Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji
2 maja 2025
RASopatie to wielosystemowe zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją szlaku RAS-MAPUK. Potencjalnie patogenne warianty oczekujące na walidację pojawiają się nieustannie, podczas gdy słabe dowody przedkliniczne ograniczają terapię. Tutaj opisujemy nasz protokół in vivo polegający na testowaniu i krzyżowej weryfikacji poziomów aktywacji ERK związanych z RASopatią oraz jego modulacji farmakologicznej podczas embrigenezy za pomocą obrazowania FRET na żywo u danio danio młodego typu Teen-reporter.
Tworzymy modele danio danio dla złożonych chorób rozwojowych, łącząc sekwencjonowanie pacjentów z genomiką funkcjonalną, aby wspierać interpretację wariantów oraz przedkliniczne testy leków. Pomimo ulepszonych czujników FRET, solidny test in vivo wykrywający subtelne patogenne zmiany sygnalizacji Ras-MAPK przy odpowiedniej czułości czasoprzestrzennej pozostaje niewystarczający. Na początek umieść niestandardową płytkę mikrowtryskową zawierającą formowaną 2%agarozę w medium E3 na platformie roboczej.
Ułóż i ustawij zapłodnione jaja młodych danio pręgowanych na talerzu w odpowiednich pasach, aby ograniczyć ruch jaj podczas mikroiniekcji. Wkładaj do igły dwa mikrolitry materiału do wtrysku za pomocą pipety mikroładowającej. Dostosuj ustawienia ciśnienia i czasu, aby skalibrować każdy zastrzyk na podstawie jakości igły i zarodka na urządzeniu do mikroiniekcji.
Wstrzyknij roztwór do stadium jednokomórkowego zarodków młodych danio pręgowanych. Hodować mikrozastrzykowane nastolatki w warunkach kontrolowanego hodowla. Oczyść wszystkie jaja, które wyglądają na mętne lub zdegenerowane w ciągu trzech godzin od złożenia.
Około cztery godziny po zapłodnieniu, przy użyciu standardowego mikroskopu stereo fluorescencyjnego, ustawiony na zakres długości fal od 465 do 500 nanometrów. Przesiewaj zarodki pod kątem ekspresji fluorescencyjnej reportera. Wybieranie młodych pozytywnych ryb do obrazowania FRET i rezerwowanie negatywnego rodzeństwa do badań immunohistochemicznych.
Umieść baseny zarodków o tej samej liczbie w różnych dołkach płyty z sześcioma dołkami. Aby rozpocząć leczenie, zanurz zarodki w trzech mililitrach pożywki E3 zawierającej kontrolę pojazdu jako DMSO lub rozcieńczony MEK w pożądanym stężeniu. Na początek roztop agarozę o niskim topnieniu w temperaturze 1,5%–2% w termomieszaku w temperaturze 50 stopni Celsjusza.
Po rozpuszczeniu obniż temperaturę do około 30 stopni Celsjusza. Umieść pojedynczy zarodek nastolatka pozytywnego w centrum szklanej spodniej misy o średnicy 35 milimetrów do obrazowania na żywo. Usuń nadmiar E3 i dodaj kroplę niskotopniącej agarozy, aby unieruchomić zarodek.
Pozwól agarozie polimeryzować się w temperaturze pokojowej. Włącz kontroler inkubatora co najmniej godzinę przed akwizucją i ustaw temperaturę na 28 stopni Celsjusza, aby utrzymać zdrowie zarodka. Gdy inkubator się ustabilizuje, umieść miskę obrazującą z zarodkiem na pojemniku i użyj 10x suchego obiektywu do wizualizacji próbki.
Włącz laser jonowy argonu i dostosuj moc lasera do 50%. W ustawieniach sprzętowych wybierz ośmiobitową rozdzielczość głębokości, aby uzyskać obrazy. Następnie w panelu Akwizycja wybierz tryby skanowania wykrywania spektralnego xy, gamma, lambda, z i ustaw format obrazu na 512 na 512 pikseli, prędkość skanowania 400 Hz oraz zoom optyczny 0,75. Aktywuj linię laserową 458-nanometrową lasera jonowego argonu i ustaw jej intensywność na 8,5%. Następnie wybierz detektor hybrydowy i ustaw jego czułość na wartość wzmocnienia 500.
Otwórz menu rozwijane na pasku detektora, aby wybrać białko fluorescencji cyjanu lub krzywą emisji ECFP. Aby wyświetlić krzywą emisji YPET, aktywuj drugi detektor. Następnie wybierz żółtą krzywą emisji białka fluorescencji YFP.
Aby rozpocząć akwizycje na żywo, ustaw kursor detekcji w zakresie najsilniejszego sygnału YFP, aby zwizualizować próbkę. Ustaw pozycję początkową i końcową grubości próbki w oknie Z-Stack LASX. Ustaw właściwości zakresu skanowania gamma tak, aby zaczynały się od 460 nanometrów i kończyły na 570 nanometrach zakresu detekcji.
Zdefiniuj szerokość pasma detekcji jako pięć nanometrów, a krok skanowania jako pięć nanometrów. Rozpocznij akwizycję z-stack. Wstaw i zapisz dwa dostosowane referencyjne widma emisji dla CFP i YFP w bazie barwników dostępnej w oknie konfiguracji, aby wykluczyć przenikanie widmowe.
Wybierz powstały plik obrazu spektralnego z sesji obrazowania i otwórz okno procesu. Następnie w narzędziu do separacji barwników wybierz Spektralną separację barwników i skonfiguruj ustawienia separacji barwników. W rozwijanych listach po lewej stronie dialogu wybierz nowe widmo emisji CFP na pierwszym miejscu oraz nowe widmo emisji YFP z bazy danych widma.
W skanowaniu gamma obrazów zidentyfikowaj obraz o największej intensywności sygnału. Następnie przesuń się wzdłuż skanu z, aby wybrać sekcję optyczną, która podkreśla obszar zainteresowania w strefie marginesu. Aktywuj tryb wyboru ROI na marginesie bieguna zwierzęcego, aby zdefiniować obszar o najlepszym widmie.
Kliknij na celownik ROI w oknie wyświetlania i dostosuj rozmiar referencyjnego ROI do 40 wokseli w obszarze pomiarów. Otwórz nowo wygenerowany plik zawierający dwa oddzielne kanały. Uzyskaj dwuwymiarowy obraz projekcji z trójwymiarowej serii obrazów, używając projekcji maksymalnej intensywności.
W oknie Process wybierz przycięcie, aby rozdzielić kanały na dwa oddzielne pliki: kanał pierwszy i kanał drugi. W oknie Process wybierz Combine Images, następnie wybierz plik kanału dwa i wstaw go w pierwszej opcji. Następnie wybierz plik kanału pierwszego i wstaw go w drugiej opcji.
Ustaw przeskalowanie z czynnikiem pięć i wybierz operację stosunku. Kliknij Apply, aby wygenerować nowy plik zawierający obraz metryki stosunku. Zapisz plik do analizy danych.
Importuj pliki obrazów spektralnych i separacji barwników do otwartoźródłowego oprogramowania Fiji do analizy. Konfiguruj parametry pomiarów odczytu na Fidżi za pomocą Analyze and Set Measurements. Wybierz obszar, całkowitą gęstość i średnią wartość szarości jako parametry zainteresowania.
Za pomocą narzędzia do wyboru wielokątów z paska narzędzi wybierz obszar zainteresowania odpowiadający marginesowi gastruli. Kolejno kliknij Analizuj, Narzędzia i Menedżer ROI, aby zapisać specyfikacje XY z ROI. Aby wykonać pomiary w wybranym ROI, kliknij Analizuj i Mierz.
Zorganizuj FRET według wartości wskaźnika CFP dla każdego ROI w arkuszu z grupami eksperymentalnymi w kolumnach i wartościami surowymi w wierszach. Dla pojedynczej replikacji biologicznej stwórz tabelę kolumnową z jedną zmienną grupującą, gdzie każda grupa jest zdefiniowana przez kolumnę. Po zakończeniu gastrulacji utrwal zarodki poprzez zanurzenie w 4% paraldehydzie przygotowanym w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
Po utrwaleniu myj zarodki kilkakrotnie PBS. Za pomocą pipety pastor ułóż zarodki boczne w pojedynczym dołku z 12-dołkową płytką zawierającą świeże PBS. Używając stereoskopu z obiektywem o powiększeniu 2,7x, obiektywem skanującym 0,63x i współczynnikiem zoomu 8,6x, rejestrując obrazy w trybie jasnego pola, aby ocenić obecność owalnego kształtu.
Zaimportuj przechwycony obraz zarodka do oprogramowania Fiji. Aby zmierzyć długość osi zarodka, wybierz narzędzie proste z paska narzędzi i kliknij Analizuj, a następnie Mierz. Po wykonaniu wybranych pomiarów dodaj je do listy menedżera ROI i zapisz plik ROI.
Wyeksportuj dane do arkusza. Oblicz stosunek osi, dzieląc długość osi głównej przez długość osi mniejszą. Oblicz średnią, odchylenie standardowe średniej lub błąd standardowy średniej różnych replikacji.
Nasz żywy pipeline FRET u danio danych umożliwia wczesne wykrywanie aktywacji sygnalizacji ERK przez patogeny, wspierając interpretację wariantów oraz testy efektywności inhibitorów MEK.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia protokół in vivo wykorzystujący rybki zebrafish do zbadania poziomów aktywacji ERK związanych z RASopathy za pomocą żywej obrazowania FRET. Podejście ma na celu zweryfikowanie patogennych wariantów i ocenę modulacyjnych farmakologicznych zmian podczas embriogenezy.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Genetyka
- Biologia rozwojowa
Tło
- RASopathie to zespoły genetyczne związane z nadmierną aktywacją szlaku RAS-MAPK.
- Pojawiające się warianty wymagają weryfikacji dla skutecznego rozwoju terapii.
- Obecne dowody przedkliniczne są ograniczone, co wymaga ulepszenia modeli.
- Żywe obrazowanie FRET oferuje nowatorskie podejście do badania aktywacji ERK in vivo.
Cel badania
- Aby przetestować poziomy aktywacji ERK związane z RASopathy u rybek zebrafish.
- Aby zweryfikować potencjalnie patogenne warianty związane z RASopathy.
- Aby zbadać modulacyjne farmakologiczne zmiany podczas embriogenezy.
Zastosowane metody
- Generowanie modeli ryb zebrafish dla złożonych chorób rozwojowych.
- Łączenie danych sekwencjonowania pacjentów z funkcjonalną genomiką.
- Mikrowstrzykiwanie zapłodnionych jajeczek ryb zebrafish z niestandardowymi materiałami.
- Wykorzystanie czujników FRET do wykrywania zmian w sygnalizacji Ras-MAPK.
Główne wyniki
- Pomyślne wyrównanie i wstrzyknięcie jajeczek ryb zebrafish dla spójności eksperymentalnej.
- Wykazanie przestrzenno-czasowej wrażliwości w wykrywaniu aktywacji ERK.
- Weryfikacja testu in vivo do oceny patogennych zmian.
- Potencjał dla ulepszonych metodologii testowania leków przedklinicznych.
Wnioski
- Badanie zapewnia solidną ramę dla badania RASopathy.
- Żywe obrazowanie FRET jest obiecującym narzędziem do analizy ścieżek sygnalizacyjnych w czasie rzeczywistym.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych znaleziskach, aby ulepszyć strategie terapeutyczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Rapid in vivo assessment of ERK activity modulation in zebrafish enables early-stage functional validation of RASopathy-associated variants, directly supporting target validation and mechanistic de-risking in rare disease pipelines. The protocol's integration of live FRET imaging and immunofluorescence provides quantitative, reproducible outputs essential for preclinical evaluation of pharmacological modulators. This scalable approach enhances predictive confidence and accelerates variant triage for portfolio advancement in genetic disease research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of RAS-MAPK pathway variants in a live vertebrate system.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying ERK signaling changes linked to pathogenic mutations.
- Facilitates rapid triage of candidate variants for downstream therapeutic exploration.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, quantitative readout of ERK activity for assay standardization.
- Delivers reproducible FRET-based measurements suitable for pharmacological screening of MEK inhibitors.
- Supports scalability and platform reuse in cost-effective zebrafish models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns early functional outputs with disease-relevant phenotypes for translational continuity.
- Enables preclinical assessment of drug repositioning candidates in a whole-organism context.
- Reduces biological risk by linking molecular activity to morphometric outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery and preclinical validation by enabling real-time ERK activity measurement and pharmacological testing in zebrafish embryos.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and variant interpretation through live ERK activity quantification.
- Screening: Establishes assay readiness and reproducibility for MEK inhibitor evaluation.
- Analytics: Provides ratiometric FRET and morphometric data for robust statistical comparison.
- Translational Research: Connects molecular signaling changes to phenotypic outcomes relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for diverse RASopathy and pathway-targeted studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in variant pathogenicity and drug response.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible in vivo assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage biological uncertainty.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic targets and therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish microinjection and live imaging techniques.
- Needs access to multispectral FRET-capable confocal microscopy and image analysis software.
- Demands cross-team standardization of imaging and data analysis protocols.
- Adaptation may be needed for different genetic backgrounds or pathway targets.
- Throughput is limited by embryo handling and imaging capacity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:30
Microinjection and Treatment of Zebrafish Embryos for FRET Imaging and MEK Inhibition Assays
2:13
Live Multispectral FRET Imaging of RASopathy Zebrafish Models
4:57
Postprocessing and Dye Separation for Ratiometric FRET Imaging
7:03
Quantitative Analysis of FRET Signals and Image Rendering
8:14
Assessment of Morphological Phenotypes and Image Analysis in Zebrafish Embryos
9:41
Conclusion
