Zautomatyzowana i wysokowydajna mikrobiologiczna hodowla monoklonalna i zbiór z wykorzystaniem systemu omicznego do hodowli mikrolitrowych mikrolitrów
14 marca 2025
Ten protokół opisuje, jak używać Jednokomórkowego Systemu Mikrolitrowego Zarządzania Kulturami Kropelkowymi (komórka MISS) do przeprowadzania izolacji, hodowli i pobierania mikrobiologicznego monoklonu. Komórka MISS osiąga zintegrowany przepływ pracy oparty na technologii mikroprzepływowej kropelkowej, która zapewnia doskonałą monodyspersyjność kropel, wysoką hodowlę równoległą i wysokowydajne wykrywanie biomasy.
Badania te dotyczą omiki hodowli drobnoustrojów przy użyciu automatycznej platformy w celu poprawy izolacji drobnoustrojów, hodowli i badań przesiewowych monoklonalnych. Celem jest lepsze zrozumienie ludzkich jelit, mikrobiomu i ich zastosowań. Technolodzy zajmujący się badaniami nad mikrobiomem obejmują zrzut mikrofluidyki, platformy automatycznej izolacji szczepów i badań przesiewowych, algorytmy uczenia maszynowego oraz dozowniki monoklonalne do hodowli o wysokim poziomie obciążenia i analizy mikrobiomu.
System komórek środkowych znacznie poprawia mikroview, izolację monoklonalną i barwienie, generując prawie dwukrotnie większą liczbę klonów w porównaniu z tradycyjnymi metodami, zwiększając w ten sposób możliwości badawcze w zakresie mieszania mikrowizji jelitowych. Protokół ten odpowiada na potrzebę taniej, wysoce wspierającej platformy badań przesiewowych drobnoustrojów, pokonując tradycyjne metody, ograniczenia w zakresie wydajności i możliwości punktacji w badaniach nad mieszankami kultur. Nasze laboratorium będzie nadal koncentrować się na integracji dodatkowych technik manipulacji kroplami, takich jak rozdzielanie i łączenie kropel, aby rozszerzyć zakres zastosowań technologicznych.
Aby rozpocząć, otwórz drzwi komory generowania kropel i hodowli w komórce MISS. Zdejmij pionowo osłonę ochronną mikrorurki i chip mikroprzepływowy generujący kropelki. Za pomocą jednorazowej strzykawki dodaj 10 mililitrów sterylnej wody destylowanej do nawilżacza wewnątrz komory i ponownie załóż osłonę ochronną.
Otwórz sterylne opakowanie mikrorurki i chipa mikroprzepływowego do generowania kropelek i umieść je pionowo bezpośrednio nad komorą uprawową. Następnie w interfejsie oprogramowania kliknij instalację. Gdy pojawi się wyskakujące okienko potwierdzenia, kliknij tak, aby rozpocząć instalację.
Wyjmij zmywacz pęcherzyków powietrza i zamocuj go do góry nogami na urządzeniu do usuwania pęcherzyków powietrza umieszczonym w komorze. Przymocuj rurkę odprowadzającą kropelki urządzenia do usuwania pęcherzyków powietrza do clampzawór poniżej. Przeprowadź go przez całość prowadzącą do komory wykrywania i zbierania kropel.
Po otwarciu drzwiczek komory należy włożyć rurkę detekcyjną w pionie do gniazda detekcyjnego. Upewnij się, że rurka detekcyjna jest całkowicie włożona. Dokręć mocującą rurkę detekcyjną w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara.
Po potwierdzeniu pełnego włożenia i zabezpieczeniu zamknij drzwiczki komory. Podłącz każdą z 10 silikonowych rurek z chipa mikroprzepływowego, oznaczonych od L1 do L10, do odpowiadających im numerowanych zaworów zaciskowych. Następnie podłącz szybkozłącze z chipa mikroprzepływowego do odpowiedniego portu w systemie omicznym, wykonując prawidłowe połączenia.
Po zakończeniu instalacji chipa pojawi się wyskakujące okienko z komunikatem, zawór zaciskowy rurki kropelkowej jest otwarty. Kliknij przycisk OK po zakończeniu instalacji mikrorurki i chipa do generowania kropel. Po upewnieniu się, że wszystkie rurki są prawidłowo podłączone do odpowiednich zaworów zaciskowych, kliknij OK.
Przed wykonaniem inicjalizacji kliknij interfejs ustawień, aby skonfigurować odpowiednie parametry, takie jak tryb selektywny, temperatura inkubacji, czas inkubacji, prędkość mieszadła, długość fali wykrywania OD oraz długość fali wzbudzenia i emisji do wykrywania fluorescencji. Przejdź do interfejsu głównego i kliknij przycisk Zainicjuj. Pojawi się wyskakujące okienko potwierdzenia, kliknij tak, aby umożliwić układowi IC przeprowadzenie samokontroli swoich elementów, w tym pompy wtryskowej, ustawień temperatury, testowania odprowadzania cieczy odpadowych, modułu przesiewowego i modułu wykrywania kropel.
Po zakończeniu inicjalizacji kliknij OK w wyskakującym okienku. Aby przygotować próbkę, należy pobrać próbkę drobnoustrojów i przeprowadzić seryjne rozcieńczanie odpowiednim podłożem, aby osiągnąć stężenie około 50 komórek na mililitr, aby uzyskać zawiesinę próbki o pojemności 40 mililitrów. Następnie odkręcić nakrętkę butelki z próbką i wlać rozcieńczoną zawiesinę kału do butelki z mieszadłem magnetycznym, aż do pozycji dodawania próbki.
Zakręć nakrętkę i mocno ją dokręć. Następnie włóż szybkozłączkę A do szybkozłączki B, aby zakończyć proces ładowania próbki. Po umieszczeniu butelki z próbką w wyznaczonej pozycji oddziel szybkozłączki A i B od butelki na próbkę.
Podłącz szybkozłącze A butelki z próbką do portu O3 w systemie omicznym. Podłącz złącze C3 na chipie mikroprzepływowym do szybkozłącza B i zamknij drzwiczki komory. W interfejsie głównym oprogramowania wybierz żądaną liczbę rurek kropelkowych do wygenerowania i kliknij przycisk produkuj, aby rozpocząć generowanie kropel z pojedynczymi komórkami.
Poczekaj na wyskakujące okienko wskazujące zakończenie tworzenia kropli i kliknij OK. Zamknij zacisk na trzech złączach i wyjmij butelkę z próbką. W interfejsie głównym oprogramowania wybierz ten sam numer rurki kropli, który jest używany podczas generowania kropli.
Kliknij pozycję Kultura. Potwierdź czas i temperaturę uprawy, a następnie rozpocznij proces. Poczekaj na wyskakujące okienko wskazujące zakończenie hodowli kropel.
Naciśnij przycisk UV na systemie omicznym, aby włączyć ultrafioletowe światło UV. Napromieniować komorę wykrywania i zbierania kropel przez 30 minut przed jej wyłączeniem. W super czystej ławce otwórz wszystkie 96 dołków używanych do zbierania kropelek i ułóż je jedna na drugiej bez pokrywek, numerując je sekwencyjnie od dołu do góry.
Upewnij się, że górna płytka studzienki jest przykryta pokrywką. Otwórz drzwiczki komory do wykrywania i zbierania kropel i umieść płytki studzienki w wyznaczonych miejscach. Zdejmij pokrywę z górnej płytki studzienki, a następnie zamknij drzwi komory.
Ponownie włącz światło UV w systemie omicznym na 30 minut, aby przeprowadzić wtórną sterylizację. Następnie wyjmij środek do usuwania pęcherzyków powietrza z pozycji umieszczenia. Odkręć nakrętkę i wykręć w kształcie motyla z nakrętki.
Wlej 200 mililitrów oleju do usuwania pęcherzyków powietrza do środka do usuwania pęcherzyków powietrza. Mocno dokręć nakrętkę, a następnie zamocuj środek do usuwania pęcherzyków powietrza do góry nogami w wyznaczonym miejscu. W interfejsie głównym wybierz rurkę kropelkową do sortowania.
Kliknij przycisk Sortowanie. Wprowadź liczbę płytek dołkowych do zebrania i rozpocznij proces sortowania. Obserwuj obszar wyświetlania procesu, aby w czasie rzeczywistym mierzyć gęstość optyczną kropel lub wartości fluorescencji.
Przeanalizuj około 20 do 30 kropel, aby sprawdzić wartość OD. Jeśli większość kropel ma OD około 0,2, ustaw dolny próg OD na 0,5, a górny próg OD na cztery. System automatycznie zbiera kropelki w tym zakresie do płytek 96-dołkowych.
Poczekaj na wyświetlenie wyskakującego okienka wskazującego zakończenie sortowania i zbierania kropel, a następnie kliknij przycisk OK. Otwórz drzwiczki komory do wykrywania i zbierania kropel. Umieść pokrywę płytki studzienki na górnej płytce dołka i wyjmij płytki razem.
Kliknij przycisk Eksportuj dane, aby zapisać zebrane dane sygnału kropelki. Kliknij mapę skupień. Wybierz plik z danymi pobierania kropel i obserwuj średnicę zewnętrzną wyświetlaną w formacie mikropłytki.
Wizualizuj te wartości OD jako mapę cieplną, na której intensywność koloru odpowiada rozkładowi OD w studzienkach, zapewniając przejrzystą i intuicyjną reprezentację. Różnorodność gatunkowa ludzkiej mikrobioty jelitowej uzyskana z systemu omicznego, metody litej płytki i początkowej próbki kału porównano na poziomie rodziny. 34 rodziny drobnoustrojów zostały wzbogacone zarówno metodą litej płytki, jak i zademonstrowaną metodą omiczną, przy czym system omiczny dodatkowo wzbogacił cztery rodziny.
System omiczny skutecznie wzbogacił również niektóre rodziny o niskiej liczebności. Na poziomie rodzaju obie metody wzbogaciły 74 rodzaje drobnoustrojów, natomiast metoda komórkowa MISS dodatkowo wzbogaciła 13 rodzajów. Co więcej, dwa rodzaje początkowo występujące w niskiej liczebności zostały skutecznie wzbogacone za pomocą systemu OMIC.
Wyniki te wykazały, że metoda hodowli komórek MISS zapewniła lepsze warunki wzrostu dla tych szczepów, które były obecne w niskich proporcjach lub miały słabą wydajność wzrostu w oryginalnej zawiesinie drobnoustrojów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje zastosowanie systemu Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS cell) do izolacji i hodowli monoklonalnych mikroorganizmów. System wykorzystuje technologię mikroprzepływową w kropelkach w celu zwiększenia wydajności i przepustowości w badaniach mikrobiologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Kultura mikroorganizmów
- Mikroprzepływy
- Przesiewy wysokoprzepustowe
Wstęp
- Badanie koncentruje się na ulepszeniu technik izolacji i hodowli mikroorganizmów.
- Tradycyjne metody często charakteryzują się niską wydajnością i ograniczoną skalowalnością.
- Komórka MISS rozwiązuje te ograniczenia dzięki zastosowaniu zaawansowanej technologii.
- Omika kultur mikrobiologicznych jest kluczowa dla zrozumienia mikrobiomu jelitowego człowieka.
Cel badania
- W celu usprawnienia izolacji mikroorganizmów oraz przesiewu monoklonalnego.
- W celu pogłębienia wiedzy na temat mikrobiomu jelitowego i jego zastosowań.
- Aby zapewnić niskokosztową platformę o wysokim stopniu wsparcia dla przesiewu mikroorganizmów.
Zastosowane metody
- System hodowli pojedynczych komórek w mikrolitrowych kropelkach.
- Technologia mikroprzepływowa w kropelkach do wysokoparalelnej hodowli.
- Automatyczne platformy izolacji i screeningu szczepów.
- Algorytmy uczenia maszynowego do analizy danych.
Główne wyniki
- Komórka MISS znacząco zwiększa liczbę generowanych klonów w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Zwiększona wydajność monoklonalnej izolacji i hodowli mikroorganizmów.
- Lepsze zrozumienie oddziaływań mikroorganizmów w kulturze.
- Potencjał do rozszerzenia zastosowań technologicznych w badaniach nad mikrobiomem.
Wnioski
- Komórka MISS stanowi znaczący postęp w technikach hodowli drobnoustrojów.
- Rozwiązuje ona kluczowe ograniczenia tradycyjnych metod.
- Przyszłe badania skupią się na integracji dodatkowych technik manipulacji kroplami.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokoprzepustowa, zautomatyzowana monoklonalna hodowla drobnoustrojów ma kluczowe znaczenie dla przyspieszenia odkryć w badaniach nad mikrobiomem i kulturomiką drobnoustrojów. System komórkowy MISS umożliwia szybką, skalowalną izolację i przesiewanie różnorodnych szczepów drobnoustrojów, co bezpośrednio wpływa na identyfikację celów na wczesnym etapie oraz walidację funkcjonalną. Możliwość ta wspiera rozszerzanie portfolio i zmniejsza ryzyko w translacyjnych programach mikrobiomu, umożliwiając dostęp do taksonów, które wcześniej były niehodowalne lub występowały w niskiej obfitości.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia systematyczną analizę różnorodności mikrobiologicznej w celu walidacji celów w terapiach opartych na mikrobiomie.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez izolację i charakterystykę szczepów o niskiej liczności lub wymagających specjalnych warunków hodowli.
- Zwiększa wiarygodność predykcyjną w badaniach funkcjonalnych poprzez dostarczenie czystych kultur monoklonalnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane kultury monoklonalne do dalszego screeningu fenotypowego i testów funkcjonalnych.
- Standaryzuje procesy izolacji i hodowli, poprawiając powtarzalność i wydajność ilościową.
- Umożliwia przygotowanie do screeningu wysokoprzepustowego oraz skalowalność dla dużych bibliotek mikrobiologicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Rozszerza dostęp do istotnych w kontekście chorób taksonów mikrobiologicznych w celu odkrywania biomarkerów translacyjnych.
- Poprawia ciągłość procesu od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej poprzez umożliwienie rygorystycznego wyboru szczepów.
- Wspiera dostosowane do ryzyka wdrażanie kandydatów opartych na mikrobiomie poprzez wzbogacanie różnorodności funkcjonalnej.
Integracja potoku i przepływu pracy
System komórkowy MISS integruje się z kontinuum od etapu odkrycia do fazy przedklinicznej, łącząc wczesną izolację drobnoustrojów z późniejszymi badaniami funkcjonalnymi i translacyjnymi.
- Biologia odkrywcza: Przyspiesza weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków metabolicznych poprzez umożliwienie szybkiej izolacji monoklonalnej.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki dla rozwoju testów i oceny związków.
- Analityka: Dostarcza pomiary oparte na gęstości optycznej i fluorescencji w celu rzetelnego porównania warunków wzrostu drobnoustrojów.
- Badania translacyjne: Jest zgodne z wzbogacaniem biomarkerów i taksonów istotnych dla chorób w badaniach przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy skalowalną, zautomatyzowaną platformę do wielokrotnego zastosowania w różnorodnych projektach mikrobiologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad mikrobiomem.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowane, powtarzalne i skalowalne przepływy pracy w zakresie hodowli monoklonalnej.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji typu go/no-go oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez rozszerzenie dostępnej różnorodności drobnoustrojów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój zasobów opartych na mikrobiomie.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroprzepływów, pracy z mikroorganizmami oraz analizy danych.
- Wymaga specjalistycznej aparatury do generowania, detekcji i sortowania kropel.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia porównywalności danych i integracji przepływu pracy.
- Możliwa jest potrzeba adaptacji metody dla różnych zbiorowisk mikrobowych lub rodzajów próbek.
- Wzrost wydajności i różnorodności zależy od przygotowania próbek oraz kalibracji systemu.
