Name: Znakowanie in vivo stabilnych izotopów do identyfikacji spektrometrii mas ojcowskich metabolitów przenoszonych z plemnika do oocytu podczas zapłodnienia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Poznaj metodę znakowania stabilnymi izotopami do identyfikacji ojcowskich metabolitów przenoszonych do oocytu podczas zapłodnienia u myszy. Technika ta umożliwia badanie roli metabolitów w rozwoju zarodka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania na Uniwersytecie Fryderyka II w Neapolu we Włoszech. Odczynniki i sprzęt używany w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Selekcja i grupowanie samców C57BL/6J
<ol>
	<li>Wybierz samce C57BL/6J w wieku około 12 tygodni.</li>
	<li>Podziel samce na dwie grupy i nazwij je ZNAKOWANE (poddawane znakowaniu stabilnymi izotopami) lub NIEZNAKOWANE (używane jako kontrola i do pomiaru skuteczności znakowania izotopowego w plemnikach i morulach).</li>
	<li>Aby opróżnić najądrze z nieoznakowanych plemników, pozwól samcom na kojarzenie się ze sparowanymi samicami.</li>
</ol>
2. Stabilne znakowanie izotopowe samców C57BL / 6J
<ol>
	<li>W przypadku stosowania 2H2O do znakowania in vivo , należy przygotować 10% v/v 2H2O - wzbogaconą wodą do użycia jako woda pitna, mieszając 100 ml 2H2O z 900 ml wody z kranu. W przypadku stosowania U13C-Glucose do znakowania in vivo , należy przygotować 5%-15% wody U13C-Glucose do użycia jako woda pitna, rozpuszczając 50-150 g U13C-Glucose w 1 L wody z kranu; UWAGA: Długotrwałe spożywanie 2H2O jest toksyczne dla myszy. Ustaw dla każdego konkretnego szczepu myszy, maksymalną ilość 2H2O do dodania do wody pitnej, aby osiągnąć maksymalną skuteczność etykietowania i minimalne skutki uboczne. Długotrwałe spożywanie glukozy powoduje hiperglikemię i cukrzycę u myszy. Ustaw maksymalną ilość U13C-Glucose do dodania do wody pitnej, aby osiągnąć maksymalną skuteczność etykietowania i minimalne skutki uboczne.</li>
	<li>Zastąp butelki z wodą na te zawierające wodę pitną znakowaną izotopowo i pozwól myszom pić ją przez 2,5-5 tygodni (obejmując co najmniej połowę spermatogenezy), odnawiając płyn dwa razy w tygodniu.</li>
	<li>Pod koniec okresu leczenia pozwól oznakowanym samcom na kojarzenie się z samicami z superowulacją.</li>
</ol>
3. Superowulacja kobiet C57BL/6J
<ol>
	<li>Wybierz samice w wieku około 4 tygodni o wadze od 12,5 do 14 g, w wieku przedpokwitaniowym.</li>
	<li>Wywołać dojrzewanie pęcherzyka przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 5 IU/50 μL/mysz PMSG (surowica ciężarnej klaczy).</li>
	<li>Po 47 godzinach wstrzyknąć dootrzewnowo hormon luteinizujący HCG (ludzka gonadotropina kosmówkowa, 5 IU / 50 μL / mysz), aby przyspieszyć zakończenie dojrzewania pęcherzyka i wywołać owulację oraz tworzenie ciałka żółtego.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu HCG pozwól samicom kojarzyć się z myszami ZNAKOWANYMI i NIEZNAKOWANYMI, zgodnie z krokiem 1 na rysunku 1.</li>
	<li>Po kryciu wykonaj kontrolę czopa dopochwowego42. Oddziel pozytywne samice i umieść je w klatce.</li>
</ol>
4. Pobieranie zarodków przed implantacją przez płukanie
<ol>
	<li>Składaj w ofierze samice z czopem pochwowym zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami (2,5 dnia po stosunku w celu pobrania moruli).</li>
	<li>Ułóż zwierzęta w pozycji grzbietowej na stole; Zwilż brzuch 70% etanolem i wykonaj szeroką laparotomię.</li>
	<li>Usuń macicę z jednej strony, ściskając szyjkę macicy i przecinając ogonowy koniec szyjki macicy; z drugiej strony, poprzez nacięcie na końcu rogu macicy (część lejkowata).</li>
	<li>Umieść macicę na szalce Petriego z PBS, aby ją wypłukać, a następnie przenieś ją na inną czystą szalkę Petriego, aby uniknąć obecności pozostałości.</li>
	<li>W celu przepłukania macicy należy załadować strzykawkę o pojemności 2,5 ml z pożywką hodowlaną i przymocować ją do igły Hamiltona o sile 33 G z końcówką.</li>
	<li>Włóż igłę do lejka jajowodu przygotowanego zgodnie z powyższym opisem i umyj całą macicę.</li>
	<li>Zbierz morule w kropli pożywki hodowlanej, aby zmyć je z resztek błony śluzowej i krwi.</li>
	<li>Pobrane próbki należy przenieść do nowych probówek zbiorczych i pogrupować je w OZNAKOWANE MORULE i NIEOZNAKOWANE MORULE, w zależności od tego, czy pochodzą one z wydarzeń krytych z udziałem buhajów OZNAKOWANYCH czy NIEOZNAKOWANYCH. Próbki należy zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie.</li>
	<li>Złóż w ofierze grupę niepokrytych, superowulowanych samic (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami) w celu zebrania niezapłodnionych oocytów. Przenieś pobrane próbki do nowych probówek zbiorczych i oznacz je jako NIEOZNAKOWANE OOCYTY. Próbki należy zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie.</li>
</ol>
5. Pobranie nasienia z ogona najądrza
<ol>
	<li>Składanie w ofierze buhajów OZNAKOWANYCH lub NIEOZNAKOWANYCH.</li>
	<li>Ułóż zwierzęta w pozycji grzbietowej na stole, zwilż brzuch 70% etanolem i wykonaj szeroką laparotomię.</li>
	<li>Usuń najądrza i natychmiast zanurz je w 3 ml PBS (pH 7,6) i luźno je pokrój, aby odprowadzić plemniki z przewodów.</li>
	<li>Przefiltruj próbki nasienia przez gazę.</li>
	<li>Odwirować plemniki w temperaturze 800 x g przez 10 minut (w temperaturze pokojowej).</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml zimnej wody dejonizowanej. Tylko plemniki będą odporne na roztwór hipotoniczny podczas gdy komórki nieplemnikowe pękną.</li>
	<li>Odwirować plemniki o masie 800 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Oznacz probówki i pogrupuj je jako ZNAKOWANE PLEMNIKI i NIEZNAKOWANE PLEMNIKI, w zależności od tego, czy zostały pobrane od OZNAKOWANYCH czy NIEOZNAKOWANYCH buhajów.</li>
	<li>Próbki należy zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywać je w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
6. Ekstrakcja lipidów i metabolitów polarnych
<ol>
	<li>Zrównoważyć próbkę z etapów 1-5 w temperaturze 4 °C na lodzie.</li>
	<li>Do próbek dodać 225 μl lodowatego metanolu (MeOH) i inkubować w temperaturze -30 °C przez 1 minutę, a następnie umieścić je w łaźni sonicznej na 10 minut.<ol>
		<li>Opcjonalnie: podczas ustalania warunków doświadczalnych należy dodać 0,1-2 ppm zarówno chlorowodorku C16-Ceramide-13 C3-15 N, jak i chlorowodorku L-lizyny-ε-15N jako wzorców wewnętrznych w celu pomiaru efektywności ekstrakcji odpowiednio dla metabolitów niepolarnych i polarnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 750 μl lodowatego eteru metylowo-tert-butylowego (MTBE) w termomikserze przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C (550 obr./min).</li>
	<li>Dodać 188 μlH2Odo próbek po ich odwirowaniu. Oddzielić górne fazy (lipidy) od dolnej fazy (metabolity polarne) i wysuszyć je. UWAGA: MeOH powoduje ślepotę i uszkodzenie wątroby, nerek i serca w przypadku połknięcia. Nadmierna ekspozycja ma kumulatywny wpływ na ośrodkowy układ nerwowy. MTBE może powodować podrażnienie skóry, oczu i dróg oddechowych. Praca pod wyciągiem.</li>
	<li>Wysuszyć próbkę za pomocą koncentratora próżniowego. Wysuszone próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy masy/spektrometrii. UWAGA: Wysuszone próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy, w oczekiwaniu na analizę masy/spektrometrii. W celu identyfikacji metabolitów mniej reprezentowanych w zarodkach przedimplantacyjnych może być konieczne zebranie próbek uzyskanych z tej samej pary kryjącej i zdarzenia krycia.</li>
</ol>
7. Ekstrakcja steroli
UWAGA: Unikaj używania plastikowych rurek i końcówek [zostaną rozpuszczone przez niepolarny rozpuszczalnik organiczny]; zamiast tego używaj szklanych probówek i szklanych pipet Pasteura do dozowania płynów.
<ol>
	<li>Zrównoważyć próbkę z etapów 1–5 w temperaturze 4 °C na lodzie. Ponownie zawiesić pobrane próbki w 500 μl roztworu metanolu/H20 70% v/v i przenieść zawiesinę do szklanej probówki.<ol>
		<li>Homogenizować przez wirowanie przez 30 s. Pozostawić homogenat na 16 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Opcjonalnie: ustalając warunki doświadczalne, dodać 0,1-2 ppm steroli roślinnej Sitostanol-5,6,22,23-d4 jako wzorce wewnętrzne do pomiaru efektywności ekstrakcji steroli. UWAGA: MeOH powoduje ślepotę i uszkodzenie wątroby, nerek i serca w przypadku połknięcia. Nadmierna ekspozycja ma kumulatywny wpływ na ośrodkowy układ nerwowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 3,220 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść supernatant do czystej szklanej probówki i uzupełnić ją 500 μl PBS.</li>
	<li>Dodaj 7 ml lodowatego eteru dietylowego i wiruj przez 1 minutę. Pozostaw próbkę na 1-2 minuty i poczekaj na rozdzielenie faz. Zamrozić, zanurzając rurkę w kąpieli suchego lodu/acetonu. Przenieść niezamrożoną fazę eteru dietylowego do nowo oznakowanej szklanej probówki. UWAGA: Eter dietylowy jest niezwykle łatwopalną cieczą i parą i rozkłada się na wybuchowe nadtlenki w powietrzu i świetle. Nie pracuj w bliskim kontakcie z płomieniami. Eter dietylowy jest niebezpieczny w przypadku połknięcia i szkodliwy dla skóry.</li>
	<li>Rozmrozić fazę wodną w temperaturze 37 °C i powtórzyć krok 4.3. Połączyć fazy eteru dietylowego zebrane w krokach 4.3-4.4 w jednej szklanej probówce.</li>
	<li>Wysuszyć próbkę za pomocą koncentratora próżniowego. Wysuszone próbki należy przechowywać w temperaturze -80°C do czasu analizy masy/spektrometrii.</li>
</ol>
8. Derywatyzacja próbki
UWAGA: Próbki skorzystałyby na derywatyzacji TMS do analizy określonych metabolitów (cholesterolu, kwasów tłuszczowych, aminokwasów).
<ol>
	<li>Zrównoważyć próbki w temperaturze pokojowej UWAGA: Niepełna równowaga może spowodować kondensację wody atmosferycznej na ściankach rur i próbkach. Woda ostro konkuruje o derywatyzację TMS.</li>
	<li>Rozpuścić próbki w 50 μl pirydyny i pochodną przez dodanie 25 μl N,O-bis(trimetylosililo(TMS)trifluoroacetamidu (BSTFA). Inkubować próbki przez 90 minut w temperaturze 60 °C. Odwirować próbki i natychmiast przystąpić do analizy GC-MS. UWAGA: Pirydyna jest łatwopalna, drażniąca i toksyczna. BSTFA jest łatwopalny, i drażniący. Pracuj pod wyciągiem i używaj rękawic ochronnych.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, Y., Liu, H., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamarck+rises+from+his+grave%3A+Parental+environment-induced+epigenetic+inheritance+in+model+organisms+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Lamarck rises from his grave: Parental environment-induced epigenetic inheritance in model organisms and humans.</a> Biol Rev. 92 (4), 2084-2111 (2017).</li>
<li>Champroux, A., Cocquet, J., Henry-Berger, J., Drevet, J. R., Kocer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+exploring+the+mammalian+sperm+epigenome%3A+Paternal+epigenetic+and+transgenerational+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A decade of exploring the mammalian sperm epigenome: Paternal epigenetic and transgenerational inheritance.</a> Front Cell Dev Biol. 6, 50(2018).</li>
<li>Horsthemke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+view+on+transgenerational+epigenetic+inheritance+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A critical view on transgenerational epigenetic inheritance in humans.</a> Nat Commun. 9 (1), 2973(2018).</li>
<li>Schagdarsurengin, U., Steger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+in+male+reproduction%3A+Effect+of+paternal+diet+on+sperm+quality+and+offspring+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Urol%22%5BJournal%5D)">Epigenetics in male reproduction: Effect of paternal diet on sperm quality and offspring health.</a> Nat Rev Urol. 13 (10), 584-595 (2016).</li>
<li>Skinner, R. C., Gigliotti, J. C., Ku, K. -M., Tou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+analysis+of+the+composition%2C+health+benefits%2C+and+safety+of+apple+pomace%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+Rev%22%5BJournal%5D)">A comprehensive analysis of the composition, health benefits, and safety of apple pomace.</a> Nutr Rev. 76 (12), 896-909 (2018).</li>
<li>King, S. E., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+transgenerational+inheritance+of+obesity+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Epigenetic transgenerational inheritance of obesity susceptibility.</a> Trends Endocrinol Metab. 31 (7), 478-494 (2020).</li>
<li>Martínez Duncker Rebolledo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+DNA+methylation+defects+in+a+new+mouse+model+of+the+5%2C10-methylenetetrahydrofolate+reductase+677C%26gt%3BT+variant+and+correction+with+moderate+dose+folic+acid+supplementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Sperm DNA methylation defects in a new mouse model of the 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase 677C&gt;T variant and correction with moderate dose folic acid supplementation.</a> Mol Hum Reprod. 30 (4), gaae008(2024).</li>
<li>Lismer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3+lysine+4+trimethylation+in+sperm+is+transmitted+to+the+embryo+and+associated+with+diet-induced+phenotypes+in+the+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Histone H3 lysine 4 trimethylation in sperm is transmitted to the embryo and associated with diet-induced phenotypes in the offspring.</a> Dev Cell. 56 (5), 671-686.e6 (2021).</li>
<li>Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodeling+and+epigenetic+features+of+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodeling and epigenetic features of germ cells.</a> Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).</li>
<li>Diaz-Castillo, C., Chamorro-Garcia, R., Shioda, T., Blumberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenerational+self-reconstruction+of+disrupted+chromatin+organization+after+exposure+to+an+environmental+stressor+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Transgenerational self-reconstruction of disrupted chromatin organization after exposure to an environmental stressor in mice.</a> Sci Rep. 9 (1), 13057(2019).</li>
<li>Gapp, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+sperm+RNAs+in+transgenerational+inheritance+of+the+effects+of+early+trauma+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Implication of sperm RNAs in transgenerational inheritance of the effects of early trauma in mice.</a> Nat Neurosci. 17 (5), 667-669 (2014).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+tsRNAs+contribute+to+intergenerational+inheritance+of+an+acquired+metabolic+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sperm tsRNAs contribute to intergenerational inheritance of an acquired metabolic disorder.</a> Science. 351 (6271), 397-400 (2016).</li>
<li>Liberman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((18S+rRNA+methyltransferases+DIMT1+and+BUD23+drive+intergenerational+hormesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">18S rRNA methyltransferases DIMT1 and BUD23 drive intergenerational hormesis.</a> Mol Cell. 83 (18), 3268-3282.e7 (2023).</li>
<li>Tomar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+inheritance+of+diet-induced+and+sperm-borne+mitochondrial+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic inheritance of diet-induced and sperm-borne mitochondrial RNAs.</a> Nature. 630 (8017), 720-727 (2024).</li>
<li>Pinhas-Hamiel, O., Zeitler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+spread+of+type+2+diabetes+mellitus+in+children+and+adolescents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr%22%5BJournal%5D)">The global spread of type 2 diabetes mellitus in children and adolescents.</a> J Pediatr. 146 (5), 693-700 (2005).</li>
<li>Galan, C., Krykbaeva, M., Rando, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+life+lessons%3A+The+lasting+effects+of+germline+epigenetic+information+on+organismal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">Early life lessons: The lasting effects of germline epigenetic information on organismal development.</a> Mol Metab. 38, 100924(2020).</li>
<li>Rando, O. J., Simmons, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I%27m+eating+for+two%3A+Parental+dietary+effects+on+offspring+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">I'm eating for two: Parental dietary effects on offspring metabolism.</a> Cell. 161 (1), 93-105 (2015).</li>
<li>Perez, M. F., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intergenerational+and+transgenerational+epigenetic+inheritance+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intergenerational and transgenerational epigenetic inheritance in animals.</a> Nat Cell Biol. 21 (2), 143-151 (2019).</li>
<li>Carone, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paternally+induced+transgenerational+environmental+reprogramming+of+metabolic+gene+expression+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Paternally induced transgenerational environmental reprogramming of metabolic gene expression in mammals.</a> Cell. 143 (7), 1084-1096 (2010).</li>
<li>Pastore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-conceptional+paternal+diet+impacts+on+offspring+testosterone+homoeostasis+via+epigenetic+modulation+of+cyp19a1%2Faromatase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Metab+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Pre-conceptional paternal diet impacts on offspring testosterone homoeostasis via epigenetic modulation of cyp19a1/aromatase activity.</a> NPJ Metab Health Dis. 2 (1), 8(2024).</li>
<li>Fullston, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paternal+obesity+initiates+metabolic+disturbances+in+two+generations+of+mice+with+incomplete+penetrance+to+the+F2+generation+and+alters+the+transcriptional+profile+of+testis+and+sperm+microRNA+content%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Paternal obesity initiates metabolic disturbances in two generations of mice with incomplete penetrance to the F2 generation and alters the transcriptional profile of testis and sperm microRNA content.</a> FASEB J. 27 (10), 4226-4243 (2013).</li>
<li>Lumey, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohort+profile%3A+The+Dutch+Hunger+Winter+Families+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Cohort profile: The Dutch Hunger Winter Families Study.</a> Int J Epidemiol. 36 (6), 1196-1204 (2007).</li>
<li>Pembrey, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-specific%2C+male-line+transgenerational+responses+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Sex-specific, male-line transgenerational responses in humans.</a> Eur J Hum Genet. 14 (2), 159-166 (2006).</li>
<li>Comas-Armangue, G., Makharadze, L., Gomez-Velazquez, M., Teperino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+legacy+of+parental+obesity%3A+Mechanisms+of+non-genetic+transmission+and+reversibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">The legacy of parental obesity: Mechanisms of non-genetic transmission and reversibility.</a> Biomedicines. 10 (10), 2461(2022).</li>
<li>Shea, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+epigenetic+variation%2C+but+not+diet%2C+shape+the+sperm+methylome%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic and epigenetic variation, but not diet, shape the sperm methylome.</a> Dev Cell. 35 (6), 750-758 (2015).</li>
<li>Dupont, J., Bertoldo, M. J., Rak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+sensors+in+female+and+male+reproduction+and+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Energy sensors in female and male reproduction and fertility.</a> Int J Endocrinol. 2018, 8285793(2018).</li>
<li>Guiton, R., Henry-Berger, J., Drevet, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunobiology+of+the+mammalian+epididymis%3A+The+black+box+is+now+open%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Clin+Androl%22%5BJournal%5D)">The immunobiology of the mammalian epididymis: The black box is now open.</a> Basic Clin Androl. 23 (1), 8(2013).</li>
<li>Jarvis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+diet+causes+distinct+aberrations+in+the+testicular+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes%22%5BJournal%5D)">High fat diet causes distinct aberrations in the testicular proteome.</a> Int J Obes. 44 (9), 1958-1969 (2020).</li>
<li>Liu, L. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+signaling+in+human+sperm+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor gamma signaling in human sperm physiology.</a> Asian J Androl. 17 (6), 942(2015).</li>
<li>Masaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-chain+fatty+acid+triglyceride+metabolism+disorder+impairs+male+fertility%3A+A+study+using+adipose+triglyceride+lipase+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Long-chain fatty acid triglyceride metabolism disorder impairs male fertility: A study using adipose triglyceride lipase deficient mice.</a> Mol Hum Reprod. 23 (7), 452-460 (2017).</li>
<li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics+profiles+of+human+spermatozoa%3A+Insights+into+capacitation+and+acrosome+reaction+using+UPLC-MS-based+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Lipidomics profiles of human spermatozoa: Insights into capacitation and acrosome reaction using UPLC-MS-based approach.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1273878(2023).</li>
<li>Collodel, G., Castellini, C., Lee, J. C. -Y., Signorini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+fatty+acids+to+sperm+maturation+and+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid+Med+Cell+Longev%22%5BJournal%5D)">Relevance of fatty acids to sperm maturation and quality.</a> Oxid Med Cell Longev. 2020, 7038124(2020).</li>
<li>Watkins, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paternal+diet+programs+offspring+health+through+sperm-+and+seminal+plasma-specific+pathways+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Paternal diet programs offspring health through sperm- and seminal plasma-specific pathways in mice.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 115 (40), 10064-10069 (2018).</li>
<li>Darbandi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress-induced+alterations+in+seminal+plasma+antioxidants%3A+Is+there+any+association+with+keap1+gene+methylation+in+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress-induced alterations in seminal plasma antioxidants: Is there any association with keap1 gene methylation in human spermatozoa.</a> Andrologia. 51 (1), e13159(2019).</li>
<li>Deneke, V. E., Pauli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fertilization+enigma%3A+How+sperm+and+egg+fuse%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The fertilization enigma: How sperm and egg fuse.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 37 (1), 391-414 (2021).</li>
<li>Cobellis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gradient+of+2-arachidonoylglycerol+regulates+mouse+epididymal+sperm+cell+start-up%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">A gradient of 2-arachidonoylglycerol regulates mouse epididymal sperm cell start-up.</a> Biol Reprod. 82 (2), 451-458 (2010).</li>
<li>Kawano, N., Yoshida, K., Miyado, K., Yoshida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts%3A+Keys+to+sperm+maturation%2C+fertilization%2C+and+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipids%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts: Keys to sperm maturation, fertilization, and early embryogenesis.</a> J Lipids. 2011, 264706(2011).</li>
<li>Rubinstein, E., Ziyyat, A., Wolf, J., Lenaour, F., Boucheix, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+players+of+sperm-egg+fusion+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The molecular players of sperm-egg fusion in mammals.</a> Semin Cell Dev Biol. 17 (2), 254-263 (2006).</li>
<li>Satouh, Y., Inoue, N., Ikawa, M., Okabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+moment+of+mouse+sperm-egg+fusion+and+dynamic+localization+of+IZUMO1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Visualization of the moment of mouse sperm-egg fusion and dynamic localization of IZUMO1.</a> J Cell Sci. 125 (pt 3), 498-506 (2012).</li>
<li>Kim, J., Seo, S., Kim, T. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+deuterium+oxide+%28D2O%29+labeling+in+quantitative+omics+studies%3A+A+tutorial+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Metabolic deuterium oxide (D2O) labeling in quantitative omics studies: A tutorial review.</a> Anal Chim Acta. 1242, 340722(2023).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+high+glucose+intake+accelerates+type+1+diabetes+in+NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Sustained high glucose intake accelerates type 1 diabetes in NOD mice.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1037822(2022).</li>
<li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> PLoS One. 7 (4), e35538(2012).</li>
<li>Katz, J. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKatz%2C+JJ+%22Chemical+and+biological+studies+with+deuterium%22">Chemical and biological studies with deuterium</a>. , Sigma Xi, The Scientific Research Honor Society. (2024).</li>
<li>Oakberg, E. F., Hughes, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deuterium+oxide+effect+on+spermatogenesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Deuterium oxide effect on spermatogenesis in the mouse.</a> Exp Cell Res. 50 (2), 306-314 (1968).</li>
<li>Sumiyoshi, M., Sakanaka, M., Kimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+intake+of+high-fat+and+high-sucrose+diets+differentially+affects+glucose+intolerance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Chronic intake of high-fat and high-sucrose diets differentially affects glucose intolerance in mice.</a> J Nutr. 136 (3), 582-587 (2006).</li>
<li>Aragno, M., Mastrocola, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+sugars+and+endogenous+formation+of+advanced+glycation+endproducts%3A+Emerging+mechanisms+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Dietary sugars and endogenous formation of advanced glycation endproducts: Emerging mechanisms of disease.</a> Nutrients. 9 (4), 385(2017).</li>
<li>Wilkinson, D. J., Brook, M. S., Smith, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+stable+isotope+research-with+special+reference+to+protein+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Nutr+Open+Sci%22%5BJournal%5D)">Principles of stable isotope research-with special reference to protein metabolism.</a> Clin Nutr Open Sci. 36, 111-125 (2021).</li>
<li>Wilkinson, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+validation+of+the+application+of+D2O+stable+isotope+tracer+techniques+for+monitoring+day-to-day+changes+in+muscle+protein+subfraction+synthesis+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">A validation of the application of D2O stable isotope tracer techniques for monitoring day-to-day changes in muscle protein subfraction synthesis in humans.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 306 (5), E571-E579 (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Opisany protokół umożliwia identyfikację metabolitów przenoszonych z plemników do oocytów podczas zapłodnienia za pomocą znakowania stabilnymi izotopami samców myszy za pomocą 2H2Olub U13C Glukozy, a następnie analizy metabolomicznej. Izotopowo znakowane metabolity znajdujące się w morulach są pochodzenia ojcowskiego.
Chociaż wodór i deuter są izotopami, nie są całkowicie identyczne pod względem zachowania chemicznego. Temperatury topnienia i wrzenia 2</su...

Epigenom ojcowski wpływa na podatność potomstwa na dysmetabolizm W przeciwieństwie do mnóstwa ról przed i po poczęciu wykorzystywanych przez matki podczas rozwoju zarodka, od dziesięcioleci uważa się, że wkład plemników jest wyłącznie genetyczny. Zgodnie z teorią dziedziczenia genetycznego ojcowski wkład w zmienność fenotypową osobnika (w tym jego podatność na choroby) musiał być przypisany wyłącznie sekwencji genetycznej wariantów alleli dziedziczonych po ojcu i ich interakcjom z wariantami odziedziczonymi pomatce1. W dzisiejszych czasach jasne jest, że allele nie są jedynymi wiadomościami genetycznymi przekazywanymi przez ojca swojemu potomstwu podczas zapłodnienia, a zamiast tego wiele sygnałów epigenetycznych przyczynia się do dziedziczenia ojcowskiego 2,3,4. Dotychczas zidentyfikowane sygnały epigenetyczne obejmują: (1) grupy metylowe kowalencyjnie dodawane do cytozyn genomu rodzicielskiego 5,6,7, (2) modyfikacje potranslacyjne (acetylacja, metylacja) histonów związanych z chromosomami plemników i dostarczanych do oocytów8, (3) organizację 3D chromosomów ojcowskich prowadzącą do interakcji wewnątrzchromosomalnej (znaną również jako domeny asocjacyjne topologicznie, TAD) utrzymujące się w zygocie9,10 i (4) regulatorowe cząsteczki RNA (miRNA, fragmenty pochodzące z tRNA i RNA oddziałujące z piwi)11,12, a także rRNA13 i tRNA14 uwalniane z plemników do oocytu podczas zapłodnienia.
Epigenom ojcowski jest ważnym nośnikiem informacji dla potomstwa. Informacje ojcowskie będą miały wpływ na zygotę, zarodek podczas jego rozwoju, a po urodzeniu na skłonność potomstwa do dysmetabolizmu i chorób. To niemendlowskie dziedziczenie (określane jako międzypokoleniowe lub międzypokoleniowe w zależności od tego, czy dotyczy jednego, czy wielu kolejnych pokoleń) jest uważane przez wielu autorów za jeden z ukrytych czynników odpowiedzialnych za drastyczny wzrost chorób dysmetabolicznych występujących w rozwiniętychkrajach zachodnich. Rzeczywiście, zgodnie z teoriami PoHaD (Ojcowskie Pochodzenie Zdrowia i Choroby) i DoHaD (Rozwojowe Pochodzenie Zdrowia i Choroby), rodzicielski wkład epigenetyczny jest jednym z czynników predysponujących potomstwo do rozwoju cukrzycy, otyłości i chorób sercowo-naczyniowych w wieku dorosłym16,17. Co ciekawe, epigenom rodzicielski jest wyjątkowo podatny na bodźce środowiskowe i mogą na niego wpływać warunki metaboliczne (takie jak zażywanie narkotyków, nawyki żywieniowe i sprawność metaboliczna)18, a także parametry ściśle środowiskowe (takie jak narażenie na zanieczyszczenia, relacje społeczne oraz stres psychiczny i relacyjny)5,11. Każdy z wyżej wymienionych bodźców może więc zmieniać epigenomy komórek rozrodczych (plemników i oocytów) i wpływać na przyszłe pokolenia.
Konsumpcja diety wysokotłuszczowej (HFD) stanowi jeden z najszerzej badanych bodźców środowiskowych, który może zmieniać epigenom ojca i prowadzić do szkodliwych wiadomości dostarczanychpotomstwu. Bodziec ten wpływa na fenotyp potomstwa (do trzeciego pokolenia), które często wykazuje większą skłonność do rozwoju dysmetabolizmu, niezależnie od spożycia kalorii. Potomstwo ojca spożywającego HFD wykazuje opóźnienie wzrostu, nietolerancję glukozy i insulinooporność zarówno u myszy, jak i szczurów20,21. U ludzi dziedziczenie epigenetyczne badano przede wszystkim w pokoleniach urodzonych w okresach głodu lub przekarmienia i bezpośrednio po nich22. W kohorcie Överkalix dostępność pożywienia dziadków ze strony ojca w okresie ich powolnego wzrostu była skorelowana z ogólnym ryzykiem śmiertelności, chorobami sercowo-naczyniowymi, BMI, obwodem talii i masą tłuszczową ich wnuków23. Ostatnio dowody na ojcowską transmisję międzypokoleniową zostały potwierdzone w innych kohortach24.
Metabolity ojcowskie biorące udział w dziedziczeniu międzypokoleniowym Pomimo dowodów klinicznych i epidemiologicznych, szczegóły molekularne dziedziczenia międzypokoleniowego przez ojca pozostają niejasne. Na początku identyfikacja wszystkich molekularnych przetworników informacji epigenetycznej nie została jeszcze zakończona. Dowody naukowe sugerują, że składnik nukleinowy plemników sam w sobie nie może wyjaśnić złożoności dziedziczenia międzypokoleniowego. Różnice w metylacji DNA zostały rzeczywiście zmierzone w plemnikach myszy i szczurów karmionych HFD, ale u tak niskiego odsetka populacji plemników, że nie może to tłumaczyć wysokiej penetracji fenotypu dysmetabolicznego obserwowaneju potomstwa. Z drugiej strony, pula sygnalizacyjnych RNA przenoszonych z plemników do oocytów ma bardzo krótki okres półtrwania i, chociaż może wpływać na ekspresję genu zygotycznego, wydaje się mało prawdopodobne, aby utrzymała się w efektywnych stężeniach po zapłodnieniu, w zygocie w zarodkach dnia 2, dnia 3, w morulach i blastocystach. Wydaje się więc oczywiste, że w mechanizm dziedziczenia międzypokoleniowego muszą być zaangażowane nowe determinanty molekularne.
Wraz z kwasami nukleinowymi plemniki wnoszą również składniki metabolomiczne do zygoty, takie jak lipidy, węglowodany i aminokwasy 26,27,28,29. Metabolity te, szczególnie te obdarzone aktywnością modulacyjną, mogą wpływać na ekspresję genów zygotycznych i rozwój embrionalny, a tym samym mogą działać jako sygnały epigenetyczne30. Ponadto, podobnie jak w przypadku kwasów nukleinowych, na stężenie i względną obfitość tych metabolitów w plemnikach mogą wpływać warunki środowiskowe doświadczane przez ojca, a tym samym stanowić nośniki informacji dla potomstwa 28,30,31,32,33,34. Rzeczywiście, wykazano, że metabolom dojrzałych plemników zależy od stanu zdrowia ojca i zależy od czynników środowiskowych, takich jak dieta, ćwiczenia fizyczne, substancje toksyczne i substancje zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego.
Zrozumienie roli metabolitów plemników w rozwoju embrionalnym jest skomplikowane z powodu kilku ograniczeń technicznych: (1) różnica wielkości między plemnikiem a oocytem, która skutkuje minimalnym udziałem masy metabolicznej plemników dla zygoty, oraz (2) kilka zmian metabolomicznych, którym ulega plemnik podczas etapów produkcji (spermatogeneza), dojrzewania najądrza, wytrysk i fuzja z oocytem.
Wahania metabolomu plemników podczas dojrzewania plemników U ssaków plemniki są wytwarzane w jądrach w wyniku spermatogenezy, procesu zależnego od spermatogoniów komórek macierzystych, w którym zaangażowane plemniki przekształcają się w pierwotne spermatocyty, które wchodzą w mejozę i wytwarzają okrągłe haploidalne plemniki. Morfogeneza tych komórek do plemników zachodzi poprzez spermiogenezę, masywną morfofunkcjonalną przebudowę spermatydów, od komórek okrągłych do wydłużonych/zagęszczonych/wysoce wyspecjalizowanych komórek, odpowiadających ostatniej fazie spermatogenezy. Jednak powstałe plemniki są nieruchome i nie są jeszcze zdolne do zapłodnienia35. Po nasieniu, gdy plemniki są uwalniane z jądra rete do najądrza, plemniki oddziałują z komórkami nabłonka najądrza i angażują się w białka i pęcherzyki egzosomalne wydzielane przez te komórki (najądrza, bogate w sfingomielinę i kwas arachidonowy). Przejście przez najądrza umożliwia plemnikom osiągnięcie pełnej dojrzałości i, nawet jeśli są utrzymywane w stanie precapacitowanym, nabywają zdolność do ruchliwości36. Podczas pasażu najądrza błona plemnika staje się bardziej ujemnie naładowana i wzbogacona w sfingomielinę. Błona plemnika staje się również bardziej płynna z powodu postępującego obniżenia poziomu cholesterolu i jednoczesnego wzrostu wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (głównie kwasów arachidonowego, dokozapentaenowego i dokozaheksaenowego). Po wytrysku, w żeńskich drogach rodnych, białka płynu nasiennego i albuminy sprzyjają kapacytacji plemników, promując hiperpolaryzację i napływ wapnia w celu aktywacji ruchliwości plemników. Błona plazmatyczna zpojemnościonych plemników wykazuje dodatkowo zwiększoną płynność, niski stosunek cholesterolu do fosfolipidów oraz obniżoną zawartość kwasu sjalowego, gangliozydu GM1 i trójglicerydów31,37.
Przed spotkaniem z oocytem plemnik przechodzi reakcję akrosomową, fuzję akrosomu (błoniastych organelli pochodzących od Golgiego, która pokrywa przednią część jądra plemnika i powstaje podczas spermiogenozy) z błoną plazmatyczną plemnika, która ułatwia reorganizację błony plazmatycznej plemnika i zdolność do przenikania przez osłonkę przejrzystą (ZP), matrycę glikoprotein otaczającą oocyt35, Lokal mieszkalny 38. Ostatnim etapem jest hemifuzja między plemnikiem a błoną oocytów, promowana przez białka plemników IZUMO1, SPACA6 i TMEM9539, powoduje włączenie lipidów plemników do błon oocytów i przeniesienie zawartości nukleinowej i metabolicznej do oocytu.
Uzasadnienie zabiegu Celem tej procedury jest identyfikacja metabolitów transportowanych przez plemniki i przekazywanych do komórki jajowej w momencie zapłodnienia (ryc. 1). Aby odróżnić metabolity pochodzące z plemników i oocytów w zygocie, plemniki znakuje się deuterem (2H, izotop wodoru) lub 13C (izotop węgla) przy użyciu znakowania metabolicznego in vivo tlenkiem deuteru, 2H2O40 lub jednolicie znakowanym U13C Glukoza41. Samce myszy znakowane izotopami są następnie kojarzone z nieznakowanymi samicami, aby ostatecznie zebrać zygoty, morule i blastocysty. Zarodki we wczesnym stadium rozwoju są przetwarzane w celu ekstrakcji (1) metabolitów polarnych, (2) metabolitów niepolarnych i (3) steroli. Metabolomy są następnie analizowane przy użyciu technik spektrometrii mas. Metabolity znakowane izotopowo (ojcowskie) zostaną zidentyfikowane i odróżnione od metabolitów nieznakowanych (matczynych), jednoznacznie wykazując ich ojcowskie pochodzenie.

<table><tbody><tr><td>Filtr 2H2O, 99,8 atomu % 2H</td><td>Sigma Aldrich</td><td>756822</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Agilent&nbsp; SIL-8</td><td>Agilent (Santa Clara, Kalifornia, Stany Zjednoczone)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C16-Ceramid-13C3-15N</td><td>Norma LGC</td><td>TRC-C342770-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometanu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34856</td><td></td></tr><tr><td>Eter dietylowy&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>673811</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1,11,727</td><td></td></tr><tr><td>HCG (ludzka gonadotropina kosmówkowa,</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CG5-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek L-lizyny-&epsilon;-15N</td><td>Sigma Aldrich</td><td>608971</td><td></td></tr><tr><td>Mężczyzna i kobieta&nbsp; Myszy C57BL/6JOlaHsd</td><td>Inotiv&nbsp;</td><td>C57BL/6JOlaHsd</td><td></td></tr><tr><td>eter metylowo-tert-butylowy (MTBE)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>306975</td><td></td></tr><tr><td>MetOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1,06,035</td><td></td></tr><tr><td>N,O-bis(trimetylosililo(TMS) trifluoroacetamid (BSTFA)</td><td>Supelco powiedział:</td><td>15238</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Aplikacja</td><td>A0965-9010</td><td></td></tr><tr><td>PMSG (Klacz w ciąży) surowica)</td><td>Lee Biosolutions</td><td>493-10</td><td></td></tr><tr><td>Pirydyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360570</td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu GCMS 2010plus&nbsp;</td><td>Shimadzu powiedział:</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sitostanol-5,6,22,23-d4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>680028</td><td></td></tr><tr><td>trifluoroctan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1615138</td><td></td></tr><tr><td>SolariX XR 7T&nbsp;</td><td>Daltoniki Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TimsTOF Pro Q-TOF&nbsp;</td><td>Daltoniki Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U13C glukoza&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny RS3000 UHPLC&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolumna wstępna VanGuard CSHTM (5,0 &razy; 2,1 mm; 1,7 &mu; m, 130 & Aring ;)</td><td>Wody</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

znakowanie in vivo stabilnych izotopów do identyfikacji spektrometrii mas ojcowskich metabolitów przenoszonych z plemnika do oocytu podczas zapłodnienia

Stable Isotope In-Vivo Labeling for Mass-Spectrometry Identification of Paternal Metabolites Transferred from Sperm to Oocyte During Fertilization

Wkład ojców w genetykę zarodków był do tej pory ograniczony do sekwencji alleli przez dziesięciolecia. Dekada wyników sugeruje natomiast, że czynniki epigenetyczne – metylacja DNA, modyfikacje histonów, organizacja chromosomów i regulatorowe RNA – odgrywają kluczową rolę w dziedziczeniu ojcowskim i wpływają na rozwój embrionalny i ekspresję genów zygoty. Wraz z kwasami nukleinowymi metabolom plemników (lipidy, węglowodany, wolne aminokwasy) może działać jako sygnał epigenetyczny. Protokół ten ma na celu identyfikację metabolitów przenoszonych z plemnika do oocytu za pomocą spektrometrii mas. Procedura obejmuje znakowanie plemników stabilnymi izotopami za pomocą 2H2Olub U13C Glukozy w celu prześledzenia, za pomocą metabolomiki, ojcowskich metabolitów przenoszonych do oocytu podczas zapłodnienia. Ogólnym celem protokołu jest ujawnienie roli ojcowskiego metabolomu plemników w podatności potomstwa na dysmetabolizm i może on zostać dostosowany do uzyskania wglądu w to, w jaki sposób warunki środowiskowe, takie jak dieta i narażenie na zanieczyszczenia, zmieniają ojcowskie komunikaty metaboliczne, potencjalnie wpływając na zdrowie potomstwa i predyspozycje do cukrzycy, otyłości, i choroby układu krążenia.

W celu monitorowania transferu metabolitów z plemnika do oocyty, morule wyizolowane od samic C57 BL/6J kopulowanych z samcami z grup ZNACZNIKOWANEJ (LABELED) i NIEZNACZNIKOWANEJ (UNLABELED) są zbierane i analizowane za pomocą metabolomiki opartej na spektrometrii mas. Metabolity wyekstrahowano zgodnie z opisem w krokach 6-7 i poddano derywatyzacji TMS zgodnie z opisem w kroku 8. Wykonano profilowanie metabolomiczne i lipidomiczne znacznikowych morul, nieznacznikowych morul, nieznacznikowych oocytów oraz znacznikowych i n...

Procedura ta ma na celu identyfikację metabolitów przenoszonych z plemników do oocytów podczas zapłodnienia za pomocą znakowania stabilnymi izotopami za pomocą 2H2O lub U13C Glukozy, a następnie analizy metabolomicznej. Buhaje znakowane deuterem są kojarzone z matkami nieoznakowanymi. Pobrane zarodki przedimplantacyjne są analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu oddzielenia metabolitów ojcowskich (deuterowanych) od matczynych (niedeuterowanych).

Znakowanie in vivo stabilnych izotopów do identyfikacji spektrometrii mas ojcowskich metabolitów przenoszonych z plemnika do oocytu podczas zapłodnienia

Paternal contribution to embryo genetics has so far been limited to allelic sequences for decades. A decade of results suggests, instead, that epigenetic ...

Nasze badania mają na celu zidentyfikowanie ojcowskich metabolitów przenoszonych do zygoty podczas zapłodnienia, odkrywając ojcowską rolę we wczesnym rozwoju i dziedziczeniu epigenetycznym wykraczającym poza sekwencje alleliczne DNA. Ojcowski wkład w genetykę zarodków był do tej pory przypisywany jedynie sekwencjom allelicznego DNA. Teraz wiemy, że czynniki epigenetyczne, metylacja DNA, modyfikacje histonów i regulatorowe RNA odgrywają kluczową rolę w dziedziczeniu ojcowskim i wpływają na rozwój embrionalny. Obecnie w dziedzinie dziedziczenia międzypokoleniowego wykorzystuje się epigenetyczną platformę analityczną, taką jak NGS, do identyfikacji statusu metylacji chromosomów ojcowskich oraz mikroRNA i fragmentów sygnujących RNA. Wyzwania polegają głównie na próbie opracowania oprzyrządowania zdolnego do zbierania informacji w rozdzielczości pojedynczej komórki rozrodczej i pojedynczej zygoty, zwłaszcza do analizy metabolomicznej i lipidomicznej. Przyszłe prace będą dotyczyły funkcjonalnych ról zidentyfikowanych metabolitów, oceniając ich role fizjologiczne poprzez hamowanie ich sygnalizacji podczas zapłodnienia. Stosując specyficzne inhibitory szlaków wewnątrzkomórkowych, stymulują one zarodki.[Instruktor] Aby wyekstrahować metabolity lipidowe i polarne, należy uzyskać próbki oocytów i plemników myszy. Zrównoważ je na lodzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Do każdej próbki dodać 225 mikrolitrów lodowatego metanolu. Następnie umieść próbki w zamrażarce ustawionej na minus 30 stopni Celsjusza na jedną minutę. Przenieść próbki do łaźni sonicznej i inkubować przez 10 minut. Następnie odpipetuj 750 mikrolitrów lodowatego MTBE do próbek. Inkubować próbki w mieszalniku termicznym przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy 550 obr./min. Odwirować próbki z prędkością 13 000 obr./min przez 10 minut. Następnie dodaj 188 mikrolitrów wody do każdej probówki. Oddzielić górną fazę zawierającą lipidy od dolnej fazy zawierającej metabolity polarne. Całkowicie wysuszyć obie fazy w koncentratorze próżniowym. Wysuszone próbki należy przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza. Aby usunąć sterylne substancje, umieść próbki oocytów i plemników na lodzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zawiesić każdą próbkę w 500 mikrolitrach 70% roztworu metanolu i wody. Następnie przenieść zawiesinę do oznakowanej szklanej probówki. Wirować próbki przez 30 sekund w celu homogenizacji. Pozostawić homogenat do odpoczynku w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 16 godzin. Teraz odwirować homogenizowane próbki o sile 3,220 G przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść supernatant do nowych szklanych probówek. Odpipetować 500 mikrolitrów PBS do probówek. Teraz dodaj siedem mililitrów lodowatego eteru dietylowego do każdej probówki. Wirować zawiesinę przez jedną minutę. Zanurz szklaną rurkę w kąpieli suchego lodu i acetonu, aby zamrozić fazę wodną. Po pozostawieniu próbki na dwie minuty, aby umożliwić separację faz, przenieś niezamrożoną fazę eteru dietylowego do nowej probówki. Powtórzyć proces ekstrakcji, dodając eter dietylowy i izolując górną fazę jak poprzednio. Połącz wszystkie zebrane warstwy eteru dietylowego w jednej szklanej probówce. Wysuszyć końcowy połączony ekstrakt za pomocą koncentratora próżniowego. Wysuszone sterylne próbki należy przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza. Doprowadź wysuszone próbki do temperatury pokojowej w celu zrównoważenia. Dodaj 50 mikrolitrów pirydyny, aby rozpuścić próbki. Dodaj 25 mikrolitrów BSTFA do probówek w celu derywatyzacji. Inkubować próbki przez 90 minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza przed dalszą analizą. Cholesterol znakowany deuterem pochodzący z plemników wykryto w znakowanych morulach, potwierdzając ojcowski transfer cholesterolu podczas zapłodnienia. Analiza głównych składników ujawniła wyraźne grupowanie znakowanych moruli od nieznakowanych moruli, nieznakowanych oocytów i znakowanych plemników, co wskazuje na unikalne profile metaboliczne po zapłodnieniu. Analiza mapy cieplnej 50 kluczowych metabolitów wykazała, że znakowane morule miały wyraźną sygnaturę metaboliczną w porównaniu z innymi grupami próbek.

stable-isotope-vivo-labeling-for-mass-spectrometry-identification

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oceniono sygnały [Ca2+]i wywołane bodźcem w pojedynczych ludzkich plemnikach. Ruchome komórki obciążono fluorescencyjnym barwnikiem wrażliwym na Ca2+ (metodą estru AM) i unieruchomiono w komorze przepływowej. Obrazowanie komórek przeprowadzono za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej, a stymulację wykonano poprzez medium perfuzyjne. Odpowiedzi pojedynczych komórek (lub obszarów) przeanalizowano offline przy użyciu programu Excel.

Techniki obrazowania sygnalizacji Ca2+ w ludzkich plemnikach

Opisano profilowanie stabilnych izotopów za pomocą analizy chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas w celu badania przepływu metabolitów pośrednich u nicienia Caenorhabditis elegans. Szczegółowo przedstawiono metody oceny wzbogacenia izotopowego w dwutlenku węgla, kwasach organicznych i aminokwasach po ekspozycji na izotopy, zarówno podczas rozwoju na płytkach agarowych, jak i w okresie dorosłości w hodowli ciekłej.

Stabilne profilowanie izotopowe strumieni metabolicznych produktów pośrednich u Caenorhabditis elegans w stadium rozwojowym i dorosłym

Ten protokół pokaże ekstrakcję i analizę wolnych i estryfikowanych bioaktywnych kwasów tłuszczowych z komórek. Kwasy tłuszczowe są dokładnie oznaczane ilościowo za pomocą rozcieńczania stabilnych izotopów, chiralnej chromatografii cieczowej, wychwytywania elektronów, atmosferycznej jonizacji chemicznej, wielokrotnego monitorowania spektrometrii mas (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Ekstrakcja lipidów komórkowych do ukierunkowanego rozcieńczania stabilnych izotopów Chromatografia cieczowa - analiza spektrometrii mas

Mutageneza z użyciem pirosiarczynu jest złotym standardem analizy metylacji DNA. Nasz zmodyfikowany protokół umożliwia analizę metylacji DNA na poziomie pojedynczych komórek i został zaprojektowany specjalnie dla poszczególnych oocytów. Może być on również stosowany w przypadku embrionów w stadium przedziałowym.

Mutageneza z użyciem pirosiarczynu w pojedynczych oocytach

Analiza proteomiczna dowolnego typu komórek jest wysoce zależna zarówno od czystości, jak i wstępnego frakcjonowania materiału wyjściowego w celu de-kompleksizacji próbki przed chromatografią cieczową metodą spektrometrii mas (MS). Stosując techniki płukania wstecznego, można uzyskać czyste plemniki od gryzoni. Po trawieniu fosfopeptydy można wzbogacić za pomocą TiO2.

Analiza fosfopeptydowa plemników najądrzy gryzoni

Opisujemy kroki, które umożliwiają szybkie pobieranie próbek in situ małej części pojedynczej komórki z dużą precyzją i minimalną inwazją, przy użyciu mikropróbkowania opartego na kapilarach, aby ułatwić chemiczną charakterystykę migawki aktywności metabolicznej w żywych zarodkach przy użyciu specjalnie zbudowanej platformy do elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas z pojedynczą komórką.

Elektroforeza kapilarna z mikrosondą Spektrometria mas do metabolomiki pojedynczych komórek w żywych zarodkach żab (Xenopus laevis)

Podejście markerów troficznych kwasów tłuszczowych, tj. asymilacja kwasów tłuszczowych jako całej cząsteczki i transfer do tkanki konsumenckiej bez lub z niewielkimi modyfikacjami, jest utrudnione przez luki w wiedzy na temat metabolizmu kwasów tłuszczowych u małych bezkręgowców glebowych. Profilowanie izotopologiczne jest cennym narzędziem do rozplątywania oddziaływań troficznych.

Profilowanie izotopologu kwasów tłuszczowych 13C zapewnia wgląd w troficzny transfer węgla i metabolizm lipidów u konsumentów bezkręgowców

Tutaj opisujemy opartą na spektrometrii mas proteomiczną charakterystykę linii komórkowych ze znanymi losami tkanek u zarodka kręgowca Xenopus laevis.

Proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby)

Przedstawiona tutaj jest metoda badania struktur lipidowych poprzez znakowanie stabilnych izotopów przy użyciu czasu ich retencji, mobilności i fragmentacji.

Śledzenie lipidów de novo przy użyciu znakowania stabilnych izotopów LC-TIMS-TOF MS/MS

Niniejszy film prezentuje przygotowanie ultrascienistej warstwy matrycy/analitu do analizy peptydów i białek za pomocą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-MS).

Przygotowanie próbek do analizy MALDI: metoda ultracienkiej warstwy

Poznaj metodę znakowania stabilnymi izotopami do identyfikacji ojcowskich metabolitów przenoszonych do oocytu podczas zapłodnienia u myszy. Technika ta umożliwia badanie roli metabolitów w rozwoju zarodka.

Znakowanie in vivo stabilnych izotopów do identyfikacji spektrometrii mas ojcowskich metabolitów przenoszonych z plemnika do oocytu podczas zapłodnienia (Wideo) | JoVE Journal

Znakowanie in vivo stabilnych izotopów do identyfikacji spektrometrii mas ojcowskich metabolitów przenoszonych z plemnika do oocytu podczas zapłodnienia

Przeglądaj więcej filmów