Name: Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Poznaj metodę oceny aktywności ERK w zespołach RASopatii u danio danio za pomocą mikroskopii FRET na żywo. Protokół umożliwia walidację wariantów patogennych i testowanie inhibitorów MEK.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy dr Jeroenowi den Hertog (Instytut Hubrecht, Utrecht, Holandia) za uprzejme udostępnienie pCS2+_eGFP-2a-Shp2a, z którego wyodrębniono pełny CDS shp2 , aby wygenerować szablon plazmidu, którego użyliśmy7. Dziękujemy Nara Institute of Science and Technology (Takaaki Matsui), National Institute of Genetics (NIG/ROIS) (Koichi Kawakami) za udostępnienie transgenicznej linii reporterskiej dla nastolatków . Prace te zostały wsparte przez włoskie Ministerstwo Zdrowia – Current Research Funds 2021 i Current Research Funds 2024 oraz Ricerca Finalizzata Giovani Ricercatori GR-2019-12368907 dla AL; Aktualne fundusze badawcze 2019, PNRRMR1-2022-12376811, 5x1000 2019, AIRC (IG-21614 i IG-28768) oraz LazioInnova (A0375-2020-36719) do MT.

<ol><li>Iroegbu, J. D., Ijomone, O. K., Femi-Akinlosotu, O. M., Ijomone, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK%2FMAPK+signalling+in+the+developing+brain%3A+Perturbations+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Biobehav+Rev%22%5BJournal%5D)">ERK/MAPK signalling in the developing brain: Perturbations and consequences.</a> Neurosci Biobehav Rev. 131, 792-805 (2021).</li>
<li>Tartaglia, M., Aoki, Y., Gelb, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+genetics+of+RASopathies%3A+An+update+on+novel+disease+genes+and+new+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet+C+Semin+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">The molecular genetics of RASopathies: An update on novel disease genes and new disorders.</a> Am J Med Genet C Semin Med Genet. 190 (4), 425-439 (2022).</li>
<li>Tate, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC%3A+the+catalogue+of+somatic+mutations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">COSMIC: the catalogue of somatic mutations in cancer.</a> Nucleic Acids Res. 47 (D1), D941-D947 (2019).</li>
<li>Tartaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+PTPN11%2C+encoding+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2%2C+cause+Noonan+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome.</a> Nat Genet. 29 (4), 465-468 (2001).</li>
<li>Jopling, C., van Geemen, D., den Hertog, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shp2+knockdown+and+Noonan%2FLEOPARD+mutant+Shp2-induced+gastrulation+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Shp2 knockdown and Noonan/LEOPARD mutant Shp2-induced gastrulation defects.</a> PLoS Genet. 3 (12), e225(2007).</li>
<li>Wong, K. -L., Akiyama, R., Bessho, Y., Matsui, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK+activity+dynamics+during+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">ERK activity dynamics during zebrafish embryonic development.</a> Int J Mol Sci. 20 (1), 109(2019).</li>
<li>Fasano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+FRET-based+Teen+sensor+to+monitor+ERK+activation+changes+preceding+morphological+defects+in+a+RASopathy+zebrafish+model+and+phenotypic+rescue+by+MEK+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Assessment of the FRET-based Teen sensor to monitor ERK activation changes preceding morphological defects in a RASopathy zebrafish model and phenotypic rescue by MEK inhibitor.</a> Mol Med. 30 (1), 47(2024).</li>
<li>Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+and+linear+un-mixing+enables+improved+FRET+efficiency+with+a+novel+GFP2-YFP+FRET+pair%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair.</a> FEBS Lett. 531 (2), 245-249 (2002).</li>
<li>Sari, D. W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+observation+of+stepwise+regression+of+Erk+activity+in+zebrafish+presomitic+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Time-lapse observation of stepwise regression of Erk activity in zebrafish presomitic mesoderm.</a> Sci Rep. 8 (1), 4335(2018).</li>
<li>Wang, H., Li, J., Xue, T., Cheng, N., Du, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+series+of+pCS2%2B+backbone-based+Gateway+vectors+for+overexpressing+various+tagged+proteins+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Construction of a series of pCS2+ backbone-based Gateway vectors for overexpressing various tagged proteins in vertebrates.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 48 (12), 1128-1134 (2016).</li>
<li>Abdelrahman, D., Hasan, W., Da'as, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+quality+control+in+zebrafish+model+for+genetic+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Microinjection quality control in zebrafish model for genetic manipulations.</a> MethodsX. 8, 101418(2021).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (27), e1113(2009).</li>
<li>Rossant, J., Nutter, L. M. J., Gertsenstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Engineering the embryo.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (19), 7659-7660 (2011).</li>
<li>Jindal, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+severity+ranking+of+Ras+pathway+mutations+associated+with+developmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In vivo severity ranking of Ras pathway mutations associated with developmental disorders.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 114 (3), 510-515 (2017).</li>
<li>Leavesley, S. J., Rich, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+lmitations+of+FRET+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Overcoming lmitations of FRET measurements.</a> Cytometry A. 89 (4), 325-327 (2016).</li>
<li>Mascha, E., Vetter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance%2C+errors%2C+power%2C+and+sample+size%3A+Theblocking+and+tackling+of+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Significance, errors, power, and sample size: Theblocking and tackling of statistics.</a> Anesth Analg. 126 (2), 691-698 (2018).</li>
<li>Faul, F., Erdfelder, E., Lang, A. -G., Buchner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%2APower+3%3A+a+flexible+statistical+power+analysis+program+for+the+social%2C+behavioral%2C+and+biomedical+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Res+Methods%22%5BJournal%5D)">G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences.</a> Behav Res Methods. 39 (2), 175-191 (2007).</li>
<li>Cohen, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+J+%22Statistical+power+analysis+for+the+behavioral+sciences%22">Statistical power analysis for the behavioral sciences</a>. , Routledge. New York. (1988).</li>
<li>Anastasaki, C., Rauen, K. A., Patton, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continual+low-level+MEK+inhibition+ameliorates+cardio-facio-cutaneous+phenotypes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Continual low-level MEK inhibition ameliorates cardio-facio-cutaneous phenotypes in zebrafish.</a> Dis Model Mech. 5 (4), 546-552 (2012).</li>
</ol>

Pomimo dziesięcioleci badań i licznych mutacji prowadzących do wysoce heterogenicznych form RASopatii obecnie zmapowanych, warianty genetyczne o nieznanym znaczeniu nadal pojawiają się w wyniku sekwencjonowania u niezdiagnozowanych pacjentów. W rzeczywistości w wielu przypadkach diagnoza oparta wyłącznie na cechach klinicznych może być wyzwaniem, a funkcjonalne podejścia genomowe do weryfikacji wyników sekwencjonowania pozostają kluczowe. Co więcej, pomimo proponowanych niektórych dostępnych cząsteczek przeciwnowotworowy...

RASopatie to zespoły genetyczne, które zahamują prawidłowy rozwój i wpływają na różne narządy oraz tkanki. Schorzenia te często są spowodowane mutacjami linii zarodkowej (GoF) w kluczowych genach i uczestnikach sygnalizacji RAS/MAK, co skutkuje hiperaktywacją (zwiększoną fosforylacją) kinazy sterowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK). ERK reguluje niektóre podstawowe procesy ważne podczas rozwoju – wzrost tkanek – poprzez translokację do jądra 1,2. Mutacje somatyczne w genach zaangażowanych w szlak RAS-MAPK są najczęstszymi zdarzeniami prowadzącymi do raka3. Nic dziwnego więc, że predyspozycje do nowotworów obserwuje się także w RASopatiach. Zespół Noonana (NS), charakteryzujący się opóźnieniem rozwojowym, niskim wzrostem, deficytami poznawczymi o zmiennym nasileniu oraz kardiomiopatią, jest najczęstszą formą RASopatii2. W większości przypadków choroba jest wywoływana przez mutacje GoF w PTPN11, pierwszym genie RASopatii odkrytym na początku 2000 roku, 4 kodującym białko tyrozynową fosfatazę SHP2, która pełni funkcję dodatniego regulatora szlaku.
Od tego czasu, dzięki wykładniczemu zastosowaniu metod sekwencjonowania egzomu u niezdiagnozowanych pacjentów, potencjalnie patogenne warianty wpływające na czynniki związane z RAS-MAPK, prawdopodobnie powiązane z różnymi formami RASopatii, są nadal odkrywane i czekają na funkcjonalną charakterystykę dla efektywnej stratyfikacji pacjentów2. Aby osiągnąć ten cel, wymagane są protokoły eksperymentalne gwarantujące szybkie i informacyjne prawidłowe walidację funkcjonalną na poziomie organizmu. Wykorzystanie klasycznych i standaryzowanych modeli ssaków do testowania wariantów o nieznanym znaczeniu byłoby kosztowne, bardzo czasochłonne i wymagałoby inwazyjnych metod u nieprzezroczystych dużych zwierząt. Taka strategia wyraźnie nie jest zgodna z wymogiem szybkich testów, biorąc pod uwagę obciążenie społeczne związane z ubogimi lub niezdiagnozowanymi pacjentami z RASopatią, obecnie bez leczenia i leczenia. Protokoły ilościowej oceny kluczowych cech fenotypowych i molekularnych korelatów w całych organizmach służyłyby również przyspieszeniu możliwej translacji klinicznej leków dostępnych dla pacjentów z RASopatią poprzez ponowne wykorzystanie i przepozycjonowanie.
Danio pręgowany jest idealnym modelem kręgowców do badania chorób wpływających na wczesny rozwój. Na początek, danio pręgowane dzieli wysoki poziom genetycznej homologii z ludźmi. Wysoka płodność dorosłych ryb skutkuje dużą produkcją małych zarodków, które rozwijają się szybko. Zarodki są przezroczyste na wczesnym etapie, dzięki czemu główne procesy rozwojowe – epibolia, gastrulacja, osie i kształtowanie się ciała – można łatwo zobrazować za pomocą standardowej mikroskopii. Ponadto dostępność linii transgenicznych, które mogą być wykorzystywane do śledzenia specyficznego zachowania komórkowego i dynamicznych zdarzeń molekularnych w przestrzeni i czasie podczas rozwoju, w połączeniu z zaawansowanymi technikami generowania modeli genetycznych, jest nie do pobicia. Ponadto odczyty fenotypowe można oceniać na wielu poziomach u danio pręgowanego (od defektów organizmowych po komórkowe), a dedykowane testy są już opracowane dla kilku chorób, w tym RASopathies5. Ponadto stosunkowo proste metody zanurzenia w kąpieli do podawania leków we wczesnych stadiach, przynajmniej dla związków rozpuszczalnych w wodzie, pozwalają na wysokoprzepustowe badania leków in vivo w formacie 96-dołkow.
Z molekularnego punktu widzenia badania wykorzystujące standardowe podejścia, takie jak immunohistochemia i immunoblot, wyraźnie wykazują korelację między aktywacją ERK a wadami rozwojowymi związanymi z RASopatią w zarodkach ryb 6,7. Niedawno opracowany biosensor FRET typu EKAR u danio (Tg[ef1a:ERK biosensor-nes], Teen) stanowi niezawodne narzędzie in vivo do rejestrowania aktywacji ERK podczas embrigenezy w sposób rozdzielony czasowo-przestrzennie. Dlatego może być cenny do lepszej oceny dynamicznych zmian ERK i modulacji farmakologicznych w modelach ryb RASopathy.
W czujniku Teen specyficzny substrat ERK w reporterze jest fosforylowany podczas aktywacji ERK, wywołując zmianę konformacyjną, która w bliskim sąsiedztwie sprowadza do obecności dawcy fluorescencyjnego CFP (D) oraz akceptora fluorescencyjnego Ypet (ulepszony YFP) (A). Jeśli widmo emisji D znacznie pokrywa się ze spektrum absorpcji A, może wystąpić FRET (absorpcja energii z D do A). Jest to proporcjonalne do odległości między D a A, a więc w Teen, do statusu aktywacji ERK. Różne protokoły obrazowania można skonfigurować zarówno przy użyciu standardowych, jak i zaawansowanych modułów obrazowania standardowych lub konfokalnych mikroskopów zarówno w próbkach żywych, jak i stałych. Po wzbudzeniu D, pozyskanie wielospektralnych skanów wzdłuż określonego spektrum emisji (λ) od CFP do YFP, a następnie algorytmów spektralnego "rozmieszania", jest jedną z najbardziej wiarygodnych metod rejestracji i ilościowego określenia danych FRET8. Może być również stosowany do żywych okazów danio pręgowanego w celu rejestrowania dynamiki tkanek in vivo .
Na podstawie wcześniejszych raportów 6,9 oraz naszej najnowszej aplikacji7, tutaj szczegółowo opisujemy krok po kroku workflow z użyciem młodych ryb do oceny aktywacji ERK w komórkach na marginesie zwierzęcego bieguna modeli NS na początku gastrulacji oraz korelujemy go z charakterystycznymi defektami osi ciała widocznymi dopiero później w rozwoju. Pokazujemy, jak uzyskać i przeanalizować ilościowe dane FRET z żywych gastruli NS przed i po leczeniu dostępnym MEKi oraz jak weryfikować wyniki za pomocą standardowej immunohistochemii względem fosforylowanego (aktywnego) ERK lub przeprowadzić korelacyjną morfometryczną analizę defektów wydłużania zarodków.
Workflow ten mógłby być stosowany do zwiększenia funkcjonalnych testów nowych wariantów i genów chorób domniemanych z RASopatiami oraz uzyskania wglądu w korelację dynamiki aktywacji ERK przestrzennie i czasowo podczas rozwoju kręgowców oraz defektów morfologicznych w embrionach. Pokazujemy, że protokół ten może być również używany do testowania skuteczności leków kandydatów na modulację aktywacji ERK.

<table><tbody><tr><td><Mocne>Plastiki</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik hodowlany 1,7 l - projekt w stylu plażowym</td><td>Tecniplast</td><td>1,7L NACHYLONY</td><td>Zbiornik hodowlany</td></tr><tr><td>Kapilary GC100F-10</td><td>Aparat Harvarda</td><td>30-0019</td><td>Mikroiniekcja zarodka w stadium jednej komórki</td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych i tkankowych - 12 dołków</td><td>BIOFIL</td><td>TCP011012</td><td>Pobieranie i leczenie zarodków</td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych i tkankowych - 6 dołków</td><td>BIOFIL</td><td>TCP011006</td><td>Pobieranie i leczenie zarodków</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>SPL Nauki o Życiu</td><td>20100</td><td>Pobieranie zarodków &nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc Glass Dishes 12mm</td><td>Thermo Fisher</td><td>150680</td><td>Obrazowanie spektralne zarodków FRET</td></tr><tr><td>Pipette Pasteur</td><td>Corning</td><td>357524</td><td>Transfer zarodka</td></tr><tr><td>Białkowe rurki wiązające 2ml</td><td>Eppendorf</td><td>30108450</td><td>Badanie IHC</td></tr><tr><td><silne>odczynniki i inne</silne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kawior 500-800 & mikro; m</td><td>Rettenmaier Italia</td><td>BE2269 (500-800)</td><td>Sucha karma dla ryb</td></tr><tr><td>Torbiele artemii błękitnej w Great Salt Lake</td><td>Sanders</td><td>00004727</td><td>Pokarm dla żywych ryb</td></tr><tr><td>Natychmiastowa sól oceaniczna</td><td>Tecniplast</td><td>XPSIO25R</td><td>Suszona sól morska do przygotowywania żywej żywności</td></tr><tr><td>Tg(EF1a:ERK Biosensor-nes) (Teen)</td><td>Kontakty do zamówień*: National BioResource Project Danio, Jednostka Wsparcia Rozwoju Zasobów Zwierzęcych, RRD, RIKEN Center for Brain Science, Japonia. https://shigen.nig.ac.jp/zebra/index_en.html *po podpisie MTA.&nbsp; </td><td>-</td><td>Dostawca linii danio danych ERK Reporter. Zarodki ryb można uzyskać po podpisie MTA z Narodowego Projektu BioZasobów Japonii dla danio dano (RIKEN, Japonia). Linia danio była deponowana przez Nara Institute of Science and Technology (Takaaki Matsui) oraz National Institute of Genetics (NIG/ROIS) (Koichi Kawakami, patent na system Tol2) (Wong i in., 2018, Urasaki i in., 2006, Okamoto i Ishioka, 2010).</td></tr><tr><td>Barwnik ładowający 6x</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>B7024S</td><td>Elektroforeza żelowa</td></tr><tr><td>Drabinka DNA 100 bp</td><td>NEB</td><td>N3231S</td><td>Elektroforeza żelowa</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1,01,236</td><td>Elektroforeza żelowa</td></tr><tr><td>Agaroza, niska temperatura żelowania</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td>Montaż zarodków do obrazowania spektralnego FRET i testu IHC</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8022</td><td>Badanie IHC</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td>Komponent średni E3</td></tr><tr><td>Azotan wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237124</td><td>Komponent rozwiązania stockowego Danieau</td></tr><tr><td>Dimetylsulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>Badanie IHC</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>Składnik buforowy TBE do przygotowania żelu</td></tr><tr><td>Etanol 99%+</td><td>Fisher Scientific</td><td>10048291</td><td>Oczyszczanie RNA in vitro</td></tr><tr><td>Formaldeid 16%</td><td>Thermo Fisher</td><td>28908</td><td>Utrwalanie zarodków</td></tr><tr><td>Formamide&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td>Elektroforeza żelowa</td></tr><tr><td>Bufor załadowujący żel II (DENATURUJĄCA STRONA)</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM8546G</td><td>Transkrypcja RNA in vitro</td></tr><tr><td>Kwas octowy lodowcowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td>Składnik buforowy TBE do przygotowania żelu</td></tr><tr><td>Glicerol & nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279-1L</td><td>Badanie IHC</td></tr><tr><td>Antymyszy dla kóz Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td>Badanie IHC</td></tr><tr><td>Antykrólikowy Alexa Fluor 633</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21070</td><td>Badanie IHC</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Komponent rozwiązania stockowego Danieau</td></tr><tr><td>KpnI - HF (Enzyme + rCutSmart Buffer)</td><td>NEB</td><td>R3142</td><td>Linearyzacja plazmidów &nbsp;</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>Komponent średni E3/komponent roztworu Danieau</td></tr><tr><td>Markery RNA Milenium</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM7150</td><td>Elektroforeza żelowa</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania DNA genomowego Monarch</td><td>NEB</td><td>T3010L</td><td>Linearyzacja plazmidów &nbsp;</td></tr><tr><td>Myszy monoklonalny p44/42 MAPK</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>4696S</td><td>Badanie IHC</td></tr><tr><td>zestaw transkrypcji mMACHINE SP6&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1340</td><td>Transkrypcja RNA in vitro</td></tr><tr><td>Normalne serum dla kóz (NGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>Badanie IHC</td></tr><tr><td>Ambion bez nukleazy</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9937</td><td>Transkrypcja RNA in vitro</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PZ0162</td><td>Inhibitor MEK</td></tr><tr><td>Roztwór fenolu czerwonego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>Składnik mieszanki do mikroiniekcji & nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do ogoniania Poly A</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1350</td><td>Transkrypcja RNA in vitro</td></tr><tr><td>Chlorek potasu bioxtra&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Komponent średni E3/Danieau roztwór stock/komponent PBS stock solution</td></tr><tr><td>Fosforan diwodoru potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>Komponent roztworu zapasowego PBS</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td>Badanie IHC</td></tr><tr><td>Królik poliklonalny fosfo-p44/42 MAPK&nbsp;</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>4695S</td><td>Badanie IHC</td></tr><tr><td>Bezpieczne barwienie DNA w żelu SYBR</td><td>Thermo Fisher</td><td>S33102</td><td>Elektroforeza żelowa</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434-M</td><td>Komponent średni E3/Danieau roztwór stock/komponent PBS stock solution</td></tr><tr><td>Dwubazowy fosforan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td>Komponent roztworu zapasowego PBS</td></tr><tr><td>Baza Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Składnik buforowy TBE do przygotowania żelu</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Komponent bufora PBSTr</td></tr><tr><td><silny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alliance Mini HD9&nbsp;</td><td>Uvitec</td><td>-</td><td>System obrazowania</td></tr><tr><td>Wirówka 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000205</td><td>Mikrowirówka</td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>-</td><td>Montaż zarodka&nbsp;</td></tr><tr><td>FemtoJet 4x</td><td>Eppendorf</td><td>-</td><td>System mikrowtrysku</td></tr><tr><td>Infinite M Plex&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>-</td><td>Czytnik płyt wielomodowych</td></tr><tr><td>Leica M205FA</td><td>Leica Microsystems</td><td>-</td><td>Mikroskop stereomikroskopowy fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Leica TCS-SP8X wyposażona w inkubator (OkoLab)</td><td>Leica Microsystems</td><td>-</td><td>Mikroskop konfokalny</td></tr><tr><td>Mini-subkomórka GT system horiziontalnej elektroforezy&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1704406</td><td>Elektroforeza żelowa</td></tr><tr><td>PC-100 Pionowy ciągnik</td><td>Narishige</td><td>-</td><td>Ciągarka igieł</td></tr><tr><td>Zasilacz uniwersalny PowerPac</td><td>Bio-Rad</td><td>1645070</td><td>Elektroforeza żelowa</td></tr><tr><td>Stellaris 5&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>-</td><td>Mikroskop konfokalny</td></tr><tr><td>Vortex MiniStar silverline</td><td>VWR</td><td>-</td><td>Przygotowanie plazmidów</td></tr><tr><td><silne>Oprogramowanie</silne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biorender</td><td>Biorender</td><td>Licencja CC-BY 4.0</td><td>Komiksowe rozwinięcie figurek</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft Office Professional Plus 2019</td><td>-</td><td>Analizy danych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Fiji</td><td>ImageJ</td><td>15.3T</td><td>Obrazowanie obrazowe i analizy ilościowe (pomiary sygnałów FRET, intensywność fluorescencji ERK w teście IHC, długość osi zarodka)</td></tr><tr><td>GraphPad Prism&nbsp;</td><td>GraphPad Software LLC</td><td>w. 9</td><td>Analizy danych statystycznych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie spektrofotometru iControl</td><td>Tecan</td><td>v. 2.0</td><td>Ilościowość RNA</td></tr><tr><td>Ilustrator</td><td>Adobe</td><td>26.0.3 (64-bitowy)</td><td>Montaż figur</td></tr><tr><td>Oprogramowanie LASX</td><td>Leica Microsystems</td><td>v. 4.5 (Stellaris 5), v. 3.0 (M205FA), v. 3.5 (TCS-SP8X)</td><td>Pozyskiwanie obrazów do eksperymentów spektralnych FRET oraz obrazowanie zarodków do pomiarów długości osi</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Q9 Mini 18.02-SN</td><td>Uvitec</td><td>-</td><td>Pozyskiwanie obrazów żelowych</td></tr></tbody></table>

efektywny protokół oceny modulacji aktywności erk w wczesnych modelach zespołu noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo fret i immunofluorescencji

An Efficient Protocol to Assess ERK Activity Modulation in Early Zebrafish Noonan Syndrome Models via Live FRET Microscopy and Immunofluorescence

RASopatie to zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją ERK, prowadzące do chorób wieloorodowych, które mogą również prowadzić do predyspozycji do nowotworów. Pomimo szerokiej heterogeniczności genetycznej, mutacje przyrostu funkcji linii zarodczej w kluczowych regulatorach szlaku RAS-MAPK stanowią podstawę większości przypadków, a dzięki zaawansowanym technikom sekwencjonowania potencjalnie patogenne warianty wpływające na szlak RAS-MAPK są nadal identyfikowane. Funkcjonalna walidacja patogenności tych wariantów, niezbędna do dokładnej diagnozy, wymaga szybkich i wiarygodnych protokołów, najlepiej in vivo. Biorąc pod uwagę niedobór skutecznych terapii we wczesnym dzieciństwie, takie protokoły, zwłaszcza jeśli są skalowalne w opłacalnych modelach zwierzęcych, mogą być kluczowe dla stworzenia przedklinicznych podstaw do przestawiania i ponownego wykorzystania leków. 
Tutaj szczegółowo opisujemy krok po kroku protokół szybkiego generowania przejściowych modeli RASopatii w embrionach danio młodego oraz bezpośrednią inspekcję zmian aktywności ERK związanych z chorobą zachodzących już podczas gastrulacji za pomocą wielospektralnego obrazowania Förstera rezonansowego transferu energii (FRET) w czasie rzeczywistym. Protokół wykorzystuje transgeniczny raporter ERK, niedawno zainstalowany i zintegrowany ze sprzętem mikroskopów komercyjnych. Przedstawiamy przykładowe zastosowanie modeli danio nosaczonych (NS) uzyskanych przez ekspresję Shp2D61G. Opisujemy prostą metodę, która umożliwia rejestrację zmiany sygnału ERK w modelu ryb NS przed i po modulacji sygnału farmakologicznej za pomocą dostępnych inhibitorów MEK w niskiej dawce. Szczegółowo opisujemy, jak generować, odzyskiwać i oceniać ratiometryczne sygnały FRET z wielospektralnych akwizycji przed i po leczeniu oraz jak weryfikować wyniki poprzez klasyczną immunofluorescencję na całych zarodkach we wczesnych stadiach. Następnie opisujemy, jak poprzez analizę standardowych parametrów morfometrycznych można zapytać o późne zmiany kształtu zarodka, wskazujące na wynikające z tego zaburzenie gastrulacji, u tych samych embrionów, których aktywność ERK jest oceniana za pomocą żywego FRET 6 godzin po zapłodnieniu.

Protokół ten pokazuje prosty sposób pracy umożliwiający szybkie generowanie przejściowych modeli RASopatii w embrionach danio pręgowanego oraz ocenę fluktuacji ERK u wczesnych mutantów za pomocą standardowej metody obrazowania na żywo FRET zastosowanej na nowo opracowanym czujniku ERKdanio pręgowanego 6,9. Jak niedawno pokazano 6,7 w tym samym procesie eksperymentalnym, wyniki FRET mogą być weryfikowane przez standardowy IHC wzg...

RASopatie to wielosystemowe zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją szlaku RAS-MAPUK. Potencjalnie patogenne warianty oczekujące na walidację pojawiają się nieustannie, podczas gdy słabe dowody przedkliniczne ograniczają terapię. Tutaj opisujemy nasz protokół in vivo polegający na testowaniu i krzyżowej weryfikacji poziomów aktywacji ERK związanych z RASopatią oraz jego modulacji farmakologicznej podczas embrigenezy za pomocą obrazowania FRET na żywo u danio danio młodego typu Teen-reporter.

Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. ...

Tworzymy modele danio danio dla złożonych chorób rozwojowych, łącząc sekwencjonowanie pacjentów z genomiką funkcjonalną, aby wspierać interpretację wariantów oraz przedkliniczne testy leków. Pomimo ulepszonych czujników FRET, solidny test in vivo wykrywający subtelne patogenne zmiany sygnalizacji Ras-MAPK przy odpowiedniej czułości czasoprzestrzennej pozostaje niewystarczający. Na początek umieść niestandardową płytkę mikrowtryskową zawierającą formowaną 2%agarozę w medium E3 na platformie roboczej.Ułóż i ustawij zapłodnione jaja młodych danio pręgowanych na talerzu w odpowiednich pasach, aby ograniczyć ruch jaj podczas mikroiniekcji. Wkładaj do igły dwa mikrolitry materiału do wtrysku za pomocą pipety mikroładowającej. Dostosuj ustawienia ciśnienia i czasu, aby skalibrować każdy zastrzyk na podstawie jakości igły i zarodka na urządzeniu do mikroiniekcji.Wstrzyknij roztwór do stadium jednokomórkowego zarodków młodych danio pręgowanych. Hodować mikrozastrzykowane nastolatki w warunkach kontrolowanego hodowla. Oczyść wszystkie jaja, które wyglądają na mętne lub zdegenerowane w ciągu trzech godzin od złożenia.Około cztery godziny po zapłodnieniu, przy użyciu standardowego mikroskopu s

an-efficient-protocol-to-assess-erk-activity-modulation-early

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje nieinwazyjny test do badania elektrofizjologii neuronów ruchowych w zarodkach danio pręgowanego. Po zmierzeniu zwijania ogona w zarodkach w wyniku spontanicznej depolaryzacji neuronów ruchowych rdzenia kręgowego, stosuje się bloker kanału sodowego w celu zmniejszenia częstotliwości zwijania. Następnie zarodki są unieruchamiane w agarozie i umieszczane pod mikroskopem fluorescencyjnym. Genetycznie zmodyfikowane neurony ruchowe wyrażają bioczujnik wykrywający napięcie z...

Nieinwazyjne podejście do badania elektrofizjologii neuronów ruchowych w zarodkach danio pręgowanego

Danio pręgowany jest teraz sprawdzonym i potężnym narzędziem do modelowania dystrofii mięśniowych, wrodzonych miopatii i pokrewnych chorób nerwowo-mięśniowych. Dwójłomność i zachowanie ucieczki wywołane dotykiem to dwa powszechne nieinwazyjne testy stosowane do określenia stopnia dezorganizacji mięśni i upośledzenia lokomocji zarodków danio pręgowanego we wczesnym okresie rozwoju.

Analiza wad mięśni szkieletowych u larw danio pręgowanego za pomocą testów dwójłomności i reakcji ucieczki wywołanej dotykiem

Opisany tutaj jest protokół półautomatycznego obrazowania specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego.

Półautomatyczne obrazowanie specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego

Prezentujemy metodę analizy elektroretinograficznej (ERG) larw danio pręgowanego z wykorzystaniem technik mikromanipulacji i elektroretinografii. Jest to prosta i nieskomplikowana metoda oznaczania funkcji wzrokowych larw danio pręgowanego in vivo.

Elektroretinogram Analiza odpowiedzi wzrokowej u larw danio pręgowanego

Opisane tutaj protokoły pozwalają na badanie właściwości elektrycznych komórek pobudliwych w najbardziej nieinwazyjnych warunkach fizjologicznych poprzez wykorzystanie zarodków danio pręgowanego w systemie in vivo wraz z genetycznie kodowanym wskaźnikiem napięcia (GEVI) opartym na rezonansie fluorescencyjnym (FRET), selektywnie wyrażanym w interesującym typie komórki.

Biodetekcja potencjału błonowego neuronu ruchowego w żywych zarodkach danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki epilepsji u danio pręgowanego, wynikającej z przejściowego zahamowania genu DEPDC5.

Analiza behawioralna i fizjologiczna w modelu padaczki danio pręgowanego

Ten manuskrypt opisuje prostą metodę behawioralnego pomiaru stresu u dorosłego gryba. Podejście to wykorzystuje wrodzoną tendencję do tego, że danio pręgowany preferuje dolną połowę zbiornika, gdy jest w stanie stresu. Opisano również metody sprzężenia testu z farmakologią.

Behawioralne podejścia do badania wrodzonego stresu u danio pręgowanego

Przejrzystość optyczna jest główną zaletą dla biologicznej i fizjologicznej pracy komórek u danio pręgowanego. Opisano solidne metody pomiaru wzrostu komórek u poszczególnych zwierząt, które pozwalają na nowy wgląd w to, w jaki sposób wzrost mięśni szkieletowych i sąsiednich tkanek jest zintegrowany ze wzrostem całego ciała.

Wielokrotne pomiary wzrostu mięśni szkieletowych w czasie rzeczywistym u poszczególnych żywych ryb danio pręgowanych poddanych zmienionej aktywności elektrycznej

Danio pręgowany celujący w reaktywne elektrofile i utleniacze (Z-REX) to oparta na biologii chemicznej metoda badania reaktywnej sygnalizacji małocząsteczkowej. Technikę tę można zastosować do żywych ryb na różnych etapach rozwoju. Tutaj łączymy standardowe testy u danio pręgowanego z Z-REX do analizy szlaku sygnałowego.

Monitorowanie docelowych reakcji sygnalizacyjnych u larw danio pręgowanego - Z-REX demaskuje precyzyjne mechanizmy działania leków elektrofilowych i metabolitów

Optogenetyczne manipulowanie szlakami sygnałowymi może być potężną strategią do zbadania, w jaki sposób sygnalizacja jest dekodowana w rozwoju, regeneracji, homeostazie i chorobie. Protokół ten zawiera praktyczne wskazówki dotyczące stosowania aktywatorów sygnalizacyjnych białka węzłowego i morfogennego kości (BMP) opartych na dziedzinie wykrywania światła i tlenu we wczesnym zarodku danio pręgowanego.

Aktywacja sygnalizacji optogenetycznej w zarodkach danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania aktywności neuronalnej w obszarach mózgu transgenicznego danio pręgowanego, które wyrażają wskaźniki wapnia GCaMP za pomocą mikroskopii konfokalnej.

In vivo (in vivo) Konfokalne obrazowanie fluorescencyjne aktywności neuronalnej wywołanej stymulacją sensoryczną u częściowo unieruchomionych larw danio pręgowanego

Poznaj metodę oceny aktywności ERK w zespołach RASopatii u danio danio za pomocą mikroskopii FRET na żywo. Protokół umożliwia walidację wariantów patogennych i testowanie inhibitorów MEK.

Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji (Wideo) | JoVE Journal

Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji

Przeglądaj więcej filmów