Zmodyfikowany test liczbowy "Najbardziej prawdopodobny" w celu ilościowego określenia salmonelli w surowych i gotowych do przyrządzenia produktach z kurczaka

Nasze badania rozwijają technologie szybkiego wykrywania, kwantyfikacji i charakterystyki patogenów przenoszonych przez żywność, koncentrując się na czułych metodach, które mogą poprawić bezpieczeństwo żywności poprzez identyfikację zanieczyszczenia w warunkach rzeczywistych. Kluczowe wyzwania obejmują osiągnięcie szybkiej czułości wykrywania i złożonych macierzy przy użyciu tanich, ale skalowalnych rozwiązań. Rozwiązujemy również problemy związane z redukcją wyników fałszywie dodatnich i poprawą kompatybilności z różnymi środowiskami testowymi.

Z punktu widzenia bezpieczeństwa żywności oznacza to dokładne wykrywanie patogenów w niskich stężeniach w różnych matrycach żywnościowych. Nasz protokół wypełnia lukę między wykrywaniem występowania a kwantyfikacją salmonelli, aby zapewnić deterministyczne wartości poziomu zanieczyszczenia w produktach spożywczych. Proces ten jest minimalnie uciążliwy, ponieważ obejmuje zwalidowane testy stosowane w protokołach FSIS i jest wystarczająco elastyczny, aby pomieścić dodatkowe patogeny i matryce żywnościowe.

Na początek umieść mielonego kurczaka pozyskanego z działu świeżego mięsa lokalnych sprzedawców detalicznych na platformie roboczej. Mięso należy podzielić w asepcie na próbki o wadze 25 gramów. Kup gotowe do gotowania produkty z kurczaka z działu mrożonek lokalnych sprzedawców detalicznych i aseptycznie podziel je na 25-gramowe próbki.

Smuga salmonella enterica serowar Typhimurium ATCC 14028 na płytce ślimakowej do infuzji serca mózgu. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia zaszczep 25 mililitrów bulionu z naparu z serca mózgu jedną kolonią świeżo wyhodowanej salmonelli.

Kultura uprawiana tlenowo przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 100 obr./min. Aby przygotować serię dziesięciokrotnych rozcieńczeń, przenieś 0,5 mililitra kultury do 4,5 mililitra buforowanej wody peptydowej lub BPW i dokładnie wymieszaj. Następnie przenieś 0,5 mililitra z przygotowanego rozcieńczenia do 4,5 mililitra BPW na każde kolejne rozcieńczenie.

Następnie aseptycznie przenieś 25 gramów napromieniowanego mielonego kurczaka do sterylnych torebek stomacher. Zaszczepić próbkę jednym mililitrem pożądanego stężenia rozcieńczenia kultury. Używając sterylnego rozsiewacza komórek, delikatnie rozprowadź inokulum równomiernie na powierzchni kurczaka i pozwól mu stać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę.

Po inkubacji napromieniowanych zmielonych próbek kurczaka z kulturą salmonelli przez godzinę, dodaj 225 mililitrów BPW do każdej próbki, aby uzyskać pożądany stosunek próbki do podłoża. Homogenizować próbki kurczaka za pomocą stomachera z normalną prędkością przez 120 sekund. Za pomocą pipety o pojemności 50 mililitrów ostrożnie usuń płyn z przefiltrowanej strony stomachera i podziel go na dwie sterylne butelki wirówkowe.

Odwirować próbki o sile 10 000 G przez 10 minut i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad komórkowy w trzech mililitrach BPW za pomocą sterylnej szpatułki. Dodaj 12 mililitrów BPW do zawieszonego osadu i dokładnie wymieszaj, mieszając sterylną szpatułką.

Połącz zawartość obu butelek wirówkowych w jedną butelkę. Dodać trzy mililitry ponownie zawieszonej próbki do każdej studzienki w pierwszej kolumnie z 48 bloków dołków, aby utworzyć osiem powtórzeń. Aby przygotować serię dziesięciokrotnych rozcieńczeń w kolumnach od pierwszej do szóstej za pomocą pipety ośmiokanałowej, dodaj 0,3 mililitra próbki z każdej studzienki do 2,7 mililitra BPW w następnej kolumnie, zapewniając dokładne wymieszanie.

Inkubuj bloki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 100 obr./min. Następnego dnia, używając pipety wielokanałowej, umieść siedem mikrolitrów kultury z każdego rozcieńczenia na płytkach ślimakowych do infuzji serca mózgu w siatce cztery na sześć. Pozostaw płytki do wyschnięcia na 10 minut przed inkubacją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin.

Po inkubacji zbadaj płytki ślimakowe, oznaczając co najmniej jedną kolonię jako dodatnią, a brak wzrostu jako ujemny. Wprowadź liczbę rozcieńczeń i współczynnik rozcieńczenia w arkuszu. Wprowadzić odpowiednią objętość lub masę próbki.

Następnie określ liczbę powtórzeń i wprowadź liczbę próbek, które dały wynik pozytywny. Kliknij oblicz wyniki, aby przeanalizować wyniki dodatnie i ujemne z adnotacjami przy użyciu prostej metody rozwiązywania maksymalnych prawdopodobieństw. Na początek ustaw 48-dołkowy blok MPN dla kultury salmonelli zaszczepionej próbkami kurczaków.

Wymieszaj kultury w bloku 48-dołkowym, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół. Przenieś 200 mikrolitrów każdej kultury na 96-dołkową płytkę do PCR. Zamknąć płytkę i odwirować przy 6,600 G przez 10 minut.

Usunąć supernatant i dodać 20 mikrolitrów odczynnika z zestawu do ekstrakcji DNA do osadu. Wymieszaj granulki, pipetując w górę i w dół. Ponownie uszczelnij płytkę i podgrzej ją w temperaturze 99 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie schładzaj do 20 stopni Celsjusza.

Po odwirowaniu należy użyć dwóch mikrolitrów supernatantu do przygotowania mieszaniny QPCR zgodnie z ustalonym protokołem. Korzystając z poniższych warunków, wykonaj PCR w czasie rzeczywistym. Po PCR wyeksportuj wyniki i potraktuj dołki o wartościach progowych cyklu mniejszych lub równych 30 jako dodatnich i większych niż 30 jako ujemnych.

Wymieszaj kultury w bloku 48-dołkowym, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół. Przenieś 20 mikrolitrów każdej próbki do probówki do lizy dostarczonej z zestawem do wykrywania molekularnego salmonelli. Podgrzewać próbki w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Następnie inkubować próbki przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś 20 mikrolitrów lizatu z każdej probówki do lizy do probówki z odczynnikiem i załaduj probówki z odczynnikiem do uchwytu. Dodaj uchwyt z probówkami z odczynnikiem do przyrządu systemu detekcji molekularnej.

Skonfiguruj ustawienia oprogramowania dla testu systemu detekcji molekularnej. Uruchom test i wyeksportuj raport do analizy. Raport MDS Run zawiera szczegółowe informacje wyjściowe, które są dodatnie lub ujemne.