Name: Kompleksowa analiza odpowiedzi na lek przy użyciu testu FLICK (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Poznaj metodę FLICK do kompleksowej analizy odpowiedzi komórek nowotworowych na leki. Technika ta umożliwia precyzyjne obliczanie wskaźników wzrostu i śmierci komórek, dostarczając szczegółowych danych o mechanizmach działania leków przeciwnowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim byłym i obecnym członkom Lee Lab za ich wkład w perspektywę naszego laboratorium w zakresie oceny reakcji na leki. Prace te były wspierane przez fundusze z National Institutes of Health dla MJL (R21CA294000 i R35GM152194).

<ol><li>Hafner, M., Niepel, M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+drug+sensitivity+metrics+improve+preclinical+cancer+pharmacogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Alternative drug sensitivity metrics improve preclinical cancer pharmacogenomics.</a> Nat Biotechnol. 35 (6), 500-502 (2017).</li>
<li>Dixon, S. J., Lee, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+tips+for+interpreting+cell+death+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quick tips for interpreting cell death experiments.</a> Nat Cell Biol. 25 (12), 1720-1723 (2023).</li>
<li>Schwartz, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+GRADE%3A+An+Integrated+Analysis+of+Population+Growth+and+Cell+Death+Reveals+Drug-Specific+and+Cancer+Subtype-Specific+Response+Profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Drug GRADE: An Integrated Analysis of Population Growth and Cell Death Reveals Drug-Specific and Cancer Subtype-Specific Response Profiles.</a> Cell Rep. 31 (12), 107800(2020).</li>
<li>Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+rate+inhibition+metrics+correct+for+confounders+in+measuring+sensitivity+to+cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs.</a> Nat Methods. 13 (6), 1-11 (2016).</li>
<li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+cell+death+recommendations+of+the+Nomenclature+Committee+on+Cell+Death+2018%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018.</a> Cell Death Differ. 25 (3), 486-541 (2018).</li>
<li>Tsvetkov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+induces+cell+death+by+targeting+lipoylated+TCA+cycle+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins.</a> Science. 375 (6586), 1254-1261 (2022).</li>
<li>Holze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxeiptosis%2C+a+ROS-induced+caspase-independent+apoptosis-like+cell-death+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Oxeiptosis, a ROS-induced caspase-independent apoptosis-like cell-death pathway.</a> Nat Immunol. 19 (2), 130-140 (2018).</li>
<li>Maltese, W. A., Overmeyer, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methuosis+Nonapoptotic+Cell+Death+Associated+with+Vacuolization+of+Macropinosome+and+Endosome+Compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Methuosis Nonapoptotic Cell Death Associated with Vacuolization of Macropinosome and Endosome Compartments.</a> Am J Pathol. 184 (6), 1630-1642 (2014).</li>
<li>Inde, Z., Forcina, G. C., Denton, K., Dixon, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Heterogeneity+of+Cancer+Cell+Fractional+Killing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Kinetic Heterogeneity of Cancer Cell Fractional Killing.</a> Cell Rep. 32 (1), 107845(2020).</li>
<li>Forcina, G. C., Conlon, M., Wells, A., Cao, J. Y., Dixon, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Quantification+of+Population+Cell+Death+Kinetics+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Systematic Quantification of Population Cell Death Kinetics in Mammalian Cells.</a> Cell Syst. 4 (6), 1-18 (2017).</li>
<li>Gelles, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+and+Population-Level+Analyses+Using+Real-Time+Kinetic+Labeling+Couples+Proliferation+and+Cell+Death+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell and Population-Level Analyses Using Real-Time Kinetic Labeling Couples Proliferation and Cell Death Mechanisms.</a> Dev Cell. 51 (2), 277-291.e4 (2019).</li>
<li>Richards, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+antagonism+and+single-agent+dominance+result+from+differences+in+death+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Drug antagonism and single-agent dominance result from differences in death kinetics.</a> Nat Chem Biol. 16 (7), 791-800 (2020).</li>
<li>Richards, R., Honeywell, M. E., Lee, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLICK%3A+an+optimized+plate+reader-based+assay+to+infer+cell+death+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">FLICK: an optimized plate reader-based assay to infer cell death kinetics.</a> STAR Protoc. 2 (1), 100327(2021).</li>
<li>Honeywell, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+screens+with+death+rate+analyses+reveal+mechanisms+of+drug+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional genomic screens with death rate analyses reveal mechanisms of drug action.</a> Nat Chem Biol. 20 (11), 1443-1452 (2024).</li>
<li>Jannoo, R., Xia, Z., Row, P. E., Kanamarlapudi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+the+Interleukin-13+Receptor+%28IL-13R%29%CE%B12+Expressing+Prostate+Cancer+by+a+Novel+Hybrid+Lytic+Peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Targeting of the Interleukin-13 Receptor (IL-13R)α2 Expressing Prostate Cancer by a Novel Hybrid Lytic Peptide.</a> Biomolecules. 13 (2), 356(2023).</li>
<li>Gelles, J. D., Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+not+add+some+SPARKL+to+your+life+%28and+death%29%21%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Oncol%22%5BJournal%5D)">Why not add some SPARKL to your life (and death)!</a> Mol Cell Oncol. 7 (1), 1685841(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Test FLICK jest solidną metodą generowania kompleksowej oceny wpływu leku na wzrost i śmierć populacji komórek. Ponieważ metoda ta nie zlicza bezpośrednio komórek, krytycznymi krokami w protokole są zapewnienie liniowości testu i całkowitej lizy podczas etapów przepuszczalności trytonu. Prawidłowy czas przenikania można określić wizualnie, jak podkreślono w niniejszym protokole, lub ilościowo, odczytując fluorescencję płytki w czasie i określając, kiedy sygnał się stabilizuje. Z naszego doświadczenia wynika jednak, że w ...

Dla leków przeciwnowotworowych, przedkliniczna ocena wrażliwości leków zazwyczaj obejmuje testowanie, jak leki wpływają na żywotność komórek w hodowli1. Żywotność komórek po ekspozycji na lek jest produktem co najmniej dwóch oddzielnych efektów: indukowanego lekiem hamowania proliferacji komórek i aktywacji śmierci komórki2. Niestety, mimo że śmierć komórki jest krytyczną cechą, która jest wymagana do trwałej odpowiedzi na lek, standardowe podejścia nie wyjaśniają stopnia, w jakim lek aktywuje śmierć komórki3.
Typowe testy odpowiedzi na leki obejmują te, które bezpośrednio liczą komórki (np. licznik Coultera, niektóre zastosowania cytometrii przepływowej lub mikroskopii), określają zdolność komórek do proliferacji (np. test tworzenia kolonii) lub określają ilościowo aktywność metaboliczną (np. testy CellTiter-Glo, MTT oparte na tetrazolium lub MTS). Wspólną cechą tych testów jest to, że generowane dane są proporcjonalne do liczby żywych komórek. Ponieważ leki różnią się znacznie pod względem sposobu koordynowania hamowania wzrostu i śmierci komórki, liczba żywych komórek po ekspozycji na lek dostarcza niewiarygodnego wglądu w poziom śmierci komórki wywołanej przez lek3. Ponadto, ponieważ komórki nowotworowe na ogół szybko namnażają się w hodowli komórkowej, liczba żywych komórek może być znacznie zmniejszona w stosunku do populacji nieleczonej bez wywoływania śmierci komórki4. Tak więc główną wadą jest to, że stopnia śmierci komórki nie można określić ilościowo bez zmierzenia zarówno liczby żywych, jak i martwych komórek.
Dokładne określenie liczby martwych komórek po ekspozycji na lek jest trudne z kilku powodów2. Po pierwsze, istnieje ponad tuzin regulowanych ścieżek śmierci komórki5,6,7,8. Chociaż na ogół istnieją markery biochemiczne do identyfikacji każdego typu regulowanej śmierci komórki, markery te różnią się swoją specyficznością i nie można użyć pojedynczego testu do jednoczesnego ilościowego określenia wszystkich podtypów śmierci. Po drugie, czas aktywacji dla każdej formy śmierci komórki może się znacznie różnić w zależności od kontekstu, więc pełny obraz nie może się wyłonić, jeśli śmierć nie zostanie określona ilościowo w czasie9,10. Wiele testów biochemicznych do ilościowego określania śmierci komórki daje pomiar punktu końcowego, więc generowanie danych kinetycznych może być trudne i ograniczone kosztami. Trzecią komplikacją jest to, że martwa komórka sama w sobie jest przejściowym stanem pośrednim między stanem żywej komórki a zdysocjowanymi szczątkami komórki. Stabilność martwych komórek różni się w zależności od podtypu śmierci, przy czym niektóre typy, takie jak apoptoza, tworzą stosunkowo stabilne zwłoki, podczas gdy inne rodzaje śmierci powodują szybką lizę. W związku z tym metody ilościowego określania śmierci, które wymagają zbierania i liczenia martwych komórek, również zapewnią tendencyjne zrozumienie śmierci komórki. Wreszcie czwartym ograniczeniem jest to, że testy biochemiczne, które określają ilościowo stopień śmierci komórki, zazwyczaj nie dostarczają żadnego wglądu w to, jak lek zmienia proliferację. W związku z tym nie można interpretować ogólnej wielkości populacji - i, co ważne, tego, czy populacja się powiększa, czy maleje.
Niektóre testy oparte na mikroskopii, takie jak STACK i SPARKL, są skuteczne w mierzeniu żywych i martwych komórek w czasie, a te testy mogą dostarczyć wyczerpujących informacji na temat śmierci komórek wywołanej przez leki10,11. Testy te wymagają jednak specjalistycznych instrumentów, takich jak mikroskop Incucyte, co stwarza ograniczenia w przepustowości i dostępie do tych metod. Ponadto techniki oparte na mikroskopii wymagają, aby martwe komórki pozostawały w płaszczyźnie ogniskowej mikroskopu przez cały czas trwania eksperymentu, co ogranicza zdolność do ilościowego określania martwych komórek, gdy tracą przyleganie do płytki lub z czasem, gdy martwe komórki ulegają rozpadowi. Podobnie, testy oparte na mikroskopii napotykają wyzwania, gdy są stosowane w kontekście hodowli zawiesinowych, ponieważ komórki dryfują do i z danej płaszczyzny ogniskowej.
Aby rozwiązać powyższe problemy, stworzyliśmy test o nazwie FLICK (Fluorescence-based and Lysis-dependent Inference of Cell Death Kinetics)12,13. Celem testu FLICK jest określenie poziomu śmierci komórki wywołanej przez lek, niezależnie od tego, w jaki sposób komórki umierają. W metodzie FLICK wykorzystuje się barwniki nieprzepuszczalne dla komórek, których fluorescencja zależy od wiązania DNA. Kluczową cechą FLICK jest wykorzystanie tych fluoroforów do oznaczania akumulacji martwych komórek w czasie ze względu na ich dostępne DNA, a następnie mechanicznej lizy na bazie detergentu w celu przeniknięcia do żywych komórek pod koniec testu. Dane te, w połączeniu z modelowaniem matematycznym, umożliwiają kwantyfikację zarówno żywych, jak i martwych populacji komórek z ciągłą rozdzielczością czasową i bez konieczności zbierania lub przetwarzania martwych komórek. Co więcej, zastosowanie czytnika płytek do oceny fluorescencji martwych komórek pozwala na ocenę martwych komórek bez wymagania, aby martwe komórki pozostały nienaruszone, łagodząc w ten sposób uprzedzenia do martwiczych form śmierci, które skutkują pęknięciem komórki. Wreszcie, test FLICK wymaga minimalnej obsługi płytki i może szybko generować pomiary kinetyczne, co pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków. W tym protokole skupiamy się na zastosowaniu testu FLICK, w tym na tym, jak używać FLICK do wnioskowania o tempie wzrostu indukowanym lekiem, wskaźniku śmiertelności i / lub mechanizmach śmierci komórki.

<table><tbody><tr><td>Belinostat</td><td>ApexBio</td><td>A4612</td><td></td></tr><tr><td>Camptothecin</td><td>ApexBio</td><td>A2877</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowa probówka wirówkowa, 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-269</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10017CV</td><td>Do wysiewu i odurzania komórek</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25950CQC</td><td>Do wysiewu i leków komórek</td></tr><tr><td>Fisherbrand 96-Well, Mikropłytka z dnem w kształcie litery U poddana działaniu hodowli komórkowych</td><td>Fisher Scientific FB012932</td><td></td><td>Do wysiewu i narkotyzacji komórek (płytka szpilkowa)</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One&nbsp; CELLSTAR &mu; Przezroczysta 96-dołkowa, poddana działaniu kultur komórkowych, płaska płytka Microplate</td><td>Greiner</td><td>655090</td><td>Do wysiewu i narkotyzacji komórek</td></tr><tr><td>IncuCyte S3</td><td>Essen Biosciences</td><td></td><td>Będzie działał dowolny mikroskop fazowy</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td><td>MATLAB w wersji R2023b, wymagana jest licencja</td></tr><tr><td>Czytnik fluorescencji mikropłytek</td><td>Tecan</td><td>Spark</td><td>Do pomiaru fluorescencji martwych komórek</td></tr><tr><td>Palbociclib</td><td>ApexBio</td><td>A8316</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td>Dowolna praca PBS</td></tr><tr><td>Wielomodowy czytnik mikropłytek Spark Tecan</td><td></td><td>https://www.tecan.com/spark-overview</td><td>Oprogramowanie SparkControl wersja 2.2</td></tr><tr><td>Sterylny zbiornik, 25 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-508</td><td>Do wysiewu i leków komórek</td></tr><tr><td>Sytox Zielone barwienie kwasem nukleinowym</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td>Barwienie DNA do pomiaru fluorescencji martwych komórek</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J66624-AP</td><td>Do przepuszczalności komórek</td></tr><tr><td>U2OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td>Przykładowa linia komórkowa wykorzystana w tym protokole</td></tr><tr><td>Z-VAD-FMK</td><td>ApexBio</td><td>A1902</td><td></td></tr></tbody></table>

kompleksowa analiza odpowiedzi na lek przy użyciu testu flick

Comprehensive Analysis of Drug Response using the FLICK Assay

Dla zrozumienia skuteczności leków, kluczową potrzebą jest scharakteryzowanie zakresu śmierci komórek wywołanej przez lek. Wysiłki zmierzające do ilościowego określenia poziomu śmierci komórek wywołanej przez leki są kwestionowane przez istnienie ponad tuzina molekularnie odrębnych form regulowanej śmierci, z których każda ma swój własny czas aktywacji i biochemiczne cechy charakterystyczne. Co więcej, w przypadku niektórych podtypów śmierci martwiczej cechy charakterystyczne są obserwowane tylko przejściowo i szybko zanikają z powodu pęknięcia komórki. W związku z tym, nawet przy użyciu kombinacji testów specyficznych dla ścieżki śmierci, trudno jest dokładnie określić ilościowo całkowitą ilość śmierci komórki lub względny udział każdego podtypu śmierci. Inną kwestią jest to, że wiele testów specyficznych dla zgonu ignoruje wpływ leków na proliferację komórek, co utrudnia interpretację, czy populacja leczona lekami powiększa się, czy maleje. Test FLICK pozwala na ilościowe określenie całkowitego poziomu śmierci komórki po stymulacji w sposób, który jest specyficzny dla śmierci, ale także w dużej mierze niezależny od typu (typów) aktywowanej śmierci. Dodatkowo test FLICK zachowuje informacje o całkowitej wielkości populacji i tempie proliferacji komórek. W tym manuskrypcie opisujemy podstawowe zastosowanie testu FLICK, sposób rozwiązywania problemów z tym testem przy użyciu różnych typów materiału biologicznego oraz sposób wykorzystania testu FLICK do ilościowego określenia udziału każdego rodzaju śmierci komórki w obserwowanej odpowiedzi na lek.

Stosując niniejszy protokół, zbadaliśmy wrażliwość komórek U2OS na inhibitor HDAC Belinostat. Eksperymenty te przeprowadzono z użyciem 2 µM SYTOX Green w celu znakowania martwych komórek (Rycina 1A). Odczyty kinetyczne wykonano za pomocą fluorescencyjnego czytnika płytek przy ustawieniu wzmocnienia (gain) na poziomie 130 (Rycina 1B). Na koniec analizy komórki poddano lizie w 1,5% roztworze Triton-X w PBS przez 2 h (Rycina 1C...

Ten protokół opisuje, jak używać testu FLICK do oceny reakcji na leki, w tym szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z tego testu do obliczania wskaźników wzrostu i śmiertelności wywołanych przez lek oraz do oceny mechanizmu śmierci komórek wywołanej przez lek.

Kompleksowa analiza odpowiedzi na lek przy użyciu testu FLICK

For understanding drug efficacy, a critical need is to characterize the extent of drug-induced cell death. Efforts to quantify the level of drug-induced ...

Badania te koncentrują się na zrozumieniu, jak działają leki przeciwnowotworowe. Głównym celem jest zbadanie, w jaki sposób leki te aktywują śmierć komórki. Metody oceny wrażliwości leku określają ilościowo liczbę komórek, ale nie wskazują, czy komórki umierają, w jakim stopniu są one aktywowane. Protokół ten pozwala na precyzyjne obliczenia wzrostu śmiertelności wywołanego przez leki, czego nie można osiągnąć, badając tylko wielkość populacji, jak to ma miejsce w przypadku innych testów. FLICK ocenia zarówno żywe, jak i martwe komórki z równą precyzją w ramach tego samego testu, bez ograniczeń co do typów komórek lub form śmierci komórkowej, które można badać.[Instruktor] Na początek umieść żądaną liczbę komórek w każdym dołku 96-dołkowej płytki o czarnych ściankach z dnem optycznym. Dodaj 100 mikrolitrów kompletnej pożywki i pozwól komórkom przylgnąć do płytki przez noc. Dodać 10 mikrolitrów 1,5% roztworu Triton X do każdej studzienki zawierającej posiane komórki bez mieszania. Obserwuj morfologie komórek pod mikroskopem świetlnym za pomocą obiektywu 10X i sprawdzaj komórki co godzinę, aż ciała komórek przestaną być widoczne. Dla każdego badanego stężenia należy umieścić 40 000 komórek w 180 mikrolitrach pożywki do hodowli komórkowych w trzech egzemplarzach wzdłuż skrajnej lewej kolumny 96-dołkowej optycznej dolnej płytki o czarnych ściankach. Dodaj 90 mikrolitrów pożywki do pozostałych studzienek. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 90 mikrolitrów z skrajnej lewej kolumny do sąsiedniej kolumny po prawej stronie, aby uzyskać seryjne rozcieńczenie jeden lub dwa. Pipetować w górę i w dół 15 razy, aby wymieszać. W przypadku przedostatniej kolumny usuń 90 mikrolitrów, tak aby wszystkie studzienki zawierały 90 mikrolitrów pożywki o zróżnicowanej liczbie komórek. Dodaj 10 mikrolitrów barwnika DNA 10X do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Następnie dodaj 10 mikrolitrów 1,5% roztworu Triton X, aby przepuszczalność komórek. Aby zmierzyć intensywność fluorescencji, załaduj płytkę do czytnika płytek fluorescencyjnych. Dostosuj długości fal wzbudzenia i emisji oraz wzmocnienie cyfrowe w zależności od używanego czytnika płytek. I zmierz intensywność fluorescencji na płytce miareczkowania komórek. Określ ilościowo fluorescencję w różnych ustawieniach akwizycji. Odejmij średni sygnał z kolumny nie zawierającej żadnych komórek, aby usunąć sygnał tła z każdego pomiaru. Wykreśl liczbę komórek w stosunku do sygnału fluorescencyjnego i wykonaj regresję liniową, aby określić liniowość każdego stężenia barwnika DNA dla każdego ustawienia akwizycji. Wybierz ustawienia stężenia i akwizycji barwnika DNA, które zapewniają najlepsze połączenie liniowości i zakresu dynamiki. Po zliczeniu komórek wymieszać zawiesinę policzonych komórek z odpowiednią objętością pożywki za pomocą pipety serologicznej. Przenieść tę zawiesinę do zbiornika odczynnika z dnem w kształcie litery V. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 90 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki z 96 płytek dołkowych. Zawiesinę komórkową należy regularnie mieszać przez wielokrotne pipetowanie, aby utrzymać pożądane stężenie komórek. Używając 10-krotnego stężenia wybranego barwnika DNA w kompletnej pożywce wzrostowej, przygotuj 10-krotne stężenie każdego badanego leku. I seryjnie rozcieńczyć za pomocą pipety wielokanałowej. Wymieszaj 15 razy między każdym dołkiem. Teraz dodaj 10 mikrolitrów mieszaniny leku i barwnika DNA do płytek zawierających komórki. Uzyskaj odczyty fluorescencji dla wszystkich płytek leczonych lekiem co trzy do czterech godzin po dodaniu leku. W ostatnim pożądanym punkcie czasowym uzyskaj odczyt fluorescencji. Natychmiast po tym dodaj 10 mikrolitrów 1,5% roztworu Triton X, aby rozpalić komórki. Następnie uzyskaj odczyty fluorescencji po przepuszczalności komórek. Obliczyć średnie wartości fluorescencji z płytki kontrolnej T zero, używając 50% przyciętej średniej. Korzystając z dopasowania krzywej i funkcji wzrostu wykładniczego, oblicz kinetykę wzrostu populacji dla wszystkich odwiertów. Na podstawie parametrów wzrostu oblicz całkowitą liczbę komórek w każdym zmierzonym punkcie czasowym w teście dla każdego dołka. Teraz odejmij pomiar martwych komórek od całkowitej liczby komórek, aby określić liczbę żywych komórek w każdym zmierzonym punkcie czasu. Oblicz frakcję śmiertelną lub LF w każdym punkcie czasowym, dzieląc sygnał fluorescencji martwej komórki przez całkowity sygnał komórki dla każdego punktu czasowego. Dopasuj równanie opóźnionej śmierci wykładniczej (LED) do danych dotyczących przebiegu w czasie ułamka śmiertelnego. W przypadku dawek leków, które nie powodują znaczącej śmiertelności, należy użyć modelu liniowego o zerowym nachyleniu. Określ znaczące poziomy śmiertelności na podstawie hałasu w teście lub LF obserwowanego w stanach nieodurzonych. Z równania LED wyodrębnij cztery parametry za pomocą regresji nieliniowej. Początkowa frakcja letalna lub LFI, plateau frakcji śmiertelnej lub LFP, maksymalny współczynnik śmiertelności lub DR. Oraz czas wystąpienia zgonu lub DO. Oblicz ułamkową żywotność lub FV w punkcie końcowym testu dla każdego leku przy każdej dawce. Odejmij końcową frakcję śmiertelną od jednej lub podziel liczbę żywych komórek przez całkowitą liczbę komórek. Określić średnią liczbę żywych komórek dla każdej studzienki na początku testu, obliczając różnicę między odczytem zera T po przepuszczalności a odczytem zera T dla każdej studzienki. Ta wartość jest określana jako X zero. Teraz, dla każdego dobrze leczonego leku, oblicz znormalizowaną wartość zahamowania szybkości wzrostu lub GR, używając podanego równania. Wykonaj dopasowanie krzywej przy użyciu czteroparametrowej regresji logistycznej. Następnie określ zależność między wzrostem i śmiertelnością a wielkością populacji za pomocą symulacji opartej na modelu urodzeń/śmierci. Użyć średniej liczby żywych komórek z płytki kontrolnej T zero, długości testu. Oraz zdefiniowane przez użytkownika zakresy dla prawdopodobnej proliferacji i śmiertelności jako dane wejściowe dla tej symulacji. Aby określić prawdopodobne tempo wzrostu, użyj nieleczonego tempa wzrostu w podwajaniu populacji komórek na godzinę jako najwyższego możliwego tempa i zera jako najniższego. Podziel ten zakres na 500 równomiernie rozmieszczonych segmentów. Określ wartości GR dla każdej symulowanej pary proliferacji i śmiertelności. Następnie określ wartości LF. Oblicz odległość parami między każdą obliczoną parą GR i LF a każdą teoretyczną parą GR i LF w tabeli przeglądowej. Zidentyfikuj teoretyczną parę z minimalną odległością od eksperymentalnie obserwowanej pary GR i LF jako prawdziwe wskaźniki proliferacji i śmiertelności wywołanej przez leki. Rysunek ten ilustruje, w jaki sposób test FLICK i analiza GRADE określają ilościowo i rozróżniają między indukowanym lekiem hamowaniem wzrostu a śmiercią komórki w komórkach U2 OS. Belinostat w jednym mikromolarze wykazywał wartość GR równą zero, co wskazywało na zastój cyto, ale także powodował około 50% śmierć komórki. Analiza GRADE wykazała, że jeden mikromolowy belinostat powodował zarówno zahamowanie wzrostu, jak i śmierć komórek, co miało wyraźny wpływ na ogólną wielkość populacji. Inhibitor apoptozy Z-VAD zmniejszał śmiertelność indukowaną przez belinostat o 18%, co wskazuje na zaangażowanie w apoptozę. Konwencjonalna analiza wykazała, że wszystkie leki mają zmniejszoną żywotność, ale analiza GR wykazała, że tylko belinostat i kamptotekyna powodowały śmierć komórek w dużych dawkach. Analiza GRADE wykazała, że Belinostat indukował zarówno zahamowanie wzrostu, jak i śmierć po podaniu wszystkich dawek. Kamtotekyna była dwufazowa, powodując jedynie zatrzymanie wzrostu przy niskich dawkach i śmierć przy wysokich dawkach. A palbocyklib powodował tylko zahamowanie wzrostu.

comprehensive-analysis-of-drug-response-using-the-flick-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy materiał wideo przedstawia szczegółowy protokół badania profilu farmakologicznego ludzkich kanałów TRPA1 przy użyciu systemu FlexStation 3. Protokół obejmuje szczegóły dotyczące przygotowania komórek, ładowania barwnika oraz obsługi czytnika mikropłytek FlexStation 3.

Komórkowy test wapniowy do przesiewowej analizy funkcji kanałów TRP o średniej i wysokiej przepustowości z wykorzystaniem systemu FlexStation 3

Opisujemy procedurę i analizę danych chemicznego systemu przesiewowego sygnalizacji glikokortykosteroidowego hormonu stresu za pomocą larw danio pręgowanego: test aktywności lucyferazy zebry reagujący na glikokortykosteroidy in vivo (GRIZLY). Test z czułością i swoistością wykrywa wpływ związków wymagających metabolizowania lub wpływających na endogenną produkcję glikokortykosteroidów na sygnalizację glikokortykosteroidów.

Chemiczna procedura przesiewowa sygnalizacji glikokortykosteroidów za pomocą systemu reporterowego lucyferazy larw danio pręgowanego

Opisujemy wysokoprzepustowy test wrażliwości na leki dla pierwotnych komórek szpiczaka mnogiego. Polega ona na rekonstrukcji mikrośrodowiska szpiku kostnego (w tym macierzy zewnątrzkomórkowej i zrębu) na płytkach wielodołkowych oraz nieinwazyjnej metodzie podłużnego oznaczania żywotności komórek.

Organotypowy wysokoprzepustowy system do charakteryzowania wrażliwości pierwotnych komórek szpiczaka mnogiego na leki

Proste metody wykrywania selektywnej aktywacji białek G przez receptory sprzężone z białkiem G pozostają wyjątkowym wyzwaniem w sygnalizacji komórkowej. W tym przypadku biosensory rezonansowego transferu energii (FRET) Fӧrster zostały opracowane poprzez parowanie peptydów GPCR z białkiem G w celu zbadania zmian konformacyjnych w kontrolowanych stężeniach w żywych komórkach.

Selektywne dla białka G konformacje GPCR mierzone za pomocą czujników FRET w teście fluorometrycznym zawiesiny żywych komórek

Prezentujemy otwarty instrument do analizy wysokiej zawartości (HCA) wykorzystujący automatyczne obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) do oznaczania interakcji białek za pomocą odczytów opartych na transferze energii rezonansu Förstera (FRET). Akwizycja danych dla tego urządzenia openFLIM-HCA jest kontrolowana przez oprogramowanie napisane w μManager, a analiza danych odbywa się w FLIMfit.

Analiza Open Source o wysokiej zawartości z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Opisany test komórkowy jest przeznaczony do identyfikacji czynników oddziałujących z receptorem chemokiny 4 (CXCR4) CXC, które hamują lub stymulują, konkurencyjnie lub allosterycznie, wewnątrzkomórkowe uwalnianie Ca2+ zainicjowane przez aktywację CXCR4.

Test mobilizacji Ca2 + oparty na fluorescencji kinetycznej w celu identyfikacji agonistów, antagonistów i modulatorów allosterycznych sprzężonych z białkiem G

Synergiczne kombinacje leków są trudne i czasochłonne do empirycznego zidentyfikowania. W tym miejscu opisujemy metodę identyfikacji i walidacji synergicznych małych cząsteczek.

Wysokoprzepustowa identyfikacja synergicznych kombinacji leków metodą Overlap2

Wprowadzamy protokół do mierzenia reakcji na lek w czasie rzeczywistym w organotypowych wycinkach tkanki nowotworowej. Przedstawiona tutaj strategia eksperymentalna stanowi platformę do przeprowadzania średnio-wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków na wycinkach tkanek pochodzących z nowotworów klinicznych lub mysich w warunkach ex vivo.

Pomiar reakcji na lek w czasie rzeczywistym w organotypowych wycinkach tkanki nowotworowej

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Organoidy nowotworowe pochodzące od pacjentów są wyrafinowanym systemem modelowym do badań podstawowych i translacyjnych. Ten artykuł dotyczący metod szczegółowo opisuje zastosowanie multipleksowanego obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek do jednoczesnej oceny kinetycznej różnych fenotypów organoidów.

Multipleksowane obrazowanie żywych komórek w celu uzyskania odpowiedzi na leki w organoidalnych modelach raka pochodzących od pacjenta

Poznaj metodę FLICK do kompleksowej analizy odpowiedzi komórek nowotworowych na leki. Technika ta umożliwia precyzyjne obliczanie wskaźników wzrostu i śmierci komórek, dostarczając szczegółowych danych o mechanizmach działania leków przeciwnowotworowych.

Kompleksowa analiza odpowiedzi na lek przy użyciu testu FLICK

Przeglądaj więcej filmów