Name: MEDUSA do identyfikacji genów regulujących śmierć w danych z profilowania chemogenetycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Poznaj metodę MEDUSA do identyfikacji genów regulujących śmierć komórkową w badaniach chemogenetycznych. Ta technika pozwala ilościowo ocenić wpływ knockoutów genów na śmierć komórek w kontekście terapii przeciwnowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim członkom Lee Lab, byłym i obecnym, za ich wkład w punkt widzenia naszego laboratorium na ocenę reakcji na leki. Prace te były wspierane przez finansowanie MJL i MEH z National Institutes of Health (U01CA265709, R21CA294000 i R35GM152194 do MJL, a F31CA268847 do MEH), finansowanie MJL z Fundacji Jayne Koskinas Ted Giovanis.

1. Optymalizacja dawki leku w celu wywołania śmierci komórki
UWAGA: Poniższy protokół służy do optymalizacji jednej kombinacji linii komórkowej, leku i dawki za pomocą testu FLICK7,8. Przykładowe dane dla tego protokołu opisują optymalizację i badania przesiewowe etopozydu 5 μM w komórkach U2OS, ale te same kroki optymalizacji można zastosować do dowolnej innej pożądanej kombinacji linii komórkowej i leku/dawki. Protokół ten nie wymaga pobierania ani analizy martwych komórek. Protokół ten może być stosowany do hodowli zawiesinowych, pod warunkiem, że martwe komórki zostaną usunięte. W przypadku kultur zawiesinowych martwe komórki można sortować/oddzielać za pomocą markera żywotności lub markera specyficznego dla śmierci komórki.
<ol>
	<li>Przed wykonaniem testu FLICK zoptymalizuj liczbę komórek, przepuszczalność Triton-X, stężenie SYTOX i ustawienia akwizycji czytnika płytek, korzystając ze szczegółowego protokołu opisanego w8.</li>
	<li>Komórki płytkowe w czarnych, przezroczystych 96-dołkowych płytkach. Typowe gęstości wysiewu wynoszą 1500-5000 komórek na studzienkę, a liczba ta powinna być zoptymalizowana na linię komórkową. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością przez 16-24 godziny.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczenia leku w pożywce zawierającej stężenie SYTOX, które zostało zidentyfikowane jako optymalne w kroku (1.1). Leki są zazwyczaj testowane w serii rozcieńczeń logarytmicznych zawierających 8-12 biologicznie lub klinicznie istotnych dawek. 
	UWAGA: Niektóre leki mogą emitować fluorescencję na tej samej długości fali co SYTOX, co uniemożliwia kwantyfikację za pomocą tego testu. W takich przypadkach korzystne może być wykorzystanie wariantów SYTOX, które emitują fluorescencję na różnych długościach fal. Ponadto test ten nie może ocenić reakcji na leki, które wpływają na fluorescencję SYTOX lub uniemożliwiają wiązanie się SYTOX z DNA.</li>
	<li>Lizować jedną płytkę (T0) przy użyciu Triton-X w stężeniu zoptymalizowanym w kroku (1.1). Po lizie komórek użyj czytnika płytek, aby zmierzyć fluorescencję SYTOX i określić całkowitą początkową liczbę komórek na podstawie empirycznie ustalonej zależności między fluorescencją a liczbą komórek (patrz protokół FLICK7,8).</li>
	<li>Zmierzyć fluorescencję SYTOX na płytkach eksperymentalnych w T0 za pomocą czytnika płytek, z ustawieniami zoptymalizowanymi w kroku (1.1).</li>
	<li>Monitoruj sygnał SYTOX w czasie przez trzy dni. Aby ograniczyć wynikowe dane kinetyczne, należy użyć co najmniej trzech punktów czasowych dziennie, każdy w odstępie 4 godzin. 
	UWAGA: Ten protokół ocenia śmierć i wzrost komórki w ciągu 3 dni. Ten czas jest zwykle wystarczający dla leków powodujących śmierć; Jednak test można skrócić lub wydłużyć, aby uwzględnić leki o alternatywnej kinetyce śmierci.</li>
	<li>Po ostatnim punkcie czasowym poddaj lizę płytki eksperymentalnej za pomocą Triton-X, aby określić ostateczną wielkość populacji każdego stanu.</li>
	<li>Oblicz ułamkową żywotność (FV) i dopasuj dane końcowe do krzywych dawki, zgodnie z opisem w protokole FLICK7,8.</li>
	<li>Zidentyfikuj dawki leków, które indukują około 50% śmierci komórek, oceniając krzywe dawki FV. 
	UWAGA: Identyfikacja martwych komórek za pomocą SYTOX wymaga zarówno pęknięcia błony plazmatycznej, jak i rozpadu otoczki jądrowej. Błony te wymagają ciągłej konserwacji, więc SYTOX będzie identyfikować martwe komórki niezależnie od mechanizmu śmierci komórki indukowanego przez lek. Procesy te nie zachodzą jednak z taką samą skutecznością w przypadku wszystkich form śmierci komórkowej, co może mieć wpływ na zdolność SYTOX do precyzyjnego pomiaru martwych komórek. Dodatkowo, różne mechanizmy śmierci komórkowej będą wytwarzać zwłoki komórkowe o różnej stabilności. Odkryliśmy jednak, że wszystkie testowane do tej pory formy śmierci komórki skutkują DNA związanym z SYTOX (albo wewnątrz permeabilizowanego jądra, albo w pożywce do hodowli komórkowej). Ten sygnał SYTOX jest na ogół stabilny przez 72 godziny testu, ale może być monitorowany, oceniając całkowitą liczbę komórek na początku i na końcu testu.</li>
</ol>
2. Wybór długości testu
<ol>
	<li>Korzystając z danych FLICK zebranych w kroku 1, oblicz frakcję śmiertelną (LF) każdego warunku w czasie, zgodnie z opisem w protokole FLICK7,8. Dopasuj dane kinetyczne LF do modelu opóźnionej śmierci wykładniczej (LED), jak opisano wcześniej9.</li>
	<li>Wykreślić LF w czasie dla każdej dawki śmiertelnej określonej w kroku 1. Wybierz dawkę i punkt czasowy, które wytwarzają ~50% LF. 
	UWAGA: Śmiertelna frakcja ~50% wzbogaca silne, specyficzne dla śmierci sygnały w danych przesiewowych CRISPR, pozostawiając wystarczająco dużo żywych komórek, aby utrzymać reprezentację biblioteki5. Jednak niektóre leki będą ograniczone przez pierwszeństwo w literaturze lub wąski zakres dawek, które indukują określony pożądany fenotyp. Jeśli dawka jest ograniczona, punkt końcowy testu powinien zostać skrócony lub rozszerzony, aby zapewnić, że pożądana dawka osiągnie ~50% LF. Jeśli 50% śmiertelność nie jest możliwa, może być konieczne zwiększenie liczebności populacji wyjściowej.</li>
</ol>
3. Określanie początkowej wielkości populacji
<ol>
	<li>Wybierz żądaną dawkę leku, aby jeszcze bardziej zoptymalizować badania przesiewowe w oparciu o powyższą optymalizację.</li>
	<li>Płytki komórkowe na 10 cm szalkach w kompletnych podłożach. Każdy warunek powinien być posiany technicznymi trzema powtórzeniami i wystarczającą liczbą powtórzeń biologicznych, aby komórki można było liczyć co 12-24 godziny na długości ekranu, w tym punkt czasowy T = 0. 
	UWAGA: Dodatkowa liczba komórek może wymagać osobnej optymalizacji dla komórek nieleczonych i poddanych działaniu substancji chemicznej, biorąc pod uwagę tempo wzrostu populacji netto i wielkość komórek. Komórki powinny być zasadniczo posiane w gęstościach, które powodują zbieg, który nie zagraża zdrowiu komórek w punkcie końcowym testu (tj. dla wielu typów komórek < 80% zlewa). Komórki poddane działaniu substancji i niepoddane działaniu substancji mogą być również ponownie posiane podczas badania, jeśli to konieczne, o ile zachowana jest reprezentacja biblioteki.</li>
	<li>Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Dodaj lek w pożądanym stężeniu do płytek zabiegowych. Równolegle zbierz komórki z 3 nietraktowanych płytek i policz liczbę żywych komórek za pomocą hemocytometru. Wybarwić martwe komórki błękitem trypanowym (lub porównywalnym barwnikiem żywotności), aby upewnić się, że liczone są tylko żywe komórki. Dane te określają liczbę komórek w punkcie czasowym T = 0.</li>
	<li>Po 12-24 godzinach zbierz komórki z 3 niepoddanych działaniu i 3 poddanych działaniu środka płytek i policz liczbę żywych komórek. Powtarzać zbiór aż do osiągnięcia punktu końcowego testu. Aby w pełni zrozumieć kinetykę leku i śmierci komórki, zaleca się monitorowanie żywych komórek przez 24-48 godzin po punkcie czasowym określonym w kroku (2.2).</li>
	<li>Wizualizacja zmian żywotności poprzez wykreślenie wielkości populacji (oś y) w czasie (oś x). 
	UWAGA: Na podstawie maksymalnej obserwowanej liczby komórek i ostatecznej wielkości populacji można w przybliżeniu oszacować frakcję śmiertelną w punkcie końcowym. Należy to porównać z danymi dotyczącymi żywotności frakcyjnej i frakcji letalnej wygenerowanymi za pomocą testu FLICK (etap 1.9 i etap 2.2), aby zapewnić osiągnięcie oczekiwanej wielkości śmierci komórki.</li>
	<li>Zidentyfikuj punkt czasowy o najmniejszej wielkości populacji. W zależności od wielkości wzrostu, który występuje w obecności leku, będzie to na początku lub na końcu ekranu CRISPR.</li>
	<li>Wybierz początkową wielkość populacji. Upewnij się, że początkowa liczba komórek jest zoptymalizowana, aby utrzymać pokrycie biblioteki co najmniej 500x-1000x na całym ekranie. 
	UWAGA: Na przykład biblioteka TKOv3 zawiera 70 948 sgRNA. Aby przedstawić tę bibliotekę przy 500-krotnym pokryciu, przez cały czas trwania testu należy utrzymać nie mniej niż 35 474 000 komórek na powtórzoną próbę. Ta wielkość populacji z wąskim gardłem jest często spotykana na początku testu lub po trypsynizacji i zmniejszeniu próbki w przypadku chorób nieleczonych lub proliferujących. W przeciwieństwie do tego, wielkość populacji z wąskim gardłem jest często podyktowana wielkością populacji w punkcie końcowym testu dla leczenia farmakologicznego, które wywołują znaczną śmiertelność.</li>
	<li>W razie potrzeby powtórz powyższą optymalizację na płytkach, które będą używane do ekranu CRISPR (np. Płytki 15 cm), aby potwierdzić, że skuteczność leku skaluje się prawidłowo.</li>
</ol>
4. Wykonywanie ekranu CRISPR
UWAGA: Komórki mogą być badane przy użyciu sprawdzonych metod przesiewowych CRISPR po optymalizacji dawki leku i długości testu. Uznane protokoły, takie jak protokół przesiewowy TKO z Moffat lab10,11, mogą być używane do przygotowania biblioteki przesiewowej CRISPR, produkcji wirusów, przeprowadzenia badania przesiewowego CRISPR i przygotowania bibliotek do sekwencjonowania (Rysunek 1A-B). Poniższy protokół opisuje etapy specyficzne dla analizy MEDUSA, które należy przeprowadzić na danych na poziomie zliczania po sekwencjonowaniu.
<ol>
	<li>Oblicz eksperymentalnie zaobserwowane zmiany fałdowania dla każdego sgRNA (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C), jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Wygeneruj tabelę zliczeń na poziomie sgRNA, aby przygotować dane sekwencjonowania do analizy. Przycinanie i mapowanie bibliotek sekwencjonowania przy użyciu standardowych potoków, zgodnie z opisem5,12.</li>
		<li>Normalizacja głębokości biblioteki sekwencjonowania. Biblioteki można normalizować ręcznie lub za pomocą wbudowanych funkcji, takich jak te w DESeq2, na przykład w 5,12. Normalizacja względem wszystkich prowadnic lub przy użyciu rozkładu prowadnic niedocelowych.</li>
		<li>Losowo przypisz nieukierunkowane sgRNA do genów niedocelowych. Na przykład biblioteka z czterema sgRNA na gen powinna mieć cztery niedocelowe sgRNA na gen nieukierunkowany.</li>
		<li>Dla każdego interesującego porównania (nieleczone/T0 i/lub poddane obróbce/nieleczone) obliczyć log2 (krotna zmiana). Zaleca się, aby zostało to obliczone przy użyciu dopasowania parametrycznego w DESeq2, chociaż można również przeprowadzić ręczne obliczenia zmiany zagięcia. </li>
		<li>Przytnij sgRNA z małą liczbą zliczeń. Prawidłowa strategia przycinania będzie zależeć od poziomu szumu między powtórzeniami i od tego, jak zmienia się on w zależności od zliczeń. Te funkcje będą się różnić w zależności od biblioteki CRISPR i będą testować wiele odcięć równolegle dla nowych danych. Typowe strategie odcięcia oparte na precedensach literaturowych obejmują usuwanie najniższych 5% prowadnic lub usuwanie prowadnic poniżej pewnego nominalnego progu13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ wpływ każdego pojedynczego nokautu genu na tempo wzrostu, jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Oblicz tempo wzrostu populacji netto (NPG) nieleczonych komórek (tj. obserwowany czas podwojenia populacji, <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D). Można to wyodrębnić z danych FLICK w kroku 1, liczby żywych komórek w czasie w kroku 3 lub wcześniejszych pomiarów eksperymentalnych dla linii komórkowej będącej przedmiotem zainteresowania.</li>
		<li>MEDUSA wymaga trzech parametrów do modelowania nieleczonego stanu: NPG: Net Population Growth Rate, w podwojeniach/h; T start: Punkt początkowy, w godz. Jest to ustawione na wartość domyślną 0; Tendunt: Końcowy punkt czasowy dla nieleczonego schorzenia, w godz.</li>
		<li>Zasymuluj wszystkie możliwe perturbacje kursu NPG. Użyj pętli for, aby ocenić zakres możliwych wartości NPG. Dla każdej względnej szybkości wzrostu oblicz log2 (krotna zmiana), która zostałaby zaobserwowana w punkcie końcowym testu.</li>
		<li>Dla każdego eksperymentalnego sgRNA w kroku 4.1.5 zidentyfikuj symulowaną zmianę krotności najbliższą obserwowanym danym. Przypisz względną szybkość wzrostu, która spowodowała symulowaną zmianę fałdowania, do tego sgRNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Scharakteryzuj koordynację między wzrostem a śmiercią w sposób opisany poniżej. 
	UWAGA: Parametry wymagane dla MEDUSA można wyodrębnić z danych w stylu FLICK podczas analizy za pomocą metody analizy GRADE14. Można do tego wykorzystać dane z (1) i (2) lub przeprowadzić dodatkowy eksperyment parametryzacji.
	<ol>
		<li>MEDUSA wykorzystuje cztery parametry do scharakteryzowania koordynacji między wzrostem a śmiercią w obecności leku: GRlek1: Tempo wzrostu wywołane lekiem przed wystąpieniem śmierci, w podwojeniach/h; DO: Czas nadejścia śmierci, w h; GRlek2: Tempo wzrostu wywołane lekiem po wystąpieniu zgonu, w podwojeniach/h; Lek DR: Śmiertelność spowodowana lekiem, w jednostkach frakcji śmiertelnej/h. Aby sparametryzować DO, użyj kinetyki LF. Wyodrębnij czas początku śmierci z pasowania diody LED.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określlek DR za pomocą kinetyki LF. Określ średnią śmiertelność, dzieląc końcową LF przez czas następujący po wystąpieniu zgonu (w godzinach).</li>
	<li>Określ GRlek1 na podstawie danych zliczania żywych komórek w kroku 3. Przed wystąpieniem zgonu należy określić tempo wzrostu wywołane lekiem, dopasowując dane do prostego równania wykładniczego.
	<ol>
		<li>Określ GRlek2 za pomocą kombinacji danych z kroku 3 i leku GRADE14. Oblicz i wykreśl GRADE dla wybranej dawki leku na wykresie GRADE. Jeśli GRADE = 0, załóżmy, że GRlek2 wynosi 0; Jeśli GRADE > 0, użyj funkcji GRADE, aby określić średnie tempo wzrostu populacji. Na podstawie eksperymentalnie wyznaczonej wartości dla GRleku1 określ wartość dla GRleku2, która daje obserwowaną średnią szybkość wzrostu. 
		UWAGA: Średnią szybkość wzrostu indukowaną lekiem można wywnioskować z wykresu GRADE, obliczając odległość parami między obserwowanym punktem danych (tj. parą danych GR i FV dla leku) a każdym punktem tworzącym przestrzeń GRADE i identyfikując najbliższy punkt. Szczegółowe instrukcje można znaleźć w ref14. Tempo wzrostu i śmiertelność wywołane przez lek nie są stałymi wartościami dla każdego leku i są specyficzne dla leku w danej dawce w danym kontekście komórkowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wygeneruj symulowane zmiany fałdowania dla wszystkich możliwych kombinacji szybkości wzrostu i śmiertelności, jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Korzystając z eksperymentalnie ustalonej koordynacji tempa wzrostu i śmiertelności wywołanej lekiem, zbuduj model, który symuluje wielkość populacji wywołanej przez lek w czasie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D). Model ten może być zbudowany jako funkcja odcinkowa, która łączy dwie niezależne fazy odpowiedzi na lek (czas przed i po śmierci).</li>
		<li>Aby uzyskać pełny model MEDUSA, uwzględnij te osiem parametrów: NPG: Tempo wzrostu populacji netto, w podwojeniach/h; GRlek1: Tempo wzrostu wywołane lekiem przed wystąpieniem zgonu, w podwojeniach/h; DO: Czas nadejścia śmierci, w h; GRlek2: Tempo wzrostu wywołane lekiem po wystąpieniu zgonu, w podwojeniach/h; Lek DR: Śmiertelność wywołana przez lek, w jednostkach frakcji śmiertelnej/h; T start: Punkt początkowy, w godz. Jest to ustawione na wartość domyślną 0; Tendunt: Końcowy punkt czasowy dla nieleczonego schorzenia, w h; Tendtr: Końcowy punkt czasowy dla leczonego stanu, w h.</li>
		<li>W przypadku modelu bazowego należy zasymulować wszystkie możliwe perturbacje związane ze wzrostem i śmiertelnością. Dla każdej kombinacji oblicz log2 (krotna zmiana), która byłaby obserwowana. 
		UWAGA: W przypadku MEDUSA zakłada się, że zaburzenia tempa wzrostu są proporcjonalne dla NPG, GRlek1 i GRleku2. Na przykład 80-procentowe zmniejszenie wskaźnika NPG powoduje również 80-procentowe zmniejszenie obu wskaźników wzrostu wywołanych przez leki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wywnioskuj współczynnik śmiertelności każdego nokautu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D-E), jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Dla każdego sgRNA dokonaj triangulacji śmiertelności wywołanej lekiem, która spowodowałaby obserwowaną zmianę fałdowania. Najpierw wyodrębnij względną szybkość wzrostu określoną w kroku (4.2.4).</li>
		<li>Określ stawki dla GRlek1 i GRlek2. Zastosuj względną szybkość wzrostu z NPG, aby obliczyć proporcjonalną szybkość wzrostu dla GRleku1/GRleku2.</li>
		<li>Korzystając z ograniczeń do NPG, GRlek1 i GRleku2, zidentyfikuj symulowaną zmianę fałdowania najbliższą obserwowanej zmianie fałdowania dla każdego sgRNA (leczonego/nieleczonego). Wykorzystaj kombinację tych obserwacji, aby obliczyć wstecznie współczynnik śmiertelności wywołanej przez leki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz tempo wzrostu na poziomie genów i wskaźniki śmiertelności, jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Określ wskaźniki poziomu genu dla każdego genu w bibliotece. Oblicz średnią dla każdego tempa wzrostu i współczynnika śmiertelności dla wszystkich sgRNA związanych z danym genem (zwykle 4-10).</li>
		<li>Aby obliczyć empiryczne wartości p, uruchom dane na poziomie sgRNA. Wykonaj korektę FDR za pomocą procedury Benjamini-Hochberg. 
		UWAGA: Instrukcje uzupełniające, a także przykładowe dane do analizy danych przesiewowych CRISPR za pomocą MEDUSA, znajdują się w naszym repozytorium GitHub (https://github.com/MJLee-Lab/MEDUSA). </li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Przybyla, L., Gilbert, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+era+in+functional+genomics+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">A new era in functional genomics screens.</a> Nat Rev Genet. 23 (2), 89-103 (2021).</li>
<li>Colic, M., Hart, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetic+interactions+in+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Chemogenetic interactions in human cancer cells.</a> Comput Struct Biotechnol J. 17, 1318-1325 (2019).</li>
<li>Colic, M., Hart, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+computational+tools+for+analyzing+CRISPR+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Top+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Common computational tools for analyzing CRISPR screens.</a> Emerg Top Life Sci. 5 (6), 779-788 (2021).</li>
<li>Dixon, S. J., Lee, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+tips+for+interpreting+cell+death+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quick tips for interpreting cell death experiments.</a> Nat Cell Biol. 25 (12), 1720-1723 (2023).</li>
<li>Honeywell, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+screens+with+death+rate+analyses+reveal+mechanisms+of+drug+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional genomic screens with death rate analyses reveal mechanisms of drug action.</a> Nat Chem Biol. 20 (11), 1443-1452 (2024).</li>
<li>Leylek, O., Honeywell, M. E., Lee, M. J., Hemann, M. T., Ozcan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+reveals+an+off-target+dependency+of+drug+synergy+in+gastric+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gastric+Cancer%22%5BJournal%5D)">Functional genomics reveals an off-target dependency of drug synergy in gastric cancer therapy.</a> Gastric Cancer. 27 (6), 1201-1219 (2024).</li>
<li>Richards, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+antagonism+and+single-agent+dominance+result+from+differences+in+death+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Drug antagonism and single-agent dominance result from differences in death kinetics.</a> Nat Chem Biol. 16 (7), 791-800 (2020).</li>
<li>Richards, R., Honeywell, M. E., Lee, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLICK%3A+an+optimized+plate+reader-based+assay+to+infer+cell+death+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">FLICK: an optimized plate reader-based assay to infer cell death kinetics.</a> STAR Protoc. 2 (1), 100327(2021).</li>
<li>Forcina, G. C., Conlon, M., Wells, A., Cao, J. Y., Dixon, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+quantification+of+population+cell+death+kinetics+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Systematic quantification of population cell death kinetics in mammalian cells.</a> Cell Syst. 4 (6), 600-610.e6 (2017).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+design+of+genome-wide+CRISPR%2FSpCas9+knockout+screens%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Evaluation and design of genome-wide CRISPR/SpCas9 knockout screens.</a> G3. 3 (8), 2719-2727 (2017).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+CRISPR+screens+reveal+fitness+genes+and+genotype-specific+cancer+liabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li>
<li>Cruz-Gordillo, P., Honeywell, M. E., Harper, N. W., Leete, T., Lee, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELP-dependent+expression+of+MCL1+promotes+resistance+to+EGFR+inhibition+in+triple-negative+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">ELP-dependent expression of MCL1 promotes resistance to EGFR inhibition in triple-negative breast cancer cells.</a> Sci Signal. 13 (658), eabb9820(2020).</li>
<li>Parnas, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genome-wide+CRISPR+screen+in+primary+immune+cells+to+dissect+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Genome-wide CRISPR screen in primary immune cells to dissect regulatory networks.</a> Cell. 162 (3), 675-686 (2015).</li>
<li>Schwartz, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+GRADE%3A+An+integrated+analysis+of+population+growth+and+cell+death+reveals+drug-specific+and+cancer+subtype-specific+response+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Drug GRADE: An integrated analysis of population growth and cell death reveals drug-specific and cancer subtype-specific response profiles.</a> Cell Rep. 31 (12), 107800(2020).</li>
<li>Montecucco, A., Biamonti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+response+to+etoposide+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Cellular response to etoposide treatment.</a> Cancer Lett. 252 (1), 9-18 (2007).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li>
<li>Colic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+chemogenetic+interactions+from+CRISPR+screens+with+drugZ%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Identifying chemogenetic interactions from CRISPR screens with drugZ.</a> Genome Med. 11 (1), 52(2019).</li>
<li>Olivieri, M., Durocher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+chemogenomic+CRISPR+screens+in+human+cells+using+the+TKOv3+library%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-scale chemogenomic CRISPR screens in human cells using the TKOv3 library.</a> STAR Protoc. 2 (1), 100321(2021).</li>
<li>Cai, X., Stringer, J. M., Zerafa, N., Carroll, J., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xrcc5%2FKu80+is+required+for+the+repair+of+DNA+damage+in+fully+grown+meiotically+arrested+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Xrcc5/Ku80 is required for the repair of DNA damage in fully grown meiotically arrested mammalian oocytes.</a> Cell Death Dis. 14 (7), 397(2023).</li>
<li>Colville, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death-seq+identifies+regulators+of+cell+death+and+senolytic+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Death-seq identifies regulators of cell death and senolytic therapies.</a> Cell Metab. 35 (10), 1814-1829.e6 (2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym protokole opisujemy zastosowanie metody analitycznej MEDUSA do ilościowego określania danych profilowania chemogenetycznego w celu oceny, w jaki sposób zaburzenia genetyczne zmieniają wskaźniki wzrostu i zgonów wywołane przez leki. Ponieważ główny wynik eksperymentu z profilowaniem chemogenetycznym jest związany z wielkością populacji, a nie ze wskaźnikami, podstawowe wskaźniki są wnioskowane za pomocą symulacji. W związku z tym krytycznymi etapami metody są dokładna eksperymentalna parametryzacja kinetyki o...

W profilowaniu chemogenetycznym, systematyczne zaburzenia genetyczne są wykorzystywane do zrozumienia wkładu każdego genu w daną odpowiedź na lek1,2,3. Eksperymenty te są cenne i mogą dostarczyć ważnych informacji na temat reakcji na leki, w tym celu wiązania leku oraz mechanizmów napływu/odpływu leku. Ponieważ jednak eksperymenty te są zwykle przeprowadzane w sposób zbiorczy, który ocenia wszystkie geny jednocześnie, generowanie mechanistycznych spostrzeżeń na podstawie danych z profilowania chemogenetycznego może być trudne.
Mechanizmy kontroli i genetyczne zależności dla śmierci komórek wywołanej przez lek wydają się być trudne do rozwiązania w danych profilowania chemogenetycznego. Istnieje kilka przyczyn tego problemu, ale wiele z nich wynika z wpływu zmian w proliferacji komórek4. Na przykład, ponieważ komórki proliferują wykładniczo, wpływ zaburzeń genetycznych na tempo proliferacji ma większy wpływ na wielkość populacji niż zmiana wskaźników umierania komórek. Ponadto, ponieważ ta stronnicza czułość nasila się z czasem, a eksperymenty te są zwykle przeprowadzane przez kilka tygodni, większość badań jest zoptymalizowana tak, aby były wysoce wrażliwe na defekty proliferacji i zasadniczo niewrażliwe na zmiany w śmierci komórki wywołanej przez lek. Inne kwestie związane z proliferacją obejmują zróżnicowaną koordynację między proliferacją a śmiercią (np. jak szybko każdy klon rośnie, jednocześnie umiera i czy różni się to w zależności od perturbacji genetycznych) oraz różnice w tempie proliferacji dla każdego klonu przy braku leku, co zmienia oczekiwaną liczbę komórek, które powinny/mogłyby zostać odzyskane, gdyby lek nie był skuteczny. Najważniejsze jest to, że eksperymenty z profilowaniem chemogenetycznym na ogół oceniają wpływ zaburzeń genetycznych za pomocą pomiarów, które są proporcjonalne do względnej wielkości populacji, porównując populacje leczone i nieleczone. Ponieważ wielkość populacji jest wypadkową zarówno tempa wzrostu komórek, jak i ich śmiertelności, z perspektywy śmierci komórki proliferacja stanowi czynnik zakłócający.
Aby zaradzić tym problemom, stworzyliśmy Metodę Oceny Śmierci za pomocą Podejścia Wspomaganego Symulacją (MEDUSA)5. Działanie MEDUSA polega na interpretacji obserwowanych danych dotyczących względnej wielkości populacji przez pryzmat symulacji obliczeniowych w celu wywnioskowania kombinacji wskaźników wzrostu i śmiertelności wywołanych przez leki, które wygenerowały zaobserwowaną odpowiedź na lek dla każdego klonu genetycznego. Wcześniejsze dane sugerują, że metoda może dokładnie wywnioskować, w jaki sposób zaburzenia genetyczne wpływają na śmiertelność wywołaną przez lek, ale dokładność tej metody zależy od szczegółowego zrozumienia, w jaki sposób proliferacja komórek i śmierć komórki są koordynowane przez lek i jak te wskaźniki zmieniają się w czasie5,6. Dodatkowo, wnioski oparte na MEDUSA wymagają, aby lek był testowany w dawce, która powoduje znaczną śmierć komórki. Co ważne, te warunki stosowania leków stwarzają dodatkowe obawy dotyczące początkowej wielkości populacji i długości testów, które powinny być dokładnie rozważone i zoptymalizowane. W niniejszym protokole opisujemy, jak skonfigurować badanie profilowania chemogenetycznego do analizy opartej na MEDUSA i szczegółowo opisujemy zastosowanie tej metody analitycznej. Ogólnym celem projektu MEDUSA jest określenie, w jaki sposób delecja każdego genu wpływa na wskaźniki wzrostu i śmiertelności wywołane przez leki.

<table><tbody><tr><td>100mm Fisherbrand TC Naczynia</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012924</td><td>Do hodowli komórek i optymalizacji wielkości populacji</td></tr><tr><td>150mm Naczynia TC Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012925</td><td>Do hodowli komórek i optymalizacji wielkości populacji</td></tr><tr><td>Pakiet DESeq2</td><td>R</td><td>v1.44.0</td><td>Do obliczania zmiany fałdy</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10017CV</td><td>Do siewu i odurzania komórki</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25950CQC</td><td>Do wysiewu i lekowania komórek</td></tr><tr><td>Fisherbrand 96-Well, Mikropłytka z dnem w kształcie litery U traktowana kulturą komórkową</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012932</td><td>Do wysiewu i narkotyzacji komórek (płytka szpilkowa)</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One&nbsp; CELLSTAR &mu; Przezroczysta 96-dołkowa, poddawana hodowli komórkowej, płaska płytka do mikropłytek</td><td>Greiner</td><td>655090</td><td>Do wysiewu i odurzania komórek</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks&nbsp;</td><td>R2024a</td><td>Do wykonywania FLICK, GRADE i MEDUSA</td></tr><tr><td>Czytnik fluorescencji mikropłytek</td><td>Tecan</td><td>Spark</td><td>Do pomiarów martwych komórek</td></tr><tr><td>Sytox Green</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td>Do pomiarów martwych komórek</td></tr><tr><td>Biblioteka TKOV3 CRISPR</td><td>Addgene</td><td>125517</td><td>Do wykonywania ekranu CRISPR</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J66624-AP</td><td>Do przepuszczalności komórek</td></tr><tr><td>Błękit trypanowy&nbsp;</td><td>Corning</td><td>MT25900CI</td><td>Do pomiaru żywych/martwych komórek</td></tr></tbody></table>

medusa do identyfikacji genów regulujących śmierć w danych z profilowania chemogenetycznego

MEDUSA for Identifying Death Regulatory Genes in Chemo-genetic Profiling Data

Systematyczne badania przesiewowe zaburzeń genetycznych związanych z zyskiem lub utratą funkcji mogą być wykorzystane do scharakteryzowania genetycznych zależności i mechanizmów regulacji dla zasadniczo każdego interesującego procesu komórkowego. Eksperymenty te zazwyczaj obejmują profilowanie z puli zaburzeń pojedynczych genów i tego, jak każde zaburzenie genetyczne wpływa na względną sprawność komórki. Metody te, stosowane w kontekście badań skuteczności leków, często nazywanych profilowaniem chemogenetycznym, powinny być skuteczne w identyfikacji mechanizmów działania leków. Niestety, badania nad profilowaniem chemogenetycznym opartym na dopasowaniu są nieskuteczne w identyfikowaniu wszystkich składników odpowiedzi na lek. Na przykład, badania te na ogół nie są w stanie określić, które geny regulują śmierć komórek wywołaną przez leki. Kilka kwestii przyczynia się do zaciemnienia regulacji zgonów w badaniach przesiewowych opartych na sprawności, w tym mylące skutki zmienności tempa proliferacji, różnice w indukowanej przez lek koordynacji między wzrostem a śmiercią oraz, w niektórych przypadkach, niezdolność do oddzielenia DNA od żywych i martwych komórek. MEDUSA jest metodą analityczną służącą do identyfikacji genów regulujących śmierć w konwencjonalnych danych z profilowania chemogenetycznego. Działa poprzez wykorzystanie symulacji obliczeniowych do oszacowania wskaźników wzrostu i śmiertelności, które stworzyły obserwowany profil sprawności, a nie ocenianie samej sprawności. Skuteczne zastosowanie metody zależy od optymalnego domiaru warunków eksperymentalnych, w tym dawki leku, początkowej wielkości populacji i długości testu. W tym manuskrypcie opiszemy, jak skonfigurować badanie profilowania chemogenetycznego do analizy opartej na MEDUSA, a także pokażemy, jak wykorzystać tę metodę do ilościowego określenia śmiertelności w danych z profilowania chemogenetycznego.

Korzystając z niniejszego protokołu, zbadaliśmy zależności genetyczne w procesie śmierci komórek U2OS indukowanej etoposydem. Etoposyd jest powszechnie stosowanym chemioterapeutykiem uszkadzającym DNA15. To eksperymentalne profilowanie chemiczno-genetyczne przeprowadzono z wykorzystaniem biblioteki GeCKOv216 w komórkach U2OS ekspresujących Cas95. W tego typu eksperymentach funkcję genu zazwyczaj wnioskuje się na podstawie względnej liczebności danego...

Ten protokół opisuje, jak używać metody analitycznej MEDUSA do ilościowego określenia efektu regulacji śmierci każdego nokautu genu. Zawiera instrukcje dotyczące określania warunków eksperymentalnych, które optymalizują czułość, oraz samouczek krok po kroku dotyczący wykonywania analizy.

MEDUSA do identyfikacji genów regulujących śmierć w danych z profilowania chemogenetycznego

Systematic screening of gain- or loss-of-function genetic perturbations can be used to characterize the genetic dependencies and mechanisms of regulation ...

Nasz program badawczy koncentruje się na zrozumieniu, w jaki sposób regulowane są różne formy śmierci komórki. Generalnie badamy śmierć komórek w kontekście terapii przeciwnowotworowych, mając na celu poznanie, w jaki sposób działają leki, które włączają śmierć komórki i jak sprawić, by te reakcje były lepsze i bardziej specyficzne. Staje się coraz bardziej oczywiste, że istnieje wiele różnych rodzajów regulowanej śmierci komórki.Naukowcy zidentyfikowali obecnie co najmniej 14 mechanicznie odrębnych typów śmierci. Większość z nich powoduje morfologicznie nekrotyczną śmierć i ogólnie rzecz biorąc, wiemy bardzo niewiele o tym, jak działają te szlaki. Skutecznym sposobem badania regulacji śmierci komórkowej jest wykorzystanie genomiki funkcjonalnej.Innymi słowy, systematyczne zaburzanie każdego genu i określenie, w jaki sposób te zaburzenia wpływają na śmierć komórki. Gdy jest wykonywany w kontekście leków, nazywa się to profilowaniem chemogenetycznym. Chemogenetyczne badania przesiewowe zazwyczaj oceniają, w jaki sposób nokaut genów wpływa na ostateczną wielkość populacji.Jednak na wielkość populacji mogą mieć wpływ zmiany tempa wzrostu, śmiertelność lub jedno i drugie. Obecne metody badań przesiewowych nie są w stanie zidentyfikować genów regulujących śmierć ze względu na ograniczające skutki zmienności tempa wzrostu. Medusa wykorzystuje symulacje odpowiedzi na lek do modelowania, w jaki sposób zmiana tempa wzrostu lub śmiertelności wpływa na ostateczną wielkość populacji.Symulacje te pozwalają nam wyodrębnić śmiertelność wywołaną lekiem dla każdego genu w badaniu przesiewowym i usunąć inne czynniki zakłócające. Na początek umieść komórki w czarnych, przezroczystych płytkach 96-dołkowych przy gęstości wysiewu od 1500 do 5 000 komórek na studzienkę. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i wilgotnością przez 16 do 24 godzin. Przygotować rozcieńczenie leku w pożywce zawierającej stężenie cytotoksu, zoptymalizowane wcześniej.Lyce jedną płytkę za pomocą Triton X w optymalnym stężeniu. Następnie umieść płytkę w czytniku płytek i zmierz fluorescencję cytotoksu na płytkach eksperymentalnych w T0 przy użyciu zoptymalizowanych ustawień, a następnie w odpowiednim późniejszym punkcie czasowym. Po ostatecznym punkcie czasowym przetrzymuje płytki eksperymentalne przy użyciu Tritona X w celu określenia ostatecznej wielkości populacji każdego stanu.Obliczyć ułamkową żywotność, korzystając z danych końcowych, i dopasować wyniki do krzywych odpowiedzi na dawkę. Oceń krzywe odpowiedzi na dawkę, aby zidentyfikować dawki leku, które indukują około 50% śmierć komórki. Po zoptymalizowaniu dawki leku w celu wywołania śmierci komórki, losowo przypisz niedocelowe SG RNA do genów niedocelowych.Przycinanie RNA SG o niskiej liczbie w oparciu o wybraną strategię odcięcia. Zasymuluj wszystkie możliwe zakłócenia wskaźnika wzrostu populacji netto lub NPG, używając pętli for do oceny zakresu wartości NPG. Dla każdego eksperymentalnego pojedynczego RNA SG dopasuj symulowaną zmianę fałdowania najbliższą obserwowanym danym i przypisz odpowiednią względną szybkość wzrostu do SG RNA.Następnie określ tempo wzrostu indukowane lekiem przed śmiercią na podstawie danych dotyczących zliczania żywych komórek. Dopasuj dane do prostego równania wykładniczego, aby wyprowadzić tempo wzrostu. Oblicz tempo wzrostu wywołane lekiem po wystąpieniu śmierci, łącząc dane dotyczące zliczania żywych komórek i wartości klasy leku.Wykreślić stopień dla wybranej dawki leku na wykresie klasyfikacji. Korzystając z eksperymentalnie ustalonej koordynacji między wzrostem a śmiertelnością wywołaną przez leki, stwórz model symulujący wielkość populacji wywołanej przez lek w czasie. Następnie opracuj model Meduzy, który obejmuje NPG, tempo wzrostu wywołane przez lek przed i po wystąpieniu zgonu w podwajaniu się na godzinę oraz współczynnik śmiertelności wywołanej lekiem.Ustaw początkowy punkt czasowy na godzinę zero i zdefiniuj końcowe punkty czasowe zarówno dla stanów nieleczonych, jak i leczonych. Zasymuluj wszystkie możliwe perturbacje współczynników wzrostu i śmiertelności dla modelu bazowego. Dla każdej kombinacji należy obliczyć logarytm o podstawie dwa zmiany krotności obserwowanej w punkcie końcowym testu.Dla każdego RNA SG dokonaj triangulacji śmiertelności wywołanej lekiem, która spowodowałaby obserwowaną zmianę fałdowania. Zacznij od wyodrębnienia z góry określonej względnej szybkości wzrostu. Określ tempo wzrostu wywołanego przez lek przed i po wystąpieniu śmierci.Zastosuj względną szybkość wzrostu z NPG, aby obliczyć proporcjonalne tempo wzrostu dla szybkości wzrostu wywołanego lekiem przed i po wystąpieniu zgonu. Korzystając z ograniczeń dla NPG, szybkości wzrostu indukowanej lekiem przed i po wystąpieniu śmierci, zidentyfikuj symulowaną zmianę fałdowania najbliższą obserwowanej zmianie fałdowania dla każdego RNA SG. Określ wskaźniki wzrostu i śmiertelności na poziomie genów dla każdego genu w bibliotece.Oblicz średnie wskaźniki wzrostu i śmiertelności dla wszystkich SG RNA związanych z każdym genem, zwykle w zakresie od 4 do 10 SG RNA. Aby obliczyć empiryczne wartości P, należy pobrać dane na poziomie SG RNA i zastosować poprawkę współczynnika fałszywych odkryć przy użyciu procedury Benjamina Hochberga. Frakcyjna żywotność komórek U2 OS zmniejszyła się w sposób zależny od dawki, z około 50% śmiertelnością obserwowaną przy pięciu mikromolowych etopozydach po 96 godzinach.Wielkość ozdrowieńców zmniejszyła się o 40% do 50% po czterech dniach ekspozycji na pięć etopozydów mikromolowych, potwierdzając śmierć komórek podczas leczenia farmakologicznego. Analiza stopnia wykazała, że pięć mikromolowych etopozydów powodowało znaczne zmniejszenie szybkości wzrostu, a śmierć komórki rozpoczynała się dopiero po całkowitym zatrzymaniu wzrostu. Analiza Medusa wykazała, że pięć komórek nokautujących XRCC wykazywało powolny wzrost w nieleczonych warunkach i wysokie wskaźniki śmiertelności wywołanej lekami podczas leczenia etopozydem.Eksperymenty walidacyjne potwierdziły, że komórki nokautujące XRCC 5 wykazywały wolniejszy wzrost w nieleczonych warunkach i podwyższone wskaźniki śmiertelności w przypadku etopozydu, co jest zgodne z przewidywaniami Meduzy.

medusa-for-identifying-death-regulatory-genes-chemo-genetic-profiling

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisany tutaj jest protokół charakteryzujący moduły biologicznie synergicznych miRNA i ich łączenie w krótkie transgeny, co pozwala na jednoczesną nadekspresję dla zastosowań terapii genowej.

Charakterystyka funkcjonalnie powiązanych miRNA w glejaku i ich inżynieria w sztuczne klastry do terapii genowej

Użycie podejścia opartego na RNA do określenia ilościowych profili immunologicznych tkanek guza litego i wykorzystania kohort klinicznych do odkrycia biomarkerów immunologicznych onkologicznych jest opisane za pomocą protokołów molekularnych i informatycznych.

Predykcyjne modelowanie immunologiczne guzów litych

Prezentowany tutaj jest protokół do odkrycia nadekspresji genów napędzających, które utrzymują ustalone rakopodobne komórki macierzyste pochodzące z komórek HT29 jelita grubego. Przeprowadzono sekwencję RNAseq z dostępnymi danymi bioinformatycznymi w celu zbadania i zbadania sieci ekspresji genów w celu wyjaśnienia potencjalnego mechanizmu związanego z przetrwaniem docelowych komórek nowotworowych.

Odkrycie genów sterujących w guzach przypominających łodygi raka jelita grubego pochodzących z HT29

Ten artykuł opisuje przebieg techniki wykorzystywane do testowania nowych kandydatów na mediatory przerzutów czerniaka i ich mechanizm(y) działania.

Solidna platforma odkrywcza do identyfikacji nowych mediatorów przerzutów czerniaka

Opracowaliśmy międzygatunkowe porównawcze podejście onkogenomiczne, wykorzystując analizy genomiczne i funkcjonalne badania genomowe do identyfikacji i porównania celów terapeutycznych w nowotworach powstających w genetycznie modyfikowanych modelach mysich i odpowiadającym im typie nowotworu ludzkiego.

Profilowanie genetyczne i badania przesiewowe w skali genomu w celu identyfikacji celów terapeutycznych w mysich modelach złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych

Tutaj prezentujemy powtarzalną metodę tworzenia ortotopowego mysiego modelu raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. Guzy wykazują klinicznie istotne cechy histopatologiczne choroby, w tym martwicę, słabe różnicowanie, przerzuty węzłowe i naciek immunologiczny. U myszy z guzem rozwijają klinicznie istotne objawy, w tym dysfagię, przemieszczenie szczęki i utratę wagi.

Dośluzówkowa inokulacja komórek raka płaskonabłonkowego u myszy w celu profilowania immunologicznego guza i oceny odpowiedzi na leczenie

Tutaj prezentujemy kilka prostych metod oceny żywotności i śmierci w sferoidach komórek rakowych 3D, które znacznie lepiej naśladują gradienty fizykochemiczne guzów in vivo niż hodowla 2D. Model sferoidalny umożliwia zatem ocenę skuteczności leku przeciwnowotworowego z lepszą translacją do warunków in vivo.

Ocena żywotności i śmierci komórek w sferoidalnych kulturach 3D komórek nowotworowych

Prezentowany tutaj jest protokół do tworzenia nomogramów opartych na modelu regresji proporcjonalnego hazardu Coxa i konkurencyjnym modelu regresji ryzyka. Metoda konkurencyjna jest bardziej racjonalną metodą do zastosowania, gdy w analizie przeżycia obecne są konkurencyjne zdarzenia.

Ustanowienie konkurencyjnego modelu nomogramu regresji ryzyka dla danych dotyczących przeżycia

Tutaj przedstawiono metody pozwalające zrozumieć przeciwnowotworowe działanie bezkomórkowego supernatantu Lactobacillus (LCFS). Linie komórkowe raka jelita grubego wykazują śmierć komórek po leczeniu LCFS w hodowlach 3D. Proces generowania sferoid można zoptymalizować w zależności od rusztowania, a przedstawione metody analizy są przydatne do oceny zaangażowanych szlaków sygnałowych.

Ocena śmierci komórki przy użyciu bezkomórkowego supernatantu probiotyków w trójwymiarowych hodowlach sferoidalnych komórek raka jelita grubego

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół techniki nieinwazyjnej płynnej biopsji, w tym pobieranie krwi, separację osocza i kożucha, ekstrakcję cfDNA i DNA linii zarodkowej, kwantyfikację cfDNA lub DNA linii zarodkowej oraz analizę wzbogacania fragmentów cfDNA.

Wykrywanie bezkomórkowego DNA w próbkach osocza krwi pacjentów z rakiem

Poznaj metodę MEDUSA do identyfikacji genów regulujących śmierć komórkową w badaniach chemogenetycznych. Ta technika pozwala ilościowo ocenić wpływ knockoutów genów na śmierć komórek w kontekście terapii przeciwnowotworowych.

MEDUSA do identyfikacji genów regulujących śmierć w danych z profilowania chemogenetycznego

Przeglądaj więcej filmów