Name: Analiza przepływu metabolicznego ex vivo w makrofagach śledziony i serca oraz monocytach szpiku kostnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T14:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Odkryj analizę przepływu metabolicznego w makrofagach serca i śledziony oraz monocytach szpiku kostnego. Ta metoda pozwala badać metabolizm komórek odpornościowych podczas zawału mięśnia sercowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować za fundusze, które wsparły tę pracę: NIH/NHBLI 166737, NIH R00 HL146888, NIH U54HL169191, NIH/NIGMS P20GM104357 i NIH/NIGMS P30GM149404 za tę pracę.

Poniższe metody opisują protokoły ekstrakcji makrofagów i przeprowadzania analizy ex vivo strumienia metabolicznego z serca po zawale serca, śledziony i szpiku kostnego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). W przypadku zawału serca i śledziony zastosowana metoda ekstrakcji jest identyczna. Wszystkie protokoły z udziałem myszy zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Centrum Medycznego Uniwersytetu Mississippi (Protokół #1371, Mouton).
1. Ekstrakcja makrofagów z zawału serca i śledziony
UWAGA: Ekstrakcja makrofagów tkankowych wykorzystuje strategię selekcji negatywnej do usunięcia najpierw neutrofili, które są oznaczone mikrogranulkami Ly6G, a następnie strategię selekcji pozytywnej do uzyskania makrofagów z mikrogranulkami CD11b3,4,5,6. Wykonując ten protokół, pracuj szybko i utrzymuj komórki w niskiej temperaturze.
<ol>
	<li>Poddać mysz eutanazji zgodnie z AALAC i wytycznymi instytucjonalnymi poprzez przedawkowanie izofluranu, a następnie usunięcie serca.</li>
	<li>Szybko usuń serce i śledzionę i zważ tkanki.</li>
	<li>Przed badaniem należy przygotować bufor PEB, rozpuszczając EDTA (2 mM) i 0,5% albuminę surowicy bydlęcej (w/v) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Przechowywać w chłodzie.</li>
	<li>Umieść serce w zimnym zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS). Zmiel sterylnym skalpelem na małe kawałki.</li>
	<li>Przygotować roztwór wytrawiający zawierający 600 j./ml kolagenazy typu II i 60 μ/ml DNazy typu I. Wymieszać tkankę w 10 ml roztworu trawiącego w probówce do dysocjacji komórek MACS. 
	UWAGA: Przygotuj wystarczającą ilość roztworu wytrawiającego, aby użyć 10 ml na każdą tkankę (temperatura pokojowa).</li>
	<li>Inkubować tkanki za pomocą dysocjatora komórkowego zgodnie z protokołem producenta. Spowoduje to inkubację tkanki mielonej w temperaturze 37 °C z delikatnym wirowaniem przez ~1 godzinę w celu wytworzenia zawiesiny komórek.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę do stożkowych probówek o pojemności 15 ml i odwirować przy stężeniu 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml buforu PEB. Aby wytworzyć zawiesinę jednokomórkową, należy nałożyć zawiesinę na filtr 30 μm.</li>
	<li>Aby zlizować czerwone krwinki, dodaj 10 ml 1x roztworu do lizy czerwonych krwinek. Inkubować przez 5-10 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę o masie 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml PEB i policzyć komórki za pomocą hemacytometru.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę o stężeniu 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Aby usunąć neutrofile, przygotuj mikrogranulki, mieszając 90 μl buforu PEB z 10 μl mikrogranulek anty-Ly6G na 107 komórek. Wymieszać osad komórkowy z zawiesiną mikrogranulek i inkubować przez 10 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Aby wypłukać niezwiązane mikrogranulki, dodać 10 ml buforu PEB i odwirować w temperaturze 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj kolumny magnetyczne (MS lub LS) na stojaku magnetycznym. Zwilż kolumny, dodając 0,5-1,0 ml buforu PEB. 
	UWAGA: W przypadku tkanek z dużą ilością komórek odpornościowych (np. śledziona) kolumna magnetyczna może łatwo się zatkać i przestać płynąć. Dlatego zalecamy stosowanie kolumn LS do śledziony.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu PEB. Dodaj zawiesinę komórkową do kolumny magnetycznej i pozwól nieznakowanym komórkom (tj. nie-neutrofilom) przepłynąć. Przemyć kolumnę 2x 500 μL buforu PEB. Zbierz nieznakowane komórki (tj. makrofagi i inne komórki) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę o stężeniu 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj mikrogranulki, mieszając 90 μl buforu PEB z 10 μl mikrogranulek anty-CD11b na10-7 komórek. Wymieszać osad komórkowy z zawiesiną mikrogranulek i inkubować przez 15 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.13-1.15.</li>
	<li>Oznaczone makrofagi zostaną związane z kolumną magnetyczną. Aby je zebrać, odłącz kolumnę magnetyczną od stojaka magnetycznego i umieść ją na nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodać 1 ml pożywki RPMI uzupełnionej 0,1% płodową surowicą bydlęcą (FBS) do kolumny. Użyj tłoka, aby wyekstrahować makrofagi do probówki. Policz makrofagi za pomocą hemacytometru. 
	UWAGA: Makrofagi znajdują się teraz w probówce i są gotowe do użycia do dalszych testów.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja monocytów ze szpiku kostnego
UWAGA: Ekstrakcja monocytów ze szpiku kostnego wykorzystuje strategię selekcji negatywnej, w której nie-monocyty, w tym limfocyty, komórki NK, komórki dendrytyczne, komórki erytroidalne i granulocyty (tj. neutrofile), są znakowane immunomagnetycznie i usuwane.
<ol>
	<li>Poddać mysz eutanazji zgodnie z AALAC i wytycznymi instytucjonalnymi poprzez przedawkowanie izofluranu, a następnie usunięcie serca.</li>
	<li>Zdejmij nóżki z myszy. W zimnym HBSS wypreparuj mięsień z dala od kości piszczelowej i udowej, aż kości będą czyste.</li>
	<li>Ostrożnie odetnij oba końce kości. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o pojemności 27 g wypłukać szpik kostny do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z buforem PEB. Odwirować zawiesinę o stężeniu 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wykonaj kroki 1.8-1.12.</li>
	<li>Dodać 175 μl buforu PEB, 25 μl odczynnika blokującego FcR i 50 μl koktajlu przeciwciał biotynowych monocytów na 5 × 107 wszystkich komórek. Inkubować przez 5 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć przez dodanie 10 ml buforu PEB i odwirować w temperaturze 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zebrać osad i ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu PEB i 100 μl mikrogranulek antybiotyny. Inkubować przez 10 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj kolumny magnetyczne (LS) na stojaku magnetycznym. Zwilż kolumny, dodając 1,0 ml buforu PEB.</li>
	<li>Natychmiast nałóż zawiesinę komórek na kolumnę. Użyj probówki o pojemności 15 ml, aby zebrać przepływ, który zawiera monocyty. Niemonocyty są związane z kolumną magnetyczną.</li>
	<li>Przemyć kolumnę 2x 1 ml buforu PEB. Policz monocyty za pomocą hemacytometru.</li>
	<li>Aby przygotować monocyty do następnego etapu, odwirować w temperaturze 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. W celu analizy strumienia ponownie zawieś osad komórek w 1 ml RPMI + 0,1% FBS. W przypadku cytometrii przepływowej trzymaj komórki w zimnym PEB i kontynuuj barwienie.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek do analizy strumienia metabolicznego
<ol>
	<li>Uwodnić wkład czujnika (dzień przed testem)
	<ol>
		<li>Wyjmij wkład czujnika z opakowania. Wyjmij płytkę czujnika (zieloną) z dołków i odpipetuj 200 μl płynu kalibrowego do każdej studzienki. Umieść płytkę czujnika z powrotem na górze płytki wkładu, tak aby czujniki były zanurzone w płynie kalibru.</li>
		<li>Umieścić wkład w inkubatorze z nawilżonym roztworemCO2 (37 °C) na noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Posiewanie ogniw
	<ol>
		<li>Umieścić komórki na 96-dołkowej płytce hodowlanej w 200 μl pożywki przez co najmniej 1 godzinę. Pozostawić co najmniej jedną studzienkę ślepą do pomiarów tła (użyć tej samej objętości pożywki do ślepych studzienek). 
		UWAGA: Optymalna liczba komórek powinna zostać określona przed eksperymentowaniem. Zobacz "Wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów" w dyskusji, aby uzyskać więcej informacji.</li>
		<li>Gdy będziesz gotowy do wykonania testu, przygotuj pożywkę strumienia metabolicznego (tj. podstawowy RPMI lub DMEM bez glukozy, glutaminy, pirogronianu itp.). W teście wysiłkowym glikolizy upewnij się, że podłoże podstawowe jest uzupełnione 2 mM glutaminą. W teście wysiłkowym mitochondriów upewnij się, że podłoże podstawowe jest uzupełnione 2 mM glutaminy, 10 mM glukozy i 1 mM pirogronianu.</li>
		<li>Ostrożnie zastąp starą pożywkę nową pożywką podstawową, powoli pipetując (należy uważać, aby nie usunąć żadnych komórek). Sprawdź komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że są nadal obecne.</li>
		<li>Umieścić płytkę komórkową w inkubatorze z nawilżaniem niezawierającym CO2 (37 °C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ładowanie płyty topnika
	<ol>
		<li>Wyjmij uwodniony wkład czujnika/płytkę topnika z inkubatora.</li>
		<li>Przygotować badane związki do glikolizy lub testu wysiłkowego mitochondriów.
		<ol>
			<li>Glikoliza: Używając pożywek bazowych glikolizy, utwórz roztwory podstawowe, rozpuszczając glukozę w 3 ml, oligomycynę w 270 μl (100 μM) i 2-deoksyglukozę w 3 ml. Stworzyć roboczy roztwór oligomycyny o stężeniu 10 μM.</li>
			<li>Mitochondrialne: Używając mitochondrialnych pożywek podstawowych, twórz roztwory podstawowe, rozpuszczając oligomycynę w 630 μl (100 μM), cyjanek karbonylu-p-trifluorometoksyfenylohydrazon (FCCP) w 720 μl (100 μM) i rotenon/antymycynę A w 540 μl (50 μM). Tworzenie roztworów roboczych oligomycyny (0,5-2,5 μM), FCCP (0,125-2,0 μM) i rotenonu/antymycyny A (0,5 μM). 
			UWAGA: Odkryliśmy, że 1,5 μM oligomycyny i 2,0 μM FCCP dają najlepsze wyniki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Załaduj związki testowe do portów przy użyciu następujących objętości: port A-20 μL, port B-22 μL, port C-25 μL, port D-27 μL. Opcjonalnie: Załaduj wybrany lek lub związek do portu A i przetestuj związki do portu B, C i D, aby ocenić ostry wpływ na glikolizę lub oddychanie mitochondrialne. Jeśli nie używasz dodatkowego leku lub związku, pozostaw port D pusty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchamianie testu
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie i wybierz Mitochondrialny Test Stresu. 
		UWAGA: Ten program może być również używany do testu wysiłkowego glikolizy, ponieważ mierzony jest stopień zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR).</li>
		<li>Wybierz studnie, które będą używane. Aby odjąć tło, upewnij się, że co najmniej 1 studzienka nie ma komórek.</li>
		<li>Uruchom program. Załaduj płytkę topnika ze zdjętą pokrywką, aby płyta została skalibrowana (~20 min).</li>
		<li>Po skalibrowaniu płytki oprogramowanie wyświetli monit o załadowanie płytki ogniwa. Wyjmij płytkę komórkową z inkubatora, zdejmij spód płytki topnika i umieść płytkę komórkową w uchwycie. Naciśnij uruchom. Test zajmie ~2,5 godziny.</li>
		<li>Analizuj wyniki za pomocą oprogramowania do strumienia metabolicznego7 lub innego wybranego oprogramowania analitycznego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ma, Y., Mouton, A. J., Lindsey, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+macrophage+biology+in+the+steady-state+heart%2C+the+aging+heart%2C+and+following+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac macrophage biology in the steady-state heart, the aging heart, and following myocardial infarction.</a> Transl Res. 191, 15-28 (2018).</li>
<li>Mouton, A. J., Li, X., Hall, M. E., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+hypertension%2C+and+cardiac+dysfunction%3A+Novel+roles+of+immunometabolism+in+macrophage+activation+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Obesity, hypertension, and cardiac dysfunction: Novel roles of immunometabolism in macrophage activation and inflammation.</a> Circ Res. 126 (6), 789-806 (2020).</li>
<li>Mouton, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimethyl+fumarate+preserves+left+ventricular+infarct+integrity+following+myocardial+infarction+via+modulation+of+cardiac+macrophage+and+fibroblast+oxidative+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Dimethyl fumarate preserves left ventricular infarct integrity following myocardial infarction via modulation of cardiac macrophage and fibroblast oxidative metabolism.</a> J Mol Cell Cardiol. 158, 38-48 (2021).</li>
<li>Mouton, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+changes+in+glucose+metabolism+reflect+polarization+in+resident+and+monocyte-derived+macrophages+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Temporal changes in glucose metabolism reflect polarization in resident and monocyte-derived macrophages after myocardial infarction.</a> Front Cardiovasc Med. 10, 1136252(2023).</li>
<li>Mouton, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+metabolism+improves+left+ventricular+function+but+not+macrophage-mediated+inflammation+following+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glutamine metabolism improves left ventricular function but not macrophage-mediated inflammation following myocardial infarction.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 327 (3), C571-C586 (2024).</li>
<li>Mouton, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+macrophage+polarization+over+the+myocardial+infarction+time+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Mapping macrophage polarization over the myocardial infarction time continuum.</a> Basic Res Cardiol. 113 (4), 26(2018).</li>
<li>XF software. Agilent Seahorse Analytics. , Agilent Technologies, Inc. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/agilent-seahorse-analytics-787485">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/agilent-seahorse-analytics-787485</a> (2025).</li>
<li>Matsuura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+suppresses+glucose+uptake+and+glycolysis+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Diabetes suppresses glucose uptake and glycolysis in macrophages.</a> Circ Res. 130 (5), 779-781 (2022).</li>
<li>Alexander, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmal1+integrates+mitochondrial+metabolism+and+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Bmal1 integrates mitochondrial metabolism and macrophage activation.</a> Elife. 9, e54090(2020).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+regulates+macrophage-associated+inflammation+and+angiogenesis+in+alcohol-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatol+Commun%22%5BJournal%5D)">miR-34a regulates macrophage-associated inflammation and angiogenesis in alcohol-induced liver injury.</a> Hepatol Commun. 7 (4), e0089(2023).</li>
<li>Nomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+oxidation+in+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fatty acid oxidation in macrophage polarization.</a> Nat Immunol. 17 (3), 216-217 (2016).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolytic+reprogramming+in+macrophages+and+MSCs+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Glycolytic reprogramming in macrophages and MSCs during inflammation.</a> Front Immunol. 14, 1199751(2023).</li>
<li>Desousa, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+ATP+production+rates+using+the+Seahorse+XF+Analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Calculation of ATP production rates using the Seahorse XF Analyzer.</a> EMBO Rep. 24 (10), e56380(2023).</li>
<li>Lewis, A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+immunometabolic+cardiac+inflammation+imaging+using+hyperpolarized+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Noninvasive immunometabolic cardiac inflammation imaging using hyperpolarized magnetic resonance.</a> Circ Res. 122 (8), 1084-1093 (2018).</li>
<li>Walls, J., Romero, M. Assessing T cell bioenergetic poise and spare respiratory capacity using extracellular flux analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalls%2C+J+%22Agilent+Technologies+application+note%22">Agilent Technologies application note</a>. , 5994-4494 (2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Nasza metoda szczegółowo opisuje szybką ekstrakcję makrofagów ze szpiku kostnego, śledziony i serca po zawale, które można następnie wykorzystać do przeprowadzenia dalszych analiz, takich jak analiza zewnątrzkomórkowego strumienia metabolicznego. Połączenie tych dwóch metod jest potężnym narzędziem, które może określić ilościowo zmiany metaboliczne w makrofagach w różnych stanach chorobowych lub urazowych lub stanach metabolicznych, takich jak ćwiczenia. Podczas gdy nasza metoda koncentrowała się na makrofagach szpiku ko...

Immunometabolizm to kwitnąca dziedzina, która bada rolę metabolicznego przeprogramowania w komórkach odpornościowych w różnych stanach patologicznych chorób i urazów. Makrofagi są kluczową częścią wrodzonego układu odpornościowego, które odgrywają kluczową rolę w stanach zapalnych, odpowiedzi na infekcję, prezentacji antygenu i gojeniu się ran1. Zrozumienie, w jaki sposób makrofagi polaryzują się między podzbiorami pro- i przeciwzapalnymi (podobnymi do M1 i M2) w różnych stanach chorobowych, jest obszarem ciągłych i intensywnych badań. Ostatnie badania zidentyfikowały przeprogramowanie metaboliczne jako kluczowy mechanizm leżący u podstaw polaryzacji makrofagów. Obecny paradygmat jest taki, że ogólnie rzecz biorąc, makrofagi podobne do M1 (które są zazwyczaj podobne do monocytów) polegają bardziej na glikolizie w celu napędzania funkcji prozapalnych, podczas gdy makrofagi podobne do M2 polegają bardziej na mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej, aby stłumić funkcje prozapalne i napędzać procesy przeciwzapalne2. Zrozumienie, w jaki sposób metabolizm makrofagów zmienia się w różnych stanach chorobowych, może dostarczyć informacji na temat potencjalnych terapii, które można wykorzystać do celowania w szlaki metaboliczne.
Na przykład, nasze laboratorium dokładnie zbadało rolę przeprogramowania metabolicznego makrofagów podczas zawału mięśnia sercowego (MI)3,4,5. Makrofagi odgrywają kluczową rolę w odpowiedzi zapalnej i gojeniu się ran podczas zawału mięśnia sercowego i jako takie ulegają polaryzacji od fenotypów podobnych do M1 w kierunku M2, gdy serce po zawale przechodzi przebudowę w celu utworzenia zastępczej tkanki bliznowatej. Korzystając z opisanych tutaj metod, wykazaliśmy, że polaryzacja ta charakteryzuje się unikalnymi zmianami w metabolizmie glukozy i glutaminy oraz funkcji mitochondriów. Opisujemy metody ekstrakcji makrofagów sercowych, a także makrofagów śledziony i monocytów szpiku kostnego, które można połączyć z analizą strumienia zewnątrzkomórkowego w celu oceny przepływu metabolicznego ex vivo w ciągu jednego dnia. Mamy nadzieję, że opisane metody oferują ustandaryzowane podejście do oceny fenotypów metabolicznych komórek odpornościowych w celu zwiększenia odtwarzalności w laboratoriach badających ten ważny temat.

<table><tbody><tr><td>Mikrogranulki anty-CD11b UltraPure, mysz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-126-725</td><td></td></tr><tr><td>Mikrogranulki anty-Ly6G UltraPure, mysz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-120-337</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>Worthington</td><td>NC9522060</td><td></td></tr><tr><td>Dnaza typ I</td><td>MillPore Sigma</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS Octo Disocjator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Rurki GentleMACS C</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>Rurki do dysocjacji komórek MACS&nbsp;</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli</td><td>Hank Fisher Scientific</td><td>14-025-076</td><td></td></tr><tr><td>LS Kolumny magnetyczne</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny magnetyczne MS&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji monocytów Szpik kostny, mysz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-629</td><td>zawiera 1 ml koktajlu biotyny i przeciwciał monocytów, 2 ml mikrogranulek antybiotyny, 1 ml odczynnika blokującego FcR</td></tr><tr><td>Separator OctoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-108</td><td></td></tr><tr><td>Filtry do wstępnej separacji (30 &mikro; m)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Separator QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-051</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do lizy czerwonych krwinek (10x)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>Analizator Seahorse XFe96</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>103792-100</td><td>18 wkładów z czujnikiem Pro, 18 mikropłytek Pro Cell Cutlure, 1 butelka roztworu Seahorse XF Calibrant</td></tr><tr><td>Zestaw do testów wysiłkowych glikolizy Seahorse XF</td><td>Agilent</td><td>103020-100</td><td>6 jednorazowych saszetek, każdy z glukozą, oligomycyną i 2-deoksy-D-glukozą</td></tr><tr><td>Zestaw do testów wysiłkowych mitochondriów Seahorse XF</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td>6 jednorazowych saszetek, każda z oligomycyną, FCCP i rotenonem/antymycyną A</td></tr><tr><td>Seahorse XF RPMI Medium, pH 7,4, 500 ml</td><td>Agilent</td><td>103576-100</td><td>bez czerwieni fenolowej, wodorowęglanów, glukozy, pirogronianu lub glutaminy</td></tr></tbody></table>

analiza przepływu metabolicznego ex vivo w makrofagach śledziony i serca oraz monocytach szpiku kostnego

Analyzing Ex Vivo Metabolic Flux in Splenic and Cardiac Macrophages and Bone Marrow Monocytes

Przeprogramowanie metaboliczne jest cechą charakterystyczną aktywacji monocytów/makrofagów i polaryzacji między stanami pro- i przeciwzapalnymi. Na przykład prozapalne (tj. M1-podobne) monocyty/makrofagi wykazują większą zależność od glikolizy beztlenowej i mniejszą zależność od mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej, podczas gdy makrofagi przeciwzapalne (podobne do M2) wykazują większą zależność od utleniania glukozy i kwasów tłuszczowych w mitochondriach. W tym miejscu opisujemy szczegółowe protokoły ekstrakcji makrofagów z dwóch głównych rezerwuarów monocytów/makrofagów w organizmie, śledziony i szpiku kostnego, a także uszkodzonych tkanek, takich jak serce, po zawale mięśnia sercowego.
Makrofagi lub monocyty są ekstrahowane metodą sortowania immunomagnetycznego za pomocą mikrogranulek znakowanych przeciwciałami, które łatwo wiążą się z komórkami bez uszczerbku dla ich fenotypów. Wyekstrahowane komórki są następnie hodowane na 96-dołkowych płytkach, a następnie poddawane jest analizie strumienia zewnątrzkomórkowego za pomocą analizatora strumienia metabolicznego. Zarówno glikoliza, jak i mitochondrialna fosforylacja oksydacyjna mogą być mierzone jednocześnie w niewielkiej liczbie komórek (zaledwie 2-3 × 105 komórek). Ta metoda może być łatwo wykonana w ciągu 1 dnia i daje wiarygodne i powtarzalne wyniki. Ostatecznie metody te pomagają lepiej zrozumieć zmiany metaboliczne zachodzące podczas reakcji immunologicznej i zapalnej na urazy i choroby, co może prowadzić do opracowania nowych celów terapeutycznych dla szlaków immunometabolicznych.

Typowe liczby komórek uzyskane z różnych tkanek zależą od wielkości, wieku i płci zwierzęcia. W przypadku dorosłego samca myszy (tj. w wieku 16 tygodni, o masie ok. 30 g), śledziona może dostarczyć 3,0-4,0 × 106 makrofagi, podczas gdy szpik kostny (dwie kości piszczelowe i dwie kości udowe) zazwyczaj dostarcza 1,0-1,5 × 106 monocyty (Rycina 2A). Serce po zawale zazwyczaj również daje wysokie liczby, w zależności od dnia po MI4,<sup cla...

Tutaj szczegółowo opisujemy metody ekstrakcji makrofagów ze szpiku kostnego, śledziony i serca po zawale serca, a następnie oceny przepływu metabolicznego w żywych komórkach.

Analiza przepływu metabolicznego ex vivo w makrofagach śledziony i serca oraz monocytach szpiku kostnego

Metabolic reprogramming is a hallmark of monocyte/macrophage activation and polarization between pro- and anti-inflammatory states. For example, ...

Nasze badania koncentrują się na roli immunometabolizmu podczas zawału mięśnia sercowego. Chcemy zrozumieć, w jaki sposób zmiany w metabolizmie komórek odpornościowych regulują ich fenotyp podczas uszkodzenia serca i stanu zapalnego.Łączymy podejścia genetyczne in vivo z precyzyjną ekstrakcją komórek, fenotypowaniem komórek, fenotypowaniem metabolicznym, transkryptomiką i metabolomiką, aby lepiej zrozumieć wpływ metabolizmu makrofagów na przebudowę serca.Protokół ten pozwala nam zrozumieć, jak zmienia się metabolizm makrofagów po zawale mięśnia sercowego, w różnych stanach chorobowych, takich jak otyłość lub cukrzyca, oraz jak różne terapie wpływają na metabolizm makrofagów.Technika ta pozwala na szybką analizę świeżo wyekstrahowanych żywych makrofagów, unikając w ten sposób długotrwałej hodowli. Pozwala również na jednoczesną ocenę innych zmian fenotypowych w tych samych komórkach.Ten protokół pozwoli nam i innym lepiej zrozumieć metabolizm makrofagów w różnych stanach zapalnych lub autoimmunologicznych. Można go również zmodyfikować w celu zbadania innych podtypów immunologicznych.[Narrator] Na początek pobierz kości nóg od eksperymentalnej myszy i ostrożnie odetnij oba końce koś

analyzing-ex-vivo-metabolic-flux-splenic-cardiac-macrophages-bone

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Monocyty są kluczowymi regulatorami odporności wrodzonej i odgrywają kluczową rolę w odnowie obwodowego jednojądrzastego systemu fagocytarnego oraz w przypadku stanów zapalnych. W artykule opisano procedurę obrazowania w czasie rzeczywistym szpiku kostnego kalwarii myszy w celu zbadania mechanizmu mobilizacji monocytów.

Śledzenie monocytów szpiku kostnego myszy in vivo

Przeprogramowanie metaboliczne jest cechą charakterystyczną i warunkiem wstępnym polaryzacji makrofagów M1 i M2. Niniejszy manuskrypt opisuje test do pomiaru podstawowych parametrów glikolizy i funkcji mitochondriów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Narzędzie to można zastosować do zbadania, w jaki sposób poszczególne czynniki wpływają na metabolizm i fenotyp makrofagów.

Charakterystyka metaboliczna spolaryzowanych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego M1 i M2 przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Badanie metabolizmu staje się coraz bardziej istotne dla badań immunologicznych. W tym artykule przedstawiamy zoptymalizowaną metodę pomiaru glikolizy i oddychania mitochondrialnego w mysich splenocytach oraz limfocytach T i B.

Zoptymalizowany protokół analizy glikolizy i oddychania mitochondrialnego w limfocytach

Ten protokół przedstawia prostą i efektywną metodę izolacji, identyfikacji i ilościowego oznaczania komórek odpornościowych znajdujących się w mięśniu sercowym myszy podczas stanu stacjonarnego lub zapalnego. Protokół łączy trawienie enzymatyczne i mechaniczne w celu wytworzenia zawiesiny pojedynczej komórki, która może być dalej analizowana za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja i identyfikacja pozanaczyniowych komórek odpornościowych serca

Tutaj prezentujemy protokół izolacji komórek białaczkowych od szpiku kostnego chorych na białaczkę i analizy ich stanu metabolicznego. Ocena profilu metabolicznego komórek białaczki pierwotnej może pomóc w lepszym scharakteryzowaniu zapotrzebowania na komórki pierwotne i może prowadzić do bardziej spersonalizowanej medycyny.

Ocena profilu metabolicznego komórek białaczki pierwotnej

Hematopoetyczne komórki progenitorowe (HSPC) przechodzą ze stanu spoczynku do stanu różnicowania dzięki ich plastyczności metabolicznej podczas tworzenia krwi. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną metodę pomiaru oddychania mitochondrialnego i glikolizy HSPC.

Analiza metabolizmu krwiotwórczych komórek macierzystych

Przedstawiona tutaj metoda podsumowuje zoptymalizowane protokoły oceny bioenergetyki komórkowej w nieprzylegających mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i prymitywnych komórkach progenitorowych (HSPC) przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR) HSPC w czasie rzeczywistym.

Ocena bioenergetyki komórkowej w krwiotwórczych komórkach macierzystych myszy i prymitywnych komórkach progenitorowych przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

Tutaj opisujemy prosty protokół izolacji i barwienia mysich komórek szpiku kostnego do fenotypu hemopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych wraz z wspierającymi je niszowymi komórkami macierzystymi śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Uwzględniono również metodę wzbogacania komórek zlokalizowanych w obszarach śródkostnych i centralnych szpiku kostnego.

Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

Za pomocą modelu eksplantacji ex vivo, małe fragmenty części rostralnej tkanki tłuszczowej białej trzewnej od szczupłych myszy są hodowane przez 7–10 dni, co umożliwia indukcję i badanie zapalenia tkanki tłuszczowej, jak to ma miejsce podczas karmienia dietą wysokotłuszczową.

Ex vivo model myszy na zapaleniu tkanki tłuszczowej podobnym do diety wysoko tłuszczowej

Toxoplasma gondii przekształca się w formę cysty w odpowiedzi na stres środowiskowy, co można odtworzyć w modelach kultur tkankowych. W niniejszym materiale wideo zaprezentowano techniki badania tworzenia się ściany cysty poprzez aktywację makrofagów pochodzących z szpiku kostnego lub zmianę pH pożywki wzrostowej w komórkach fibroblastów.

Toxoplasma gondii Formowanie ściany cysty w aktywowanych makrofagach pochodzących z szpiku kostnego oraz w warunkach sprzyjających bradyzoitom

Odkryj analizę przepływu metabolicznego w makrofagach serca i śledziony oraz monocytach szpiku kostnego. Ta metoda pozwala badać metabolizm komórek odpornościowych podczas zawału mięśnia sercowego.

Analiza przepływu metabolicznego ex vivo w makrofagach śledziony i serca oraz monocytach szpiku kostnego

Przeglądaj więcej filmów