Name: Zindywidualizowana rekonstrukcja mikrobioty mleka kobiecego: wykonalne podejście w warunkach rzeczywistych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 16 s
Description: Poznaj metodę rekonstrukcji mikrobioty mleka kobiecego w pasteryzowanym mleku dawczym. Protokół umożliwia odtworzenie naturalnej mikroflory i poprawę wartości odżywczej dla noworodków w szpitalach położniczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe od Programa de Pesquisas para o SUS, PPSUS/2020, Ministério da Saúde do Brasil; Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do Estado de Santa Catarina, numer dotacji: 2021TR000506; Programa de Pesquisa Universal, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) do Ministério de Ciência e Tecnologia do Brasil, numer grantu: 420996/2023-0; Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica 2022 - 2024, numer grantu: 120815/2023-0. Dziękujemy również wolontariuszom za dostarczenie próbek.

Ten protokół został przeprowadzony jako część procedur badania klinicznego przeprowadzonego przez naszą grupę badawczą (Brazylijski Rejestr Badań Klinicznych, ReBEC RBR-729kr8x) i otrzymał zgodę Komitetu Etyki (proces CAAE nr 41063520.4.0 000.0121) oraz uzyskano świadomą zgodę od wszystkich uczestników przed randomizacją i zbieraniem próbek.
Procedura rekonstrukcji mikrobioty mleka przebiega w trzech krokach:
1. Pozyskiwanie surowego mleka matki
UWAGA: Procedurę uzyskiwania mleka można znaleźć gdzie indziej10,11.
<ol>
	<li>Przed zabiegiem należy uzyskać świadomą zgodę matki zgodnie z opinią komisji etycznej i wyjaśnić matce wszystko, co zostanie zrobione, odpowiadając na wszelkie wątpliwości, obawy, obawy i niepokoje związane z zabiegiem, aby matka była zrelaksowana.</li>
	<li>Poproś matkę o odciąganie pokarmu za pomocą laktatora elektrycznego do wysterylizowanego pojemnika pod nadzorem pielęgniarki odpowiedzialnej za oddział, zgodnie z lokalnymi standardami higieny obowiązującymi na każdym oddziale położniczym.</li>
	<li>Po pobraniu oznacz pojemnik z mlekiem informacjami o matce, datą i godziną pobrania. Mleko matki należy przechowywać w temperaturze -4 °C lub niższej przez maksymalnie 12 godzin.</li>
</ol>
2. Rozmrażanie pasteryzowanego mleka dawcy (PDM)
UWAGA: HMB mają własne zapasy PDM, zamrożone w temperaturze poniżej -4 °C na maksymalny okres do 6 miesięcy, a procedura jest dobrze opisana w literaturze gdzie indziej12,13,14.
<ol>
	<li>Rozmrażaj surowe mleko lub PDM przechowywane w wysterylizowanych szklanych pojemnikach z plastikowymi pokrywkami w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C, zapewniając utrzymanie temperatury i krótszy czas przetwarzania. 
	UWAGA: Nie rozmrażaj PDM w temperaturze pokojowej ani w temperaturze chłodniczej (wewnątrz lodówki), ponieważ czas rozmrażania w takich przypadkach jest wydłużony, co sprzyja narażeniu i rozwojowi drobnoustrojów.</li>
	<li>Wyjąć butelki z mlekiem kobiecym z łaźni wodnej, zanim mleko w butelce osiągnie temperaturę powyżej 5 °C.</li>
</ol>
3. Inokulacja PDM za pomocą MOM w celu rekonstytucji mikrobiomu
UWAGA: Standardowy stosunek objętościowy dla procesu inokulacji PDM za pomocą MOM wynosi 90%: 10% (v/v). Kroki procedury są następujące:
<ol>
	<li>Poinstruuj technika, aby założył fartuch laboratoryjny, maskę, czapkę i rękawice.</li>
	<li>Oczyść powierzchnię roboczą roztworem do czyszczenia powierzchni zgodnie z lokalnym protokołem instytucjonalnym.</li>
	<li>Ułóż materiały, które mają być użyte i przygotuj sprzęt. Rozgrzej inkubator (łaźnię wodną) wodą do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Zaplanuj ostateczną objętość zaszczepionego mleka, która ma być użyta i wybierz pojemnik o odpowiedniej wielkości. Umieść pojemnik ze świeżym surowym MOM i PDM w postaci płynnej na powierzchni roboczej.</li>
	<li>Zebrać podwielokrotność do 1 ml MOM za pomocą sterylnego sprzętu do późniejszego sekwencjonowania 16S i zliczania bakterii. Przechowywać podwielokrotność w krioprobówce wolnej od DNaz/RNaz w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Pozostałą objętość, odpowiadającą 10% końcowej pożądanej objętości mleka, przenieść za pomocą sterylnego przyrządu pomiarowego (np. strzykawki, pipety) do pojemnika dopuszczonego do kontaktu z żywnością, który należy zanurzyć w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zebrać 1 ml podwielokrotności PDM za pomocą sterylnego sprzętu do późniejszego sekwencjonowania 16S i zliczania bakterii. Przechowywać podwielokrotność w krioprobówce wolnej od DNaz/RNaz w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Przenieś ilość PDM odpowiadającą 90% końcowej pożądanej objętości mleka za pomocą sterylnego narzędzia wolumetrycznego (np. strzykawki, pipety) do pojemnika z MOM z poprzedniego etapu, tworząc teraz zaszczepione mleko matki (IM).</li>
	<li>Uszczelnić pojemnik pokrywką, która zapobiega zanieczyszczeniu wnętrza butelki przez jakikolwiek płyn zewnętrzny i zanurzyć go w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 4 godziny, aby umożliwić namnażanie się mikroorganizmów zaszczepionych w mleku.</li>
	<li>Po 4 godzinach wyjąć pojemnik ze sfermentowanym IM z łaźni wodnej, zwany teraz mlekiem odtworzonym (RM).</li>
	<li>Zarezerwuj podwielokrotność do 1 ml za pomocą sterylnego sprzętu do późniejszego sekwencjonowania 16S i zliczania bakterii. Przechowywać podwielokrotność w krioprobówce wolnej od DNaz/RNaz w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Przenieś pozostałą objętość do zdezynfekowanego pojemnika do karmienia noworodków.</li>
</ol>
4. Walidacja metody poprzez hodowlę bakterii na płytkach
UWAGA: Wszystkie procedury muszą być wykonywane w sterylnych warunkach, aby zapobiec zanieczyszczeniu i zapewnić dokładność rozcieńczeń. Wzrost bakterii można oszacować za pomocą metod opisanych w innym miejscu9,15.
<ol>
	<li>Przygotować seryjne rozcieńczenia każdej próbki mleka (PDM, MOM, IM, RM) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej w stężeniach 10-1, 10-2, 10-3 i 10-4. Dokładnie wymieszaj każde rozcieńczenie, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie bakterii.</li>
	<li>Odmierzyć pipetę i rozprowadzić 100 μl każdej rozcieńczonej próbki na płytkach Man-Rogosa-Sharpe (MRS) i Mannitol Salt Agar (MSA) w trzech egzemplarzach, używając sterylnej pętli Drigalskiego lub szklanego rozsiewacza. Upewnij się, że objętość jest równomiernie rozłożona na płytce agarowej.</li>
	<li>Inkubuj płytki agarowe MRS w słoiku beztlenowym zawierającym, aby stworzyć środowisko o niskiej zawartości tlenu dla rozwoju bakterii kwasu mlekowego.</li>
	<li>Inkubuj tlenowo płytki z agarem solnym mannitolu (MSA), aby wspomóc wzrost gatunków Staphylococcus.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 37 ± 2 °C przez 48-72 godzin.</li>
	<li>Wybrać rozcieńczenie z policzalną liczbą kolonii bakteryjnych (25-250 kolonii) na każdym rodzaju agaru</li>
	<li>Policz widoczne kolonie na każdej z trzech płytek repliki dla wybranego rozcieńczenia.</li>
	<li>Obliczyć średnią liczbę kolonii z potrójnych płytek dla wybranego rozcieńczenia zarówno w pożywce MRS, jak i MSA.</li>
	<li>Określ liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) na ml dla każdej próbki, korzystając z następującego wzoru i przelicz na skalę logarytmiczną o podstawie 10 (log10), aby ułatwić interpretację. Kontynuuj analizę statystyczną wyników. 
	Liczba jtk/ml = liczba kolonii × całkowity współczynnik rozcieńczenia/objętość podana w ml</li>
</ol>
5. Analiza mikrobiomu mleka
UWAGA: Analizę mikrobiomu mleka można przeprowadzić zgodnie z metodami i procedurami opisanymi gdzie indziej16. Zrzut ekranu skryptu R użytego w tej analizie przedstawiono na rysunku uzupełniającym S1.
<ol>
	<li>Odwirować 500 μl próbki przez 15 s w temperaturze 180 × g do komórek osadu i cząstek stałych.</li>
	<li>Zebrać 350 μl supernatantu i użyć go do ekstrakcji DNA.</li>
	<li>Określić ilościowo wyekstrahowane DNA za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Amplifikuj regiony V3 i V4 rybosomalnego RNA 16S za pomocą 20 ng DNA i starterów 357F/805R (patrz tabela materiałów)17.</li>
	<li>Użyj kulek magnetycznych, aby oczyścić powstałe amplikony i oznacz ilościowo amplikony z kodami kreskowymi za pomocą fluorymetru DNA.</li>
	<li>Sekwencjonuj amplikony w trybie sparowanego końca 250 pz.</li>
	<li>Przetwarzaj powstałe sekwencje, wykonując wysokiej jakości przycinanie i usuwanie adaptera18. Użyj trybu sparowanego końca (PE) z punktacją Phred33 i ustaw minimalną długość odczytu 200 bp, aby zapewnić wysoką jakość odczytów.</li>
	<li>Zaimportuj dane sekwencji sparowanych końców do QIIME 219 za pomocą formatu pliku manifestu i polecenia: qiime tools import.</li>
	<li>Przetwarzaj zaimportowane sekwencje za pomocą DADA2 w celu odszumiania, dereplikacji i usuwania chimery za pomocą polecenia: qiime dada2 denoise-paired. Ten krok generuje wysokiej jakości reprezentatywne sekwencje i tabelę cech.</li>
	<li>Filtruj obiekty i sekwencje, aby zachować tylko te, które mają wystarczającą reprezentację, za pomocą poleceń: qiime feature-table filter-features i qiime feature-table filter-seqs.</li>
	<li>Przygotuj bazę danych referencyjną, wyodrębniając regiony wzmocnione przez startery (V3-V4) przy użyciu: qiime feature-classifier extract-reads.</li>
	<li>Użyj algorytmu VSEARCH do klasyfikacji taksonomicznej z referencyjną bazą danych Silva przy 97% progu tożsamości, wykonując polecenie: 
	qiime feature-classifier classify-consensus-vsearch</li>
	<li>Zintegruj przypisania taksonomiczne z tabelą cech za pomocą narzędzi BIOM: biom add-metadata.</li>
	<li>Wykonuj analizy statystyczne zgodnie z opisem w innym miejscu20,21.</li>
</ol>

Restoring Pasteurized Donor Milk Microbiota Using Mother's Own Milk

<ol><li>Szyller, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+components+of+human+milk+and+their+impact+on+child%27s+health+and+development%2C+Literature+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Bioactive components of human milk and their impact on child's health and development, Literature Review.</a> Nutrients. 16 (10), 1487(2024).</li>
<li>Fernández, L., Rodríguez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+milk+microbiota%3A+Origin+and+potential+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Nestle+Nutr+Inst+Workshop+Ser%22%5BJournal%5D)">Human milk microbiota: Origin and potential uses.</a> Nestle Nutr Inst Workshop Ser. 94, 75-85 (2020).</li>
<li>Fernández, L., Ruiz, L., Jara, J., Orgaz, B., Rodríguez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+the+preservation%2C+restoration+and+modulation+of+the+human+milk+microbiota.+Implications+for+human+milk+banks+and+neonatal+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Strategies for the preservation, restoration and modulation of the human milk microbiota. Implications for human milk banks and neonatal intensive care units.</a> Front Microbiol. 9, 2676(2018).</li>
<li>Meier, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+evidence%3A+Mothers%27+own+milk+is+personalized+medicine+for+very+low+birthweight+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Med%22%5BJournal%5D)">More evidence: Mothers' own milk is personalized medicine for very low birthweight infants.</a> Cell Rep Med. 3 (8), 100710(2022).</li>
<li>Fewtrell, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictors+of+expressed+breast+milk+volume+in+mothers+expressing+milk+for+their+preterm+infant%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dis+Child+Fetal+Neonatal+Ed%22%5BJournal%5D)">Predictors of expressed breast milk volume in mothers expressing milk for their preterm infant.</a> Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 101 (6), F502-F506 (2016).</li>
<li>Abrams, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+human+milk+for+the+high-risk+infant%3A+Preparation%2C+safety%2C+and+usage+options+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Donor human milk for the high-risk infant: Preparation, safety, and usage options in the United States.</a> Pediatrics. 139 (1), e20163440(2017).</li>
<li>Brasil é referência em doação de leite materno. , Serviços e Informações do Brasil. At
 <a target="_blank" href="https://www.gov.br/pt-br/noticias/saude-e-vigilancia-sanitaria/2020/02/brasil-e-referencia-em-doacao-de-leite-materno">https://www.gov.br/pt-br/noticias/saude-e-vigilancia-sanitaria/2020/02/brasil-e-referencia-em-doacao-de-leite-materno</a> (2024).</li>
<li>Landers, S., Updegrove, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriological+screening+of+donor+human+milk+before+and+after+holder+pasteurization%5BTitle%5D)+AND+%22Breastfeed+Med%22%5BJournal%5D)">Bacteriological screening of donor human milk before and after holder pasteurization.</a> Breastfeed Med. 5 (3), 117-121 (2010).</li>
<li>Cacho, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalization+of+the+microbiota+of+donor+human+milk+with+mother%27s+own+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Personalization of the microbiota of donor human milk with mother's own milk.</a> Front Microbiol. 8, 1470(2017).</li>
<li>Pumping breast milk. , Centers for Disease Control and Prevention - CDC. 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/nutrition/infantandtoddlernutrition/breastfeeding/pumping-breast-milk.html">https://www.cdc.gov/nutrition/infantandtoddlernutrition/breastfeeding/pumping-breast-milk.html</a> (2023).</li>
<li>Expressing and storing breast milk. , NHS UK. 
 <a target="_blank" href="https://www.nhs.uk/conditions/baby/breastfeeding-and-bottle-feeding/breastfeeding/expressing-breast-milk/">https://www.nhs.uk/conditions/baby/breastfeeding-and-bottle-feeding/breastfeeding/expressing-breast-milk/</a> (2020).</li>
<li>Arslanoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+establishment+and+operation+of+a+donor+human+milk+bank%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+Rev%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the establishment and operation of a donor human milk bank.</a> Nutr Rev. 81 (Supplement_1), 1-28 (2023).</li>
<li>Moro, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+donor+human+milk%3A+Update+and+recommendations+from+the+European+Milk+Bank+Association+%28EMBA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Processing of donor human milk: Update and recommendations from the European Milk Bank Association (EMBA).</a> Front Pediatr. 7, 49(2019).</li>
<li>Landers, S., Hartmann, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+human+milk+banking+and+the+emergence+of+milk+sharing%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Donor human milk banking and the emergence of milk sharing.</a> Pediatr Clin North Am. 60 (1), 247-260 (2013).</li>
<li>Stachelska, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Lactobacillus+delbrueckii+and+Streptococcus+thermophilus+strains+present+in+artisanal+raw+cow+milk+cheese+using+real-time+PCR+and+classic+plate+count+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Pol+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of Lactobacillus delbrueckii and Streptococcus thermophilus strains present in artisanal raw cow milk cheese using real-time PCR and classic plate count methods.</a> Pol J Microbiol. 66 (4), 491-499 (2017).</li>
<li>Ruiz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+approaches+for+the+metataxonomic+analysis+of+the+human+milk+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two approaches for the metataxonomic analysis of the human milk microbiome.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 622550(2021).</li>
<li>Lopez Leyva, L., Brereton, N. J. B., Koski, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+frontiers+in+human+milk+microbiome+research+and+suggested+primers+for+16S+rRNA+gene+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Emerging frontiers in human milk microbiome research and suggested primers for 16S rRNA gene analysis.</a> Comp Struct Biotechnol J. 19, 121-133 (2021).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+A+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Bolyen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interactive%2C+scalable+and+extensible+microbiome+data+science+using+QIIME+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2.</a> Nat Biotechnol. 37 (8), 852-857 (2019).</li>
<li>McMurdie, P. J., Holmes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((phyloseq%3A+An+R+package+for+reproducible+iInteractive+analysis+and+graphics+of+microbiome+census+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">phyloseq: An R package for reproducible iInteractive analysis and graphics of microbiome census data.</a> PLoS ONE. 8 (4), e61217(2013).</li>
<li>R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R+Foundation+for+Statistical+Computing%22">R Foundation for Statistical Computing</a>. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. https://www.R-project.org/ (2024).</li>
<li>Torrez Lamberti, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+profile+of+personalized+donor+human+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Metabolomic profile of personalized donor human milk.</a> Molecules. 25 (24), 5783(2020).</li>
<li>Mallardi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inoculation+of+mother%27s+own+milk+could+personalize+pasteurized+donor+human+milk+used+for+feeding+preterm+infants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Inoculation of mother's own milk could personalize pasteurized donor human milk used for feeding preterm infants.</a> J Transl Med. 19 (1), 420(2021).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Poniżej przedstawiamy protokół, który ma być stosowany w szpitalach położniczych związanych z bankiem mleka kobiecego, mający na celu zapewnienie PDM odtworzenia mikrobioty mleka od konkretnej matki, która z różnych powodów nie może zapewnić noworodkowi wystarczającej ilości mleka. Protokół jest prosty i zasadniczo opiera się na dwóch krokach. Pierwszy z nich polega na zastosowaniu procedur rutynowo wykonywanych w bankach mleka kobiecego w celu prawidłowego pobrania, a następnie pasteryzacji mleka dawczyń, a także pobran...

Mleko matki jest powszechnie uznawane za najlepsze źródło pożywienia dla noworodków, dostarczając nie tylko niezbędnych makro i mikroelementów, ale także złożonego zestawu elementów, w tym różnych metabolitów i składników układu odpornościowego, takich jak przeciwciała, cytokiny i komórki1. Dodatkowo, korzystne właściwości mleka matki wynikają również ze społeczności mikroorganizmów komensalnych. Wszystkie te elementy mleka matki odgrywają kluczową rolę w rozwoju noworodka1. Na społeczność mikroorganizmów, znaną jako mikrobiota, wpływa kombinacja takich czynników, jak dieta, styl życia matki, rodzaj porodu i wiek ciążowy, co powoduje, że każde mleko ma mikrobiotę o szczególnych cechach2. Mechanizmy, dzięki którym mikrobiota mleka kobiecego korzystnie wpływa na rozwój noworodków, obejmują zarówno ochronę powierzchni jelita, poprzez kolonizację przez bakterie komensalne, jak i wspomaganie dojrzewania układu odpornościowego poprzez produkcję metabolitów, które oddziałują z komórkami odpornościowymi w jelicie3. Z tego powodu zindywidualizowany profil mikroorganizmów w mleku każdej matki sprawia, że jest to forma spersonalizowanej medycyny dla noworodków4.
Obecność zdrowej mikrobioty może pomóc chronić noworodka przed kolonizacją przez potencjalnie chorobotwórcze mikroorganizmy, zajmując niszę ekologiczną i wspierając żywienie, szczególnie dla wcześniaków, które są bardziej podatne na te zewnętrzne wpływy ze względu na przebywanie w środowisku szpitalnym i niedojrzały układ odpornościowy. Co więcej, matki, które rodzą przedwcześnie, często mają trudności z produkcją mleka w wystarczających ilościach dla swoich noworodków. Produkcja mleka jest zazwyczaj niższa, im młodszy jest wiek ciążowy5. W takich przypadkach najlepszą opcją karmienia noworodka jest pasteryzowane mleko dawczyni dostarczane przez Banki Mleka Kobiecego (HMB)6.
Brazylia posiada największą i najbardziej rozległą sieć HMB na świecie7. Sieć ta zbiera, przygotowuje i dystrybuuje ponad 160 000 litrów pasteryzowanego mleka kobiecego od dawców (PDM) na terenie całego kraju bez żadnych kosztów dla rodziców, za pośrednictwem krajowego ujednoliconego systemu opieki zdrowotnej (Sistema Único de Saúde), zarządzanego przez Ministerstwo Zdrowia7. Pasteryzacja jest niezbędna do zapewnienia bezpieczeństwa biologicznego oddawanego mleka przeznaczonego dla noworodków. Proces ten jest zwykle przeprowadzany przy użyciu metody Holdera, która polega na zanurzeniu pojemnika z surowym mlekiem matki dawcy w kąpieli wodnej o temperaturze 62,5 °C na 30 min6,8. Powstały PDM jest następnie przechowywany w lodówce, aż będzie gotowy do spożycia. Jednak pasteryzacja zmniejsza żywotność mikrobioty komensalnej mleka i zmniejsza biodostępność różnych składników bioaktywnych. Dzieje się tak, ponieważ proces pasteryzacji jest ustandaryzowany, aby zapobiec przenoszeniu drobnoustrojów chorobotwórczych na noworodka. W tym kontekście, w 2017 roku, Cacho i współpracownicy opisali możliwość odtworzenia mikrobioty komensalnej mleka matki poprzez zaszczepienie jej w różnych proporcjach do PDM9. Ich odkrycia wykazały, że stosowanie 10% stężenia mleka własnego matki (MOM) jest optymalnym stężeniem dla utrzymania pierwotnego składu profilu mikrobiomu MOM. Takie podejście zmniejsza ryzyko przerostu określonych bakterii, które, choć zazwyczaj komensalne, mogą stać się szkodliwe, jeśli są nieproporcjonalnie obecne w odtworzonym mleku. W szczególności w badaniu zaobserwowano, że rozcieńczenie 1:10 (10% MOM + 90% PDM), inkubowane przez 4 godziny, spowodowało dobrze zbilansowane obciążenie bakteryjne – około 60% tego, które znajduje się w nierozcieńczonym MOM – co wskazuje na bezpieczniejsze i skuteczniejsze podejście. Natomiast wyższe rozcieńczenia, takie jak 3:10, prowadziły do nadmiernego wzrostu bakterii, podkreślając krytyczną potrzebę kontrolowanych stężeń i warunków w celu zapewnienia bezpieczeństwa.
W tym artykule pokazujemy, że ta procedura odtwarzania mikrobioty mleka kobiecego w PDM może być realizowana w rzeczywistych sytuacjach w ramach rutynowej opieki szpitala położniczego i powiązanego z nim banku mleka kobiecego.

<table><tbody><tr><td>Elektryczny laktator</td><td>Horigen</td><td>XN-2219M2</td><td>Miękki laktator podwójny plus</td></tr><tr><td>Pyrex&nbsp; butelki medialne</td><td>Corning&nbsp;</td><td>CLS1395100</td><td>Pojemniki szklane z plastikowymi pokrywkami&nbsp;</td></tr><tr><td>1000 &mikro; L pipeta Labmate pro</td><td>Corning HTL SA&nbsp; &nbsp;</td><td>5666</td><td>Pipetor o zmiennej objętości&nbsp;</td></tr><tr><td>Fiolka kriogeniczna&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>CLS431417</td><td>Fiolki 2 ml bez DNaz/RNaz&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 15 ml Corning</td><td>&nbsp;</td><td>CLS431470</td><td>Probówki 15 ml bez DNaz/RNaz&nbsp;</td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>EcoSonics</td><td>Q3.0/40A</td><td></td></tr><tr><td>Man&ndash; Rogosa&ndash; Sharpe (MRS)&nbsp;</td><td>Difco</td><td>288210</td><td>Pożywka wzrostowa bakterii kwasu mlekowego</td></tr><tr><td>Agar z solą mannitolu (MSA)</td><td>Himedia</td><td>MH118</td><td>Staphylococcus&nbsp; pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>Anaerobowa</td><td>permutacja</td><td></td><td>słoika Stwórz środowisko o niskiej zawartości tlenu dla wzrostu bakterii kwasu mlekowego</td></tr><tr><td>Extracta&nbsp; Zestaw &ndash; DNA e RNA</td><td>Loccus</td><td>MPTA-PV16-B Zestaw</td><td>do ekstrakcji DNA</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Promega</td><td>E6150</td><td>Quantus DNA</td></tr><tr><td>GoTaqG2</td><td>Promega</td><td>M7841</td><td>System amplikacyjny PCR</td></tr><tr><td>Quantus Fluorometer</td><td>Promega</td><td>E5150</td><td>Zestaw do oznaczania ilościowego DNA / RNA</td></tr><tr><td>MiSeq System</td><td>Illumina Inc.</td><td>M-GL-00006 v4.0</td><td>Sprzęt do sekwencjonowania</td></tr><tr><td>MiSeq Reagent Kit v2 (300 cykli)</td><td>Illumina Inc.</td><td>MS-102-2002</td><td>Zestawy do sekwencjonowania i odczynniki</td></tr><tr><td>Nazwa oprogramowania&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trimmomatic</td><td>http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic</td><td></td><td>Narzędzie do przycinania odczytu danych Illumina NGS</td></tr><tr><td>QIIME 2&nbsp;</td><td>https://docs.qiime2.org/2024.10/</td><td></td> <td>Pakiet do analizy mikrobiomu&nbsp;</td></tr><tr><td>Nazwa podkładu<</td><td>strong>Sekwencja podkładu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16S_357F&nbsp;</td><td>TCGTCGGCAGCGTCAGAGA TGTGTATAAGAGACAGC CTACGGGNGGCWGCAG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16S_805R</td><td>GTCTCGTGGGCTCGGAG ATGTGTATAAGAGACAGG ACTACHVGGGTATCTAATC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zindywidualizowana rekonstrukcja mikrobioty mleka kobiecego: wykonalne podejście w warunkach rzeczywistych

Individualized Reconstitution of Human Milk Microbiota: A Feasible Approach in Real-World Settings

Mleko matki (MOM) jest najbardziej kompletnym źródłem składników odżywczych dla noworodków. W przypadkach, gdy matki nie są w stanie wyprodukować wystarczającej ilości mleka lub nie mogą karmić piersią, preferowaną alternatywą jest pasteryzowane mleko kobiece dawczyni (PDM), które jest rutynowo dostarczane przez banki mleka kobiecego. PDM oferuje lepszą gamę składników odżywczych i immunologicznych w porównaniu z jakąkolwiek dostępną na rynku formułą. Jednak, aby zapewnić bezpieczeństwo biologiczne, PDM jest poddawana pasteryzacji, procesowi, który dezaktywuje mikrobiotę komensalną i redukuje niektóre związki bioaktywne. W badaniu przedstawiono protokół mający na celu przywrócenie mikrobioty PDM przy użyciu MOM jako źródła drobnoustrojów, dostosowując podejście do rzeczywistych warunków klinicznych.
Protokół został wdrożony w badaniu klinicznym przeprowadzonym w szpitalu położniczym i powiązanym z nim banku mleka kobiecego, w celu zapewnienia spersonalizowanego mleka od dawczyni wcześniakom, których matki nie są w stanie wyprodukować wystarczającej ilości mleka. Metodologia polega na inokulacji PDM 10% MOM, a następnie inkubacji w temperaturze 37 °C przez 4 godziny. Analiza mikrobiologiczna wykazała pomyślny wzrost bakterii w zaszczepionym mleku (IM) po inkubacji, przy czym profil mikrobioty mleka odtworzonego (RM) jest bardzo podobny do profilu MOM, co wskazuje na skuteczne przywrócenie mikrobioty. Wyniki te sugerują, że protokół rekonstytucji jest możliwy do wdrożenia w opiece neonatologicznej, z potencjałem poprawy jakości odżywczej i immunologicznej PDM, wspierając w ten sposób zdrowie i rozwój noworodków niekarmionych piersią.

Analiza wzrostu bakterii za pomocą posiewu na płytkach 
Badania mikrobiologiczne przeprowadzone w celu walidacji metody inokulacji PDM za pomocą MOM, zaproponowanej przez Cacho i wsp.9, wykazały, że w oparciu o liczbę CFU/mL nie stwierdzono istotnych różnic między inokulowanymi próbkami mleka przed i po 4 h inkubacji. Jednakże w tych dwóch punktach czasowych zaobserwowano różnice w liczbie kolonii, co wskazuje na wzrost bakterii podczas inkubacji na podłożu MSA dla Staphylo...

Artykuł opisuje protokół odtwarzania mikrobioty pasteryzowanej mleka dawcy przy użyciu mikrobioty mleka matki w praktycznych, rzeczywistych warunkach. Wykazuje skuteczny wzrost bakterii i modulację mikrobiomu, wspierając wykonalne zastosowanie tej procedury w rutynowej opiece szpitala położniczego i powiązanego z nim banku mleka kobiecego.

Zindywidualizowana rekonstrukcja mikrobioty mleka kobiecego: wykonalne podejście w warunkach rzeczywistych

Mother&#39;s own milk (MOM) is the most complete nutritional resource for newborns. In cases where mothers are unable to produce sufficient milk or cannot ...

Badamy, czy możliwe jest odzyskanie mikrobioty konkretnego mleka matki, zachowując strukturę odżywczą mleka pasteryzowanego za pomocą metodologii, którą można wdrożyć w szpitalach. Naszym celem jest opracowanie nowej super strategii żywieniowej dla noworodków i ocena jej widoczności. Uważamy, że największym wyzwaniem w eksperymentalnym odtworzeniu mikrobioty mleka kobiecego jest uzyskanie rekonstrukcji, która jest jeszcze bliższa pierwotnemu profilowi obecnemu w mleku matki, i to szybko.To nie tylko wzmocni jego efekty, ale także jeszcze bardziej zwiększy bezpieczeństwo zabiegu. Naszym celem jest ustalenie, czy ta nowa super strategia żywieniowa oferuje znaczące korzyści kliniczne dla noworodków. Wierzymy, że jeśli praktyczne korzyści zostaną potwierdzone, strategia może zostać łatwo wdrożona we wszystkich regionach, w których banki mleka kobiecego mają pozytywny wpływ na ogólny stan zdrowia osób niebędących osobami dorosłymi.Po uzyskaniu wymaganej zgody poproś matkę o odciąganie pokarmu za pomocą laktatora elektrycznego do wysterylizowanego pojemnika pod nadzorem pielęgniarki. Po pobraniu oznacz pojemnik z mlekiem danymi matki, datą i godziną pobrania. Mleko matki należy przechowywać w temperaturze minus czterech stopni Celsjusza lub niższej przez maksymalnie 12 godzin.Rozmrozić surowe mleko lub pasteryzowane mleko dawcy lub PDM, przechowywane w wysterylizowanych szklanych pojemnikach z plastikowymi pokrywkami w łaźni wodnej o temperaturze 40 stopni Celsjusza. Wyjmij butelkę z mlekiem matki z łaźni wodnej, zanim temperatura mleka przekroczy pięć stopni Celsjusza. Następnie załóż fartuch laboratoryjny, maskę, czapkę i rękawiczki.Oczyść powierzchnię roboczą roztworem do czyszczenia powierzchni, postępując zgodnie z lokalnym protokołem instytucjonalnym. Przenieś podwielokrotność do jednego mililitra MOM do krioprobówki w celu późniejszego sekwencjonowania 16S i zliczania bakterii. Przechowuj krioprobówkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Za pomocą sterylnej pipety przenieś pozostałą objętość MOM, odpowiadającą 10% końcowej pożądanej objętości, do pojemnika bezpiecznego dla żywności. Zanurz pojemnik w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przenieś jednomililitrową porcję PDM do krioprobówki wolnej od DNaz / RNaz w celu sekwencjonowania 16S i zliczania bakterii.Przechowuj krioprobówkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Za pomocą sterylnej pipety przenieś ilość PDM odpowiadającą 90% końcowej pożądanej objętości do pojemnika zawierającego MOM, tworząc mleko zaszczepionej matki. Uszczelnij pojemnik pokrywką, aby zapobiec zanieczyszczeniu i zanurz go w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na cztery godziny, aby umożliwić namnażanie się mikroorganizmów w mleku.Po czterech godzinach wyjmij pojemnik ze sfermentowanym zaszczepionym mlekiem matki z łaźni wodnej. Przenieść jedną mililitrową porcję odtworzonego mleka do krioprobówki wolnej od DNaz / RNaz w celu sekwencjonowania 16S i zliczania bakterii. Przechowuj krioprobówkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Pozostałą objętość odtworzonego mleka należy przenieść do odkażonego pojemnika do karmienia noworodków.

individualized-reconstitution-human-milk-microbiota-feasible-approach

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano protokół produkcji na małą skalę probiotycznego fermentowanego napoju mlecznego z pomocą nowatorskiej bakteryjnej kultury starterowej.

Nowoczesny protokół produkcji w celu małoskalowego wytwarzania fermentowanych żywności probiotycznej

Ten protokół opisuje, jak stworzyć system hodowli enteroidów z noworodków myszy lub przedwcześnie urodzonych ludzi z jelita ludzkiego, a także skuteczną metodę pobierania mleka od myszy.

Mleko matki wspomaga wzrost enteroidów: model proliferacji komórek ex vivo

Przedstawiono półautomatyczny przepływ pracy dla ukierunkowanego sekwencjonowania 16S rRNA z mleka matki i innych typów próbek o niskiej biomasie.

Metoda celowanego sekwencjonowania 16S próbek mleka kobiecego

Tutaj prezentujemy protokół hodowli mikrobioty jelitowej jelita grubego in vitro, przy użyciu szeregu bioreaktorów, które symulują warunki fizjologiczne przewodu pokarmowego.

Zastosowanie zaawansowanej technologii hodowli in vitro do badania mikrobioty jelitowej człowieka

Ten protokół opisuje system fermentacji in vitro mikroflory kałowej przy użyciu inuliny (dobrze znanego prebiotyku i jednego z najczęściej badanych modulatorów mikrobioty), aby zademonstrować użycie tego systemu do szacowania wpływu konkretnych interwencji na skład mikrobioty kałowej i aktywność metaboliczną.

Model hodowli okresowej in vitro w celu oszacowania wpływu schematów interwencyjnych na mikrobiotę kału ludzkiego

Protokół ten został zaprojektowany tak, aby przyspieszyć i umożliwić skuteczną izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od mleka matki o wysokiej czystości.

Szybka izolacja pęcherzyków zewnętrznych pochodzących z ludzkiego mleka matki

Ten protokół opisuje najlepsze praktyki transferu myszy wolnych od zarazków do eksperymentalnych izolatorów jednoklatkowych (izoklatek) przy zachowaniu sterylnych warunków. Omówiono metody przeszczepu kału myszom wolnym od zarazków i pobierania żywych bakterii od tych "humanizowanych" myszy jelitowych w celu dalszych zastosowań.

Przygotowanie i utrzymanie eksperymentu z izododatnią klatką z wykluczeniem biologicznym do przeszczepu kału u myszy wolnych od zarazków

Minibioreactor Array (MBRA) to wysokowydajny, konfigurowalny system hodowli o ciągłym przepływie, który umożliwia hodowlę złożonych społeczności drobnoustrojów, wspierając równoległe eksperymenty w celu badania dynamiki mikrobiomu, interakcji terapeutycznych i reakcji drobnoustrojów na czynniki środowiskowe.

Zaktualizowany protokół montażu i użytkowania macierzy minibioreaktorów (MBRA)

Protokół ten umożliwia szybką i opłacalną ocenę składu mikroorganizmów w produktach mlecznych poprzez połączenie kulturologii z MALDI-TOF MS. Dostarcza wyniki taksonomiczne porównywalne z sekwencjonowaniem 16S rRNA, z krótszym czasem realizacji niż tradycyjne metody hodowla.

Ocena bezpieczeństwa mikroorganizmów w mleczarstwach za pomocą profilowania bakteryjnego proteomicznego za pomocą podejścia MALDI

Rehabilitacja oddechowa jest powszechnie uznawana w leczeniu chorób układu oddechowego. Kluczowym elementem udanej rehabilitacji oddechowej jest przestrzeganie zalecanego treningu fizycznego. Celem niniejszego protokołu jest opisanie sposobu, w jaki technologia ciągłego śledzenia danych może być wykorzystana do precyzyjnego pomiaru przestrzegania zalecanej intensywności treningu aerobowego.

Wykorzystanie technologii ciągłego śledzenia danych do badania przestrzegania zaleceń dotyczących ćwiczeń w rehabilitacji pulmonologicznej

Poznaj metodę rekonstrukcji mikrobioty mleka kobiecego w pasteryzowanym mleku dawczym. Protokół umożliwia odtworzenie naturalnej mikroflory i poprawę wartości odżywczej dla noworodków w szpitalach położniczych.

Zindywidualizowana rekonstrukcja mikrobioty mleka kobiecego: wykonalne podejście w warunkach rzeczywistych

Przeglądaj więcej filmów