Name: Obrazowanie biofilmu Proteus mirabilis w superrozdzielczości za pomocą mikroskopii ekspansyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Poznaj metodę PmbExM do superrozdzielczej analizy biofilmu Proteus mirabilis za pomocą mikroskopii ekspansyjnej. Technika umożliwia wizualizację struktur komórkowych i subkomórkowych z rozdzielczością nanometrową przy użyciu konwencjonalnych mikroskopów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy wyrażają swoją wdzięczność dr Juanowi Eduardo Rodríguezowi i prof. dr Ulrichowi Kubitschekowi (U-Bonn) za ich wkład we wdrażanie technik ekspansji w SCIAN-Lab. Praca została sfinansowana ze środków ANID ICM P09-015-F (SH, DC, KP, JJW), FONDECYT 1211988 (SH, DC, KP), FONDECYT 3220832 (JJW), FONDEQUIP EQM210020 (DC, KP, JJW, JT, NCH, PS, SH); Núcleo SELFO NCN2024_068 (SH, KP, JJW), CORFO 16CTTS- 66,390, MINEDUC grant RED 21994 (SH), BASAL FB210005 (SH), DAAD 57519605 (SH, NC), Centro CTI230006 (SH), FONDEF ID 23I10337 (SH) oraz Regional Binational Project Cooperación SUR-SUR AUCI / AGCID BIL-URY-2019-661 (SH, NCH, PS, MJG).

<ol><li>Franklin, M. J., Chang, C., Akiyama, T., Bothner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+technologies+for+studying+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">New technologies for studying biofilms.</a> Microbiol Spectr. 3 (4), 10(2015).</li>
<li>Valdivieso González, D., Jara, J., Almendro-Vedia, V. G., Orgaz, B., López-Montero, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+applied+to+mono-+and+dual-species+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy applied to mono- and dual-species biofilms.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 9 (1), 92(2023).</li>
<li>Castagnini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteus+mirabilis+biofilm+expansion+microscopy+yields+over+4-fold+magnification+for+super-resolution+of+biofilm+structure+and+subcellular+DNA+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Proteus mirabilis biofilm expansion microscopy yields over 4-fold magnification for super-resolution of biofilm structure and subcellular DNA organization.</a> J Microbiol Methods. 220, 106927(2024).</li>
<li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging-+Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical imaging- Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li>
<li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li>
<li>Gao, R., Asano, S. M., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q%26A%3A+Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+biology%22%5BJournal%5D)">Q&A: Expansion microscopy.</a> BMC biology. 15 (1), 50(2017).</li>
<li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nat Biotechnol. 34 (9), 987-992 (2016).</li>
<li>Lim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+resolved+imaging+of+bacteria+using+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy.</a> PLoS biology. 17 (10), e3000268(2019).</li>
<li>Kunz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expandables%3A+Cracking+the+staphylococcal+cell+wall+for+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The expandables: Cracking the staphylococcal cell wall for expansion microscopy.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 644750(2021).</li>
<li>Jacobsen, S. M., Shirtliff, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteus+mirabilis+biofilms+and+catheter-associated+urinary+tract+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Proteus mirabilis biofilms and catheter-associated urinary tract infections.</a> Virulence. 2 (5), 460-465 (2011).</li>
<li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%3A+Protocols+for+imaging+proteins+and+RNA+in+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy: Protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues.</a> Curr Protoc Cell Biol. 80 (1), e56(2018).</li>
<li>Yokogawa, K., Kawata, S., Nishimura, S., Ikeda, Y., Yoshimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutanolysin%2C+bacteriolytic+agent+for+cariogenic+streptococci%3A+partial+purification+and+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Mutanolysin, bacteriolytic agent for cariogenic streptococci: partial purification and properties.</a> Antimicrob Agents Chemother. 6 (2), 156-165 (1974).</li>
<li>Hurst, P. L., Nielsen, J., Sullivan, P. A., Shepherd, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+a+cellulase+from+Aspergillus+niger%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of a cellulase from Aspergillus niger.</a> Biochem J. 165 (1), 33-41 (1977).</li>
<li>Scott, J. H., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyticase%3A+Endoglucanase+and+protease+activities+that+act+together+in+yeast+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Lyticase: Endoglucanase and protease activities that act together in yeast cell lysis.</a> J Bacteriol. 142 (2), 414-423 (1980).</li>
<li>Bano, S., Qader, S. A. U., Aman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+novel+%CE%B1-amylase+from+Bacillus+subtilis+KIBGE+HAS%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+PharmSciTech%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of novel α-amylase from Bacillus subtilis KIBGE HAS.</a> AAPS PharmSciTech. 12, 255-261 (2011).</li>
<li>Kaplan, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+involved+in+the+synthesis+and+degradation+of+matrix+polysaccharide+in+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+and+Actinobacillus+pleuropneumoniae+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genes involved in the synthesis and degradation of matrix polysaccharide in Actinobacillus actinomycetemcomitans and Actinobacillus pleuropneumoniae biofilms.</a> J Bacteriol. 186 (24), 8213-8220 (2004).</li>
<li>Kaplan, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+human+DNase+I+decreases+biofilm+and+increases+antimicrobial+susceptibility+in+staphylococci%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antibiot%22%5BJournal%5D)">Recombinant human DNase I decreases biofilm and increases antimicrobial susceptibility in staphylococci.</a> J Antibiot. 65 (2), 73-77 (2012).</li>
<li>Schlapp, G., Scavone, P., Zunino, P., Härtel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+3D+architecture+of+uropathogenic+Proteus+mirabilis+batch+culture+biofilms%3A+A+quantitative+confocal+microscopy+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of 3D architecture of uropathogenic Proteus mirabilis batch culture biofilms: A quantitative confocal microscopy approach.</a> J Microbiol Methods. 87 (2), 234-240 (2011).</li>
<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+demystified%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nat Cell Biol. 21 (1), 72-84 (2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie ma finansowych ani osobistych konfliktów interesów związanych z tą pracą.

Krytyczne kroki PmbExM Podobnie jak w przypadku każdego wariantu ExM, jednym z najbardziej krytycznych etapów protokołu jest homogenizacja właściwości mechanicznych próbki. W przypadku PmbExM osiąga się to poprzez szereg zabiegów enzymatycznych. Niewystarczające trawienie może skutkować niskim poziomem EF i potencjalnym uszkodzeniem morfologii i/lub topologii biofilmu, co prowadzi do nieoptymalnej rozdzielczości i niewiarygodnych wyników. I odwrotnie, zbyt agresywne trawienie, zwłaszcza zabiegi prot...

Mikroskopia fluorescencyjna jest szeroko stosowanym narzędziem do badania architektury, składu i funkcji biofilmu1. Jednak zdolność mikroskopii optycznej do rozpoznawania strukturalnych, komórkowych i subkomórkowych cech biofilmów jest ograniczona przez barierę dyfrakcyjną. Mikroskopia ekspansywna (ExM) to innowacyjna, dostępna i łatwa w użyciu technika superrozdzielcza, która ma ogromny potencjał w ujawnianiu struktury biofilmu poza granicą dyfrakcji2,3. ExM zwiększa rozdzielczość poprzez izotropowe rozszerzanie próbek biologicznych około czterokrotnie w stosunku do ich pierwotnego rozmiaru. Metoda polega na polimeryzacji in-situ pęczniejącego hydrożelu jonowego w całej próbce i zachowaniu względnego przestrzennego układu celów molekularnych przy ostrożnym stosowaniu4,5.
Aby ExM działało poprawnie, homogenizacja właściwości mechanicznych materiału biologicznego jest kluczowym krokiem6. Standardowe warianty ExM zostały opracowane na hodowlach komórek i tkanek ssaków, gdzie skutecznie osiągnęły homogenizację tylko poprzez trawienie proteolityczne proteinazy K4,5 lub denaturacja miękkich białek za pomocą detergentów i autoklawowanie7, co daje izotropową 4-krotną ekspansję. Jednak w przypadku bakterii i biofilmów bakteryjnych ściana komórkowa peptydoglikanu i elementy matrycy EPS, takie jak polisacharydy strukturalne, stanowią przeszkodę przed ekspansją2,3,8,9.
Ten artykuł opisuje procedury Mikroskopii Ekspansji Biofilmu Proteus mirabilis (PmbExM), dostosowanego wariantu ExM zaprojektowanego do rozszerzania biofilmów P. mirabilis, klinicznie istotnej pałeczki Gram-ujemnej związanej z wysoką opornością na antybiotyki i infekcjami dróg moczowych związanymi z cewnikiem10. PmbExM wykorzystuje kombinację mutanolizyny, α-amylazy, celulazy, litykazy i enzymatycznej proteinazy K do hydrolizy ściany komórkowej peptydoglikanu, polisacharydów i białek. Wyniki pokazują, że metoda ta pozwala osiągnąć 4,3-krotną ekspansję izotropową 48-godzinnych biofilmów P. mirabilis. Technika ta umożliwia wizualizację w superrozdzielczości architektury, montażu i cech wewnątrzkomórkowych biofilmu P. mirabilis poprzez podwójne barwienie3. Ponadto PmbExM można dostosować do innych modeli biofilmu poprzez dostosowanie zabiegów enzymatycznych do docelowych składników biofilmu specyficznych dla danego gatunku.
Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu procedur związanych z żelowaniem, trawieniem, rozszerzaniem i mocowaniem próbek biofilmu dla PmbExM. Ponadto praca ta przedstawia warunki wzrostu bakterii, formaty próbek i techniki barwienia fluorescencyjnego stosowane przez autorów, a także procedurę przetwarzania i analizy danych, która może być łatwo zastosowana przez badaczy z ograniczonym doświadczeniem w przetwarzaniu obrazu. Aby uzyskać bardziej obszerny i szczegółowy przewodnik na temat przetwarzania i analizy obrazu, zapoznaj się z Castagnini, D. et al.3.

<table><tbody><tr><td>&alfa;-Amylaza z Bacillus sp.</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>10070</td><td>Mineralizacja polisacharydowa</td></tr><tr><td>0,1% (w/v) roztwór wodny poli-L-lizyny&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>Unieruchomienie próbki do obrazowania</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane 12 mm</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CLS-1760</td><td>Komponent komory żelowej</td></tr><tr><td>16-bitowa kamera C13440-20CU</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>Niedostępna</td><td>kamera cyfrowa CMOS do akwizycji obrazu</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane 24 mm x 50 mm</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CLS-1764 Manipulacja</td><td>/obsługa próbek</td></tr><tr><td>Komora obrazowania wydrukowana w 3D</td><td>Własny</td> <td>projekt-opcja</td> <td>komory obrazowania</td></tr><tr><td>4-hydroksy-2,2,6,6-tetrametylopirydyno-1-oksyl (4-hydroksy-TEMPO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>176141</td><td>Składnik roztworu żelującego</td></tr><tr><td>6-dołkowa szklana płyta denna z czarnymi</td><td>ściankami CelVis</td><td>P06-1.5H-N</td><td>Opcja komory obrazowania</td></tr><tr><td>Kwas octowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>818755</td><td>Enzymatyczny składnik buforowy</td></tr><tr><td>Akrylamid&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4058</td><td>Składnik roztworu monomeru</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td>Składnik roztworu żelującego</td></tr><tr><td>Mikroskop Axiovert 200</td><td>Zeiss</td><td>Niedostępny</td><td>Mikroskop konfokalny</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td>Enzymatyczny składnik buforowy</td></tr><tr><td>C-Apochromat 63x 1,2 NA Obiektyw do zanurzania w wodzie</td><td>Zeiss</td><td>Niedostępne</td><td>Obiektyw mikroskopu</td></tr><tr><td>Celulaza od Aspergillus niger</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>22178</td><td>Trawienie polisacharydowe</td></tr><tr><td>Chamlide CMB 35 mm miska magnetyczna</td><td>Instrument</td> do żywych komórek <td>Niedostępne</td><td>Opcja komory obrazowania</td></tr><tr><td></td><td>Roztwór podstawowy odczynnika kotwiczącego Sigma-Aldrich 472301 MA-NHS&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosforan disodowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td>Enzymatyczny składnik buforowy</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Czyszczenie i sterylizacja</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Merck</td><td>324503</td><td>Enzymatyczny składnik buforowy</td></tr><tr><td>Polistyren Falcon 24-dołkowe Corning</td><td></td><td>351147</td><td>Platforma procedur ogólnych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td> <td>FIJINational Institutes of</td> <td>Health-Oprogramowanie</td> <td>do przetwarzania obrazów</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893</td><td>Enzymatyczny składnik buforowy</td></tr><tr><td>Chlorowodorek guanidyny</td><td>Thermo Scientific</td><td>24115</td><td>Enzymatyczny składnik</td></tr><tr><td>buforowy Huygens Software</td> Naukowe oprogramowanie do <td>obrazowania objętości</td><td></td> do <td>przywracania obrazu</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Supelco</td><td>1.00317</td><td>Przygotowanie buforu</td></tr><tr><td>Bibułka Kimwipes</td><td>Fisher Scientiffic</td><td>06-666</td><td>Usuwanie nadmiaru wody</td></tr><tr><td>Pęseta laboratoryjna</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>M5E</td><td>Ogólna manipulacja/obsługa próbek</td></tr><tr><td>Bulion Luria Bertani</td><td>Invitrogen</td><td>12795-027</td><td>Pożywka wzrostowa biofilmu</td></tr><tr><td>Lyticase z Arthrobacter luteus</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L4025</td><td>Trawienie polisacharydowe</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5652</td><td>Enzymatyczny składnik buforowy</td></tr><tr><td>Kwas metakrylowy N-hydroksysukcynimidyl ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>730300</td><td>Odczynnik kotwiczący</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32213</td><td>Odwadnianie i przechowywanie próbki</td></tr><tr><td>MicrobeJ&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>Wtyczka oprogramowania do przetwarzania obrazu</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG-8221</td><td>Składnik komory żelowej</td></tr><tr><td>Fosforan monosodowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>Enzymatyczny składnik buforowy</td></tr><tr><td>Mutanolizyna z Streptomyces globisporus</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>M990</td><td>Trawienie peptydoglikanem</td></tr><tr><td>N, N, N', N'-tetrametyloetylenodiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7024</td><td>Składnik roztworu żelującego</td></tr><tr><td>N,N&prime;-metylenobisakryloamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1533</td><td>Składnik roztworu monomeru</td></tr><tr><td>Nunc 40,4 mm szklane dno szalki Petriego</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-567-400</td><td>Opcja komory obrazowania</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>Utrwalanie próbki</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79383</td><td>Składnik roztworu monomeru, Mycie, Bufor enzymatyczny</td></tr><tr><td>Proteinaza K z Engyodontium album</td><td>Invitrogen</td><td>25530-031</td><td>Trawienie białek</td></tr><tr><td>Proteus mirabilis ATCC 12453</td><td>Mikrobiologia</td><td>0440P</td><td>Przedmiot badania</td></tr><tr><td>Mały płaski pędzel</td><td>Lokalny sklep z narzędziami</td> <td>-</td> <td>manipulacja/obsługa próbek</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>241245</td><td>Enzymatyczny składnik buforowy</td></tr><tr><td>Akrylan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408220</td><td>Składnik roztworu monomeru</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Enzymatyczny składnik buforowy</td></tr><tr><td>Chlorek</td> <td>soduSigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Składnik roztworu monomeru, Składnik buforowy enzymu</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>Czyszczenie szkiełek</td></tr><tr><td>Linia laserowa na ciele stałym</td><td>Omicron</td><td>Niedostępne</td><td>Linia lasera wzbudzającego 488, 568 i 647 nm Barwienie</td></tr><tr><td>kwasami nukleinowymi SYTO 61</td><td>Invitrogen</td><td>S11343</td><td>Barwnik fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan chlorowodorek</td><td>SAFC</td><td>108219</td><td>Enzymatyczny składnik buforowy</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Permeabilizacja próbki, Enzymatyczny składnik buforowy</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przechwytywania Volocity 7.0.0</td> Oprogramowanie <td>kontrolera akwizycji</td><td>Quorum</td> <td>Technologies-Microscoy</td></tr> System <tr><td>wirujących dysków Volocity ViewVox</td><td>Perkin-Elmer</td><td>Niedostępne</td><td>System wirujących dysków do konfokalnych mikroskop</td></tr><tr><td>Aglutynina z kiełków pszenicy &ndash; Alexa Fluor 488 fluorescencyjny koniugat lektyny</td><td>Invitrogen</td><td>W11261</td><td>Barwnik fluorescencyjny</td></tr></tbody></table>

obrazowanie biofilmu proteus mirabilis w superrozdzielczości za pomocą mikroskopii ekspansyjnej

Super-resolution Imaging of Proteus mirabilis Biofilm by Expansion Microscopy

Dostęp do szczegółowych informacji wizualnych i danych ilościowych z próbek mikrobiologicznych przy użyciu konwencjonalnej mikroskopii optycznej jest ograniczony przez barierę dyfrakcyjną. Jednym z rozwiązań zwiększających rozdzielczość jest mikroskopia ekspansywna (ExM), innowacyjna i ekonomiczna technika superrozdzielczości, która fizycznie powiększa próbki o około czterokrotne ich pierwotne rozmiary. Dla pomyślnej ekspansji niezbędna jest homogenizacja właściwości mechanicznych materiału biologicznego. Biofilmy to społeczności bakteryjne, przylegające do powierzchni i osadzone w wytwarzanej przez nie macierzy zewnątrzkomórkowej; wymagają one dostosowania protokołów ExM do ich unikalnych elementów konstrukcyjnych. W artykule przedstawiono biofilm Proteus mirabilis ExM (PmbExM), wyspecjalizowany wariant ExM, który umożliwia superrozdzielczą wizualizację biofilmów P. mirabilis hodowanych przez 48 godzin. Protokół koncentruje się na ukierunkowanej degradacji kluczowych składników strukturalnych próbek poprzez seryjne trawienie enzymatyczne, zoptymalizowane w pobliżu ich warunków teoretycznych. PmbExM wykorzystuje kombinację enzymów, w tym α-amylazy, celulazy i hydrolazy glikozydów litykazy do hydrolizy polisacharydów; mutanolizyna do hydrolizy peptydoglikanu; i proteinazy K do hydrolizy białek. Te procedury trawienia są niezależne od procesu żelowania, co pozwala na modyfikacje w celu spełnienia określonych wymagań homogenizacji w różnych modelach biofilmu. Ta zdolność adaptacyjna oferuje ogromny potencjał do zastosowania w różnych gatunkach bakterii i warunkach wzrostu. ExM zastosowano do różnych gatunków biofilmu o ogólnie nieoptymalnych współczynnikach ekspansji. Natomiast PmbExM osiąga teoretyczny maksymalny współczynnik rozszerzalności standardowego hydrożelu akryloamidowo-akrylowego ExM, bez znacznego zniekształcenia morfologii lub topologii. Celem tej pracy jest zapewnienie dostępnego protokołu super-rozdzielczości do wizualizacji architektury, montażu oraz cech komórkowych i wewnątrzkomórkowych biofilmów P. mirabilis.

Metoda PmbExM zwiększyła rozmiar biofilmu P. mirabilis 4,3-krotnie, zachowując jego morfologię i topologię 
Rysunek 3A-D dowodzi fizycznego powiększenia komórek biofilmu P. mirabilis oraz zwiększenia rozdzielczości uzyskanej dzięki tej technice. Co więcej, zaobserwowano to nie tylko w cienkich obszarach biofilmu, gdzie komórki organizują się w układzie przypominającym monowarstwę, ale ta...

Ten artykuł przedstawia obszerny protokół dla PmbExM, techniki mikroskopii ekspansyjnej zaprojektowanej specjalnie dla biofilmów Proteus mirabilis. PmbExM wykorzystuje stopniową obróbkę enzymatyczną próbek biofilmu w celu uzyskania izotropowej, 4,3-krotnej ekspansji, umożliwiającej analizę w superrozdzielczości organizacji przestrzennej struktur komórkowych i subkomórkowych w tych siedzących zbiorowiskach drobnoustrojów.

Obrazowanie biofilmu Proteus mirabilis w superrozdzielczości za pomocą mikroskopii ekspansyjnej

Accessing detailed visual information and quantitative data from microbiological samples using conventional optical microscopy is limited by the ...

Zakres naszych badań polega na dostarczeniu społeczności naukowej dostępnej metody super rozdzielczości do badania architektury, składania i cech międzykomórkowych proteus mirabilis poza granicą oporności.Mikroskopia ilościowa biofilmów jest trudna ze względu na ograniczenia narzucone przez rozdzielczość optyczną. Mikroskopia ekspansji biofilmu Proteus mirabilis (PmbExM) przyczyni się do lepszego morfologicznego i topologicznego opisu i analizy tych złożonych zbiorowisk drobnoustrojów. Dwie główne zalety PmbExM polega na tym, że po pierwsze, umożliwia on wizualizację biofilmów Proteus mirabilis w super rozdzielczości przy użyciu konwencjonalnych mikroskopów o ograniczonej refrakcji, a po drugie, nie opiera się na skomplikowanych procedurach przetwarzania danych po akwizycji.Nasza metoda ułatwia badanie struktury i organizacji biofilmu w nanoskali badaczom nieposiadającym dostępu do specjalistycznego sprzętu o super rozdzielczości i posiadającym zaawansowane doświadczenie w cyfrowym przetwarzaniu lub analizie obrazów.PmbExM pozwoli na zbadanie architektury, składania, cech komórkowych i wewnątrzkomórkowych proteus mirabilis w nanoskali. Ponadto jego plastyczność wspomaga adaptację i kodyfikację dla innych gatunków biofilmu.[Narrator] Na początek dodaj 400 mikrolitrów jednomilimolowego estru N-hydroksysukcynimidylu kwasu metakrylowego lub MA-NHS w PBS do barwionych próbek biofilmu i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez godzinę z łagodnym mieszaniem. Po godzinie delikatnie umyj wybarwione próbki biofilmu trzykrotnie 300 mikrolitrami PBS w temperaturze pokojowej przez 10 minut każda. Usunąć PBS i dodać 300 mikrolitrów roztworu monomeru do próbek. Inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby skonstruować komory wstępne do żelowania, użyj szklanego szkiełka jako podstawy, a następnie wytnij, ułóż i przymocuj dwa kawałki złożonej taśmy dwustronnej na szkiełku, aby działały jako przekładki o długości 400 mikrometrów. Ułóż mokre komory, aby chronić próbki przed wysuszeniem podczas polimeryzacji. Teraz przygotuj świeżą objętość roztworu żelującego, mieszając roztwór monomeru, 10% tetrametyloetylenodiaminy, 0,5% 4-hydroksy-TEMPO i 10% nadsiarczanu amonu w stosunku 47 do 1 do 1 do 1. Natychmiast po przygotowaniu roztworu żelującego należy usunąć roztwór monomeru z próbek i zastąpić go 300 mikrolitrami roztworu żelującego. Inkubować próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. W międzyczasie usuń pozostałą osłonę ochronną z dwustronnych pasków taśmy umieszczonych na szkiełkach. Odpipetować 40 mikrolitrów roztworu żelującego między przekładkami. Po zakończeniu inkubacji próbki za pomocą pęsety podnieś każde szkiełko nakrywkowe zawierające biofilm i umieść je na 40-mikrolitrowej kropli roztworu żelującego na szkiełku. Ustawić szkiełko nakrywkowe w taki sposób, aby biofilm na swojej powierzchni stykał się z roztworem żelującym. Zakończ konstruowanie komory żelowania, delikatnie dociskając pęsetą szkiełko nakrywkowe zawierające biofilm, aby zapewnić przyczepność do przekładek taśmy. Umieść zmontowaną komorę żelowania w mokrej komorze, aby umożliwić polimeryzację, i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez mieszania przez dwie godziny. Po dwóch godzinach zdemontuj komory żelowe i użyj ostrza chirurgicznego, aby przyciąć nadmiar żelu wokół obszaru zainteresowania próbki biofilmu. Umieść szkiełka nakrywkowe przenoszące odcięte żele na nowej płytce 24-dołkowej stroną z żelem skierowaną do góry. Po enzymatycznym roztwarzaniu zżelowanych próbek roztworem proteinazy K, należy usunąć roztwór proteinazy i przenieść każdy żel na oddzielną 60-milimetrową szalkę Petriego w celu rozprężenia próbek. Napełnij każdą szalkę Petriego nadmiarem wody dejonizowanej, tak aby żel był całkowicie zanurzony, i inkubuj pod delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po zakończeniu piątej wymiany wody usuń wodę dejonizowaną pokrywającą żel. Użyj małej płaskiej szczoteczki, aby delikatnie wepchnąć próbkę na szklane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 na 50 milimetrów. Usuń nadmiar wody z żelu za pomocą bibuły. Ostrożnie umieść żel na szklanej powierzchni komory obrazowania, upewniając się, że między żelem a szkłem nie zostały uwięzione pęcherzyki powietrza. Na koniec dodaj wodę dejonizowaną do komory obrazowania, aż żel zostanie całkowicie zanurzony. Analizy ilościowe i przestrzenne wykorzystano do oceny wierności ekspansji i zachowania morfologicznego biofilmów proteus mirabilis po mikroskopii ekspansji biofilmu proteus mirabilis lub leczeniu PmbExM. Technika PmbExM rozszerzyła struktury biofilmu około 4,3-krotnie, zachowując zarówno morfologię komórkową, jak i organizację topologiczną. Ekspansja ta znacznie zwiększyła rozdzielczość wizualną komórek bakteryjnych, dzięki czemu poszczególne struktury komórkowe są ostrzejsze i bardziej zdefiniowane. Dzięki zwiększonej rozdzielczości projekt PmbExM umożliwił również wyraźną identyfikację wielowarstwowych układów bakteryjnych w biofilmie, które wcześniej nie były rozwiązane. Projekt PmbExM ułatwił również wizualizację wcześniej nierozwiązywalnych struktur subkomórkowych, w tym odrębnych wzorców organizacji DNA. Te wzorce organizacyjne zostały potwierdzone przez profile intensywności linii, które ujawniły wiele wyraźnych pików fluorescencji w rozszerzonych próbkach w porównaniu z pojedynczym pikiem obserwowanym w nierozszerzonych komórkach.

super-resolution-imaging-proteus-mirabilis-biofilm-expansion

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiamy prostą, półilościową metodę badania tworzenia się biofilmu in vitro. Metoda ta wykorzystuje stereomikroskop Zeiss stemi 2000-C (z dołączoną kamerą) do monitorowania czasu oraz wzorca tworzenia się biofilmu, ocenianego na podstawie rozwoju pomarszczonych kolonii.

Półilościowe podejście do oceny tworzenia biofilmu z wykorzystaniem rozwoju pomarszczonych kolonii

Opisujemy metodę obrazowania w super-rozdzielczości, aby zbadać strukturalną organizację bakteryjnego pierścienia FtsZ, niezbędnego aparatu do podziału komórek.  Metoda ta opiera się na analizach ilościowych obrazów z mikroskopii lokalizacji aktywowanej fotoaktywowaną (PALM) i może być stosowana do innych bakteryjnych białek cytoszkieletu.

Obrazowanie w superrozdzielczości maszynerii podziału bakteryjnego

Ten protokół opisuje nową metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii konfokalnej i elektronowej.

Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej

Białka receptora germinantu skupiają się w 'germinosomach' w wewnętrznej błonie zarodników Bacillus subtilis. Opisujemy protokół wykorzystujący mikroskopię super rozdzielczości i fluorescencyjne białka reporterowe do wizualizacji germinosomów. Protokół identyfikuje również wewnętrzne domeny błony zarodnikowej, które są preferencyjnie barwione barwnikiem błonowym FM4-64.

Wizualizacja germinosomów i błony wewnętrznej w zarodnikach Bacillus subtilis

Przedstawiona metoda umożliwia wizualizację znakowanych fluorescencyjnie białek komórkowych za pomocą mikroskopii ekspansywnej, co prowadzi do rozdzielczości 70 nm na konwencjonalnym mikroskopie.

Obrazowanie białek podocytarnych nefryny, aktyny i podocyny za pomocą mikroskopii ekspansyjnej

Ten artykuł zawiera prosty i przejrzysty protokół oznaczania efektorów wydzielanych przez Salmonellę za pomocą rozszerzenia kodu genetycznego (GCE) specyficznie dla miejsca i obrazowania subkomórkowej lokalizacji wydzielanych białek w komórkach HeLa za pomocą bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (dSTORM)...

Obrazowanie w superrozdzielczości białek wydzielanych przez bakterie za pomocą ekspansji kodu genetycznego

Tutaj przedstawiono protokół implementacji mikroskopii ekspansywnej we wczesnych zarodkach Drosophila w celu uzyskania obrazowania w superrozdzielczości przy użyciu konwencjonalnego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego.

Wykorzystanie mikroskopii ekspansywnej do fizycznego powiększenia całych zarodków Drosophila w celu obrazowania w superrozdzielczości

Prezentowana jest tutaj nowa wersja mikroskopii ekspansyjnej (ExM), Magnify, która jest zmodyfikowana do 11-krotnej ekspansji, zachowując szeroki wachlarz klas biomolekuł i jest kompatybilna z szerokim zakresem typów tkanek. Umożliwia badanie konfiguracji biomolekuł w nanoskali przy użyciu konwencjonalnych mikroskopów o ograniczonej dyfrakcji.

Uniwersalna retencja molekularna z 11-krotną mikroskopią ekspansywną

To badanie pokazuje szczegółowy protokół do przeprowadzenia mikroskopii ekspansji ultrastruktury w trzech etapach cyklu życia in vitro Trypanosoma cruzi, patogenu odpowiedzialnego za chorobę Chagasa. Uwzględniamy zoptymalizowaną technikę białek cytoszkieletu i znakowania pan-proteomu.

Mikroskopia ekspansji ultrastrukturalnej w trzech etapach cyklu życia Trypanosoma cruzi in vitro

Tutaj proponujemy prosty protokół łączący metaboliczną inżynierię oligosacharydów, chemię kliknięć i mikroskopię ekspansji, który umożliwia bioobrazowanie wewnątrzkomórkowych sjalowanych N-glikoprotein z lepszą rozdzielczością przy użyciu rutynowego sprzętu mikroskopowego.

Wizualizacja sialilacji wewnątrzkomórkowej za pomocą chemii kliknięć i mikroskopii ekspansyjnej

Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół łączący metody kriofiksacji i mikroskopii ekspansyjnej (Cryo-ExM), umożliwiający obrazowanie w wysokiej rozdzielczości z zachowaniem strukturalnym dostosowanym do różnych próbek biologicznych. Próbki biologiczne są zamrażane, osadzane w polimerze puchniącym, denaturowane, rozszerzane i znakowane immunosystemowo, co umożliwia obrazowanie o nadrozdzielczości za pomocą standardowych mikroskopów świetlnych.

Mikroskopia ekspansyjna: Obrazowanie fluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości za pomocą konwencjonalnego mikroskopu

Poznaj metodę PmbExM do superrozdzielczej analizy biofilmu Proteus mirabilis za pomocą mikroskopii ekspansyjnej. Technika umożliwia wizualizację struktur komórkowych i subkomórkowych z rozdzielczością nanometrową przy użyciu konwencjonalnych mikroskopów.

Obrazowanie biofilmu Proteus mirabilis w superrozdzielczości za pomocą mikroskopii ekspansyjnej

Przeglądaj więcej filmów