Name: Pomiar wychwytu analogu glukozy, 6-(N-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-ylo)amino)-6-deoksyglukozy, w nienaruszonej mysiej siatkówce nerwowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Poznaj metodę pomiaru wychwytu glukozy w nienaruszonej mysiej siatkówce nerwowej przy użyciu fluorescencyjnego analogu 6-NBDG. Protokół ten umożliwia szybką i ekonomiczną analizę metaboliczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z nieograniczonych funduszy departamentu przyznanych Lauren K. Wareham.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Centrum Medycznego Uniwersytetu Vanderbilt.
1. Przygotowanie do testu
UWAGA: Przygotowanie powinno być przeprowadzone w dniu testu, bezpośrednio przed jego przeprowadzeniem. Jest to konieczne ze względu na wrażliwy na czas charakter protokołu.
<ol>
	<li>Ogólne przygotowanie przed eksperymentem 
	UWAGA: 6-NBDG jest wrażliwy na światło i należy go chronić przed światłem. Przykryj wszystkie roztwory 6-NBDG folią aluminiową.
	<ol>
		<li>Roztwór podstawowy 5 mM 6-NBDG w 50% DMSO/1x PBS jest stabilny w temperaturze -20 °C przez 6 miesięcy. Przygotuj roztwór podstawowy i przechowuj 500 μl podwielokrotności do przyszłych testów.</li>
		<li>Umieść stożkową probówkę o pojemności 50 ml z pożywką Neurobasal-A (bez glukozy) na lodzie.</li>
		<li>Upewnij się, że łaźnia wodna jest ustawiona na 37 °C.</li>
		<li>Oznacz 4 × 1,5 ml probówek do mikrowirówek na siatkówkę: 1) głód glukozy, 2) inkubacja 6-NBDG, 3) sonikacja i 4) probówka do pobierania próbki do testu Pierce'a (tj. jeśli masz w sumie cztery siatkówki, będziesz potrzebować 16 probówek do mikrowirówek). Zobacz Rysunek 1 dla podsumowania konfiguracji rury.</li>
		<li>Dodać 200 μl pożywki neurobazalnej A z 50 ml stożkowej probówki na lodzie do wstępnie znakowanych probówek sonikacyjnych i umieścić na lodzie dla kroku 2.5.4.</li>
		<li>Włącz czytnik płytek.</li>
		<li>Skonfiguruj informacje o płytce w oprogramowaniu czytnika płytek za pomocą funkcji oznaczania punktu końcowego fluorescencji z następującymi parametrami: wzbudzenie 483 nm, emisja 550 nm i odcięcie 530 nm (parametry wstępnie określone dla 6-NBDG).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie odczynnika przed eksperymentem: 6-NBDG
	<ol>
		<li>Sporządzić roztwór roboczy 6-NBDG w pożywce neurobazalnej-A o końcowym stężeniu 500 μM, rozcieńczając 5 mM zapas wykonany w kroku 1.1.1. 
		UWAGA: Pamiętaj, aby wszystkie roztwory 6-NBDG przykryć folią aluminiową. Przygotować odpowiednią objętość 500 μM roztworu roboczego 6-NBDG dla całego testu (potrzeba 200 μl roboczego roztworu 6-NBDG na siatkówkę; uwzględnij dodatkową objętość dla błędu i ilości potrzebne do utworzenia roztworów wzorcowych w kroku 2.4.).</li>
		<li>Odpipetować 200 μl roztworu roboczego 6-NBDG do wstępnie oznakowanych probówek przygotowanych w kroku 1.1.4 dla etapu inkubacji 6-NBDG.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przeprowadzanie testu wychwytu 6-NBDG
UWAGA: Zobacz Rysunek 2, aby zapoznać się z przeglądem krok po kroku.
<ol>
	<li>Rozwarstwienie tkanki siatkówki
	<ol>
		<li>Uspokoić mysz za pomocą wziewnego znieczulenia izofluranem (2% izofluranu w 5% dwutlenku węgla/95% tlenu). 
		UWAGA: Upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona, ściskając podkładkę pod stopy na obu tylnych łapach. Jeśli zostanie odpowiednio znieczulony, nie powinno być szarpnięć (odruch wycofania pedału). Jeśli wystąpi ruch odruchowy, wróć do kroku 2.1.1.</li>
		<li>Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy, a następnie dekapitację, a następnie szybkie wyłuszczenie oczu. Umieść wyłuszczone oczy na szalce Petriego wypełnionej 5-10 ml lodowatego podłoża neurobasel-A (bez glukozy) na lodzie. 
		UWAGA: Poniżej znajdują się podstawowe wytyczne dotyczące rozwarstwienia siatkówki nerwowej (z wyłączeniem nabłonka barwnikowego siatkówki i naczyniówki); Aby uzyskać bardziej szczegółowe instrukcje i wskazówki, zapoznaj się z wcześniej opublikowanym protokołem11 i postępuj zgodnie z sekcją "Rozwarstwienie siatkówki myszy".</li>
		<li>Umieścić szalkę Petriego pod mikroskopem preparacyjnym na lodzie.</li>
		<li>Złóż niestrzępiącą się chusteczkę w mały kwadrat i zwilż ją podłożem Neurobasal A.</li>
		<li>Przenieś oczko na wilgotną, niestrzępiącą się chusteczkę za pomocą plastikowej pipety transferowej z odciętym końcem. 
		UWAGA: Niestrzępiąca się chusteczka zapewnia zwiększone tarcie, aby oko nie poruszało się podczas sekcji.</li>
		<li>Weź igłę 26 G i nakłuj bok rogówki przed rąbkiem.</li>
		<li>Użyj nożyczek Vannas, aby przeciąć wzdłuż rąbka od miejsca nakłucia, aby usunąć rogówkę.</li>
		<li>Po usunięciu rogówki chwyć twardówkę w połowie odległości między rąbkiem a głową nerwu wzrokowego za pomocą kleszczy. Używając drugiej pary kleszczy w przeciwnej ręce, chwyć soczewkę i szybko ją zdejmij jednym szybkim ruchem. 
		UWAGA: Jeśli soczewka jest usuwana powoli, siatkówka pozostanie przymocowana do soczewki i stanie się trudna do wypreparowania.</li>
		<li>Przenieść muszlę oczną na szalkę Petriego z zimnym Neurobasem A na lodzie.</li>
		<li>Używając kleszczy w obu rękach, weź muszlę oczną i ostrożnie przytrzymaj miseczkę w ora serrata.
		<ol>
			<li>Aby uwolnić miseczkę siatkówki od twardówki, zaciśnij twardówkę za pomocą kleszczy, uważając, aby nie zacisnąć tkanki siatkówki.</li>
			<li>Ostrożnie przesuwaj kleszcze między tkanką twardówki a tkanką siatkówki po całej kuli ziemskiej, aż cała siatkówka zostanie uwolniona z rąbka.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Za pomocą nożyczek Vannas wykonaj małe nacięcie w twardówce na rąbku.</li>
		<li>Weź kleszcze, aby chwycić krawędzie nacięcia i oderwij tkankę twardówki aż do okolicy głowy nerwu wzrokowego. Chwyć twardówkę za pomocą kleszczy w ręce niedominującej i delikatnie odprowadź siatkówkę od twardówki za pomocą zamkniętych kleszczy w ręce dominującej.</li>
		<li>Odetnij głowę nerwu wzrokowego nożyczkami, aby całkowicie oderwać siatkówkę od twardówki i pozostałego nerwu wzrokowego.</li>
		<li>Przenieść siatkówkę za pomocą przyciętej pipety transferowej do wstępnie przygotowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml w celu zagłodzenia glukozy z kroku 1.1.4, która zawiera 200 μl pożywki neurobasel-A (bez glukozy)-1 siatkówkę na probówkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Etap głodu glukozy
	<ol>
		<li>Przenieść probówki z kroku 2.1.14 do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja NBDG
	<ol>
		<li>Przenieś każdą siatkówkę do nowej, wstępnie znakowanej probówki do inkubacji 6-NBDG z kroku 1.1.4, która zawiera 200 μL 500 μM 6-NBDG w pożywce neurobasel-A z kroku 1.2.2. 
		UWAGA: Siatkówka powinna być przenoszona za pomocą pipety transferowej, która została przecięta w celu powiększenia końcówki tak, aby przenieść siatkówkę z minimalnym uszkodzeniem. Dodatkowo można to zrobić za pomocą pęsety, jeśli masz pewność, że jesteś w stanie przenieść siatkówkę bez uszkodzenia.</li>
		<li>Przenieść probówki do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie wzorców 6-NBDG (zakres stężeń 0 μM-40 μM) 
	UWAGA: Przygotować wzorce podczas 60-minutowego okresu inkubacji 6-NBDG (krok 2.3.2.). Wzorce można przygotować w temperaturze pokojowej. Chroń roztwory przed światłem.
	<ol>
		<li>Oznacz probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 ml #1-8 dla 8 wzorców (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
		<li>Dla wzorca #1 (40 μM 6-NBDG) odpipetuj 32 μl 500 μM roztworu podstawowego 6-NBDG wykonanego w kroku 1.2.1.</li>
		<li>Dodać 368 μl pożywki neurobasel-A do probówki mikrowirówki i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół.</li>
		<li>W przypadku norm #2-8 należy seryjnie rozcieńczać próbki w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Odpipetować 200 μl pożywki neurobasel-A do probówek #2-8.</li>
			<li>Pobrać 200 μl ze standardowej probówki #1 i odpipetować ją do probówki #2, a następnie dokładnie wymieszać z pipetą, pipetując w górę i w dół.</li>
			<li>Pobrać 200 μl ze standardowej probówki #2 i pipetować do standardowej probówki #3. Dokładnie wymieszać pipetą, pipetując w górę i w dół.</li>
			<li>Pobrać 200 μl ze standardowej probówki #3 i odpipetować ją do probówki #4, a następnie dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół.</li>
			<li>Pobrać 200 μl ze standardowej probówki #4 i odpipetować ją do probówki #5, a następnie dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół.</li>
			<li>Weź 200 μl ze standardowej probówki #5 i odpipetuj ją do probówki #6, a następnie dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół.</li>
			<li>Pobrać 200 μl ze standardowej probówki #6 i odpipetować ją do probówki #7, a następnie dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół.</li>
			<li>Nie dodawaj dodatkowego roztworu do probówki #8 (tj. powinna zawierać tylko 200 μl pożywki neurobasel-A dodanej w kroku 2.4.4.1.).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mycie, sonikacja i wirowanie w celu pobrania próbki
	<ol>
		<li>Wyjąć wszystkie probówki z łaźni wodnej o temperaturze 37 °C po zakończeniu 60-minutowej inkubacji 6-NBDG.</li>
		<li>Przemyj każdą siatkówkę 500 μl lodowatego podłoża neurobase-A tak szybko i ostrożnie, jak to możliwe.
		<ol>
			<li>Aby umyć, usuń roztwór 6-NBDG za pomocą pipety, uważając, aby nie dotknąć ani nie naruszyć tkanki siatkówki. 
			UWAGA: Istnieje również możliwość przeniesienia siatkówki za pomocą pęsety z probówki inkubacyjnej 6-NBDG do świeżej probówki, która zawiera 500 μl pożywki neurobasel-A. Następnie wystarczy wykonać tylko 3 dodatkowe prania. Zrób to, jeśli czujesz się komfortowo ze swoją zdolnością do nieuszkadzania siatkówki pęsetą.</li>
			<li>Następnie wyrzuć roztwór do odpowiedniego pojemnika na odpady. Natychmiast odpipetować 500 μl zimnego podłoża neurobazal-A do tej samej probówki, aby zastąpić usunięty roztwór. Wymień rurki na lód między praniami.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Powtórz jeszcze 3 razy, w sumie 4 prania.</li>
		<li>Za pomocą pipety transferowej z przyciętą krawędzią lub pęsety, ostrożnie przenieś siatkówkę do probówek sonikacyjnych zawierających podłoże neurobazalne A na lodzie (patrz krok 1.1.4).</li>
		<li>Pokrój siatkówkę na małe kawałki za pomocą małych nożyczek do preparowania. 
		UWAGA: Upewnij się, że myjesz narzędzia w etanolu między siekaniem każdej siatkówki, aby nie zanieczyścić krzyżowo innych próbek.</li>
		<li>Wykonaj sonifikację każdej siatkówki przez 5-10 s o amplitudzie 10 i natychmiast umieść ją z powrotem na lodzie. 
		UWAGA: Upewnij się, że sonda sonikacyjna, między próbkami jest czyszczona 100% etanolem, a następnie ultraczystymH2O. W tym momencie należy wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C lub użyć wirówki w chłodni o temperaturze 4 °C, jeśli jest dostępna.</li>
		<li>Wirować w temperaturze 4 °C przez 15 minut przy 21130 x g lubmaksymalnej prędkości, jeśli jest mniejsza niż 21130 x g. 
		UWAGA: Podczas 15-minutowej wirówki w kroku 2.5.7 odpipetować 100 μl wzorców #1-8 wykonanych w kroku 2.4 na czarną, przezroczystą płytkę 96-dołkową z dnem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odczyt próbek na czytniku płytek
	<ol>
		<li>Po zakończeniu 15-minutowej wirówki usunąć 100 μl supernatantu i odpipetować do 96-dołkowej płytki.</li>
		<li>Włóż płytkę do czytnika płyt. 
		UWAGA: Na płytce powinno znajdować się 100 μl każdej próbki i 100 μL każdego wzorca.</li>
		<li>W oprogramowaniu czytnika płytek wybierz test końcowy fluorescencji z parametrami wybranymi w kroku 1.1.7.</li>
		<li>Uruchom test i zapisz wyniki.</li>
		<li>Próbki pipet z płytki 96-dołkowej do wstępnie znakowanych probówek z ppkt 1.1.4 do testu Pierce'a. 
		UWAGA: W tym momencie próbki mogą być natychmiast badane na obecność białka (patrz poniżej) lub przechowywane w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test Pierce'a do normalizacji białek 
	UWAGA: Test Pierce'a powinien być przeprowadzany w dwóch egzemplarzach (zarówno wzorce, jak i próbki) w celu zwiększenia dokładności.
	<ol>
		<li>Korzystając ze wstępnie rozcieńczonych wzorców do oznaczania białek w teście Pierce'a, odpipetować 10 μl każdego z nich w dwóch egzemplarzach do 96-dołkowej przezroczystej płytki dennej.</li>
		<li>Pobrać pipetę po 10 μl każdej z próbek w dwóch egzemplarzach z kroku 2.6.5 na płytkę 96-dołkową.</li>
		<li>Dodać 150 μl odczynnika Pierce'a do wszystkich studzienek zawierających wzorce lub próbki. Przykryj 96-dołkową płytkę i mieszaj na wytrząsarce do płytek na średnich obrotach przez 1 minutę.</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut.</li>
		<li>Włóż płytkę do czytnika płytek. Wybierz test punktu końcowego absorbancji i ustaw długość fali na 660 nm.</li>
		<li>Zmierz absorbancję wzorców i próbek, a następnie zapisz wyniki. Obliczyć całkowitą zawartość białka w mikrogramach w każdej próbce, wykreślając krzywą wzorcową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczanie wychwytu 6-NBDG w siatkówce. 
	UWAGA: Wyniki 6-NBDG muszą być znormalizowane do całkowitej zawartości białka ze względu na nierówne rozmiary siatkówki.
	<ol>
		<li>Korzystając z wartości intensywności fluorescencji uzyskanych w kroku 2.6, użyj odczytów fluorescencji z wcześniej ustalonych wzorców, aby wykreślić krzywą wzorcową fluorescencji 6-NBDG i określić ilościowo stężenie 6-NBDG (μM) w każdej próbce.</li>
		<li>Znormalizuj wyniki próbki do odpowiednich ilości białka, aby oznaczyć [6-NBDG] μM/μg białka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Casson, R. J., Chidlow, G., Crowston, J. G., Williams, P. A., Wood, J. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+energy+metabolism+in+health+and+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal energy metabolism in health and glaucoma.</a> Prog Retin Eye Res. 81, 100881(2021).</li>
<li>Daniele, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+uptake+by+GLUT1+in+photoreceptors+is+essential+for+outer+segment+renewal+and+rod+photoreceptor+survival%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Glucose uptake by GLUT1 in photoreceptors is essential for outer segment renewal and rod photoreceptor survival.</a> FASEB J. 36 (8), e22428(2022).</li>
<li>Fernandes, R., Hosoya, K. -I., Pereira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+downregulate+glucose+transport+system+in+retinal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species downregulate glucose transport system in retinal endothelial cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C927-C936 (2011).</li>
<li>Badr, G. A., Tang, J., Ismail-Beigi, F., Kern, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+downregulates+GLUT1+expression+in+the+retina+and+its+microvessels+but+not+in+the+cerebral+cortex+or+its+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Diabetes downregulates GLUT1 expression in the retina and its microvessels but not in the cerebral cortex or its microvessels.</a> Diabetes. 49 (6), 1016-1021 (2000).</li>
<li>Kumagai, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+transport+in+brain+and+retina%3A+implications+in+the+management+and+complications+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes.</a> Diabetes Metab Res Rev. 15 (4), 261-273 (1999).</li>
<li>Winkler, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLUT1+reductions+exacerbate+Alzheimer%27s+disease+vasculo-neuronal+dysfunction+and+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GLUT1 reductions exacerbate Alzheimer's disease vasculo-neuronal dysfunction and degeneration.</a> Nat Neurosci. 18 (4), 521-530 (2015).</li>
<li>Mosconi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypometabolism+exceeds+atrophy+in+presymptomatic+early-onset+familial+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Hypometabolism exceeds atrophy in presymptomatic early-onset familial Alzheimer's disease.</a> J Nucl Med. 47 (11), 1778-1786 (2006).</li>
<li>Moreno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+morphometric+changes+in+rat+optic+nerve+microvessels+in+a+glaucoma+experimental+model%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Soc+Esp+Oftalmol%22%5BJournal%5D)">Morphological and morphometric changes in rat optic nerve microvessels in a glaucoma experimental model.</a> Arch Soc Esp Oftalmol. 89 (12), 471-476 (2014).</li>
<li>Barros, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+validation+of+6-NBDG+as+a+probe+for+the+glucose+transporter+GLUT1+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes.</a> J Neurochem. 109 (s1), 94-100 (2009).</li>
<li>Hamilton, K. E., Bouwer, M. F., Louters, L. L., Looyenga, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+binding+and+uptake+of+fluorescent+glucose+analogs+2-NBDG+and+6-NBDG+occurs+independent+of+membrane+glucose+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Cellular binding and uptake of fluorescent glucose analogs 2-NBDG and 6-NBDG occurs independent of membrane glucose transporters.</a> Biochimie. 190, 1-11 (2021).</li>
<li>Feigenspan, A., Babai, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+horizontal+slices+of+adult+mouse+retina+for+electrophysiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of horizontal slices of adult mouse retina for electrophysiological studies.</a> J Vis Exp. 119, e55173(2017).</li>
<li>Lundgaard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+neuronal+glucose+uptake+heralds+activity-dependent+increases+in+cerebral+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism.</a> Nat Commun. 6 (1), 6807(2015).</li>
<li>Zou, C., Wang, Y., Shen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-NBDG+as+a+fluorescent+indicator+for+direct+glucose+uptake+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement.</a> J Biochem Biophys Methods. 64 (3), 207-215 (2005).</li>
<li>Wareham, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solving+neurodegeneration%3A+common+mechanisms+and+strategies+for+new+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Solving neurodegeneration: common mechanisms and strategies for new treatments.</a> Mol Neurodegener. 17 (1), 23(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podsumowując, opisana metoda umożliwia naukowcom zajmującym się naukami podstawowymi pomiar wychwytu fluorescencyjnego analogu glukozy, 6-NBDG, w mysiej siatkówce nerwowej ex vivo . Glukoza jest niezbędnym metabolitem dla siatkówki nerwowej, jej wychwyt wspiera wysokie tempo glikolizy i oddychania mitochondrialnego potrzebne do produkcji energii w postaci adenozynotrójfosforanu (ATP)1. Ponieważ glukoza jest preferowanym substratem energetycznym, wiele komórek siatkówki wykazuje ekspresję ...

Glukoza jest niezbędnym metabolitem dla siatkówki nerwowej, gdzie jest używana do napędzania wysokich wskaźników glikolizy i oddychania mitochondrialnego do produkcji energii w postaci adenozynotrifosforanu (ATP)1. Ponieważ glukoza jest preferowanym substratem energetycznym, wiele komórek siatkówki wykazuje ekspresję transporterów glukozy (GLUT), aby ułatwić wychwyt glukozy z układu krwionośnego i otaczającej tkanki2. GULT obejmują rodzinę wewnętrznych glikoprotein błonowych, które są odpowiedzialne za transport glukozy do komórek ssaków3. Transporter GLUT-1 (GLUT1) jest głównym transporterem glukozy w siatkówce, wyrażanym w warstwach siatkówki 4 oraz przez komórki śródbłonka naczyń włosowatych, które tworzą barierę krew-siatkówka (BRB)5. Co ciekawe, w chorobach neurodegeneracyjnych ośrodkowego układu nerwowego (OUN), w tym w chorobie Alzheimera, obniżenie poziomu białka GLUT1 i wychwytu glukozy poprzedza atrofię mózgu i dysfunkcję neuronów u ludzi6,7. W szczurzym modelu nadciśnienia ocznego niższe poziomy GLUT1 zaobserwowano również w naczyniach włosowatych8. Zmniejszony transport glukozy do zewnętrznej siatkówki jest związany z utratą fotoreceptorów w zwierzęcych modelach barwnikowego zwyrodnienia siatkówki u ludzi i może również odgrywać rolę w neurodegeneracji siatkówki, takiej jak obserwowana w jaskrze. Dlatego zrozumienie transportu glukozy w siatkówce nerwowej jest niezbędne do ustalenia jego roli w neurodegeneracji siatkówki.
Tutaj opisujemy nowatorską, tanią i prostą biochemiczną metodę pomiaru wychwytu 6-NBDG w mysiej siatkówce nerwowej ex vivo, tj. z wyłączeniem pigmentowanego nabłonka siatkówki i naczyniówki. W porównaniu z innymi analogami fluorescencyjnymi, takimi jak 2-NBDG, 6-NBDG składa się z ugrupowania glukozy, na którym fluorescencyjna grupa nitrobenzoksydiazoaminowa zastępuje grupę hydroksylową przy węglu 6, zapobiegając fosforylacji przez heksokinazę i dalszemu rozpadowi metabolicznemu9. Chociaż 6-NBDG ma wysoką swoistość dla GLUT1, z powinowactwem wiązania 300 razy wyższym niż glucose9, wykrywamy wychwyt tego analogu w obecności inhibitorów GLUT110. W związku z tym test ten zapewnia stosunkowo szybką i niedrogą metodę pomiaru wychwytu glukozy ex vivo w całej siatkówce myszy, w której częściowo pośredniczy GLUT1. 
Pomiar wychwytu glukozy w tkance w czasie rzeczywistym jest wyzwaniem, często wymagającym znakowania radioizotopowego lub metod obrazowania o wysokiej rozdzielczości. W tym przypadku stosujemy fluorescencyjny test biochemiczny, aby szybko określić wychwyt 6-NBDG w wielu próbkach siatkówki w warunkach ex vivo. Protokół dostarcza informacji na temat całkowitego wychwytu glukozy przez siatkówkę; nie dostarcza informacji na temat specyficznych dla komórek siatkówki poziomów wychwytu 6-NBDG.

<table><tbody><tr><td># 5 kleszczyków</td><td>Katena</td><td>K5-6550</td><td>Służy do preparowania siatkówki</td></tr><tr><td>1,5 ml probówek mikrowirówkowych</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Igła 26 G x 5/8"</td><td>sol-M</td><td>112658</td><td>Służy do nakłuwania rogówki podczas rozwarstwiania</td></tr><tr><td>Probówki 5 ml</td><td>MTC bio</td><td>c2540</td><td></td></tr><tr><td>50 ml</td><td>Avantor firmy VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>6-NBDG</td><td>Invitrogen</td><td>N23106</td><td>Fluorescencyjne analogowe</td></tr><tr><td>płytki 96-dołkowe z czarnym dnem</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>265301</td><td></td></tr><tr><td>Anestezjologiczny filtr węglowy Kanister</td><td>ReFresh</td><td>EZ-258</td><td>Stosowany w konfiguracji anestezjologicznej</td></tr><tr><td>BAY-876</td><td>Millipore Sigma</td><td>SML1774</td><td>Do hamowania GLUT1.</td></tr><tr><td>Wirowanie w temperaturze 4 & stopni; C</td><td>Eppendorf</td><td>EPP-5424</td><td></td></tr><tr><td>Sprężony gaz (5% dwutlenku węgla, 95% tlenu)</td><td>Airgas</td><td>UN3156</td><td>Używany w anestezjologii ustawić</td></tr><tr><td>zakrzywione kleszcze</td><td>Narzędzie chirurgiczne Roboz</td><td>RS-5137</td><td>Używane do rozwarstwiania siatkówki</td></tr><tr><td>DDH2O</td><td>Elga LabWater</td><td>Elga PureLab Ultra</td><td>Używany po etanolu do czyszczenia sonikatora między próbkami</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Olympus</td><td>szX12</td><td>Używany do preparacji siatkówki</td></tr><tr><td>Etanol 200 proof</td><td>Decon laboratories</td><td>2701</td><td>Do czyszczenia sonikatora między próbkami</td></tr><tr><td>Piankowy pływający stojak na rurki</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>36-099-2328</td><td>Do probówek podczas inkubacji w kąpieli wodnej etapy</td></tr><tr><td>Nożyczki ogólne</td><td>Roboz instrument chirurgiczny</td><td>RS-680</td><td>Używany do siatkówki preparacja</td></tr><tr><td>Izofluran 250 ml butelka</td><td>Piramal critical care</td><td>NDC &nbsp; 6679401725</td><td>Znieczulenie</td></tr><tr><td>Sprzęt do izofluranu</td><td>Vetequip sprzedawany przez VWR</td><td>89012-492</td><td>Służy do znieczulenia przed eutanazją</td></tr><tr><td>Chusteczki Kim</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Czytnik mikropłytek SpectraMax M2</td><td>Służy do odczytu próbki</td></tr><tr><td>Neurobasal-A media</td><td>Gibco</td><td>12349-015</td><td></td></tr><tr><td>Stożek nosowy (niski profilowa maska anestezjologiczna</td>)<td>Kent Scientific</td><td>SOMNO-0801</td><td>Służy do dostarczania ansethesji</td></tr><tr><td>Obiektyw na mikroskopie preparacyjnym</td><td>Olympus</td><td>DF plapo 1x pf</td><td>Służy do preparacji siatkówki</td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>Używany podczas rozwarstwiania siatkówki</td></tr><tr><td>Odczynnik do testu Pierce'a</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1861426</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet P20</td><td>Olympus Tworzywa sztuczne</td><td>26-404</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet P200, P1000, P10 XL</td><td>VWR</td><td>76322-150, 76322-154, 76322-132</td><td></td></tr><tr><td>Pipety P200, P1000, P20, P10</td> Oprogramowanie <td>VWR</td><td>F144055M, F144056M, F144058M, F144059M</td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro na komputerze</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Oprogramowanie SoftMax Pro 7</td><td>Oprogramowanie służące do odczytu próbki</td></tr><tr><td>Dysmembrator soniczny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB50110</td><td>Sonicate sample (retina)</td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-9AM</td><td>Służy do przenoszenia siatkówki z jednej rurki do drugiej</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas</td><td>Katena</td><td>K4-5000</td><td>Służy do preparacji siatkówki</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna ustawiona na 37 &deg; C</td><td>N/A</td><td>N/D</td><td>Używany do inkubacji</td></tr></tbody></table>

pomiar wychwytu analogu glukozy, 6-(n-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-ylo)amino)-6-deoksyglukozy, w nienaruszonej mysiej siatkówce nerwowej

Measuring Uptake of the Glucose Analog, 6-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-6-Deoxyglucose, in Intact Murine Neural Retina

Siatkówka to wysoce metaboliczna tkanka z wieloma typami komórek, wymagająca glukozy i jej pochodnych do produkcji energii w postaci ATP. Komórki siatkówki, w tym komórki śródbłonka, neurony, fotoreceptory i komórki glejowe, wyrażają transportery glukozy (GLUT; np. GLUT1-4), aby umożliwić wychwyt glukozy do produkcji energii. GLUT1 jest transporterem glukozy o największej ekspresji w siatkówce. Protokół ten umożliwia naukowcom pomiar wychwytu glukozy w mysiej siatkówce nerwowej w warunkach ex vivo przy użyciu fluorescencyjnego analogu glukozy 6-(N-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-ylo)amino)-6-deoksyglukozy (6-NBDG). Po rozwarstwieniu siatkówki całkowity poziom 6-NBDG w siatkówce można łatwo określić za pomocą pomiaru punktu końcowego fluorescencji za pomocą czytnika płytek. Aby zachować spójność, zalecamy normalizację wyników do całkowitego poziomu białka. Chociaż 6-NBDG jest wysoce specyficzny dla GLUT1, wychwyt tego analogu wykrywa się w obecności inhibitora GLUT1 BAY-876. W związku z tym test ten zapewnia stosunkowo szybką i niedrogą metodę pomiaru wychwytu glukozy ex vivo w całej siatkówce nerwowej myszy, w której częściowo pośredniczy GLUT1.

Rysunek 4 przedstawia reprezentatywne pomiary fluorescencji glukozy w siatkówce myszy WT inkubowanej z 6-NBDG przez różne okresy czasu. Po 30 min inkubacji poziomy 6-NBDG wynosiły średnio 336 ± 27,91 AU, natomiast po 60 min poziomy 6-NBDG wzrosły do średnio 616,3 ± 8,38 AU. Dalsza inkubacja przez 30 min doprowadziła do obniżenia poziomu 6-NBDG (506,4 ± 5,3 AU). W 60 min zmienność wyników była minimalna, dlatego czas ten wybrano jako optymalny czas inkubacji siatkówki z 6-NBDG. Należy zauważy...

Wiele typów komórek w siatkówce, w tym komórki śródbłonka, neurony i komórki glejowe, wyrażają transportery glukozy (GLUT), aby umożliwić wychwyt glukozy do komórek. Korzystając z mysiej siatkówki nerwowej ex vivo i fluorescencyjnego analogu glukozy 6-NBDG, opisujemy stosunkowo szybką i niedrogą metodę pomiaru wychwytu glukozy w całej siatkówce myszy.

Pomiar wychwytu analogu glukozy, 6-(N-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-ylo)amino)-6-deoksyglukozy, w nienaruszonej mysiej siatkówce nerwowej

The retina is a highly metabolic tissue with multiple cell types requiring glucose and its derivatives to produce energy in the form of ATP. Retinal ...

Nasze laboratorium bada zmiany metaboliczne w siatkówce i w całym ośrodkowym układzie nerwowym, które zachodzą wraz z wiekiem, a także w chorobie neurodegeneracyjnej. Naszym nadrzędnym celem jest wykorzystanie tych odkryć do zidentyfikowania nowych celów terapeutycznych w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem. Wykrywanie wychwytu glukozy w tkance siatkówki jest często kosztowne i czasochłonne, wymaga skomplikowanych metod obrazowania, a nawet substancji radioaktywnych.Opracowaliśmy ten protokół, aby zapewnić nowatorską technikę ex vivo do pomiaru fluorescencyjnego wychwytu analogu glukozy w próbkach siatkówki. Opracowany przez nas protokół zapewnia prostą i opłacalną strategię pomiaru ex vivo fluorescencyjnych analogów glukozy do całej nienaruszonej siatkówki. Ta metoda jest również korzystna, ponieważ pozwala naukowcom na jednoczesny pomiar wielu próbek.Protokół ten umożliwi naukowcom ocenę zmian w wychwytywaniu fluorescencyjnych analogów glukozy w siatkówce, co pomoże nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób siatkówka wykorzystuje glukozę jako substrat energetyczny zarówno z wiekiem, jak i w stanach zdrowych i chorobowych. Na początek przygotuj roztwór podstawowy p

measuring-uptake-glucose-analog-6-n-7-nitrobenz-2-oxa-13-diazol-4-yl

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano prostą i wygodną metodę określania zakresu sprzężenia markerów złączy szczelinowych pomiędzy neuronami siatkówki. Technika ta umożliwia badanie funkcji synaps elektrycznych pomiędzy neuronami w nienaruszonej siatkówce w różnych warunkach oświetlenia oraz o różnych porach dnia i nocy.

Ładowanie przez przecięcie (cut-loading): użyteczne narzędzie do badania zakresu sprzężenia markerów złącz szczelinowych między neuronami siatkówki

W tym filmie demonstrujemy technikę ex vivo do pomiaru wyczerpania zewnątrzkomórkowego analogu glukozy w pobranych narządach myszy. Polega na inkubacji tkanki myszy w roztworze zawierającym znakowaną fluorescencyjnie deoksyglukozę, która jest pobierana przez komórki. Wychwyt analogu glukozy można pośrednio określić, mierząc fluorescencję inkubowanej pożywki.

Pomiar zubożenia analogu glukozy we fluorescencji zewnątrzkomórkowej: zastępcza technika pomiarowa do oceny wychwytu glukozy w narządach myszy ex vivo

Ten film pokazuje ocenę wychwytu dopaminy w synaptosomach pobranych z mózgów myszy. Przedstawiono w nim etapy przygotowania synaptosomów do wychwytu dopaminy za pośrednictwem transporterów dopaminy, traktowania ich różnymi stężeniami dopaminy znakowanej radioaktywnie, izolowania synaptosomów i pomiaru radioaktywności w celu ilościowego określenia wychwytu dopaminy.

Pomiar wychwytu dopaminy w synaptosomach mózgu myszy za pomocą dopaminy znakowanej radioaktywnie

Aktywność pojedynczych neuronów u myszy w wieku dorosłym może być badana poprzez dysocjację neuronów z określonych regionów mózgu i użycie obrazowania barwnika potencjału błony fluorescencyjnej. Testując reakcje na zmiany poziomu glukozy, technika ta może być wykorzystana do badania wrażliwości na glukozę dorosłych brzuszno-przyśrodkowych neuronów podwzgórza.

Obrazowanie potencjału błonowego barwnika brzuszno-przyśrodkowego neuronów podwzgórza od dorosłych myszy w celu zbadania wykrywania glukozy

Wiele zagrażających wzrokowi chorób oczu jest związanych z dysfunkcyjnymi mikronaczyniami siatkówki. Dlatego pomiar odpowiedzi tętniczek siatkówki jest ważny dla zbadania podstawowych mechanizmów patofizjologicznych. W artykule opisano szczegółowy protokół izolacji i przygotowania tętniczek siatkówki myszy do oceny wpływu substancji wazoaktywnych na średnicę naczyń krwionośnych.

Etapy przygotowania do pomiaru reaktywności tętniczek siatkówki myszy ex vivo

Ta technika opisuje rejestrowanie w czasie rzeczywistym zużycia tlenu i wskaźników zakwaszenia zewnątrzkomórkowego w eksplantowanych tkankach siatkówki myszy za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

Pomiar metabolizmu energetycznego w eksplantowanej tkance siatkówki za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

Wychwyt glukozy jest zwiększony w neuronach ruchowych Drosophila dotkniętych proteinopatią białka wiążącego DNA TAR (TDP-43), na co wskazuje genetycznie kodowany czujnik glukozy oparty na FRET.

Pomiar wychwytu glukozy w modelach proteinopatii TDP-43 u drosophila

Unaczynienie siatkówki myszy jest szczególnie interesujące w zrozumieniu mechanizmów powstawania wzorców naczyniowych. Protokół ten automatycznie mierzy średnicę naczyń siatkówki myszy na podstawie obrazów dna oka angiografii fluorescencyjnej w stałej odległości od tarczy nerwu wzrokowego.

Pomiar średnicy naczynia siatkówki na podstawie obrazów angiografii fluorescencyjnej myszy

Opisujemy metodę wielokrotnej wizualizacji mikrogleju mysiego oraz monocytów krążących in vivo w czasie liczonym w godzinach, dniach lub tygodniach, z wykorzystaniem transkranialnej mikroskopii dwufotonowej. Demonstrujemy sposób przygotowania okna z cienkiej czaszki, które umożliwia przerywaną obserwację spoczywającego mikrogleju, który może zostać aktywowany poprzez sąsiednią stereotaktyczną iniekcję białka regulatorowego Tat wirusa HIV-1.

Technika cienkiej okienkowej czaszki do przewlekłego obrazowania dwufotonowego in vivo mikrogleju mysiego w modelach neurozapalenia

Niniejszy artykuł przedstawia rejestrację sygnałów z pojedynczych komórek pochodzących z fluorescencyjnie znakowanych populacji neuronów w nienaruszonej siatkówce myszy. Dzięki zastosowaniu dwufotonowego wzbudzenia w podczerwieni, transgenicznie znakowane komórki zostały wytypowane do rejestracji metodą patch-clamp w celu zbadania ich reakcji na światło, właściwości pól recepcyjnych oraz morfologii.

Charakterystyka elektrofizjologiczna populacji komórek wykazujących ekspresję GFP w nienaruszonej siatkówce

Poznaj metodę pomiaru wychwytu glukozy w nienaruszonej mysiej siatkówce nerwowej przy użyciu fluorescencyjnego analogu 6-NBDG. Protokół ten umożliwia szybką i ekonomiczną analizę metaboliczną.

Pomiar wychwytu analogu glukozy, 6-(N-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-ylo)amino)-6-deoksyglukozy, w nienaruszonej mysiej siatkówce nerwowej (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar wychwytu analogu glukozy, 6-(N-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-ylo)amino)-6-deoksyglukozy, w nienaruszonej mysiej siatkówce nerwowej

Przeglądaj więcej filmów