja cytotoksyczna retrowirusowych limfocytów T transdukowanych wektorem replikującym, nieadherentnych alloreagujących limfocytów T

Przedstawiamy szybki i elastyczny protokół dla systemu ekspresji in vivo opartego na pojedynczym receptorze limfocytów T (TCR).  Wektory retrowirusowe są wykorzystywane do transdukcji komórek progenitorowych szpiku kostnego w celu zbadania rozwoju i funkcji pojedynczych komórek T in vivo jako alternatywy dla myszy transgenicznych TCR.

Transdukcja retrowirusowa komórek progenitorowych szpiku kostnego w celu wytworzenia myszy retrogenicznych receptora komórek T

Wiele eksperymentalnych systemów zostało wykorzystanych do zrozumienia mechanizmów regulujących rozwój i funkcję limfocytów T w odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisano podejście genetyczne wykorzystujące transdukcję retrowirusową, które jest ekonomiczne, efektywne czasowo, a co najważniejsze, bardzo pouczające w identyfikacji szlaków regulacyjnych.

Transdukcja retrowirusowa limfocytów T pomocniczych jako genetyczne podejście do badania mechanizmów kontrolujących ich różnicowanie i funkcję

Obecny protokół łączy sekwencjonowanie łańcucha alfa i beta TCR w parach pojedynczych komórek z usprawnionym generowaniem wektorów retrowirusowych kompatybilnych z ekspresją TCR in vitro i in vivo.

Usprawniona izolacja TCR z pojedynczych komórek i generowanie wektorów retrowirusowych do ekspresji TCR u ludzi in vitro i in vivo

Ten protokół opisuje wykrywanie za pomocą mikroskopii konfokalnej internalizacji receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR) w komórkach ssaków. Obejmuje podstawową procedurę hodowli komórek, transfekcji i mikroskopii konfokalnej oraz zapewnia wydajną i łatwą do interpretacji metodę wykrywania subkomórkowej lokalizacji i internalizacji GPCR wyrażanego fuzją.

Wykrywanie internalizacji receptora sprzężonego z białkiem G aktywowanym ligandem za pomocą mikroskopii konfokalnej

Tutaj opisujemy metodę retrowirusowej nadekspresji i adoptywnego transferu mysich komórek B-1a w celu zbadania in vivo migracji i lokalizacji komórek B-1a. Protokół ten można rozszerzyć o różne dalsze testy funkcjonalne, w tym kwantyfikację lokalizacji komórek B-1a dawcy lub analizę czynników wydzielanych przez komórki dawcy po transferze adopcyjnym.

Retrowirusowa nadekspresja CXCR4 na mysich komórkach B-1A i transfer adoptywny w celu ukierunkowanej migracji komórek B-1A do szpiku kostnego i produkcji IgM

Przedstawiamy protokół retrowirusowej transdukcji przewodnikowego RNA do pierwotnych limfocytów T od transgenicznych myszy Cas9, zapewniając efektywną alternatywę dla edycji genów w badaniu różnicowania Th17.

Retrowirusowe celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w badaniu różnicowania Th17 in vitro

Poznaj ulepszone protokoły transdukcji retrowirusowej i konkurencyjnego naprowadzania limfocytów T do badania lokalizacji komórek immunologicznych w różnych mikrośrodowiskach tkankowych.

Wydajna transdukcja retrowirusowa i konkurencyjne naprowadzanie do badania lokalizacji limfocytów T za pośrednictwem GPCR w różnych mikrośrodowiskach tkankowych (Wideo) | JoVE Journal

Wydajna transdukcja retrowirusowa i konkurencyjne naprowadzanie do badania lokalizacji limfocytów T za pośrednictwem GPCR w różnych mikrośrodowiskach tkankowych

Przeglądaj więcej filmów