Name: Zmodyfikowany test liczbowy Najbardziej prawdopodobny w celu ilościowego określenia salmonelli w surowych i gotowych do przyrządzenia produktach z kurczaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T14:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Poznaj zmodyfikowany test MPN do ilościowego oznaczania Salmonella w surowym i gotowym kurczaku. Ta metoda zapewnia szybką, czułą detekcję zgodną z wytycznymi FSIS, wspierając bezpieczeństwo żywności i zdrowie publiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych, Służbę Badań Rolniczych (USDA-ARS), Narodowy Program 108, numery Systemu Informacji o Aktualnych Badaniach 8072-42000-093-000-D i 8072-42000-094-000-D. Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tym artykule służy wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznacza rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych. USDA jest dostawcą równych szans i pracodawcą.

UWAGA: Wszystkie prace związane z tym protokołem powinny być prowadzone w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). W stosownych przypadkach protokół ten powinien być przeprowadzany w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) w celu utrzymania warunków aseptycznych i zminimalizowania ryzyka zanieczyszczenia próbki lub narażenia operatora na patogeny mikrobiologiczne. Podczas przenoszenia próbek na zewnątrz BSC należy używać szczelnych pojemników, aby zachować integralność próbki i zapobiec rozlaniu w przypadku przypadkowego upuszczenia. Zaleca się, aby przez cały czas trwania procedury stosowano składniki jednorazowego użytku, aby ograniczyć możliwość zanieczyszczenia krzyżowego. W przypadkach, gdy produkty jednorazowego użytku nie są możliwe, przed użyciem upewnij się, że cały sprzęt i materiały są sterylne. Właściwa gospodarka odpadami ma kluczowe znaczenie; Wszystkie zużyte elementy jednorazowego użytku należy wyrzucić jako odpady stanowiące zagrożenie biologiczne. Autoklaw materiałów wielokrotnego użytku przed ponownym użyciem, aby zapewnić odpowiednią sterylizację i ochronę potencjalnie niebezpiecznych materiałów. Przestrzeganie tych środków ostrożności nie tylko chroni integralność próbki, ale także minimalizuje ryzyko narażenia operatora na patogeny mikrobiologiczne.
1. Przygotowanie próbek mięsa
<ol>
	<li>Pobieranie i przetwarzanie próbek mięsa
	<ol>
		<li>Świeże mięso
		<ol>
			<li>Kupuj mielonego kurczaka w dziale świeżego mięsa lokalnych sprzedawców detalicznych. Wszystkie próbki należy przenieść do magazynu w temperaturze 4 °C i przetworzyć w ciągu 24 godzin od otrzymania. Mięso należy podzielić w asepcie na próbki o wadze 25 g.</li>
			<li>Uszczelnić próżniowo i napromienić próbkę. Tutaj Texas A&M AgriLife National Center for Electron Beam Research napromieniowało mięso poddane dawce ~25 kGy. 
			UWAGA: Chociaż napromienianie zostało użyte jako środek kontrolny w tym badaniu w celu zapewnienia eliminacji mikroflory tła, nie jest to warunek wstępny dla protokołu w praktycznych zastosowaniach, jak pokazano w przypadku nienapromieniowanych produktów gotowych do przyrządzenia użytych w następnej sekcji. W warunkach terenowych alternatywne metody, takie jak selektywne pożywki lub swoistość diagnostyki molekularnej, mogą rozwiązać problem potencjalnych zakłóceń powodowanych przez mikroorganizmy inne niż docelowe.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Gotowe do przyrządzenia produkty z kurczaka
		<ol>
			<li>Kupuj gotowe do gotowania produkty z kurczaka w dziale mrożonek lokalnych sprzedawców. Przeprowadzić aseptycznie podzielić na próbki o masie 25 g.</li>
			<li>Zbierz próbki ze środka poszczególnych kawałków, aby upewnić się, że wszystkie składniki (np. panierka i ser) są uwzględnione.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie podłoża
	<ol>
		<li>Przygotować buforowaną wodę peptonową (BPW), rozpuszczając 25 g proszku BPW w 1 l nanoczystegoH2O.</li>
		<li>Przygotuj płytki do infuzji mózgu i serca (BHI). Aby to zrobić, rozpuść 37 g proszku BHI w 1 l nanoczystego H2O i dodaj 15 g agaru do roztworu BHI. Sterylizować wszystkie podłoża w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Wlej od 20 do 25 ml pożywki na szalki Petriego z przezroczystą pokrywką (100 mm x 15 mm). 
		UWAGA: Najlepiej wlać płytki do komory bezpieczeństwa biologicznego, aby utrzymać warunki aseptyki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Przygotować początkową hodowlę, rozsiewając serowar Salmonella enterica Typhimurium ATCC 14028 na płytce agarowej BHI i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Przygotuj nocne kultury, zaszczepiając 25 ml bulionu BHI jedną kolonią świeżo wyhodowanej Salmonelli. Kultury uprawiać tlenowo przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 100 obr./min.</li>
</ol>
3. Inokulacja próbek drobiu
<ol>
	<li>Rozcieńczanie i powlekanie kultur
	<ol>
		<li>Przygotować serię 10-krotnych rozcieńczeń nocnej kultury w BPW, aby osiągnąć końcowe stężenia około 1 x 108 do 1 x 101 CFU/ml. Załóżmy, że stężenie nocnej hodowli Salmonelli wynosi 1 x 109 CFU/ml.</li>
		<li>Przenieść 0,5 ml hodowli przez noc do 4,5 ml BPW, wymieszać, a następnie przenieść 0,5 ml rozcieńczenia do 4,5 ml BPW dla każdego dodatkowego rozcieńczenia.
		<ol>
			<li>Rozprowadzić 10 μl rozcieńczenia 1 x 103 jtk/ml na płytce agarowej BHI w trzech egzemplarzach w celu zliczenia komórek w celu obliczenia stężenia hodowli przez noc.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inokulacja próbek mięsa
	<ol>
		<li>Przenieść w asepcie 25 g napromieniowanego mielonego kurczaka do sterylnego worka stomachera w dwóch egzemplarzach. Torba ma wymiary 7,5 x 12 cali i jest oznaczona jako 1,63 l. Worek zawiera przegrodę filtracyjną o średnicy otworu 330 μm, a na każdy cm kwadratowy przypada 285 zł.</li>
		<li>Zaszczepić każdą próbkę 1 ml rozcieńczenia o stężeniu docelowym. Na przykład dodać 1 ml kultury z rozcieńczenia 1 x 10³ jtk/ml, aby osiągnąć poziom zanieczyszczenia około 1000 komórek/25 g kurczaka. Delikatnie rozprowadzić płynne inokulum na powierzchni próbek kurczaka za pomocą sterylnego rozsiewacza komórek i pozostawić na 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować ujemne próbki kontrolne, dodając 1 ml sterylnego BPW.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przetwarzanie próbek
<ol>
	<li>Dodaj 225 ml BPW do każdej próbki. Stosunek objętości do nośnika został wybrany tak, aby był zgodny z FSIS MLG 4.154.</li>
	<li>Homogenizuj próbki za pomocą klasy Stomacher<sup="xref">7 z normalną prędkością i czasem trwania 120 s.</li>
	<li>Wirowanie i ponowne zawieszenie
	<ol>
		<li>Ostrożnie usuń płyn z przefiltrowanej strony worka za pomocą pipety o pojemności 50 ml. Podziel płyn na dwie sterylne butelki wirówkowe.</li>
		<li>Zrównoważyć butelki sterylnym BPW, aby zapewnić równą wagę. Odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 10 minut. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 3 ml bulionu BPW za pomocą sterylnej szpatułki.</li>
		<li>Dodaj dodatkowe 27 ml bulionu BPW i dokładnie wymieszaj, mieszając szpatułką. Połączyć zawartość obu butelek wirówkowych w jednej butelce dla każdej próbki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Konfiguracja bloku MPN
UWAGA: Tabela 1 przedstawia schemat rozcieńczeń w bloku 48-dołkowym.
<ol>
	<li>Dodać 3 ml ponownie zawieszonej próbki do każdego dołka w kolumnie 1 bloku 48-dołkowego (8 powtórzeń).</li>
	<li>Przygotować serię 10-krotnych rozcieńczeń w kolumnach 1-6 w bloku za pomocą ośmiokanałowej pipety.</li>
	<li>Dodać 0,3 ml próbki do 2,7 ml pipety BPW w celu wymieszania. Powtórzyć te czynności dla każdego rozcieńczenia. Inkubować bloki przez noc (~18 h) w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy ~100 obr./min.</li>
</ol>
6. Poszycie i wyliczenie
<ol>
	<li>Zmodyfikowano wyliczanie płyt zrzutowych
	<ol>
		<li>Płytka 7 μl próbki z każdego rozcieńczenia wyhodowanej przez noc w siatce 4 x 6 na płytce agarowej za pomocą pipety wielokanałowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Użycie siatki 4 x 6 na dwóch płytkach lepiej mieści 8 próbek, w przeciwieństwie do typowej siatki kropel 6 x 6 8.</li>
		<li>Pozostaw płytki do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut przed inkubacją. Inkubować płytki agarowe przez noc (~18-24 h) w temperaturze 37 °C. Po inkubacji policz liczbę kolonii na każdej płytce.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Wykrywanie Salmonelli metodą qPCR
<ol>
	<li>Ekstrakcja DNA za pomocą komercyjnego zestawu
	<ol>
		<li>Wymieszaj kultury w bloku 48-dołkowym, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Odpipetować 200 μl każdej kultury do 96-dołkowej płytki PCR.</li>
		<li>Zamknąć, a następnie odwirować płytkę o stężeniu 6 600 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant i dodać 20 μl odczynnika z zestawu do osadu.</li>
		<li>Zawiesić osad, pipetując w górę i w dół. Uszczelnić i podgrzać płytkę w temperaturze 99 °C przez 10 minut, a następnie schłodzić do temperatury 20 °C.</li>
		<li>Ponownie odwirować przy 6 600 x g przez 10 minut. Użyć 2 μl supernatantu do analizy qPCR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja płyty
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną qPCR zgodnie z ustalonym protokołem9 w następujący sposób: 10 μL 2x Master Mix; 0,4 μL każdego startera i sondy (10 μM roztwór roboczy): invA do przodu: 5'-GTTGAGGATGTTATTCGCAAAGG-3', invA do tyłu: 5'-GGAGGCTTCCGGGTCAAG-3', sonda invA: 5'-CCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTTC-3' znakowana barwnikiem fluorenowym Cal Fluor Orange 560; 0,2 μL matrycy wewnętrznej kontroli amplifikacji (IAC) (6 x 104 copy/μL)9; 0,4 μL każdego startera i sondy IAC (10 μM): IAC do przodu: 5'-GGCGCCCTAACACATCT-3', IAC do tyłu: 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA-3', sonda IAC: 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCCACCA-3' znakowana barwnikiem TAMRA. Wyreguluj objętość za pomocą ddH2O do 20 μL ogółem.</li>
		<li>Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym w następujących warunkach cyklicznych9: 95 °C przez 10 minut (początkowa denaturacja DNA i aktywacja polimerazy gorącego startu), 40 cykli po 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 1 minutę, użyj domyślnych ustawień Ct, aby wyeksportować wyniki do analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Wykrywanie za pomocą testu MDS 3M
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z protokołem zestawu do wykrywania molekularnego Salmonella. Wymieszaj kultury w bloku 48-dołkowym, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Odpipetować 20 μl każdej próbki do rurki do lizy dostarczonej z zestawem.</li>
	<li>Podgrzewać próbki w temperaturze 100 °C przez 15 minut. Roztwór zmieni kolor z różowego na żółty. Próbki należy inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Roztwór zmieni się z żółtego na różowy.</li>
	<li>Przenieś 20 μl lizatu do probówki z odczynnikiem i załaduj probówki z odczynnikiem do uchwytu.</li>
	<li>Dodaj uchwyt do urządzenia MDS i skonfiguruj oprogramowanie tak, aby przekazywało informacje o zestawie i próbce. Przyrząd wymaga, aby każda studzienka była oznaczona numerem partii do testu i nazwą próbki. Uruchom oprogramowanie MDS i wyeksportuj raport.</li>
</ol>
9. Analiza danych
<ol>
	<li>Klasyfikacja wyników pozytywnych i negatywnych.
	<ol>
		<li>W przypadku posiewu 4 x 6 kropli należy ocenić plamki na płytkach agarowych z co najmniej 1 kolonią jako dodatnie, a plamy na płytkach agarowych bez wzrostu jako ujemne.</li>
		<li>W przypadku qPCR studzienki, w których Ct jest mniejszy lub równy 30, należy ocenić jako dodatnie, a studzienki, w których Ct jest większe niż 30, jako ujemne.</li>
		<li>W przypadku MDS należy użyć wyników z systemu MDS, zgłoszonych jako dodatnie lub negatywne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczanie MPN
	<ol>
		<li>Analizuj pozytywy i negatywy z adnotacjami, korzystając z opisanej wcześniej metody prostej rozdzielczości maksymalnego prawdopodobieństwa (SMPR) 6 lub alternatywnych zweryfikowanych kalkulatorów MPN. 10</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Batz, M., Hoffmann, S., Morris, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-outcome+trees%2C+eq-5d+scores%2C+and+estimated+annual+losses+of+quality-adjusted+life+years+%28qalys%29+for+14+foodborne+pathogens+in+the+united+states%5BTitle%5D)+AND+%22Foodborne+Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Disease-outcome trees, eq-5d scores, and estimated annual losses of quality-adjusted life years (qalys) for 14 foodborne pathogens in the united states.</a> Foodborne Pathogens and Disease. 11 (5), 395-402 (2014).</li>
<li>The Grand Challenge: Salmonella. , United States Department of Agriculture. 
 <a target="_blank" href="https://tellus.ars.usda.gov/stories/articles/the-grand-challenge-salmonella">https://tellus.ars.usda.gov/stories/articles/the-grand-challenge-salmonella</a> (2024).</li>
<li>National Advisory Committee on Microbiological Criteria in Foods (NACMCF). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+to+questions+posed+by+the+food+safety+and+inspection+service%3A+Enhancing+Salmonella+control+in+poultry+products%5BTitle%5D)+AND+%22J+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Response to questions posed by the food safety and inspection service: Enhancing Salmonella control in poultry products.</a> J Food Prot. 82 (4), 645-668 (2019).</li>
<li>Food Safety and Inspection Service. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%224.15+Isolation+and+identification+of+Salmonella+from+meat%2C+poultry%2C+pasteurized+egg%2C+siluriformes+%28Fish%29+products+and+carcass+and+environmental+sponges%22">4.15 Isolation and identification of Salmonella from meat, poultry, pasteurized egg, siluriformes (Fish) products and carcass and environmental sponges</a>. , (2024).</li>
<li>Irwin, P., Reed, S., Brewster, J., Nguyen, L., He, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-stochastic+sampling+error+in+quantal+analyses+for+campylobacter+species+on+poultry+products%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Non-stochastic sampling error in quantal analyses for campylobacter species on poultry products.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (7), 2353-2369 (2013).</li>
<li>Irwin, P., Tu, S., Damert, W., Phillips, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+gauss-newton+algorithm+and+ninety-six+well+micro-technique+for+calculating+mpn+using+excel+spreadsheets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Rapid+Methods+%26+Automation+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A modified gauss-newton algorithm and ninety-six well micro-technique for calculating mpn using excel spreadsheets.</a> Journal of Rapid Methods & Automation in Microbiology. 8 (3), 171-191 (2000).</li>
<li>Ravishankar, S. Food microbiology: A laboratory manual. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRavishankar%2C+S+%22Food+Microbiology%22">Food Microbiology</a>. Ahmed, E. Y., Carlstrom, C. 21, wiley-interscience. singapore. 489(2004).</li>
<li>Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+6+x+6+drop+plate+method+for+simultaneous+colony+counting+and+mpn+enumeration+of+campylobacter+jejuni%2C+listeria+monocytogenes%2C+and+escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">A 6 x 6 drop plate method for simultaneous colony counting and mpn enumeration of campylobacter jejuni, listeria monocytogenes, and escherichia coli.</a> J Microbiol Methods. 55 (2), 475-479 (2003).</li>
<li>Suo, B., He, Y., Tu, S. I., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+real-time+polymerase+chain+reaction+for+simultaneous+detection+of+salmonella+spp.%2C+escherichia+coli+o157%2C+and+listeria+monocytogenes+in+meat+products%5BTitle%5D)+AND+%22Foodborne+Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">A multiplex real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of salmonella spp., escherichia coli o157, and listeria monocytogenes in meat products.</a> Foodborne Pathogens and Disease. 7 (6), 619-628 (2010).</li>
<li>Jarvis, B., Wilrich, C., Wilrich, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconsideration+of+the+derivation+of+most+probable+numbers%2C+their+standard+deviations%2C+confidence+bounds+and+rarity+values%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values.</a> J Appl Microbiol. 109 (5), 1660-1667 (2010).</li>
<li>Stevens, R., Poppe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+clinical+prediction+models%3A+What+does+the+%26%2334%3Bcalibration+slope%26%2334%3B+really+measure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Validation of clinical prediction models: What does the &#34;calibration slope&#34; really measure.</a> Journal of Clinical Epidemiology. 118, (2019).</li>
<li>Miller, M. E., Hui, S. L., Tierney, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+techniques+for+logistic+regression+models%5BTitle%5D)+AND+%22Statistics+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Validation techniques for logistic regression models.</a> Statistics in Medicine. 10 (8), 1213-1226 (1991).</li>
<li>Galán-Relaño, Á, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+and+salmonellosis%3A+An+update+on+public+health+implications+and+control+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Salmonella and salmonellosis: An update on public health implications and control strategies.</a> Animals. 13 (23), 3666(2023).</li>
<li>Gorski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+assessment+of+salmonella+enterica+multi-serovar+populations+in+poultry+rinsates+with+commonly+used+enrichment+and+plating+media%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Growth assessment of salmonella enterica multi-serovar populations in poultry rinsates with commonly used enrichment and plating media.</a> Food Microbiology. 119, 104431(2024).</li>
<li>Schmidt, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+methods+for+identifying+poultry+wing+rinses+with+salmonella+concentrations+greater+than+or+equal+to+10+cfu%2Fml%5BTitle%5D)+AND+%22J+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Evaluation of methods for identifying poultry wing rinses with salmonella concentrations greater than or equal to 10 cfu/ml.</a> J Food Prot. 87 (11), 100362(2024).</li>
<li>Gorski, A., Liang, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+enrichment+medium+on+real-time+detection+of+salmonella+enterica+from+lettuce+and+tomato+enrichment+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Effect of enrichment medium on real-time detection of salmonella enterica from lettuce and tomato enrichment cultures.</a> Journal of Food Protection. 73 (6), 1047-1056 (2010).</li>
<li>Guillén, S., Nadal, L., Álvarez, I., Mañas, P., Cebrián, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+resistance+responses+to+stress+conditions+encountered+in+food+and+food+processing+environments+on+the+virulence+and+growth+fitness+of+non-typhoidal+salmonellae%5BTitle%5D)+AND+%22Foods%22%5BJournal%5D)">Impact of the resistance responses to stress conditions encountered in food and food processing environments on the virulence and growth fitness of non-typhoidal salmonellae.</a> Foods. 10 (3), 617(2021).</li>
<li>Rohde, A., Hammerl, J. A., Appel, B., Dieckmann, R., Al Dahouk, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+and+homogenization+strategies+significantly+influence+the+detection+of+foodborne+pathogens+in+meat%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Sampling and homogenization strategies significantly influence the detection of foodborne pathogens in meat.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li>
<li>Wang, D., Wang, Z., He, F., Kinchla, A. J., Nugen, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+digestion+for+improved+bacteria+separation+from+leafy+green+vegetables%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Enzymatic digestion for improved bacteria separation from leafy green vegetables.</a> Journal of Food Protection. 79 (8), 1378-1386 (2016).</li>
<li>Pitard, F. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPitard%2C+FF+%22Theory+of+sampling+and+sampling+practice%22">Theory of sampling and sampling practice</a>. , Chapman and Hall/CRC. (2019).</li>
<li>Sharpe, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSharpe%2C+A+%22in+Detecting+pathogens+in+food%22">in Detecting pathogens in food</a>. , Elsevier. 52-68 (2003).</li>
<li>Hannah, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+stomaching+on+numbers+of+bacteria+recovered+from+chicken+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of stomaching on numbers of bacteria recovered from chicken skin.</a> Poultry Science. 90 (2), 491-493 (2011).</li>
<li>Mcmeekin, T., Thomas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+bacteria+on+chicken+skin+after+immersion+in+bacterial+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Retention of bacteria on chicken skin after immersion in bacterial suspensions.</a> Journal of Applied Bacteriology. 45 (3), 383-387 (1978).</li>
<li>Rodrigues-Szulc, U., Ventoura, G., Mackey, B., Payne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+physicochemical+detachment%2C+separation+and+concentration+of+bacteria+from+beef+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Rapid physicochemical detachment, separation and concentration of bacteria from beef surfaces.</a> Journal of Applied Bacteriology. 80 (6), 673-681 (1996).</li>
<li>Vibbert, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerating+sample+preparation+through+enzyme-assisted+microfiltration+of+salmonella+in+chicken+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Accelerating sample preparation through enzyme-assisted microfiltration of salmonella in chicken extract.</a> Biotechnol Prog. 31 (6), 1551-1562 (2015).</li>
<li>Armstrong, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+commercial+tissue+dissociation+system+to+detect+salmonella-contaminated+poultry+products%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Use of a commercial tissue dissociation system to detect salmonella-contaminated poultry products.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 416 (3), 621-626 (2024).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy deklarują, że nie ma konfliktu interesów.

Znaczenie protokołu 
Salmonella pozostaje poważnym problemem w zakresie bezpieczeństwa żywności, szczególnie w produktach drobiowych, które często są przyczyną wybuchów epidemii chorób przenoszonych przez żywność13,14. Niezawodne metody wykrywania Salmonelli zarówno w świeżych, jak i gotowych do przyrządzenia produktach drobiowych, jako główna przyczyna chorób bakteryjnych przenoszonych drogą pokarmową w Stanach Zjednoczony...

Jako główna przyczyna chorób przenoszonych drogą pokarmową, hospitalizacji i zgonów w USA, Salmonella ma znaczący wpływ na zdrowie publiczne i gospodarkę. Szacowane obciążenie ekonomiczne patogenu w samym tylko 2013 roku wyniosło 3,67 miliarda dolarów1. Chociaż ostatnie inicjatywy regulacyjne mają na celu zmniejszenie liczby salmonellozy o 25% do 2030 r2, luki w obecnych strategiach wykrywania i łagodzenia skutków pozostają widoczne, szczególnie w zakresie dostosowania nadzoru zakładu przetwórczego do wyników zdrowia publicznego3 .
Mrożone produkty drobiowe gotowe do przyrządzenia, które były zamieszane w wiele epidemii Salmonelli, stanowią poważny problem dla zdrowia publicznego. W odpowiedzi Służba ds. Bezpieczeństwa i Kontroli Żywności (FSIS) sklasyfikowała Salmonellę jako domieszkę w tych produktach. Obecnie FSIS Microbiology Laboratory Guidebook (MLG) 4.15 skupia się wyłącznie na określeniu częstości występowania Salmonelli w produktach drobiowych4. Zgodnie z tymi wytycznymi pobrane próbki są wzbogacane przez 18-24 godziny, a następnie poddawane badaniom przesiewowym za pomocą systemu wykrywania molekularnego (MDS), który identyfikuje obecność lub brak Salmonelli, ale nie daje wglądu w poziom zanieczyszczenia. Chociaż podejście to jest cenne dla wykrywania obecności patogenów, nie dostarcza informacji ilościowych, które mogłyby pomóc przetwórcom żywności w dokładniejszej ocenie ryzyka zanieczyszczenia i podjęciu ukierunkowanych działań naprawczych.
W tym badaniu opracowaliśmy metodę zwiększającą wykrywalność od rozpowszechnienia do kwantyfikacji patogenów mikrobiologicznych. Został zaprojektowany z myślą o bezproblemowej integracji z istniejącymi procesami wykrywania Salmonelli w produktach drobiowych przy minimalnym zakłóceniu obecnych protokołów FSIS. Zamiast po prostu wzbogacać próbkę główną, metoda rozpoczyna się od umycia produktów drobiowych przy użyciu pożywek zgodnych z obecnymi metodami FSIS. Płukanie jest następnie rozprowadzane do pierwszej kolumny bloku studziennego o głębokości 48 głębokości. Seryjne rozcieńczenia są wykonywane w pozostałych pięciu kolumnach, a blok jest inkubowany przez 18-24 godziny, zgodnie z protokołem MLG 4.15. Po inkubacji studzienki są testowane na obecność Salmonelli, a wyniki są wykorzystywane do obliczenia najbardziej prawdopodobnej liczby (MPN)5,6. Takie podejście pozwala na ilościowe określenie zanieczyszczenia w tych samych ramach czasowych, co obecny proces FSIS, co czyni je praktyczną opcją zarówno do zastosowań przemysłowych, jak i regulacyjnych. <silna klasa="xfig">Rysunek 1 przedstawia schemat blokowy podsumowujący zmodyfikowany test MPN. Rysunek obejmuje fotografie wykonane na określonych etapach, 48-dołkowy blok wykorzystany do rozcieńczania i wzrostu kontrprób oraz trzy techniki użyte jako punkty odniesienia do oceny najbardziej prawdopodobnej liczby Salmonelli obecnej w mielonych kurczakach. W pierwszej fazie tego badania wykorzystaliśmy napromieniowanego mielonego kurczaka, aby zminimalizować wpływ mikroflory tła i niepewność pomiarów w stosunku do zweryfikowanego inokulum przed zastosowaniem protokołu do nienapromieniowanych próbek kurczaków.

<table><tbody><tr><td>48 Blok studni głębinowej 4,6 ml</td><td>Fisher Scientific International, Inc</td><td>NC1964628</td><td></td></tr><tr><td>Agar - Środek zestalający (Difco)</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td><td>281230</td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>Mettler Toledo</td><td>JL602-G/L</td><td>Sprzęt&nbsp;</td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S</td><td>Sprzęt&nbsp;</td></tr><tr><td>Autoklaw - Amsco Lab250, laboratoryjny sterylizator parowy</td><td>Steris plc</td><td>LV-250</td><td>Sprzęt&nbsp;</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego, typ A2, oczyszczacz Logic+</td><td>Labconco Corporation</td><td>302411101</td><td>Equipment&nbsp;</td></tr><tr><td>Napar z mózgu i serca (BHI) Bulion</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td><td>237500</td><td></td></tr><tr><td>Buforowana woda peptonowa</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rozsiewacz komórek 3564684 - w kształcie litery L</td><td>VWR</td><td>76208-438</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka do mikrowirówek 5424</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>Wirówka sprzętowa</td></tr><tr><td>, Avanti J-25</td><td>Beckman Coulter, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>do ekstrakcji DNA - Odczynnik do przygotowania próbek PreMan Ultra&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>4318930</tr><tr><td>Kurczak mielony&nbsp;</td><td>Lokalni sprzedawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Do przodu IAC&nbsp; podstawa: 5'-GGCGCCCTAACACATCT-3'Zintegrowane</td> <td>technologie DNA&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonda IAC: 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGC CACCA-3' znakowana 5' TAMRA/3' BHQ-2</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odwrotny starter IAC: 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA-3'Zintegrowane</td> <td>technologie DNA&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator - wytrząsarka inkubatora Inova 4230</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>4230</td><td>Sprzęt&nbsp;</td></tr><tr><td>Pętla inokulacyjna - Pętla Combi&nbsp; 10&mikro; L oraz 1&mikro; L&nbsp;</td><td>Fisher Scientific International, Inc</td><td>22-363-602</td><td></td></tr><tr><td>invA forward primer: 5'-GTTGAGGATGTTATTCGCAAAG G-3'Zintegrowane</td> <td>technologie DNA&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonda invA: 5'-CCGTCAGACCTCTGGCAGTAC CTTCCTC-3' znakowana 5' Cal Fluor Orange 560/3' BHQ-1</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>invA reverse starter: 5'-GGAGGCTTCCGGGTCAAG-3'Zintegrowane</td> <td>technologie DNA&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leczenie napromienianiem</td><td>Texas A& M Agrilife Research Narodowe Centrum Badań</td><td></td><td></td>Wiązki Elektronów</tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Bulion</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta ręczna Pipet-Lite LTS Pipeta L-1000XLS+</td><td>Mettler Toledo</td><td>17014382</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Pipeta ręczna Pipet-Lite LTS Pipeta L-100XLS+</td><td>Mettler Toledo</td><td>17014384</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Pipeta ręczna Pipet-Lite LTS Pipeta L-10XLS+</td><td>Mettler Toledo</td><td>17014388</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Pipeta ręczna Pipet-Lite LTS Pipeta L-200XLS+</td><td>Mettler Toledo</td><td>17014391</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Pipeta ręczna Pipet-Lite LTS Pipeta L-20XLS+</td><td>Mettler Toledo</td><td>17014392</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Pipeta ręczna Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+</td><td>Mettler Toledo 17013805</td><td></td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Pipeta ręczna Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+</td><td>Mettler Toledo</td><td>17013803</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Butelka do przechowywania mediów -PYREX 1L Kwadratowe szkło&nbsp; Butelka z nakrętką GL45</td><td>Corning Inc.</td><td>1396-1L</td><td></td></tr><tr><td>Butelka do przechowywania nośników - okrągła butelka z szerokimi ustami PYREX 2L, z zakrętką GLS80</td><td>Corning Inc.</td><td>1397-2L</td><td>Sprzęt Płytka</td></tr><tr><td>do mikromiareczkowania, płytka 96-dołkowa, płaskie dno, polistyren, 0,34cm2, sterylna, 108/cs</td> Mieszalnik <td>Z707902</td><td></td><td>MilliporeSigma</td></tr><tr><td>- Vortex Genie 2</td><td>Scientific Industries Inc.</td><td>SI-0236</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania molekularnego 2-Salmonella</td><td>Przyrząd</td><td></td> do wykrywania molekularnego Neogen MDA2SAL96<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sprzęt Neogen</td><td>MDS100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sterownik pipet z napędem silnikowym, PIPETBOY2</td><td>INTEGRA Biosciences Corp.</td><td>155019</td><td>Sprzęt PCR</td></tr><tr><td>Mastermix 2 razy; Ekspresja genu TaqMan&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>4369542</tr><tr><td>Rotator szalki Petriego -&nbsp; BioWORLD Gramofon do inokulacji</td><td>Fisher Scientific International, Inc</td><td>3489E20</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Szalki Petriego z przezroczystą pokrywką (100 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific International, Inc</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet GP LTS 1000&micro; L S 768A/8</td><td>Mettler Toledo</td><td>&nbsp; </td><td></td></tr><tr><td>30389273 Końcówki do pipet GP LTS 20&micro; L 960A/10</td> Końcówki do pipet <td>30389270</td><td></td><td>Mettler Toledo</td></tr><tr><td>GP LTS 200&micro; L F 960A/10</td><td>Mettler Toledo</td><td>30389276</td><td></td></tr><tr><td>Gotowy do gotowania produktów z kurczaka</td><td>Lokalni sprzedawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik odczynnika, sterylny zbiornik 25 ml używany z pipetami wielokanałowymi</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.&nbsp;</td><td>8093-11</td><td></td></tr><tr><td>System PCR w czasie rzeczywistym - 7500 System PCR w czasie rzeczywistym&nbsp;</td><td>(Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia)</td><td>2750036476</td><td>Sprzęt Pipety</td></tr><tr><td>serologiczne, Pipety serologiczne Nunc (10 ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.&nbsp;</td><td>170356N</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne, Pipety serologiczne Nunc (2 ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.&nbsp;</td><td>170372N</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne, Pipety serologiczne Nunc (25 ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.&nbsp;</td><td>170357N</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne, Pipety serologiczne Nunc (50 ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.&nbsp;</td><td>170376N</td><td></td></tr><tr><td>Rozsiewacz - Rozsiewacze komórkowe w kształcie litery L Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific International, Inc</td><td>14-665-230</td><td></td></tr><tr><td>Torba stomacher, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizator Blender Worki filtracyjne</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.&nbsp;</td><td>01-812</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 Biomaster Lab Blender</td><td>Seward</td><td>30010019</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Termocykler (GeneAmp PCR system 9700)</td><td>Applied Biosystems</td><td>535028293</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>do filtracji wody - Elga Veolia Purelab Flex&nbsp;</td><td>Elga LabWater</td><td>PF2XXXXM1-US</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Worki Whirlpak 1.63L&nbsp;</td><td>VWR</td><td>11216-777</td><td></td></tr></tbody></table>

zmodyfikowany test liczbowy "najbardziej prawdopodobny" w celu ilościowego określenia salmonelli w surowych i gotowych do przyrządzenia produktach z kurczaka

Modified Most Probable Number Assay to Quantify Salmonella in Raw and Ready-to-Cook Chicken Products

Salmonella jest główną przyczyną chorób przenoszonych drogą pokarmową w Stanach Zjednoczonych, szczególnie w produktach drobiowych. Tradycyjne metody wykrywania Salmonelli koncentrują się na rozpowszechnieniu, a nie na kwantyfikacji, co ogranicza ich użyteczność w ocenie poziomów skażenia i ryzyka. Badanie to wprowadza nowatorski test liczby najbardziej prawdopodobnej (MPN) przeznaczony do ilościowego oznaczania Salmonelli w gotowych do przyrządzenia produktach drobiowych, takich jak kurczak cordon bleu. Metoda polega na umyciu próbki drobiu, zagęszczeniu płukania przez odwirowanie i seryjnym rozcieńczeniu w bloku 48-dołkowym. Test MPN jest zintegrowany z metodą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP), aby zapewnić czułą, dokładną i szybką kwantyfikację zanieczyszczenia Salmonellą w tych samych ramach czasowych, co istniejące protokoły Służby Bezpieczeństwa i Kontroli Żywności (FSIS). Wyniki wskazują na silną korelację liniową między pomiarami MPN-LAMP a teoretycznymi poziomami inokulacji (R² = 0,933). Jednak zmienność przy niższych stężeniach uwypukla wyzwania związane z dokładnym wykrywaniem Salmonelli na tych poziomach, przy czym praktyczna dolna granica wykrywalności szacowana jest na około 300 jtk/g. Potencjalne udoskonalenia mające na celu poprawę możliwości zastosowania protokołu obejmują zwiększenie ilości pobieranych próbek w celu dalszej poprawy granicy wykrywalności, optymalizację preparatów pożywek wzbogacających oraz rozszerzenie detekcji molekularnej w celu ukierunkowania na wiele serowarów Salmonella. Ogólnie rzecz biorąc, badanie to stanowi praktyczne narzędzie dla przemysłu spożywczego, umożliwiające wiarygodne określenie ilościowe zanieczyszczenia Salmonellą w produktach drobiowych, przyczyniając się do poprawy bezpieczeństwa żywności i zdrowia publicznego.

Naświetlone mięso 
W analizie regresji nachylenie równe 1 wskazuje, że dla każdej jednostki wzrostu zmiennej niezależnej (oś x), zmienna zależna (oś y) zwiększa się dokładnie o 1 jednostkę. Sugeruje to proporcjonalną zależność między obiema zmiennymi, co oznacza, że zmiana zmiennej zależnej odzwierciedla zmianę zmiennej niezależnej. Punkt przecięcia z osią równy 0 oznacza, że gdy zmienna niezależna wynosi 0, zmienna zależna również wynosi 0. Sugeruje to brak stałego przesunięcia lub błędu systematyczn...

Dokładne określenie ilościowe Salmonelli u drobiu na niskich poziomach jest aktualnym wyzwaniem przemysłowym i regulacyjnym. Protokół ten opisuje test MPN, który umożliwia ilościowe określenie salmonelli w surowych i gotowych do przyrządzenia produktach drobiowych. Metoda ta jest szybka, czuła i zgodna z wytycznymi FSIS, zwiększając bezpieczeństwo żywności i wspierając wysiłki na rzecz zdrowia publicznego.

Zmodyfikowany test liczbowy "Najbardziej prawdopodobny" w celu ilościowego określenia salmonelli w surowych i gotowych do przyrządzenia produktach z kurczaka

Salmonella is a leading cause of foodborne illness in the United States, particularly in poultry products. Traditional methods for detecting Salmonella ...

Nasze badania rozwijają technologie szybkiego wykrywania, kwantyfikacji i charakterystyki patogenów przenoszonych przez żywność, koncentrując się na czułych metodach, które mogą poprawić bezpieczeństwo żywności poprzez identyfikację zanieczyszczenia w warunkach rzeczywistych. Kluczowe wyzwania obejmują osiągnięcie szybkiej czułości wykrywania i złożonych macierzy przy użyciu tanich, ale skalowalnych rozwiązań. Rozwiązujemy również problemy związane z redukcją wyników fałszywie dodatnich i poprawą kompatybilności z różnymi środowiskami testowymi.Z punktu widzenia bezpieczeństwa żywności oznacza to dokładne wykrywanie patogenów w niskich stężeniach w różnych matrycach żywnościowych. Nasz protokół wypełnia lukę między wykrywaniem występowania a kwantyfikacją salmonelli, aby zapewnić deterministyczne wartości poziomu zanieczyszczenia w produktach spożywczych. Proces ten jest minimalnie uciążliwy, ponieważ obejmuje zwalidowane testy stosowane w protokołach FSIS i jest wystarczająco elastyczny, aby pomieścić dodatkowe patogeny i matryce żywnościowe.Na początek umieść mielonego kurczaka pozyskanego z działu świeżego mięsa lokalnych sprzedawców detalicznych na platformie roboczej. Mięso należy podzielić w asepcie na próbki o wadze 25 gramów. Kup gotowe do gotowania produkty z kurczaka z działu mrożonek lokalnych sprzedawców detalicznych i aseptycznie podziel je na 25-gramowe próbki.Smuga salmonella enterica serowar Typhimurium ATCC 14028 na płytce ślimakowej do infuzji serca mózgu. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia zaszczep 25 mililitrów bulionu z naparu z serca mózgu jedną kolonią świeżo wyhodowanej salmonelli.Kultura uprawiana tlenowo przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 100 obr./min. Aby przygotować serię dziesięciokrotnych rozcieńczeń, przenieś 0,5 mililitra kultury do 4,5 mililitra buforowanej wody peptydowej lub BPW i dokładnie wymieszaj. Następnie przenieś 0,5 mililitra z przygotowanego rozcieńczenia do 4,5 mililitra BPW na każde kolejne rozcieńczenie.Następnie aseptycznie przenieś 25 gramów napromieniowanego mielonego kurczaka do sterylnych torebek stomacher. Zaszczepić próbkę jednym mililitrem pożądanego stężenia rozcieńczenia kultury. Używając sterylnego rozsiewacza komórek, delikatnie rozprowadź inokulum równomiernie na powierzchni kurczaka i pozwól mu stać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę.Po inkubacji napromieniowanych zmielonych próbek kurczaka z kulturą salmonelli przez godzinę, dodaj 225 mililitrów BPW do każdej próbki, aby uzyskać pożądany stosunek próbki do podłoża. Homogenizować próbki kurczaka za pomocą stomachera z normalną prędkością przez 120 sekund. Za pomocą pipety o pojemności 50 mililitrów ostrożnie usuń płyn z przefiltrowanej strony stomachera i podziel go na dwie sterylne butelki wirówkowe.Odwirować próbki o sile 10 000 G przez 10 minut i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad komórkowy w trzech mililitrach BPW za pomocą sterylnej szpatułki. Dodaj 12 mililitrów BPW do zawieszonego osadu i dokładnie wymieszaj, mieszając sterylną szpatułką.Połącz zawartość obu butelek wirówkowych w jedną butelkę. Dodać trzy mililitry ponownie zawieszonej próbki do każdej studzienki w pierwszej kolumnie z 48 bloków dołków, aby utworzyć osiem powtórzeń. Aby przygotować serię dziesięciokrotnych rozcieńczeń w kolumnach od pierwszej do szóstej za pomocą pipety ośmiokanałowej, dodaj 0,3 mililitra próbki z każdej studzienki do 2,7 mililitra BPW w następnej kolumnie, zapewniając dokładne wymieszanie.Inkubuj bloki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 100 obr./min. Następnego dnia, używając pipety wielokanałowej, umieść siedem mikrolitrów kultury z każdego rozcieńczenia na płytkach ślimakowych do infuzji serca mózgu w siatce cztery na sześć. Pozostaw płytki do wyschnięcia na 10 minut przed inkubacją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin.Po inkubacji zbadaj płytki ślimakowe, oznaczając co najmniej jedną kolonię jako dodatnią, a brak wzrostu jako ujemny. Wprowadź liczbę rozcieńczeń i współczynnik rozcieńczenia w arkuszu. Wprowadzić odpowiednią objętość lub masę próbki.Następnie określ liczbę powtórzeń i wprowadź liczbę próbek, które dały wynik pozytywny. Kliknij oblicz wyniki, aby przeanalizować wyniki dodatnie i ujemne z adnotacjami przy użyciu prostej metody rozwiązywania maksymalnych prawdopodobieństw. Na początek ustaw 48-dołkowy blok MPN dla kultury salmonelli zaszczepionej próbkami kurczaków.Wymieszaj kultury w bloku 48-dołkowym, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół. Przenieś 200 mikrolitrów każdej kultury na 96-dołkową płytkę do PCR. Zamknąć płytkę i odwirować przy 6,600 G przez 10 minut.Usunąć supernatant i dodać 20 mikrolitrów odczynnika z zestawu do ekstrakcji DNA do osadu. Wymieszaj granulki, pipetując w górę i w dół. Ponownie uszczelnij płytkę i podgrzej ją w temperaturze 99 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie schładzaj do 20 stopni Celsjusza.Po odwirowaniu należy użyć dwóch mikrolitrów supernatantu do przygotowania mieszaniny QPCR zgodnie z ustalonym protokołem. Korzystając z poniższych warunków, wykonaj PCR w czasie rzeczywistym. Po PCR wyeksportuj wyniki i potraktuj dołki o wartościach progowych cyklu mniejszych lub równych 30 jako dodatnich i większych niż 30 jako ujemnych.Wymieszaj kultury w bloku 48-dołkowym, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół. Przenieś 20 mikrolitrów każdej próbki do probówki do lizy dostarczonej z zestawem do wykrywania molekularnego salmonelli. Podgrzewać próbki w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 15 minut.Następnie inkubować próbki przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś 20 mikrolitrów lizatu z każdej probówki do lizy do probówki z odczynnikiem i załaduj probówki z odczynnikiem do uchwytu. Dodaj uchwyt z probówkami z odczynnikiem do przyrządu systemu detekcji molekularnej.Skonfiguruj ustawienia oprogramowania dla testu systemu detekcji molekularnej. Uruchom test i wyeksportuj raport do analizy. Raport MDS Run zawiera szczegółowe informacje wyjściowe, które są dodatnie lub ujemne.

modified-most-probable-number-assay-to-quantify-salmonella-raw-ready

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje prostą metodę opartą na zastosowaniu taśmy klejącej do pobierania próbek z powierzchni pomidorów oraz innych świeżych produktów rolnych, a następnie szybką detekcję całych komórek Salmonella przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Połączenie pobierania próbek za pomocą taśmy klejącej i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu szybkiego wykrywania Salmonella na świeżych produktach rolnych

Protokół obejmujący zintegrowane zagęszczenie, wzbogacenie i kolorymetryczne wykrywanie patogenów przenoszonych przez żywność w dużych ilościach wody rolniczej jest tutaj przedstawiony.  Woda jest filtrowana przez zmodyfikowane waciki Moore'a (MMS), wzbogacone o selektywne lub nieselektywne media, a detekcja odbywa się za pomocą papierowych urządzeń analitycznych (μPAD) osadzonych w bakteryjno-orientacyjnych podłożach kolorymetrycznych.

Kolorymetryczne wykrywanie Escherichia coli, Salmonella spp. i Listeria monocytogenes na papierze w dużych ilościach wody rolniczej

Salmonella spp./Shigella spp. są częstymi patogenami przypisywanymi biegunce. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową platformę do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp. przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym w połączeniu z hodowlą sterowaną.

Wysokoprzepustowa platforma do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp.

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek DNA z mikrobiomów żywności i środowiska do wspólnego wykrywania i subtypowania Salmonelli poprzez sekwencjonowanie quasimetagenomiczne. Połączone zastosowanie wzbogacania hodowli, separacji immunomagnetycznej (IMS) i amplifikacji z wielokrotnym przemieszczeniem (MDA) pozwala na skuteczną koncentrację genomowego DNA Salmonelli z próbek żywności i środowiska.

Analiza quasi-metagenomiczna salmonelli z próbek żywności i środowiska

To oparte na molekularnym podejściu do określania sprawności bakterii umożliwia precyzyjne i dokładne wykrywanie mikroorganizmów za pomocą unikalnych kodów kreskowych genomowego DNA, które są określane ilościowo za pomocą cyfrowego PCR. W protokole opisano obliczanie indeksu konkurencyjnego dla szczepów Salmonella; Technologia ta jest jednak łatwa do zaadaptowania do protokołów wymagających bezwzględnej kwantyfikacji każdego genetycznie plastycznego organizmu.

Cyfrowy indeks konkurencyjności oparty na PCR do wysokoprzepustowej analizy sprawności w Salmonelli

Tutaj prezentujemy protokół do szybkiego i łatwego pomiaru czynnika jądrowego kappa-light-chain-enhancer aktywacji aktywowanych komórek B (NF-κB) w liniach komórkowych wyrażających NF-κB::lucyferazy reporterowe, poprzez pomiary luminescencji w lizacie komórkowym. Dodatkowo ekspresję genów określa się za pomocą RT-qPCR wyizolowanego z komórek zakażonych Salmonellą Typhimurium.

Zależna od NF-κB aktywacja lucyferazy i kwantyfikacja ekspresji genów w komórkach hodowli tkankowej zakażonych salmonellą

Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP) to test izotermicznej amplifikacji kwasów nukleinowych (iNAAT), który wzbudził szerokie zainteresowanie w dziedzinie wykrywania patogenów. W tym miejscu przedstawiamy zatwierdzony przez wiele laboratoriów protokół Salmonella LAMP jako szybką, niezawodną i solidną metodę badań przesiewowych Salmonelli w żywności zwierzęcej i potwierdzania przypuszczalnej obecności Salmonelli w izolacji hodowli.

Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli do badań przesiewowych Salmonelli w karmie zwierzęcej i potwierdzania salmonelli z izolacji hodowli

System rekombinacji za pośrednictwem λ-czerwieni został użyty do stworzenia mutanta delecji małego niekodującego RNA micC.

Niekodujący mały RNA MicC przyczynia się do zjadliwości białek błony zewnętrznej w Salmonella enteritidis

Tutaj przedstawiamy zasadę, strukturę i instrukcję inteligentnego, wysokoprzepustowego systemu testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe/przesiewowego fagów. Jego zastosowanie ilustruje przykład Salmonelli wyizolowanej z drobiu w Shandong w Chinach. Obliczany jest indeks Lar, a jego znaczenie w ocenie oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe jest szczegółowo omawiane.

Zastosowanie inteligentnego, wysokowydajnego systemu badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe/przesiewowego fagów oraz wskaźnika Lar oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

Campylobacter jest główną przyczyną bakteryjnego zapalenia żołądka i jelit przenoszonego przez żywność na całym świecie. Pomimo tego, że zakłady wprowadzają środki mające na celu zmniejszenie rozpowszechnienia w swoich obiektach, skażone produkty konsekwentnie docierają do konsumentów. Technika opracowana w ciągu ostatnich dwunastu lat rozwiązuje problemy związane z ograniczeniami istniejących metod izolowania i wykrywania Campylobacter spp. z surowego mięsa.

Wykrywanie i izolacja Campylobacter spp. z surowego mięsa

Poznaj zmodyfikowany test MPN do ilościowego oznaczania Salmonella w surowym i gotowym kurczaku. Ta metoda zapewnia szybką, czułą detekcję zgodną z wytycznymi FSIS, wspierając bezpieczeństwo żywności i zdrowie publiczne.

Zmodyfikowany test liczbowy Najbardziej prawdopodobny w celu ilościowego określenia salmonelli w surowych i gotowych do przyrządzenia produktach z kurczaka (Wideo) | JoVE Journal

Zmodyfikowany test liczbowy "Najbardziej prawdopodobny" w celu ilościowego określenia salmonelli w surowych i gotowych do przyrządzenia produktach z kurczaka

Przeglądaj więcej filmów