Name: Metoda obrazowania 2-fotonowego przepływu krwi w korze nowej przez okienko czaszki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-25T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Poznaj metodę obrazowania dynamiki przepływu krwi w korze nowej myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej przez okienko czaszki. Technika umożliwia badanie fizjologii mózgu i niedokrwienia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Iniekcje fluorescencyjnych barwników dekstranowych do żyły ogonowej
<ol>
<li>Aby obrazować naczynia krwionośne mózgu, zwierzęta muszą otrzymać dożylny zastrzyk z barwnika fluorescencyjnego. Stosujemy barwniki sprzężone z dekstranem, ponieważ frakcja dekstranu zapobiega przenikaniu barwnika przez barierę krew-mózg i jego wyciekaniu z naczyń krwionośnych.</li>
<li>Myszy poddaje się anestezji izofluranem (4% do indukcji, 1,5-2% podczas wstrzykiwania).</li>
<li>Ogon zostaje zdezynfekowany 70% alkoholem.</li>
<li>Za pomocą igły o rozmiarze 26 G wstrzyknięto do żyły ogonowej, w połowie długości ogona, 75-100 µl 5% v/v roztworu dekstranu z rodamyną rozpuszczonego w soli fizjologicznej.</li>
<li>Obrazowanie zwierząt można przeprowadzić niezwłocznie po wstrzyknięciu do żyły ogonowej, aż do momentu wydalenia barwnika z moczem, który w przypadku użycia barwnika z rodamyną zabarwi się na różowo po około 2 godzinach.</li>
</ol>
Obrazowanie przepływu krwi za pomocą mikroskopii dwufotonowej (całkowity czas trwania 30-60 min na sesję, w zależności od liczby obrazowanych naczyń)
<ol>
<li>Po wstrzyknięciu fluorescencyjnego barwnika dekstranowego mysz zostaje znieczulona izofluranem (4% do indukcji, 1-1,5% podczas obrazowania).</li>
<li>Mysz zostaje mocno przymocowana za pomocą tytanowego pręta do stolika mikroskopu, który jest wyposażony w termoregulowaną podkładkę grzewczą w celu utrzymania ciepłoty ciała zwierzęcia. W celu nawilżenia oczu stosuje się maść do oczu.</li>
<li>Szkiełko przykrywowe okna czaszkowego zostaje oczyszczone 70% alkoholem.</li>
<li>Okno ustawia się równolegle do płaszczyzny ogniskowej i centruje w polu widzenia pod obiektywem 4X.</li>
<li>Zaleca się wykonanie fotografii naczyń powierzchniowych mózgu za pomocą aparatu cyfrowego. Zdjęcie to będzie służyć jako obraz referencyjny w kolejnych sesjach obrazowania, aby umożliwić powtarzalne odnajdywanie obrazowanego obszaru z dnia na dzień.</li>
<li>Obiektyw 4X zastępuje się obiektywem imersyjnym w wodzie 40X bez przesuwania stolika. Ponownie wykonuje się cyfrowe zdjęcie pola widzenia. Współrzędne na manipulatorze stolika ustawia się na zero.</li>
<li>Jako oprogramowanie do akwizycji obrazu wykorzystujemy ScanImage. Zostało ono napisane w MatLab przez Toma Pologruto i Bernardo Sabatiniego w laboratorium Karela Svobody (Pologruto et al., 2003). Następnie włączamy pozostały sprzęt: laser, miernik mocy, fotopowielacze, wzmacniacze itp.</li>
<li>Obszar okna nadający się do obrazowania jest krótko skanowany przy niskim powiększeniu w celu znalezienia najlepszych regionów. Po ich zidentyfikowaniu wykonuje się stos obrazów (stack) wybranego regionu przy niskim powiększeniu i zapisuje jego współrzędne XY.</li>
<li>Do rejestracji dynamiki przepływu krwi w małych naczyniach lub kapilarach stosujemy skanowanie liniowe wzdłuż co najmniej 40 µm badanego naczynia. Te pojedyncze „przesunięcia” (sweeps) trwające jedną sekundę są wykonywane przy użyciu jak najmniejszej mocy lasera, a współrzędne i kąt skanowania zostają zapisane.</li>
<li>Po zakończeniu sesji obrazowania zwierzę zostaje przeniesione do ciepłej komory, w której może dojść do wybudzenia z narkozy.</li>
</ol>

<ol><li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc Nat Acad Sci. 95, 15741-15746 (1998).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Eng.+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed. Eng. Online. 17, 2-13 (2003).</li>
<li>Zhang, S., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+impact+of+cortical+microcirculation+on+synaptic+structure+and+sensory-evoked+hemodynamic+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Imaging the impact of cortical microcirculation on synaptic structure and sensory-evoked hemodynamic responses in vivo.</a> 5, (2007).</li>
<li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proc Nat Acad Sci. 104, 365-370 (2007).</li>
</ol>

Dynamikę przepływu krwi w korze mózgu można badać in vivo, obrazując fluorescencyjne barwniki dekstranowe wstrzykiwane do żyły ogonowej gryzoni za pomocą mikroskopii dwufotonowej. W tym filmie zaprezentowano metodę obrazowania dynamiki przepływu krwi w nowokorze myszy z wykorzystaniem preparatu okna czaszkowego pokrytego szkłem.

<table><tbody><tr><td>Dekstran znakowany izotiocyjanianem fluoresceiny</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD500S</td><td>mol wt 500,000</td></tr><tr><td>Dekstran znakowany izotiocyjanianem rodaminy B</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9379</td><td>mol wt ~70,000</td></tr></tbody></table>

metoda obrazowania przepływu krwi w neokorze za pomocą obrazowania dwufotonowego przez okno czaszkowe

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

Zdolność do obrazowania naczyń krwionośnych mózgu (od dużych naczyń po kapilary) oraz rejestrowania dynamiki przepływu krwi w nienaruszonym mózgu żywych gryzoni jest potężną techniką. Dzięki zastosowaniu mikroskopii dwufotonowej in vivo przez okno czaszkowe możliwe jest obrazowanie barwników fluorescencyjnych wstrzykiwanych dożylnie. Pozwala to na obrazowanie naczyń korowych, a także na pomiar przepływu krwi. Technika ta została pierwotnie opracowana przez Davida Kleinfelda i Winfrieda Denka. Metoda ta może być wykorzystywana do badania dynamiki przepływu krwi podczas lub po niedokrwieniu mózgu, w chorobach neurodegeneracyjnych, w nowotworach mózgu lub w fizjologii zdrowego mózgu. Przykładowo, wykorzystano ją do zbadania, w jaki sposób udar powoduje zmiany kierunku przepływu krwi oraz zmiany prędkości lub strumienia erytrocytów w obrębie i wokół obszaru zawału. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak wykorzystać mikroskopię dwufotonową do obrazowania dynamiki przepływu krwi w neokorze żywych myszy przy użyciu barwników fluorescencyjnych wstrzykiwanych do żyły ogonowej.

Dynamikę przepływu krwi w korze mózgu można badać in vivo, obrazując fluorescencyjne barwniki dekstranowe wstrzyknięte do żyły ogonowej gryzoni za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Niniejszy film pokazuje, jak obrazować dynamikę przepływu krwi w neocortex myszy przy użyciu preparatu okna czaszkowego przykrytego szkłem.

Metoda obrazowania przepływu krwi w neokorze za pomocą obrazowania dwufotonowego przez okno czaszkowe

Zdolność do obrazowania naczyń krwionośnych mózgu (od dużych naczyń po naczynia włosowate) oraz rejestrowania dynamiki przepływu krwi w nienaruszonym mózgu żyjących gryzoni jest ...

Zdolność do obrazowania naczyń krwionośnych mózgu i rejestrowania dynamiki przepływu krwi w nienaruszonym mózgu żywych gryzoni jest potężną techniką, którą można zastosować w badaniach niedokrwienia mózgu lub prawidłowej fizjologii mózgu. Poniżej zademonstrujemy, jak wykorzystać dwie metody mikroskopii foto do obrazowania dynamiki przepływu krwi w nowokorze żywych myszy przy użyciu barwników fluorescencyjnych wstrzykiwanych do żyły ogonowej. Technika ta została pierwotnie opracowana przez Davida Kleinfelda oraz Winfreda Danka.Cześć, jestem Ricardo Mota z Laboratorium Carlosa Portera Cayo w Katedrze Neurologii na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles. W poprzednim filmie przedstawiliśmy metodę implantacji okna czaszkowego do chronicznych eksperymentów obrazowych in vivo. Dziś zaprezentujemy procedurę obrazowania dynamiki przepływu krwi w korze mózgowej poprzez okno czaszkowe.Przygotowanie to jest bardzo użyteczne, ponieważ umożliwia obrazowanie głębokich struktur mózgu przy użyciu dwufotonowej mikroskopii laserowej. Przejdźmy zatem do realizacji. Aby obrazować naczynia krwionośne mózgu, zwierzęta muszą otrzymać dożylnie wstrzyknięty barwnik fluorescencyjny.Stosujemy barwniki sprzężone z dekstranem, ponieważ cząsteczka dekstranu zapobiega przenikaniu barwnika przez barierę krew-mózg oraz jego wyciekowi z naczyń krwionośnych. Myszy znieczula się izofluranem w stężeniu 4% podczas indukcji oraz 1,5 do 2% w trakcie wstrzykiwania. Następnie ogon dezynfekuje się trzema tamponami z 70% alkoholu, a za pomocą igły 26G wstrzykuje się do żyły ogonowej od 75 do 100 µL 5% roztworu Rodamine Dextran rozpuszczonego w soli fizjologicznej.W połowie długości ogona zwierzęta mogą być obrazowane bezpośrednio po wstrzyknięciu do żyły ogonowej, aż do momentu wydalenia barwnika z moczem, który w przypadku zastosowania barwnika ERO domine przybierze różowy kolor. Około dwie godziny po wstrzyknięciu fluorescencyjnego barwnika Dextera mysz poddawana jest anestezji izofluranem: w stężeniu 4% podczas indukcji oraz od 1 do 1,5% podczas obrazowania. Mysz jest mocno przymocowana za pomocą tytanowego pręta do stolika mikroskopu, który jest wyposażony w termoregulatorowaną podkładkę grzewczą w celu utrzymania ciepła ciała zwierzęcia.Nanoszona jest maść do oczu, aby utrzymać ich wilgotność. Szkiełko nakrywkowe okna czaszkowego jest czyszczone 70% alkoholem. Okno jest ustawiane równolegle do płaszczyzny ogniskowej i centrowane w polu widzenia.Przy użyciu obiektywu 4x najlepiej wykonać fotografię naczyń powierzchniowych mózgu za pomocą aparatu cyfrowego. Zdjęcie to będzie służyć jako obraz referencyjny w kolejnych sesjach obrazowania, aby każdego dnia odnajdywać ten sam obszar obrazu. Następnie obiektyw 4x zastępuje się obiektywem imersyjnym w wodzie 40x.Bez przesuwania stolika wykonuje się cyfrowe zdjęcie widoku. Następnie współrzędne manipulatora stolika zostają ponownie ustawione na zero. Jako oprogramowanie do akwizycji obrazu wykorzystujemy program scan image.Program ten został napisany w środowisku MATLAB przez Toma Paula Rudo i Bernardo Sabatiniego w laboratorium Carls Voto. Następnie włączamy całą pozostałą aparaturę: laser, miernik mocy, fotopowielacze, wzmacniacze i tym podobne. Obszar okna nadający się do obrazowania jest krótko skanowany przy niskim powiększeniu w celu znalezienia najlepszych regionów.Po ich zidentyfikowaniu wykonuje się stos obrazów o niskim powiększeniu wybranego obszaru do obrazowania i zapisuje jego współrzędne XY, aby zarejestrować dynamikę przepływu krwi w małych naczyniach lub kapilarach. Wykonujemy skany liniowe wzdłuż co najmniej 40 µm interesującego nas naczynia. Pojedyncze przejścia trwające jedną sekundę są realizowane przy użyciu jak najmniejszej mocy lasera, a współrzędne i kąt skanowania zostają zapisane.Po zakończeniu sesji obrazowania zwierzę zostaje przeniesione do ciepłej komory, w której może dojść do niego do procesu wybudzania z narkozy. Przedstawiamy tutaj stos stu obrazów wykonanych co 5 µm za pomocą mikroskopu dwufotonowego przez okno czaszkowe umieszczone nad korą somatosensoryczną pięciomiesięcznej myszy, której do żyły ogonowej wstrzyknięto r Domine dextran. Ta sekwencja obrazów ukazuje złożoną sieć dużych i małych naczyń krwionośnych, w tym kapilar.Przedstawiliśmy metodę wizualizacji dynamiki przepływu krwi in vivo poprzez okno czaszkowe. Jest to niezwykle skuteczna metoda obrazowania dynamiki przepływu krwi mózgowej w naczyniach korowych, na przykład do badania zmian w przepływie krwi po udarze. Dzięki wielokrotnym iniekcjom fluorescencyjnego barwnika do żyły ogonowej można przeprowadzać wielokrotne obrazowanie w różnych odstępach czasu.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o pracy w jak najczystszych i najbardziej sterylnych warunkach oraz o zachowaniu wyjątkowej precyzji ruchów dłoni. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymencie.

a-method-for-2-photon-imaging-blood-flow-neocortex-through-cranial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda obrazowania 2-fotonowego przepływu krwi w korze nowej przez okienko czaszki

Niniejszy film i protokół demonstrują sposób implantacji pokrytego szkłem okna czaszkowego u gryzoni. Preparaty te mogą być wykorzystywane do przewlekłego obrazowania dwufotonowego neocortex in vivo w skalach czasowych obejmujących wiele miesięcy. Mogą one być również stosowane w innych rodzajach obrazowania, w tym w obrazowaniu sygnałów optycznie immanentnych.

Procedura kraniotomii w celu przewlekłego obrazowania mózgu

W tym filmie i materiałach uzupełniających przedstawiamy protokół przewlekłego obrazowania in vivo nienaruszonego mózgu z wykorzystaniem preparacji z cienkiej czaszki.

Przewlekłe obrazowanie kory wzrokowej myszy z wykorzystaniem preparatu z pocienioną czaszką

Przedstawiamy metodę tworzenia okna obrazującego w czaszce myszy, które obejmuje obszar o wielkości kilku milimetrów i pozostaje stabilne przez wiele miesięcy bez wywoływania stanu zapalnego mózgu. Metoda ta jest odpowiednia do podłużnych badań przepływu krwi, dynamiki komórkowej oraz struktury komórkowej i naczyniowej z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej.

Polerowane i wzmocnione okno z cienkiej czaszki do długoterminowego obrazowania mózgu myszy

Źródło: Bisht, K., et al. Precyzyjne mapowanie mózgu w celu wykonywania powtarzalnych obrazowań in vivo dynamiki neuroimmunologicznej u myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film demonstruje obrazowanie fluorescencyjne dynamiki neuroimmunologicznej u transgenicznej myszy z implantem czaszki. Stabilność naczyniowa i neuronalna jest obrazowana wraz z dynamicznymi zmianami mikrogleju, odzwierciedlającymi odpowiedzi immunologiczne na aktywność neuronów.

Obrazowanie fluorescencyjne dynamiki neuroimmunologicznej za pomocą implantu czaszki

Opisano metodę znakowania neuronów barwnikami fluorescencyjnymi w określonych funkcjonalnych mikrodomenach kory nowej. Po pierwsze, obrazowanie optyczne sygnału wewnętrznego służy do uzyskania mapy funkcjonalnej. Następnie mikroskopia dwufotonowa jest używana do oznaczania i obrazowania neuronów w mikrodomenie mapy.

Celowane znakowanie neuronów w specyficznej funkcjonalnej mikrodomenie kory nowej poprzez połączenie sygnału wewnętrznego i obrazowania dwufotonowego

Zależne od doświadczenia zmiany molekularne w neuronach są niezbędne dla zdolności mózgu do adaptacji w odpowiedzi na wyzwania behawioralne.  Opisano tutaj metodę obrazowania dwufotonowego in vivo, która umożliwia śledzenie takich zmian molekularnych w poszczególnych neuronach korowych za pomocą genetycznie kodowanych reporterów.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie zależnych od doświadczenia zmian molekularnych w neuronach korowych

Opisujemy eksperymentalną procedurę pomiaru aktywności neuronalnej za pomocą podwójnych okien optycznych nad obustronnymi głównymi korami somatosensorycznymi (S1) u transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s przy użyciu mikroskopii 2-fotonowej (2P) in vivo.

Obrazowanie aktywności neuronalnej w pierwotnej korze somatosensorycznej przy użyciu transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s

Prezentujemy protokół obrazowania in vivo dwufotonowego do obrazowania kory mózgowej noworodków myszy. Metoda ta jest odpowiednia do analizy dynamiki rozwojowej neuronów korowych, mechanizmów molekularnych kontrolujących dynamikę neuronów oraz zmian w dynamice neuronów w modelach chorób.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie neuronów korowych u nowonarodzonych myszy

To badanie demonstruje dostarczanie powtarzających się urazowych uszkodzeń mózgu myszom i jednoczesne wszczepienie okna czaszkowego do późniejszego przyżyciowego obrazowania EGFP wyrażonego przez neuron za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Przyżyciowe obrazowanie ekspresji białek fluorescencyjnych u myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu i okienkiem czaszkowym przy użyciu mikroskopu dwufotonowego

Prezentujemy nowatorskie podejście do dwufotonowej mikroskopii dostarczania przez nowotwór znakowanych fluorescencyjnie nanocząstek tlenku żelaza do glejaka w modelu mysim.

Dwufotonowa mikroskopia przyżyteczna glejaka w modelu mysim

Poznaj metodę obrazowania dynamiki przepływu krwi w korze nowej myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej przez okienko czaszki. Technika umożliwia badanie fizjologii mózgu i niedokrwienia.

Metoda obrazowania przepływu krwi w neokorze za pomocą obrazowania dwufotonowego przez okno czaszkowe

Przeglądaj więcej filmów