Metoda obrazowania 2-fotonowego przepływu krwi w korze nowej przez okienko czaszki

Zdolność do obrazowania unaczynienia mózgowego i rejestrowania dynamiki przepływu krwi w nienaruszonym mózgu żywych gryzoni jest potężną techniką, którą można zastosować do badania niedokrwienia mózgu lub normalnej fizjologii mózgu. Tutaj pokażemy, jak wykorzystać dwie mikroskopy fotograficzne do zobrazowania dynamiki przepływu krwi w korze nowej żywych myszy za pomocą barwników fluorescencyjnych wstrzykniętych do żyły ogonowej. Technika ta została pierwotnie opracowana przez Davida Kleinfelda w Winfred Dank.

Cześć, nazywam się Ricardo Mota i pracuję w laboratorium Carlosa Portera Cayo na Wydziale Neurologii Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles. W poprzednim filmie pokazaliśmy metodę wszczepiania okna czaszkowego do eksperymentów z obrazowaniem przewlekłym in vivo. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę obrazowania dynamiki przepływu krwi w korze mózgowej przez okno czaszki.

Preparat ten jest bardzo przydatny, ponieważ pozwala na obrazowanie głębokiego wnętrza mózgu za pomocą fotonowej mikroskopii laserowej. Więc zacznijmy. Aby zobrazować układ naczyniowy mózgu, zwierzętom należy wstrzyknąć dożylnie barwnik fluorescencyjny.

Używamy barwników sprzężonych z Dexterem, ponieważ dextron moty zapobiega przekraczaniu bariery krew-mózg i wyciekaniu barwnika z naczyń krwionośnych. Myszy są znieczulane izofluorem, 4% do indukcji i 1,5 do 2% podczas wstrzyknięcia. Następnie ogon dezynfekuje się trzema wacikami 70% alkoholu za pomocą igły o rozmiarze 26, przez żyłę ogonową wstrzykuje się od 75 do stu mikrolitrów 5% roztworu Dekstranu R-dominy rozpuszczonego w soli fizjologicznej.

W połowie długości trzonu ogona zwierzęta można obrazować natychmiast po wstrzyknięciu żyły ogonowej, aż do momentu, gdy matryca zostanie wydalona z moczem, który zmieni kolor na różowy w przypadku użycia barwnika dominowego ERO W ciągu około dwóch godzin po wstrzyknięciu fluorescencyjnego barwnika Dexter, Mysz jest znieczulana izofluorem. Ponownie, 4% do indukcji, od jednego do 1,5% do obrazowania. Mysz jest mocno przymocowana za pomocą tytanowego pręta do stolika mikroskopu, który zawiera regulowaną termicznie poduszkę grzewczą, aby utrzymać zwierzę w cieple.

Nakłada się maść do oczu, aby oczy były wilgotne. Szybę nakrywkową okna czaszki czyści się 70% alkoholem. Okno jest ustawione równolegle do płaszczyzny ogniskowej i wyśrodkowane w polu widzenia.

Pod obiektywem four x najlepiej jest zrobić zdjęcie naczyń na powierzchni mózgu za pomocą aparatu cyfrowego. Obraz ten zostanie wykorzystany jako obraz referencyjny w kolejnych sesjach obrazowania w celu wielokrotnego znajdowania obszaru obrazu z dnia na dzień. Obiektyw z czterema x jest następnie zastępowany obiektywem 40 x zanurzonym w wodzie.

Bez przesuwania stołu montażowego wykonywany jest cyfrowy obraz widoku. Również w tym przypadku współrzędne manipulatora stolika są ustawione na zero. Używamy zeskanowanego obrazu jako oprogramowania do akwizycji obrazu.

Zostało to napisane w MATLABie przez Toma Paula Rudo i Bernardo Sabatiniego w laboratorium Carls Voto. Następnie włączamy wszystkie inne urządzenia, laser, miernik mocy, lampy powielacza zdjęć, wzmacniacze i tak dalej. Obszar okna nadający się do zobrazowania jest krótko skanowany w małym powiększeniu, aby znaleźć najlepsze obszary.

Po ich zidentyfikowaniu wykonywany jest stos o małym powiększeniu wybranego obszaru do zobrazowania, a jego współrzędne XY są opisywane w celu zarejestrowania dynamiki przepływu krwi w małych naczyniach lub naczyniach włosowatych. Używamy skanów liniowych wzdłuż co najmniej 40 mikronów interesującego nas naczynia. Te pojedyncze przemiatanie trwające jedną sekundę jest wykonywane przy użyciu jak najmniejszej mocy lasera, a współrzędne i kąt skanowania są zapisywane.

Po zakończeniu sesji obrazowania zwierzę jest przenoszone do ciepłej komory, gdzie może dojść do siebie po znieczuleniu. Tutaj pokazujemy stos stu zdjęć wykonanych co pięć mikronów naszym mikroskopem dwufotonowym przez okienko czaszki umieszczone nad korą somatosensoryczną pięciomiesięcznej myszy, której wstrzyknięto dekstran r Domine przez żyłę ogonową. Ta sekwencja obrazów pokazuje złożoną sieć dużych i małych naczyń krwionośnych, w tym naczyń włosowatych.

Właśnie pokazaliśmy Ci metodę wizualizacji dynamiki przepływu krwi in vivo przez okno czaszkowe. Jest to niezwykle skuteczna metoda obrazowania dynamiki przepływu krwi w mózgu w korze naczyniowej, na przykład w celu zbadania zmian w przepływie krwi po udarze. W BUL można wykonać wiele wyobrażeń w różnym czasie, używając powtarzających się iniekcji barwnika fluorescencyjnego do żyły ogonowej.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o pracy w możliwie najczystszych i bardziej sterylnych warunkach oraz o bardzo pewnej ręce. Dobra, i to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymencie.