31 stycznia 2025
Tutaj prezentujemy protokół użycia organicznych tranzystorów elektrochemicznych (OECT) do translacji aktywności zewnątrzkomórkowego transferu elektronów (EET) w Shewanella oneidensis na sygnały elektryczne. Hybrydowy system OECT zapewnia zwiększoną solidność, czułość i potencjał do szybkich, wysokowydajnych testów, co czyni go skutecznym narzędziem do pomiarów EET.
Nasze badania koncentrują się na rozwoju bioelektroniki, która integruje bakteryjny zewnątrzkomórkowy transfer elektronów lub EET w celu rozszerzenia zastosowań biosensorycznych i biokomputerowych. Szukamy odpowiedzi na pytanie, w jaki sposób EET oddziałuje z materiałami elektronicznymi, jak regulować EET genetycznie w celu optymalizacji wydajności elektrycznej i czy w tych systemach elektrochemicznych, które zawierają żywe komórki, pojawiają się nowe nowe cechy. Postępy w badaniach nad bakteryjnymi komórkami HR lub transferem elektronów wykorzystują biologię syntetyczną do inżynierii ścieżek EET, system elektrochemiczny do monitorowania redoks, na przykład, i mikroskopię do aktywności komórek, prowadzenie mikroskopii sił atomowych i makroelektrody do analizy przepływu elektronów i zaawansowaną spektroskopię, taką jak UAV Raman do charakteryzacji interfejsu biologii materiałowej.
Wykazaliśmy, że genetycznie modyfikowane badania nad chorobą mogą modulować wyniki OECT, umożliwiając biologicznie sterowane reakcje elektryczne. Wyniki obejmują zilustrowanie bezpośrednich i pośrednich szlaków EET wpływających na wydajność bioelektroniki, sprzężenie logiki genetycznej z wynikami elektrycznymi oraz dostrojenie plastyczności genetycznej za pomocą EET. W porównaniu z tradycyjną pracą OECT, żywe komórki oferują takie korzyści, jak dynamiczne, genetycznie programowalne sterowanie poprzez zewnątrzkomórkowy transfer elektronów i możliwość wykorzystania metabolizmu komórkowego do odpowiedzi w czasie rzeczywistym.
W porównaniu z tradycyjnymi obwodami biologicznymi, które wykorzystują reportery fluorescencyjne, użytkownicy OECT zapewniają szybsze bezpośrednie wyniki elektryczne z wysoką czułością. Nasze przyszłe prace obejmują rozszerzanie obwodów genetycznych w celu napędzania EET oraz rozwój epigenetyki lub optogenetyki, aby umożliwić elektronice modulowanie ekspresji genów EET. Jesteśmy również zainteresowani tworzeniem pętli sterowania dla aplikacji takich jak trenowanie sieci neuronowych.
Wreszcie, badamy różnorodne materiały kanałów OECT oraz włączenie mikrofluidyki i instytutowego wytwarzania tlenu w celu dalszej kontroli wydajności urządzeń. Aby rozpocząć autoklawowanie organicznego tranzystora elektrochemicznego lub szkiełek OECT, arkuszy polidimetylosiloksanu lub PDMS oraz elektrody referencyjnej ze srebra i chlorku srebra. Składniki autoklawu upiecz w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aby je wysuszyć.
Przenieś szkiełka OECT autoklawu i elektrodę referencyjną ze srebra i chlorku srebra do schowka na rękawiczki. Poddać arkusze PDMS działaniu próżni w antykomorze komory rękawicowej przez cztery godziny w celu desorpcji uwięzionego tlenu. Następnie, aby zmontować urządzenie OECT, umieść arkusze PDMS na szkiełkach OECT.
Wstrzyknąć 45 mikrolitrów podłoża bazowego Shewanella lub SBM do każdej komory OECT. Przykryj porty komory OECT arkuszami PDMS, aby zapobiec parowaniu medium i zanieczyszczeniu. Rozpocznij początkowy pomiar elektrochemiczny OECT od pomiaru prądu kanału IDS dla kroku napięcia bramki od zera do 0,2 wolta.
Monitoruj prąd odpływu kanału OECT lub IDS przy stałym napięciu źródła drenu kanału lub VDS minus 0,05 V i napięciu bramki VGS 0,2 V, aż prąd się ustabilizuje. Skonfiguruj pierwszy kanał instrumentu, aby mierzyć prąd IDS kanału OECT. Ustaw nazwę techniki na Szybka amperometria, czas równowagi na jedną sekundę, napięcie równowagi na minus 0,05 wolta, napięcie polaryzacji na minus 0,05 wolta, czas pracy na 14 sekund i interwał próbkowania na 0,5 milisekundy.
Następnie skonfiguruj drugi kanał instrumentu, aby sterować napięciem bramki VGS. Ustaw nazwę techniki na Tryb mieszany, czas warunku na jedną sekundę, napięcie warunku na zero woltów, tryb pierwszego stopnia na stałą E, napięcie polaryzacji pierwszego stopnia na zero woltów. Etap jednego czasu pracy do czterech sekund.
Stopień drugi tryb do stałej E, stopień drugi napięcie polaryzacji do 0,2 V. Czas wykonywania drugiego etapu wynosi 10 sekund, a interwał próbkowania wynosi 0,5 milisekundy. Do wszystkich urządzeń OECT należy zastosować stałe napięcie kanału VDS wynoszące minus 0,05 V i napięcie bramki VGS wynoszące 0,2 V.
Odwirować zawiesinę Shewanella oneidensis o sile 1500 3G przez cztery minuty i trzykrotnie przemyć osad komórkowy jednym mililitrem świeżej pożywki wzrostowej. Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić komórki w 0,5 mililitra lub połowie pierwotnej objętości hodowli, aby uzyskać skoncentrowaną zawiesinę komórek o gęstości optycznej 600 od jednego do 3,5. Przenieść skoncentrowaną zawiesinę komórek do schowka na rękawiczki.
Przygotować inokulum, rozcieńczając komórki do zamierzonej gęstości optycznej 0,1, używając SBM+ uzupełnionego mleczanem przygotowanym świeżo w komorze rękawicowej z oczyszczonymi pożywkami. Zatrzymaj potencjostat. Wstrzyknąć pięć mikrolitrów przygotowanego inokulum do komory OECT zawierającej 45 mikrolitrów SBM, aby uzyskać końcową absorbancję 0,01.
Przykryj porty komory OECT arkuszami PDMS, aby uniknąć parowania medium i zanieczyszczenia. W przypadku kultur beztlenowych należy rozcieńczyć kulturę komórkową Shewanelli dziesięciokrotnie, używając pożywki rozcieńczającej o takiej samej budowie jak pożywka wzrostowa. Po odstawieniu potencjostatu wstrzyknąć pięć mikrolitrów inokulum beztlenowego do komory OECT, zawierającej 45 mikrolitrów pożywki SBM.
Zakryj porty komory OECT arkuszami PDMS. Zastosuj stałe napięcia polaryzacji do kanałów OECT o napięciu kanału VDS minus 0,05 V i napięciu bramki VGS 0,2 V przez 24 godziny. Odłącz statystykę potencjału od poszczególnych urządzeń OECT tylko podczas pomiarów punktu czasowego w celu charakteryzacji.
Monitoruj znaczące zmiany w stanie dopingu kanału OECT w ciągu pierwszych ośmiu godzin. Po 24 godzinach włóż srebrną elektrodę referencyjną z chlorkiem srebra do komory OECT, delikatnie przekręcając i przepychając ją przez port wymiany płynu. Zmierz krzywe przenoszenia OECT, przesuwając napięcie bramki od minus 0,1 V do 0,6 V, jednocześnie monitorując prąd kanału IDS ze stałym napięciem polaryzacji VDS wynoszącym minus 0,05 V.
Jednocześnie zmierz dokładne potencjały elektrody bramki i źródła w stosunku do elektrody odniesienia. Skonfiguruj pierwszy kanał instrumentu, aby mierzyć prąd IDS kanału OECT za pomocą techniki chronoamperometrii. Ustaw czas równowagi na pięć sekund, napięcie równowagi na minus 0,05 wolta, napięcie polaryzacji na minus 0,05 wolta, czas pracy na 35 sekund i interwał próbkowania na 0,09915 sekundy.
Następnie skonfiguruj drugi kanał instrumentu, aby sterować napięciem bramki OECT VGS za pomocą woltamperometrii liniowej. Ustaw czas równowagi na pięć sekund, napięcie równowagi na minus 0,1 wolta. Rozpocznij napięcie do minus 0,1 wolta.
Napięcie końcowe do 0,6 wolta. Napięcie wzrasta do 0,002 V, a szybkość skanowania do 0,02 V na sekundę. Skonfiguruj trzeci kanał przyrządu, aby zmierzyć potencjał źródła OECT VS w stosunku do elektrody referencyjnej ze srebra i chlorku srebra za pomocą potencjometrii obwodu otwartego.
Ustaw czas wykonywania na 40 sekund, a interwał próbkowania na 0,09915 sekundy. Skonfiguruj czwarty kanał instrumentu, aby zmierzyć potencjał bramki OECT VG w stosunku do elektrody odniesienia za pomocą potencjometrii obwodu otwartego. Ustaw czas wykonywania na 40 sekund, a interwał próbkowania na 0,09915 sekundy.
Po każdym pomiarze spłucz elektrodę odniesienia 70% etanolem i wytrzyj ją nowym ręcznikiem o niskiej zawartości strzępiących się elementów. Dopasowane stałe szybkości aktywności przenoszenia elektronów wykazały znaczące różnice między szczepami, przy czym mutanty Delta MtrC i Delta MTR wykazywały zmniejszone stałe w porównaniu z dzikim typem S.oneidensis MR-1. Uzupełnienie mutantów MtrC lub MTRC AB przywróciło wskaźniki do poziomów typu dzikiego w warunkach induktora.
Prąd kanału OECT wykazał szybkie wykrywanie aktywności przenoszenia elektronów za pomocą prądu źródła drenu i znormalizowanego prądu źródła drenu, wykazując statystycznie istotne różnice między szczepami w ciągu 1,5 godziny po inokulacji. Abiotyczne grupy kontrolne i nieindukowane mutanty wykazywały minimalne zmiany, wzmacniając czułość systemu hybrydowego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Niniejsze badanie przedstawia protokół wykorzystania organicznych tranzystorów elektrochemicznych (OECT) do przekształcania aktywności zewnątrzkomórkowego transportu elektronów (EET) w gatunku Shewanella oneidensis w mierzalne sygnały elektryczne. Hybrydowy system OECT zwiększa stabilność i czułość, ułatwiając szybkie i wysokoprzepustowe testy w pomiarach EET.
Przetwarzanie mikrobiologicznego pozakomórkowego transportu elektronów (EET) na sygnały elektryczne przy użyciu organicznych tranzystorów elektrochemicznych (OECTs) umożliwia bezpośredni, szybki i ilościowy odczyt aktywności komórkowej. Zdolność ta zwiększa wiarygodność predykcyjną w aplikacjach biosensorycznych i biokomputacyjnych, wspierając wczesną walidację celów oraz przesiewy funkcjonalne. Integracja genetycznie kontrolowanego EET z OECTs pozycjonuje tę platformę jako wielorazowy, skalowalny interfejs dla wysokoprzepustowych procesów odkrywania i przepływów pracy w biologii syntetycznej.
Ten system pomiaru EET oparty na OECT łączy wczesne etapy odkrywania, przesiewania i badań translacyjnych, zapewniając bezpośredni, ilościowy interfejs pomiędzy zmodyfikowanymi mikroorganizmami a elektronicznymi odczytami.