Name: Zautomatyzowana i wysokowydajna mikrobiologiczna hodowla monoklonalna i zbiór z wykorzystaniem systemu omicznego do hodowli mikrolitrowych mikrolitrów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Odkryj automatyczną hodowlę mikrobiologiczną z wykorzystaniem systemu MISS cell i mikrofluidyki kropelkowej. Ta metoda znacząco zwiększa wydajność izolacji monoklonalnej mikroorganizmów w badaniach mikrobiomu jelitowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez projekty badawczo-rozwojowe w kluczowych obszarach prowincji Guangdong (2024B1111130002), projekty badawczo-rozwojowe prowincji Hebei (22375503D) oraz projekt otwarcia Laboratorium Inżynieryjnego Anhui dla Przemysłowej Mikrobiologii Molekularnej (Grant ELMB-07).

Wszystkie procedury badawcze są zgodne ze wszystkimi odpowiednimi przepisami etycznymi. Procedury zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Nauki i Technologii Uniwersytetu Tsinghua. W celu zbadania ludzkiej mikrobioty jelitowej pobrano próbki kału od zdrowej osoby dorosłej bez istotnych schorzeń, która wyraziła pisemną świadomą zgodę.
1. Instalacja instrumentu
<ol>
	<li>Umieść instrument systemu Omics w czystym lub sterylnym środowisku (takim jak sterylne pomieszczenie lub stół beztlenowy). Przyrząd jest urządzeniem precyzyjnym, a umieszczając go w obiekcie, należy wziąć pod uwagę następujące kwestie:
	<ol>
		<li>Utrzymuj instrument pod normalnym ciśnieniem i temperaturą.</li>
		<li>Trzymaj przyrząd z dala od silnych pól elektrycznych, pól magnetycznych i źródeł promieniowania cieplnego.</li>
		<li>Upewnij się, że obszar umieszczenia przyrządu przekracza wymiary 2,500 mm (gł.) x 1,500 mm (szer.) x 2,000 mm (wys.).</li>
		<li>Utrzymuj wilgotność otoczenia instrumentu poniżej 60%.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowania
<ol>
	<li>Sekwencyjnie włączaj zasilanie systemu Omics, komputera i oprogramowania operacyjnego systemu Omics.</li>
	<li>Instalacja mikrorurkowego układu mikroprzepływowego MISS z ogniwami MISS i generacją kropelkową:
	<ol>
		<li>Otwórz drzwi komory do generowania kropel i hodowli (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1A) i pionowo zdejmij osłonę mikrorurki i chip mikroprzepływowy do generowania kropel. Użyj jednorazowej strzykawki, aby dodać 10 ml sterylnej wody destylowanej do nawilżacza wewnątrz komory do hodowli kropel (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C) i ponownie zainstaluj osłonę ochronną mikrorurki i chip mikroprzepływowy do generowania kropel.</li>
		<li>Otwórz sterylne opakowanie mikrorurkowego i kropelkowego chipa mikroprzepływowego i umieść go pionowo bezpośrednio nad komorą uprawową (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).</li>
		<li>W interfejsie oprogramowania kliknij Instalacja (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). W tym momencie pojawi się wyskakujące okienko z monitem: Potwierdź wymianę mikrorurki i chipa mikroprzepływowego do generowania kropel? Kliknij przycisk Tak, aby rozpocząć instalację.</li>
		<li>Wyjmij zmywacz pęcherzyków powietrza i zamocuj go do góry nogami na umieszczeniu zmywacza pęcherzyków powietrza w komorze do wytwarzania kropel i uprawy. Uważaj, aby nie naciskać rurek wlotowych i wylotowych kropelki urządzenia do usuwania pęcherzyków powietrza (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E).</li>
		<li>Przymocuj rurkę odprowadzającą kropelki urządzenia do usuwania pęcherzyków powietrza do zaworu zaciskowego pod nim i pozwól mu przejść przez otwór, który jest skierowany do komory wykrywania i zbierania kropel (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B).</li>
		<li>Otwórz drzwiczki komory do wykrywania i zbierania kropel, włóż pionowo rurkę detekcyjną, już podłączoną do rurki wylotowej kropli, do gniazda detekcji i upewnij się, że rurka detekcyjna jest całkowicie włożona (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D). 
		UWAGA: Podczas wkładania rurki detekcyjnej należy ją włożyć pionowo bez żadnych zagięć na rurce.</li>
		<li>Dokręć mocującą rurkę detekcyjną w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara. Po upewnieniu się, że rurka detekcyjna jest całkowicie włożona i zabezpieczona, zamknij drzwiczki komory wykrywania i zbierania kropel.</li>
		<li>Z mikrorurkowego i kropelkowego chipa mikroprzepływowego znajduje się 10 silikonowych rurek, z których każda jest oznaczona numerem (L01-L10). Podłącz każdą oznaczoną rurkę do odpowiedniego numerowanego zaworu zaciskowego (01-10) (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1C).</li>
		<li>Podłącz szybkozłącze z mikrorurkowego i mikroprzepływowego chipa generującego kropelki do odpowiedniego portu w systemie Omics: C1 do O1, C2 do O2, C4 do O4 i CF do OF. 
		UWAGA: Instalacja mikrorurkowego i mikroprzepływowego chipa do generowania kropelek została zakończona. C3 nie musi być podłączony do O3.</li>
		<li>Po zakończeniu instalacji mikrorurkowego chipa mikroprzepływowego do generowania kropel pojawi się wyskakujące okienko z monitem o otwarcie zaworu zaciskowego rurki kropelkowej. Kliknij przycisk OK po zakończeniu instalacji mikroprzepływowego układu scalonego z mikrorurkami i kropelkami. Po upewnieniu się, że wszystkie rurki silikonowe z mikrorurki i chipa mikroprzepływowego do generowania kropelek są podłączone do odpowiedniego zaworu zaciskowego, kliknij OK.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inicjalizacja instrumentu
	<ol>
		<li>Przed wykonaniem inicjalizacji kliknij na interfejs ustawień (Rysunek 2B), aby skonfigurować odpowiednie parametry: tryb wykrywania (wykrywanie oparte na OD lub fluorescencji; OD tutaj), temperatura inkubacji (37 °C) i czas (30 dni = 720 h), prędkość mieszadła (20 obr./min), długość fali wykrywania OD (600 nm) oraz długość fali wzbudzenia i emisji detekcji fluorescencji. 
		UWAGA: Parametry stosowane do izolacji i hodowli mikrobioty jelitowej człowieka w niniejszym protokole podano w nawiasach. Podczas ustawiania parametrów temperatura uprawy powinna wynosić od 5 °C do 50 °C. Wybierając tryb wykrywania, światłowód musi zostać wymieniony, jeśli światłowód na module wykrywania kropelek nie jest taki sam (patrz krok 2.3.2). Podczas konfiguracji parametrów, wartość referencyjna fazy olejowej (podstawowe widmo) jest automatycznie identyfikowana przez oprogramowanie, co eliminuje potrzebę ręcznej regulacji.</li>
		<li>Wymiana wykrytego światłowodu
		<ol>
			<li>Wyjmij wykryte włókno z uchwytu światłowodu (odkręć w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara) i poluzuj mocującą światłowód na module kropli (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D).</li>
			<li>Jeśli światłowód nie będzie używany, wyjmij go z modułu, włóż do uchwytu światłowodu i dokręć. Włóż wykryte światłowód do portu wykrywania i dokręć mocującą światłowód na module. Wymiana światłowodu została zakończona.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przejdź do interfejsu głównego i kliknij przycisk Zainicjuj, aby system Omics przeprowadził samokontrolę swoich komponentów, w tym pompy wtryskowej, ustawień temperatury, testowania odprowadzania cieczy odpadowych, modułu przesiewowego i modułu wykrywania kropel.
		<ol>
			<li>Podczas inicjalizacji należy przeprowadzić test odprowadzania cieczy odpadowej z modułu wykrywania kropel, wstrzykując 1 ml 75% alkoholu do portu cieczy odpadowej i obserwując, czy ciecz wypływa normalnie.</li>
			<li>W przypadku testu modułu przesiewowego należy umieścić 96-dołkową płytkę na płytce i obserwować, czy ruch płytki jest normalny.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Generowanie kropel
<ol>
	<li>Pobieranie i przetwarzanie próbek mikrobioty jelitowej człowieka
	<ol>
		<li>Przygotuj pojemnik na nocnik i stołek, umyj ręce i załóż rękawiczki, aby pobrać świeże próbki kału. 
		UWAGA: Podczas pobierania próbek kału należy w miarę możliwości unikać zanieczyszczenia moczem. Lepiej jest wcześniej oddać mocz i umieścić stolec w czystym, suchym pojemniku.</li>
		<li>W asepcie zebrać odpowiednią ilość stolca środkowego segmentu i zamknąć go w wysterylizowanych kriowiałach (około 3-5 g na fiolkę). Natychmiast umieścić fiolki na lodzie w celu późniejszego porcjowania i etykietowania. 
		UWAGA: Jeśli próbka kału jest duża lub nie można jej pobrać od razu, należy ją pobrać maksymalnie w ciągu 2 godzin.</li>
		<li>Na stanowisku beztlenowym użyj sterylnego wacika lub narzędzia do pobierania kału, aby pobrać próbkę środkowego segmentu. 
		UWAGA: Warstwa powierzchniowa stolca zawiera złuszczone komórki błony śluzowej jelit i jest podatna na zanieczyszczenia zewnętrzne; po wystawieniu na działanie powietrza niektóre drobnoustroje DNA zaczynają ulegać degradacji.</li>
		<li>Pobrane próbki kału przenieść do sterylnych probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml lub sterylnych kriowialiów, przy czym każda probówka zawiera 0,5-2,0 g stolca. Przygotować dwie podwielokrotności do zamrożenia na próbkę.</li>
		<li>Zawiesić świeżą próbkę kału w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, przy czym każde 100 mg stolca rozcieńczyć w 1 ml roztworu. Dokładnie wymieszaj stolec, aż nie będą widoczne żadne duże cząstki.</li>
		<li>Po naturalnej sedymentacji przez 10 minut sekwencyjnie przefiltruj supernatant przez sterylne filtry siatkowe o wielkości porów 200 mesh (0,075 mm), 400 mesh (0,038 mm) i 800 mesh (0,018 mm) w celu usunięcia niestrawionego pokarmu i mniejszych cząstek stałych. Na koniec zebrać filtrat w sterylnych probówkach wirówkowych.</li>
		<li>Pobrać 10 μl przefiltrowanej zawiesiny kałowej i oznaczyć stężenie drobnoustrojów za pomocą hemocytometru i mikroskopu fluorescencyjnego z odwróconą fluorescencją. 
		UWAGA: Po przefiltrowaniu supernatantu próbki kału przez różne rozmiary oczek pozostają pewne mniejsze cząstki kału. Dlatego przy określaniu stężenia drobnoustrojów cząstki aktywne obserwowane pod mikroskopem są uważane za mikroorganizmy, co pozwala jedynie na przybliżone obliczenie stężenia drobnoustrojów.</li>
		<li>Przenieś zawiesinę kałową do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i oznacz ją datą, stężeniem drobnoustrojów i nazwą próbki. Część należy zarezerwować na kolejne eksperymenty, a resztę przechowywać w temperaturze 4 °C na przyszłość. 
		UWAGA: Niezwłocznie zapisz informacje o próbce (nazwa próbki, czas pobrania), aby upewnić się, że próbki są pobierane w tym samym czasie (biorąc pod uwagę zmiany rytmu czasowego drobnoustrojów jelitowych ssaków). Całe pobieranie i przetwarzanie próbek powinno odbywać się w środowisku beztlenowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie do początkowej zawiesiny kału
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę Brain Heart Bulion (BHI) zgodnie z protokołem producenta i sterylizować ją w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut.</li>
		<li>Pobrać zawiesinę kałową z kroku 3.1.8 i wykonać seryjne rozcieńczenia pożywką BHI, aby osiągnąć stężenie ~50 komórek/mL. 
		UWAGA: Aby napełnić butelkę z próbką, przygotuj co najmniej 40 ml zawiesiny kałowej.</li>
		<li>Upewniając się, że na dole znajduje się małe mieszadło magnetyczne, wlej rozcieńczoną zawiesinę kału do butelki z próbką do pozycji dodawania próbki. Zakręć nakrętkę i dokręć ją. Następnie włóż szybkozłączkę A do szybkozłączki B, aby zakończyć proces ładowania próbki (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).</li>
		<li>Umieść butelkę z próbką w wyznaczonej pozycji i oddziel szybkozłączki A i B od butelki na próbkę. Podłącz szybkozłączkę A butelki z próbką do portu O3 w systemie Omics, a złącze C3 na chipie mikroprzepływowym do generowania kropelek i kropli do szybkozłącza B. Zamknij drzwiczki komory generowania kropel i hodowli (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie kropel
	<ol>
		<li>Wybierz żądaną liczbę rurek kropelkowych, które mają zostać wygenerowane w interfejsie głównym oprogramowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). 
		UWAGA: Każdy przebieg może wytworzyć do 10 rurek kropelkowych, przy czym każda rurka generuje około 5,000 kropel.</li>
		<li>Kliknij przycisk Produce (Wyprodukuj) w interfejsie głównym oprogramowania, aby rozpocząć generowanie kropel jednokomórkowych. 
		UWAGA: Sprawdź, czy pompa odprowadzania zużytej cieczy działa, czy nie. Podczas wytwarzania kropel każda kropla ma objętość 2,0 μl. Zobacz sekcję dyskusji, aby zapoznać się z opisem generowania kropel.</li>
		<li>Poczekaj, aż sygnał dźwiękowy wskaże, że generowanie kropel zostało zakończone. Zamknij zacisk na złączu C3 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E) i wyjmij butelkę z próbką.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Uprawa kropelkowa
<ol>
	<li>Wybierz ten sam numer rurki kropelkowej, co podczas generowania kropli w interfejsie domowym oprogramowania, kliknij Kultura, potwierdź czas i temperaturę uprawy, a następnie rozpocznij proces. Monitoruj pasek postępu w interfejsie głównym, który pokazuje postęp uprawy i pozostały czas.</li>
	<li>Poczekaj, aż sygnał dźwiękowy wskaże, że uprawa kropel została zakończona. Jeśli czas uprawy musi zostać wydłużony, dostosuj czas bezpośrednio w interfejsie ustawień.</li>
</ol>
5. Badanie przesiewowe kropelek
<ol>
	<li>Naciśnij przycisk UV w systemie Omiks, aby włączyć światło ultrafioletowe (UV) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A), naświetlić komorę do wykrywania i zbierania kropel przez 30 minut, a następnie wyłączyć światło UV. 
	UWAGA: Przed włączeniem światła UV upewnij się, że drzwi komory wykrywania i zbierania kropel są zamknięte.</li>
	<li>W super czystej ławce otwórz wszystkie 96-dołkowe płytki używane do zbierania kropelek i ułóż je jedna na drugiej bez pokrywek, numerując je sekwencyjnie od dołu do góry. Upewnij się, że górna płytka studzienki jest przykryta pokrywką. 
	UWAGA: Każdy przebieg może pomieścić do dziesięciu płytek 96-dołkowych, a liczba płytek zależy od całkowitej liczby kropel.</li>
	<li>Otwórz drzwi komory do wykrywania i zbierania kropel, umieść płytki studzienki w wyznaczonych pozycjach (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1D), wyjmij pokrywę z górnej płytki studzienki i zamknij drzwi komory.</li>
	<li>Włącz światło UV w systemie Omics na 30 minut, aby przeprowadzić wtórną sterylizację.</li>
	<li>Montaż urządzenia do usuwania pęcherzyków powietrza
	<ol>
		<li>Wyjmij urządzenie do usuwania pęcherzyków powietrza z pozycji umieszczenia, odkręć nakrętkę i wykręć w kształcie motyla z nasadki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C).</li>
		<li>Wlej 200 ml oleju do usuwania pęcherzyków powietrza do środka do usuwania pęcherzyków powietrza, mocno przykręć butelkę z nakrętką środka do usuwania pęcherzyków powietrza w systemie Omics, a następnie zamocuj zmywacz do góry nogami na umieszczeniu środka do usuwania pęcherzyków powietrza. Instalacja urządzenia do usuwania pęcherzyków powietrza została zakończona. 
		UWAGA: Podczas mocowania środka do usuwania pęcherzyków powietrza na miejscu należy upewnić się, że nie wycieka olej. Jeśli wystąpi jakikolwiek wyciek, dokręć pokrywę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz rurkę kropelkową do sortowania w interfejsie głównym, kliknij Sortowanie, wprowadź liczbę płytek studzienkowych do zebrania, a następnie rozpocznij proces. Po rozpoczęciu przesiewania kropelek obserwuj obszar wyświetlania procesu, który pokazuje pomiary gęstości optycznej kropelek (OD) lub wartości fluorescencji w czasie rzeczywistym.</li>
	<li>Przeanalizuj około 20-30 kropel, aby sprawdzić wartość OD. Na przykład, jeśli okaże się, że większość z nich ma wartość OD ~0,2, która odpowiada wartości OD pustych kropel, na podstawie rozkładu Poissona ustaw dolny próg OD na 0,5, a górny próg OD na 4,0. Kropelki w tym zakresie zostaną automatycznie zebrane do 96-dołkowych płytek (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A). 
	UWAGA: Zgodnie z prawem Beera-Lamberta, wartość OD pustych kropel jest określana przez skład pożywki hodowlanej w kropelkach. Zazwyczaj dolny próg OD jest ustawiony o 0,2-0,3 jednostki wyżej niż wartość OD pustych kropel, aby zapewnić wyraźne rozróżnienie między pustymi kroplami a kropelkami zawierającymi mikroorganizmy.</li>
	<li>Poczekaj, aż alarm dźwiękowy wskaże, że przesiewanie i zbieranie kropel zostało zakończone. Otwórz drzwi komory do wykrywania i zbierania kropel, umieść pokrywę płytki studzienki na górnej płytce studzienki, a następnie wyjmij wszystkie płytki studzienki razem z komory, aby przeprowadzić późniejsze sekwencjonowanie i tworzenie kopii zapasowej.</li>
</ol>
6. Eksport danych i wyświetlanie map ciepła
<ol>
	<li>Kliknij przycisk Eksportuj dane, aby zapisać zebrane dane sygnału kropelki (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A,B).</li>
	<li>Kliknij Mapę cieplną, wybierz plik z danymi zbierania kropel i obserwuj wartości OD kropelek zebranych na mikropłytce wyświetlanej przez oprogramowanie. Wizualizuj te wartości OD jako mapę cieplną, gdzie intensywność koloru odpowiada rozkładowi OD w studzienkach, zapewniając przejrzystą i intuicyjną reprezentację zebranych wartości OD monoklonalnych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4A,C).</li>
</ol>
7. Czyszczenie komórki MISS
<ol>
	<li>Po zakończeniu eksperymentu wybierz rurkę kropelkową, która wymaga czyszczenia, i kliknij przycisk Wyczyść, aby rozpocząć czyszczenie instrumentu.</li>
</ol>
8. Mikrobiologiczne tworzenie kopii zapasowych monoklonalnych i sekwencjonowanie próbek
<ol>
	<li>Sekwencjonowanie przygotowania próbki
	<ol>
		<li>Na stanowisku beztlenowym dodać 100 μl pożywki BHI do każdego dołka na zebranej płytce kropelkowej, dobrze wymieszać przez pipetowanie, a następnie pobrać 10 μl z każdej studzienki i przenieść wszystko do jednej sterylnej probówki o pojemności 15 ml. Vortex w celu uzyskania mieszanej zawiesiny mikrobiologicznej.</li>
		<li>Dodać 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami do mieszaniny zawiesiny mikrobiologicznej, odwirować przy 1 000 × g przez 10 minut, usunąć supernatant i umieścić osad mikrobiologiczny w ciekłym azocie w celu szybkiego zamrożenia. Przygotowanie próbki do sekwencjonowania zostało zakończone.</li>
		<li>Użyj metod sekwencjonowania amplikonów 16S rDNA ukierunkowanych na domenę V3 i V4 rDNA 16S. Konkretne stosowane startery sekwencjonowania są następujące: 341F: ACTCCTACGGGGCAGCA i 806R: GGACTACHVGGGTWTCTAAT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kriokonserwacja mikrobiologicznej próbki monoklonalnej:
	<ol>
		<li>Po pobraniu 10 μl próbki z każdej studzienki do płytek kropelkowych (od etapu 8.1.1), dodać 30 μl glicerolu do każdego studzienki. Umieść płytki w temperaturze poniżej -80 °C w celu zachowania szczepu mikrobiologicznego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hurst, C. J. Isolation and cultivation of bacteria. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHahn%2C+MW+%22The+structure+and+function+of+aquatic+microbial+communities%22">The structure and function of aquatic microbial communities</a>. , Springer International Publishing. Cham. 313-351 (2019).</li>
<li>Xu, M. Q., Pan, F., Peng, L. H., Yang, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+isolation%2C+cultivation%2C+and+identification+of+gut+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Mil+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in the isolation, cultivation, and identification of gut microbes.</a> Mil Med Res. 11 (1), 34(2024).</li>
<li>Lattermann, C., Büchs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+and+miniscale+fermentation+and+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microscale and miniscale fermentation and screening.</a> Curr Opin Biotechnol. 35, 1-6 (2015).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+microbial+culturomics+using+automation+and+machine+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput microbial culturomics using automation and machine learning.</a> Nat Biotechnol. 41 (10), 1424-1433 (2023).</li>
<li>Brehm-Stecher Byron, F., Johnson Eric, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+microbiology%3A+Tools%2C+technologies%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Single-cell microbiology: Tools, technologies, and applications.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 68 (3), 538-559 (2004).</li>
<li>Jian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+microliter-droplet+screening+system+%28miss+cell%29%3A+An+integrated+platform+for+automated+high-throughput+microbial+monoclonal+cultivation+and+picking%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Single-cell microliter-droplet screening system (miss cell): An integrated platform for automated high-throughput microbial monoclonal cultivation and picking.</a> Biotechnol Bioeng. 120 (3), 778-792 (2023).</li>
<li>Hu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+cell+at+a+time%3A+Droplet-based+microbial+cultivation%2C+screening+and+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Life+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">One cell at a time: Droplet-based microbial cultivation, screening and sequencing.</a> Mar Life Sci Technol. 3 (2), 169-188 (2021).</li>
<li>Leygeber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+microbial+population+heterogeneity-expanding+the+toolbox+of+microfluidic+single-cell+cultivations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analyzing microbial population heterogeneity-expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations.</a> J Mol Biol. 431 (23), 4569-4588 (2019).</li>
<li>He, Z., Wu, H., Yan, X., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+droplet+microfluidics+for+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Chemical+Letters%22%5BJournal%5D)">Recent advances in droplet microfluidics for microbiology.</a> Chinese Chemical Letters. 33 (4), 1729-1742 (2022).</li>
<li>Kaminski, T. S., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+droplet+microfluidic+systems+for+multistep+chemical+and+biological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlled droplet microfluidic systems for multistep chemical and biological assays.</a> Chem Soc Rev. 46 (20), 6210-6226 (2017).</li>
<li>Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+we+really+vastly+outnumbered%3F+Revisiting+the+ratio+of+bacterial+to+host+cells+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Are we really vastly outnumbered? Revisiting the ratio of bacterial to host cells in humans.</a> Cell. 164 (3), 337-340 (2016).</li>
<li>Simrén, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+microbiota+in+functional+bowel+disorders%3A+A+rome+foundation+report%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Intestinal microbiota in functional bowel disorders: A rome foundation report.</a> Gut. 62 (1), 159-176 (2013).</li>
<li>Periyannan Rajeswari, P. K., Joensson, H. N., Andersson-Svahn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+size+influences+division+of+mammalian+cell+factories+in+droplet+microfluidic+cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Droplet size influences division of mammalian cell factories in droplet microfluidic cultivation.</a> Electrophoresis. 38 (2), 305-310 (2017).</li>
<li>Jian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+microdroplet+culture+system+%28mmc%29%3A+An+integrated+platform+for+automated%2C+high-throughput+microbial+cultivation+and+adaptive+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Microbial microdroplet culture system (mmc): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution.</a> Biotechnol Bioeng. 117 (6), 1724-1737 (2020).</li>
<li>Baret, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactants+in+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Surfactants in droplet-based microfluidics.</a> Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).</li>
<li>Kubie, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+solubility+of+O2%2C+CO2%2C+and+N2+in+mineral+oil+and+the+transfer+of+carbon+dioxide+from+oil+to+air%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The solubility of O2, CO2, and N2 in mineral oil and the transfer of carbon dioxide from oil to air.</a> J Biol Chem. 72 (2), 545-548 (1927).</li>
<li>Poon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+density+and+viscosity+of+culture+media+for+optimized+computational+fluid+dynamics+analysis+of+in+vitro+devices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mech+Behav+Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Measuring the density and viscosity of culture media for optimized computational fluid dynamics analysis of in vitro devices.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 126, 105024(2022).</li>
<li>Yao, J., Lin, F., Kim, H. S., Park, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+oil+viscosity+on+droplet+generation+rate+and+droplet+size+in+a+t-junction+microfluidic+droplet+generator%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">The effect of oil viscosity on droplet generation rate and droplet size in a t-junction microfluidic droplet generator.</a> Micromachines. 10 (12), 808(2019).</li>
<li>Venkateshwarlu, A., Bharti, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+capillary+number+and+flow+rates+on+the+hydrodynamics+of+droplet+generation+in+two-phase+cross-flow+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Taiwan+Institute+of+Chemical+Engineers%22%5BJournal%5D)">Effects of capillary number and flow rates on the hydrodynamics of droplet generation in two-phase cross-flow microfluidic systems.</a> Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 129, 64-79 (2021).</li>
<li>Nekouei, M., Vanapalli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume-of-fluid+simulations+in+microfluidic+t-junction+devices%3A+Influence+of+viscosity+ratio+on+droplet+size%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+of+Fluids%22%5BJournal%5D)">Volume-of-fluid simulations in microfluidic t-junction devices: Influence of viscosity ratio on droplet size.</a> Physics of Fluids. 29, 032007(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Protokół ten określa działanie komórki MISS do zautomatyzowanej i wysokoprzepustowej izolacji, hodowli, wykrywania i zbierania drobnoustrojów. W porównaniu z tradycyjnymi metodami, za pomocą których można było wyizolować i wyhodować tylko ~20%-30% mikrobioty jelitowej 2,12, liczba klonów monoklonalnych uzyskanych przy użyciu systemu Omics była 1,97 razy wyższa niż tych uzyskanych z płytek litych. To porównanie pokazuje, że komórka MISS ma zalety w izolacji pojedy...

Kulturomika mikrobiologiczna ma szerokie zastosowanie w badaniach nad pożytecznymi mikroorganizmami w przemyśle spożywczym, różnorodnością mikroorganizmów środowiskowych, badaniami przesiewowymi pod kątem nowych związków przeciwdrobnoustrojowych oraz ludzkim mikrobiomem w odniesieniu do chorób1,2,3,4. Tradycyjne metody, oparte głównie na płytkach litych, płytkach studzienkowych lub mikroreaktorach do pozyskiwania i wybierania kolonii monoklonalnych, są łatwe w obsłudze, ale mają niską przepustowość ze względu na ich wieloetapowość. To ograniczenie utrudnia takie zastosowania, jak badania przesiewowe w kierunku mutagenezy mikrobiologicznej, badania kultururomii drobnoustrojów i selekcja kolonii o wysokiej wydajności, z których wszystkie wymagają rozległych badań przesiewowych monoklonalnych.
Ostatnio, różne urządzenia do wykrywania i dozowania pojedynczych komórek zostały zaprojektowane w celu znacznego zwiększenia szybkości przetwarzania próbek mikrobiologicznych, jednocześnie zmniejszając nakład pracy i minimalizując błędy związane z ręczną obsługą5. Jednak instrumenty te zazwyczaj dotyczą tylko określonych kroków w ramach tradycyjnych metod, często wymagają rozległej integracji sprzętu, zajmują znaczną przestrzeń i wiążą się z wysokimi kosztami. W związku z tym istniała pilna potrzeba opracowania taniej, uniwersalnej platformy do hodowli drobnoustrojów i badań przesiewowych, aby zrekompensować wyżej wymienione niedociągnięcia.
W naszej poprzedniej pracy udało nam się opracować zautomatyzowaną, wysokowydajną platformę przesiewową, znaną jako Jednokomórkowy System Mikrolitrowy Omiczny Hodowli Kropelkowej (komórka MISS, zwana dalej "systemem Omics")6. Platforma ta wykorzystuje technologię mikroprzepływową kropelkową, która daje nadzieję na osiągnięcie automatyzacji i integracji w izolacji, hodowli i zbieraniu mikroorganizmów7,8,9,10. System Omics składa się z kilku kluczowych modułów, w tym modułu pobierania próbek, chipa mikroprzepływowego, systemu wykrywania i zbierania kropel, umożliwiającego wydajną izolację pojedynczych komórek, hodowlę, badania przesiewowe monoklonalne i zbieranie w badaniach mikrobiologicznych. Wykorzystaliśmy już system Omics, aby uzyskać wysokoprzepustowe badania przesiewowe mutagenezy w kierunku Corynebacterium glutamicum6.
Ze względu na automatyzację i możliwości systemu Omics w zakresie badań przesiewowych o wysokiej przepustowości, oczekuje się, że zastosowanie go do kulturomiki mikrobiologicznej szybko uzyska dużą ilość danych mikrobiologicznych. W tym protokole przedstawiliśmy szczegółową procedurę operacyjną komórki MISS, na przykładzie izolacji i hodowli ludzkiej mikroflory jelitowej, aby zademonstrować proces izolacji, hodowli, wykrywania monoklonalnego i badań przesiewowych drobnoustrojów. Obsługa systemu Omics jest prosta, a badacze muszą jedynie postępować zgodnie ze wskazówkami oprogramowania dotyczącymi sekwencyjnej instalacji mikrorurkowego i układu mikroprzepływowego generującego kropelki, ustawień parametrów i przygotowania próbki.
W interfejsie operacyjnym oprogramowania, system Omiki jest podzielony na trzy główne funkcje - izolację, hodowlę i selekcję. Badacze mogą wybrać różne etapy w zależności od eksperymentu. Co więcej, na etapie badania przesiewowego kropelek naukowcy mają do wyboru dwa tryby detekcji: sygnał fluorescencyjny lub gęstość optyczną. Oprogramowanie zapewnia wizualizację procesu przesiewania kropel w czasie rzeczywistym. Wreszcie, badacze mają elastyczność w konfigurowaniu parametrów, takich jak warunki hodowli, wykryta długość fali i liczba studzienek zbiorczych w oparciu o ich specyficzne wymagania eksperymentalne, a także mogą wstrzymać instrument w dowolnym momencie, aby przeprowadzić inne operacje. Komórka MISS to przyjazna dla drobnoustrojów, wysokowydajna platforma do badań monoklonalnych o prostej obsłudze i minimalnym zużyciu odczynników.

<table><tbody><tr><td>Szalka Petriego 100 mm</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy</td><td>P5731-500EA</td><td>Do przygotowania płytek stałych</td></tr><tr><td>30 ml Pojemniki na stolec</td><td>Boen Healthcare Co., Ltd</td><td>611101</td><td>Do pobierania próbek kału</td></tr><tr><td>37 &deg; C inkubator o stałej temperaturze</td><td>Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd.</td><td>LRH-150</td><td>Uprawiaj stałą płytkę w inkubatorze</td></tr><tr><td>96-dołkowe przezroczyste mikropłytki z polistyrenu płaskodennego poddanego działaniu TC</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>Do wykrywania ruchu płytki studziennej i zbierania kropelek</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>214010</td><td>Do przygotowania płytki stałej</td></tr><tr><td>Olej do usuwania pęcherzyków powietrza</td><td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td><td>MISS cell-S-oil</td><td>Środek do usuwania pęcherzyków powietrza w oleju podczas przesiewania kropelek</td></tr><tr><td>Środek do usuwania pęcherzyków powietrza</td><td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td><td>MISS komórka-S</td><td>Wyklucz fazę gazową między kropelkami przed wykonaniem wykrywania i zbierania kropel</td></tr><tr><td>Stanowisko beztlenowe</td><td>Dział Biznesowy Argonu i Azotu Sprzętu Kosmicznego, Miasto Haiyu, Miasto Changshu</td><td>VGB-4CM&nbsp;</td><td>Do pracy aseptycznej i sterylizacji UV w warunkach beztlenowych</td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>Puhexi Zdrowie i Sprzęt Medyczny Co., Ltd.</td><td>MLS-830L</td><td>Do autoklawowania podłoża BHI, probówki EP i tak dalej.</td></tr><tr><td>Napar z mózgu i serca (BHI) Rosół</td><td>Qingdao High-tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd</td><td>HB8297-1</td><td>Składniki pożywki BHI Lista składników: 38,5 g / L BHI Rosół w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Rozsiewacz komórek</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy</td><td>HS8151</td><td>Zaszczepij roztwór mikrobiologiczny na stałej płytce</td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa, 15 ml</td><td>Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd</td><td>HB53397</td><td>Do przygotowania roztworu mikrobiologicznego</td></tr><tr><td>Komputer</td><td>Lenovo</td><td>E450</td><td>Instalacja oprogramowania i sterowanie komórkami MISS</td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Thermo Fisher</td><td>2.0 mL</td><td>Do konserwacji stolca</td></tr><tr><td>Woda destylowana</td><td>Pekin Mreda Technology Co., Ltd.</td><td>M306444-100ml</td><td>Dodaj do nawilżacza, aby utrzymać wilgotność w komorze do uprawy kropelek</td></tr><tr><td>Rurka EP</td><td>Thermo Fisher</td><td>2,0 ml</td><td>Do pobierania próbek kału</td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop odwrócony</td><td>Olympus Life Science (LS)</td><td>CKX53</td><td>Sprawdź i oblicz stężenie mikrobiologiczne</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>ODCZYNNIK OGÓLNY</td><td>G66258A</td><td>Do konserwacji</td></tr> <tr><td>szczepuHemocytometr</td><td>Acmec</td><td>AYA0810-1ea</td><td>Obliczanie stężenia mikrobiologicznego</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Ambeed</td><td>A442876</td><td>Składniki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (roztwór PBS)Lista składników: 8 g/L NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>MACKLIN</td><td>P815661</td><td>Składniki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (roztwór PBS)Lista składników: 8 g/L NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Filtr siatkowy</td><td>Anping Jiufeng Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd</td><td>200 oczek (0,075 mm), 400 oczek (0,038 mm), 800 oczek (0,018 mm)&nbsp;</td><td>Usunąć niestrawiony pokarm i mniejsze cząstki stałe z próbek kału</td></tr><tr><td>Mikrorurki i układ mikroprzepływowy do generowania kropelek</td><td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td><td>MISC-B2</td><td>Do wytwarzania kropel i inkubacji kropel</td></tr><tr><td>MISS olej komórkowy</td><td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td><td>MISS cell-BOS-B</td><td>Faza olejowa do mikrofluidyki kropelkowej</td></tr><tr><td>Oprogramowanie komórkowe MISS</td><td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td><td>Komórka MISS V3.2.4</td><td>Wykonaj operacje eksperymentalne na instrumencie komórkowym MISS</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Solarbio</td><td>D7292</td><td>Składniki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (roztwór PBS)Lista składników: 8 g/L NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ODCZYNNIK OGÓLNY</td><td>G81793J</td><td>Składniki roztworu soli fizjologicznej Lista składników: 9 g/L NaCl w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>eppendorf</td><td>2,5 &mu; L, 10 i mu; L, 100&mu; L, 1000&mu; L</td><td>Do obsługi cieczy</td></tr><tr><td>Rurka z politetrafluoroetylenu</td><td>Shenzhen WOER Heat-shrinkable Material Co., Ltd.</td><td>3401000141</td><td>Do inkubacji kropelkowej. Materiał ten został już zawarty w mikrorurkach i chipie mikroprzepływowym do generowania kropelek</td></tr><tr><td>Butelka na próbki</td><td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td><td>Butelka komórkowa MISS</td><td>Pobieranie próbek roztworu mikrobiologicznego</td></tr><tr><td>System hodowli mikrolitrowej mikrolitrowej (komórka MISS)</td> <td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td><td>MISS cell-G3f</td><td>Wykonywanie izolacji, hodowli, wykrywania i zbierania mikrobiologicznego monoklonalnego</td></tr><tr><td>wirówki Superspeed</td><td>Thermo Fisher</td><td>Sorvall Lynx 4000&nbsp;</td><td>Przygotuj roztwór mikrobiologiczny do sekwencjonowania</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Jiangsu Zhiyu Medical Instructment Co., Ltd</td><td>10 ml</td><td>Pobrać wodę destylowaną i wstrzyknąć ją do nawilżacza w komorze do uprawy kropelek</td></tr><tr><td>Lodówka niskotemperaturowa</td><td>SANYO Ultra-niska&nbsp;</td><td>MDF-U4086S&nbsp;</td><td>Do zachowania szczepu (-80 &deg; C)</td></tr></tbody></table>

zautomatyzowana i wysokowydajna mikrobiologiczna hodowla monoklonalna i zbiór z wykorzystaniem systemu omicznego do hodowli mikrolitrowych mikrolitrów

Automated and High-throughput Microbial Monoclonal Cultivation and Picking Using the Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System

Czyste kultury bakteryjne są niezbędne do badania kulturomiki mikrobiologicznej. Tradycyjne metody oparte na płytkach litych, płytkach studzienkowych i mikroreaktorach są utrudnione ze względu na uciążliwe procedury i niską przepustowość, co utrudnia szybki postęp badań nad kulturomiką mikrobiologiczną. Aby sprostać tym wyzwaniom, z powodzeniem opracowaliśmy system omiczny do hodowli jednokomórkowych mikrolitrów kropelkowych (MISS cell), zautomatyzowaną platformę o wysokiej przepustowości, która wykorzystuje technologię mikroprzepływową kropelek do izolacji, hodowli i badań przesiewowych drobnoustrojów. System ten może generować dużą liczbę kropelek jednokomórkowych oraz hodować, przesiewać i zbierać kolonie monoklonalne w krótkim czasie, ułatwiając zintegrowany proces od izolacji drobnoustrojów do zbierania. W niniejszym protokole zademonstrowaliśmy jego zastosowanie na przykładzie izolacji i hodowli ludzkiej mikroflory jelitowej oraz porównaliśmy skuteczność izolacji drobnoustrojów, wydajność hodowli monoklonalnej i przepustowość badań przesiewowych przy użyciu metody hodowli na płytkach stałych. Przebieg eksperymentu był prosty, a zużycie odczynników było bardzo niskie. W porównaniu z metodami hodowli na płytkach stałych, komórka MISS może wyhodować większą różnorodność gatunków mikroflory jelitowej, oferując znaczny potencjał i wartość dla badań nad kulturomiką mikrobiologiczną.

Szacuje się, że ludzkie mikrobiom jelitowy, stanowiący dominującą społeczność drobnoustrojów, zamieszkuje około 4 × 1013 mikroorganizmy w jelitach, obrazujące ich ogromną liczbę i złożony skład11W niniejszym badaniu dążyliśmy do wyizolowania i hodowli mikrobioty jelitowej, wykorzystując metodę wysiewu na pożywki stałe jako kontrolę w celu wykazania wydajności wysokoprzepustowej komórki MISS.
W pierwszej kolejności wykorzystaliśmy tę samą zawiesinę kałową, aby...

Ten protokół opisuje, jak używać Jednokomórkowego Systemu Mikrolitrowego Zarządzania Kulturami Kropelkowymi (komórka MISS) do przeprowadzania izolacji, hodowli i pobierania mikrobiologicznego monoklonu. Komórka MISS osiąga zintegrowany przepływ pracy oparty na technologii mikroprzepływowej kropelkowej, która zapewnia doskonałą monodyspersyjność kropel, wysoką hodowlę równoległą i wysokowydajne wykrywanie biomasy.

Zautomatyzowana i wysokowydajna mikrobiologiczna hodowla monoklonalna i zbiór z wykorzystaniem systemu omicznego do hodowli mikrolitrowych mikrolitrów

Pure bacterial cultures are essential for the study of microbial culturomics. Traditional methods based on solid plates, well plates, and micro-reactors ...

Badania te dotyczą omiki hodowli drobnoustrojów przy użyciu automatycznej platformy w celu poprawy izolacji drobnoustrojów, hodowli i badań przesiewowych monoklonalnych. Celem jest lepsze zrozumienie ludzkich jelit, mikrobiomu i ich zastosowań. Technolodzy zajmujący się badaniami nad mikrobiomem obejmują zrzut mikrofluidyki, platformy automatycznej izolacji szczepów i badań przesiewowych, algorytmy uczenia maszynowego oraz dozowniki monoklonalne do hodowli o wysokim poziomie obciążenia i analizy mikrobiomu.System komórek środkowych znacznie poprawia mikroview, izolację monoklonalną i barwienie, generując prawie dwukrotnie większą liczbę klonów w porównaniu z tradycyjnymi metodami, zwiększając w ten sposób możliwości badawcze w zakresie mieszania mikrowizji jelitowych. Protokół ten odpowiada na potrzebę taniej, wysoce wspierającej platformy badań przesiewowych drobnoustrojów, pokonując tradycyjne metody, ograniczenia w zakresie wydajności i możliwości punktacji w badaniach nad mieszankami kultur. Nasze laboratorium będzie nadal koncentrować się na integracji dodatkowych technik manipulacji kroplami, takich jak rozdzielanie i łączenie kropel, aby rozszerzyć zakres zastosowań technologicznych.Aby rozpocząć, otwórz drzwi komory generowania kropel i hodowli w komórce MISS. Zdejmij pionowo osłonę ochronną mikrorurki i chip mikroprzepływowy generujący kropelki. Za pomocą jednorazowej strzykawki dodaj 10 mililitrów sterylnej wody destylowanej do nawilżacza wewnątrz komory i ponownie załóż osłonę ochronną.Otwórz sterylne opakowanie mikrorurki i chipa mikroprzepływowego do generowania kropelek i umieść je pionowo bezpośrednio nad komorą uprawową. Następnie w interfejsie oprogramowania kliknij instalację. Gdy pojawi się wyskakujące okienko potwierdzenia, kliknij tak, aby rozpocząć instalację.Wyjmij zmywacz pęcherzyków powietrza i zamocuj go do góry nogami na urządzeniu do usuwania pęcherzyków powietrza umieszczonym w komorze. Przymocuj rurkę odprowadzającą kropelki urządzenia do usuwania pęcherzyków powietrza do clampzawór poniżej. Przeprowadź go przez całość prowadzącą do komory wykrywania i zbierania kropel.Po otwarciu drzwiczek komory należy włożyć rurkę detekcyjną w pionie do gniazda detekcyjnego. Upewnij się, że rurka detekcyjna jest całkowicie włożona. Dokręć mocującą rurkę detekcyjną w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara.Po potwierdzeniu pełnego włożenia i zabezpieczeniu zamknij drzwiczki komory. Podłącz każdą z 10 silikonowych rurek z chipa mikroprzepływowego, oznaczonych od L1 do L10, do odpowiadających im numerowanych zaworów zaciskowych. Następnie podłącz szybkozłącze z chipa mikroprzepływowego do odpowiedniego portu w systemie omicznym, wykonując prawidłowe połączenia.Po zakończeniu instalacji chipa pojawi się wyskakujące okienko z komunikatem, zawór zaciskowy rurki kropelkowej jest otwarty. Kliknij przycisk OK po zakończeniu instalacji mikrorurki i chipa do generowania kropel. Po upewnieniu się, że wszystkie rurki są prawidłowo podłączone do odpowiednich zaworów zaciskowych, kliknij OK.Przed wykonaniem inicjalizacji kliknij interfejs ustawień, aby skonfigurować odpowiednie parametry, takie jak tryb selektywny, temperatura inkubacji, czas inkubacji, prędkość mieszadła, długość fali wykrywania OD oraz długość fali wzbudzenia i emisji do wykrywania fluorescencji. Przejdź do interfejsu głównego i kliknij przycisk Zainicjuj. Pojawi się wyskakujące okienko potwierdzenia, kliknij tak, aby umożliwić układowi IC przeprowadzenie samokontroli swoich elementów, w tym pompy wtryskowej, ustawień temperatury, testowania odprowadzania cieczy odpadowych, modułu przesiewowego i modułu wykrywania kropel.Po zakończeniu inicjalizacji kliknij OK w wyskakującym okienku. Aby przygotować próbkę, należy pobrać próbkę drobnoustrojów i przeprowadzić seryjne rozcieńczanie odpowiednim podłożem, aby osiągnąć stężenie około 50 komórek na mililitr, aby uzyskać zawiesinę próbki o pojemności 40 mililitrów. Następnie odkręcić nakrętkę butelki z próbką i wlać rozcieńczoną zawiesinę kału do butelki z mieszadłem magnetycznym, aż do pozycji dodawania próbki.Zakręć nakrętkę i mocno ją dokręć. Następnie włóż szybkozłączkę A do szybkozłączki B, aby zakończyć proces ładowania próbki. Po umieszczeniu butelki z próbką w wyznaczonej pozycji oddziel szybkozłączki A i B od butelki na próbkę.Podłącz szybkozłącze A butelki z próbką do portu O3 w systemie omicznym. Podłącz złącze C3 na chipie mikroprzepływowym do szybkozłącza B i zamknij drzwiczki komory. W interfejsie głównym oprogramowania wybierz żądaną liczbę rurek kropelkowych do wygenerowania i kliknij przycisk produkuj, aby rozpocząć generowanie kropel z pojedynczymi komórkami.Poczekaj na wyskakujące okienko wskazujące zakończenie tworzenia kropli i kliknij OK. Zamknij zacisk na trzech złączach i wyjmij butelkę z próbką. W interfejsie głównym oprogramowania wybierz ten sam numer rurki kropli, który jest używany podczas generowania kropli.Kliknij pozycję Kultura. Potwierdź czas i temperaturę uprawy, a następnie rozpocznij proces. Poczekaj na wyskakujące okienko wskazujące zakończenie hodowli kropel.Naciśnij przycisk UV na systemie omicznym, aby włączyć ultrafioletowe światło UV. Napromieniować komorę wykrywania i zbierania kropel przez 30 minut przed jej wyłączeniem. W super czystej ławce otwórz wszystkie 96 dołków używanych do zbierania kropelek i ułóż je jedna na drugiej bez pokrywek, numerując je sekwencyjnie od dołu do góry.Upewnij się, że górna płytka studzienki jest przykryta pokrywką. Otwórz drzwiczki komory do wykrywania i zbierania kropel i umieść płytki studzienki w wyznaczonych miejscach. Zdejmij pokrywę z górnej płytki studzienki, a następnie zamknij drzwi komory.Ponownie włącz światło UV w systemie omicznym na 30 minut, aby przeprowadzić wtórną sterylizację. Następnie wyjmij środek do usuwania pęcherzyków powietrza z pozycji umieszczenia. Odkręć nakrętkę i wykręć w kształcie motyla z nakrętki.Wlej 200 mililitrów oleju do usuwania pęcherzyków powietrza do środka do usuwania pęcherzyków powietrza. Mocno dokręć nakrętkę, a następnie zamocuj środek do usuwania pęcherzyków powietrza do góry nogami w wyznaczonym miejscu. W interfejsie głównym wybierz rurkę kropelkową do sortowania.Kliknij przycisk Sortowanie. Wprowadź liczbę płytek dołkowych do zebrania i rozpocznij proces sortowania. Obserwuj obszar wyświetlania procesu, aby w czasie rzeczywistym mierzyć gęstość optyczną kropel lub wartości fluorescencji.Przeanalizuj około 20 do 30 kropel, aby sprawdzić wartość OD. Jeśli większość kropel ma OD około 0,2, ustaw dolny próg OD na 0,5, a górny próg OD na cztery. System automatycznie zbiera kropelki w tym zakresie do płytek 96-dołkowych.Poczekaj na wyświetlenie wyskakującego okienka wskazującego zakończenie sortowania i zbierania kropel, a następnie kliknij przycisk OK. Otwórz drzwiczki komory do wykrywania i zbierania kropel. Umieść pokrywę płytki studzienki na górnej płytce dołka i wyjmij płytki razem.Kliknij przycisk Eksportuj dane, aby zapisać zebrane dane sygnału kropelki. Kliknij mapę skupień. Wybierz plik z danymi pobierania kropel i obserwuj średnicę zewnętrzną wyświetlaną w formacie mikropłytki.Wizualizuj te wartości OD jako mapę cieplną, na której intensywność koloru odpowiada rozkładowi OD w studzienkach, zapewniając przejrzystą i intuicyjną reprezentację. Różnorodność gatunkowa ludzkiej mikrobioty jelitowej uzyskana z systemu omicznego, metody litej płytki i początkowej próbki kału porównano na poziomie rodziny. 34 rodziny drobnoustrojów zostały wzbogacone zarówno metodą litej płytki, jak i zademonstrowaną metodą omiczną, przy czym system omiczny dodatkowo wzbogacił cztery rodziny.System omiczny skutecznie wzbogacił również niektóre rodziny o niskiej liczebności. Na poziomie rodzaju obie metody wzbogaciły 74 rodzaje drobnoustrojów, natomiast metoda komórkowa MISS dodatkowo wzbogaciła 13 rodzajów. Co więcej, dwa rodzaje początkowo występujące w niskiej liczebności zostały skutecznie wzbogacone za pomocą systemu OMIC.Wyniki te wykazały, że metoda hodowli komórek MISS zapewniła lepsze warunki wzrostu dla tych szczepów, które były obecne w niskich proporcjach lub miały słabą wydajność wzrostu w oryginalnej zawiesinie drobnoustrojów.

automated-high-throughput-microbial-monoclonal-cultivation-picking

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Źródło: Jian, X. i wsp., Zautomatyzowana uprawa drobnoustrojów i ewolucja adaptacyjna przy użyciu systemu hodowli mikrodrobnoustrojów (MMC). J. Vis. Exp. (2022)Ten film demonstruje wykorzystanie platformy mikroprzepływowej opartej na kropelkach do monitorowania wzrostu bakterii w czasie rzeczywistym. Generując jednorodne kropelki zawierające zawiesiny bakteryjne i prowadząc je przez ścieżkę detekcji, system umożliwia ciągły optyczny pomiar gęstości komórek w celu skonstruowania krzywej wzrostu.

Monitorowanie wzrostu bakterii w czasie rzeczywistym za pomocą mikroprzepływowego systemu hodowli mikrokropelek

Źródło: Jian, X. i in., Zautomatyzowana uprawa drobnoustrojów i ewolucja adaptacyjna przy użyciu systemu hodowli mikrodrobnoustrojów (MMC). J. Vis. Exp. (2022).Ten film demonstruje zastosowanie systemu hodowli mikrobiologicznych mikrokropel do kierowania adaptacyjną ewolucją bakterii w kierunku tolerancji metanolu. Mieszając zmodyfikowane kultury bakteryjne z podłożem stresowym o wysokiej zawartości metanolu i dzieląc je na mikrokropelki, system wybiera mutanty, które wykazują lepszy wzrost pod...

Adaptacyjna ewolucja bakterii przy użyciu mikrobiologicznego systemu hodowli mikrokropelek

W tym protokole przedstawiono produkcję, konfigurację i podstawowe działanie mikroprzepływowego bioreaktora pikolitrowego (PLBR) do analizy pojedynczych komórek mikroorganizmów prokariotycznych. Mikroorganizmy istotne z przemysłowego punktu widzenia zostały przeanalizowane jako dowód zasadności, co pozwoliło na wgląd w tempo wzrostu, morfologię i niejednorodność fenotypową w określonych okresach czasu, co jest prawie niemożliwe przy użyciu konwencjonalnych metod.

Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Zaprojektowaliśmy aparat do ciągłej hodowli do użytku z systemami optogenetycznymi do oświetlania kultur mikrobów i regularnego obrazowania komórek w ściekach za pomocą mikroskopu odwróconego. Hodowla, pobieranie próbek, obrazowanie i analiza obrazu są w pełni zautomatyzowane, dzięki czemu dynamiczne reakcje na oświetlenie mogą być mierzone przez kilka dni.

Projekt i wdrożenie zautomatyzowanego systemu oświetlenia, hodowli i pobierania próbek do zastosowań optogenetycznych drobnoustrojów

Przedstawiono szczegółowy protokół jednoczesnego działania 48 równoległych kultur komórkowych w różnych warunkach w systemie mikrobioreaktora. Opisano proces hodowli komórek, zbiór i późniejszą analizę miana przeciwciał.

Zastosowanie wysokowydajnego zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktorów do produkcji modelowej IgG1 w komórkach CHO

Testy interakcji międzykulturowych przedstawione w tym protokole są niedrogie, mają wysoką przepustowość i są proste. Testy te można wykorzystać do obserwacji interakcji mikrobiologicznych w kokulturze, identyfikacji wzorców interakcji i scharakteryzowania potencjału hamującego badanego szczepu drobnoustrojów przeciwko patogenom ludzkim i środowiskowym.

Wysokoprzepustowe testy kokultur do badania interakcji mikrobiologicznych

Ten protokół opisuje, jak używać systemu mikrobiologicznej hodowli mikrokropel (MMC) do prowadzenia zautomatyzowanej hodowli mikrobiologicznej i adaptacyjnej ewolucji. MMC może hodować i podkulminować mikroorganizmy automatycznie i w sposób ciągły oraz monitorować online ich wzrost ze stosunkowo wysoką przepustowością i dobrą równoległością, zmniejszając zużycie pracy i odczynników.

Zautomatyzowana hodowla mikroorganizmów i ewolucja adaptacyjna z wykorzystaniem systemu hodowli mikrokropelek drobnoustrojów (MMC)

Przedstawiamy protokół urządzenia do ciągłej kultury mikrofluidalnej (MCCD), które umożliwia uprawę populacji bakteryjnych w stałych warunkach niskiego pożywienia (aż do setek nanomolarnych stężeń) lub czasowych fluktuacji składników odżywczych w skali minut.

Urządzenie mikrofluidyczne do ciągłej hodowli przeznaczone do badania Escherichia coli w warunkach niskich i wahających się stężeń składników odżywczych

Ten protokół przedstawia standardowy przepływ wysokowydajnego przesiewania dla mikroorganizmów przemysłowych. Obejmuje ono konstruowanie biblioteki mutantów poprzez mutagenezę ARTP, przeprowadzanie pozytywnego przesiewania kropel za pomocą zautomatyzowanych mikrofluidów i następnie weryfikację wyników. Niezawodność przepływu została zweryfikowana poprzez przesiewanie wysokowydajnych szczepów B. coagulans.

Przesiewowe badanie wysokowydajne mutantów Bacillus coagulans hiperprodukujących kwas L-mlekowy za pomocą zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej kroplowej

Odkryj automatyczną hodowlę mikrobiologiczną z wykorzystaniem systemu MISS cell i mikrofluidyki kropelkowej. Ta metoda znacząco zwiększa wydajność izolacji monoklonalnej mikroorganizmów w badaniach mikrobiomu jelitowego.

Zautomatyzowana i wysokowydajna mikrobiologiczna hodowla monoklonalna i zbiór z wykorzystaniem systemu omicznego do hodowli mikrolitrowych mikrolitrów (Wideo) | JoVE Journal

Zautomatyzowana i wysokowydajna mikrobiologiczna hodowla monoklonalna i zbiór z wykorzystaniem systemu omicznego do hodowli mikrolitrowych mikrolitrów

Przeglądaj więcej filmów