Name: Uproszczony, bezoznakowy, w czasie rzeczywistym 50% testu zakaźnego hodowli tkanek (TCID50) z impedancją do automatycznego ilościowania miana wirusowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Poznaj uproszczony test TCID50 z impedancją w czasie rzeczywistym do automatycznego ilościowania miana wirusowego. Ta metoda bezoznakowa umożliwia szybkie monitorowanie cytopatycznych efektów infekcji wirusowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Test TCID50 oparty na impedancji
UWAGA: Jak pokazuje Rysunek 1 , test TCID50 oparty na impedancji składa się z czterech etapów: dopuszczającego zasiewania komórek na płytce biosensorowej, przygotowania i szczepienia wirusa rozcieńczającego wirusa, pomiaru CPE w systemie oraz wreszcie analizy danych i obliczeń TCID50 z wykorzystaniem modułu Virology w oprogramowaniu systemu.
<ol>
	<li>Przygotowanie testu: ożywienie i podhodowanie komórek dopuszczających UWAGA: Ten etap należy wykonać tydzień przed badaniem. Aby zminimalizować zmienność między eksperymentami, zdecydowanie zaleca się przygotowanie banku komórek dopuszczających do tego samego przejścia do wykorzystania w teście. Nie używaj komórek starszych niż 15 kanałów po zakupie u operatora.<ol>
		<li>Rozmrażanie kriokonserwowanych komórek permisywnych<ol>
			<li>Podgrzej podłoże wzrostu komórek w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut. Na przykład Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), uzupełnione o 10% surowicę płodową bydła (FBS) i 1% penicylinę/streptomycynę, było stosowane do HEK293A hodowli.</li>
			<li>Rozmroź fiolkę z komórkami z banku komórek, krioprezerwowane do testów TCID50, delikatnie mieszając w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 1-2 minuty, aż pojawi się kilka kryształków lodu; Nie zanurzaj pokrywki. Przetrzyj fiolkę 70% etanolem i włóż ją do laminarnego okapu.</li>
			<li>Delikatnie przełóż komórki do nowej stożkowej rurki o pojemności 50 mL i dodaj 9 ml podgrzanego medium wzrostu do komórek.</li>
			<li>Wiruj zawiesinę ogniwową w stężeniu 300 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Usuń supernatant i ponownie zawiesij komórki w 15 mL podgrzanego medium wzrostowego. Przełóż je do nowej kolby T75.</li>
			<li>Hodować komórki do konfluencji 80%-90% w inkubatorze 37 °C z 5%CO2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Subhodowla komórek permisywnych.<ol>
			<li>Monitoruj komórki, aż osiągną łączność 80%-90%.</li>
			<li>Usuń medium zawierające surowicę z kolby i delikatnie opłuj monowarstwę komórki za pomocą soli fizjologicznej Dulbecco bez Mg i Ca, buforowanej fosforanem (DPBS).</li>
			<li>Trypsynizuj komórki, równomiernie rozprowadzając 2 mL roztworu 0,05% trypsyny/EDTA na kolbkę T75 i zostawiając kolbę w inkubatorze 37 °C na 1-3 minuty. UWAGA: Nie przesadzaj z trypsynizacją komórek, ponieważ może to być dla nich szkodliwe.</li>
			<li>Zatrzymaj trypsynizację, dodając 8 mL podłoża zawierającego surowicę, aby rozcieńczyć pierwotną objętość trypsyny co najmniej pięciokrotnie. Przelej 2,5 mL zawiesiny ogniwowej do nowej kolby T75, a następnie dodaj 8 mL pożywki hodowlanej. UWAGA: Unikaj używania świeżo rozmrożonych komórek dopuszczających do testu TCID50. Zamiast tego używaj komórek hodowanych przy łączności 80%-90%. Aby zmniejszyć zmienność międzyeksperymentalną, ożywione komórki powinny być utrzymywane maksymalnie przez dwa tygodnie po rozmrożaniu. Aby zapewnić wysoką żywotność i proliferację komórek podczas dwutygodniowej hodowli: (1) zmieniać podłoże wzrostu co najmniej dwa razy w tygodniu; (2) podhodowla komórek, gdy osiągają 80%-90% zbiegu się. Przy dłuższej konserwacji dłuższej niż dwa tygodnie wymagana jest walidacja.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Miażdżenie wirusa UWAGA: Ten krok należy wykonać w dniu 1.<ol>
		<li>Pomiar tła płyty biosensora<ol>
			<li>Ostrożnie przelej 50 μL podgrzanego medium do każdego dołku za pomocą pipety wielokanałowej, stosując technikę pipetowania odwrotnego, aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków i zapewnić stałą ilość dawkowania.</li>
			<li>Włóż tablicę do stacji tablicy; otwórz oprogramowanie systemu i wybierz moduł Virologia przed rozpoczęciem eksperymentu. Wprowadź odpowiednie notatki na zakładce Notatki Exp oraz wprowadź informacje o komórkach, w tym nazwę i numer komórki, w podzakładce Komórka zakładki Układ po wybraniu odpowiednich studni. Alternatywnie, informacje komórkowe można wprowadzać po seedingu. UWAGA: Przed dodaniem komórek do dołków płyty należy wykonać pomiar tła płyty. Odczyty tła dla wszystkich studni powinny wynosić od -0,063 do 0,063.</li>
			<li>Na zakładce Harmonogram kliknij przycisk Dodaj krok, aby dodać Krok 1, który jest przeznaczony do pomiaru tła tablicy. Następnie rozpocznij nagrywanie, klikając przycisk Start .</li>
			<li>Zdejmij płytkę ze stacji i włóż ją z powrotem do okapu do wysiewu komórek.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dozwolne zasiewanie komórek na 96-dołkownicą płytę biosensorową<ol>
			<li>Trypsynizuj komórki dopuszczające z kolby T75.</li>
			<li>Policz komórki i dostosuj zawiesinę komórkową do pożądanego stężenia. W tym badaniu stężenie HEK293A wyniosło 60 000 komórek/mL.</li>
			<li>Do każdej studni płyty dodaj 100 μL zawiesiny komórkowej. UWAGA: Odpowiednia gęstość komórek jest niezbędna. Nieoptymalna gęstość zasiewów może skutkować eksperymentalnym artefaktem. Dlatego przed przeprowadzeniem testu TCID50 należy zoptymalizować gęstość siewnictwa.</li>
			<li>Zostaw płytkę w okapie w temperaturze pokojowej przez 30 minut po dodaniu komórek, pozwalając komórkom rozłożyć się równomiernie na dnie dołku. UWAGA: Brak wykonania tego kroku może skutkować dużymi różnicami między studnią.</li>
			<li>Włóż talerz do stacji talerzowej w inkubatorze 37 °C z 5%CO2.</li>
			<li>Przejdź do zakładki Harmonogram w oprogramowaniu i dodaj Krok 2 , używając domyślnych ustawień nagrywania: 100 przebiegów i 15-minutowy interwał. To zainicjuje monitorowanie impedancji/CI co 15 minut, umożliwiając ocenę przywiązania i proliferacji komórek w czasie rzeczywistym jako krok kontroli jakości komórek (QC) przed szczepieniem na wirusa. UWAGA: Dzień 2 – Aby zmaksymalizować powtarzalność i spójność testów w różnych eksperymentach, kluczowe jest ocenenie funkcjonowania komórek w systemie przed przejściem do kolejnego kroku. Ponieważ CI odzwierciedla przywiązanie i wzrost komórek, wartości CI w okresie 20-28 godzin po zasiewaniu stanowią kluczowy parametr kontroli jakości. Zarówno wartość, jak i kinetyka CI są specyficzne dla komórki. W tym badaniu dla HEK293A komórek zasianych po 6 000 komórek na dołek i hodowanych przez 20-28 godzin, CI powinno przekraczać 2. Jeśli CI nie osiągnie 2 w ciągu 20-28 godzin po zasiewaniu, hodowla komórek HEK293A uznawana jest za niedostateczną kontrolę jakości (QC) i kolejny test TCID50 nie zostanie przeprowadzony. To kryterium zapewnia wysoką powtarzalność wyników eksperymentalnych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotowanie seryjnego rozcieńczenia wirusa<ol>
			<li>Oblicz całkowitą objętość podłoża (DMEM + 2% FBS + 1% penicylina/streptomycyna) potrzebnego do przygotowania rozcieńczeń i podgrzej go w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut. Medium zostanie użyte do reszty eksperymentu.</li>
			<li>Szybko rozmroz fiolkę z alikwotowanym zapasem wirusa w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 1-2 minuty, aż wszystkie kryształki lodu stopią się.</li>
			<li>Przygotuj wirusy rozcieńczone seryjnie 10 razy, przelewając 20 μL zapasu wirusa do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL zawierającej 180 μL podgrzanego medium na każdym etapie. Pipetować w górę i w dół, aby zapewnić dokładne wymieszanie podłoża i wirusa. UWAGA: Nie zanurzaj końcówki pipety zbyt głęboko w roztworze wirusowym, aby zapobiec przenoszeniu nadmiaru resztek wirusowych poza końcówkę, co mogłoby skutkować nieprawidłowymi rozcieńczeniami.</li>
			<li>Aby zapobiec wahaniom odczytów impedancji spowodowanym dodaniem próbek przeziębienia, wyrównaj rozcieńczenia wirusa, inkubując je w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5%CO2 przez 20 minut przed szczepieniem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wprowadź informacje o leczeniu wirusów na zakładce Layout <ol>
			<li>Na zakładce Layout na tablicy w oprogramowaniu; Wybieranie dołków do leczenia miarkami wirusowymi; kliknij podzakładkę Treatment i wpisz początkową rozcieńczenie, na przykład 0,001 (10-3) w tym eksperymencie; wpisz 10 jako "Czynnik Rozcieńczenia"; wybierz kierunek rozcieńczania, w tym przypadku od lewej do prawej. Rozcieńczenie wirusa będzie automatycznie obliczane na podstawie układu płyty wejściowej i wyświetlane w każdej odpowiadającej jej studni.</li>
			<li>Następnie wpisz objętość szczepienia wirusa i kliknij przycisk Aplikuj , aby zapisać wszystkie informacje o leczeniu. Ten krok jest niezbędny do dokładnego obliczenia TCID50/mL podczas analizy danych.</li>
			<li>Przypisz doły, które nie będą leczone wirusami, jako negatywne kontrole, wybierając odpowiednie dołki, a następnie sprawdzając Negatywny Ctrl w zakładce Typ studni w zakładce Leczenie . UWAGA: Studnie kontroli ujemnej muszą być oznaczone i dodane do strony Układu; pominięcie uniemożliwi obliczenia TCID50.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Szczepienie wirusa<ol>
			<li>Gdy będziesz gotowy, naciśnij przycisk Pauza w programie, aby zatrzymać pobieranie danych. Zdejmij płytkę ze stacji i umieść ją w laminarnym mascie.</li>
			<li>Ostrożnie usuń medium hodowlane z dołków płyty za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
			<li>Delikatnie dodaj 50 μL rozcieńczenia wirusa za pomocą pipety wielokanałowej na górę monowarstwy komórki, unikając zakłóceń hodowli komórkowej.</li>
			<li>Włóż płytę z powrotem do Stacji i dodaj Krok 3 , używając domyślnych ustawień nagrywania (100 przesunięcia i 15-minutowy interwał) na zakładce Harmonogram , aby wznowić impedancję nagrywania co 15 minut przez 2 godziny, pozwalając wirusowi przywiązać się do komórek.</li>
			<li>Po 2 godzinach szczepienia przeciwwirusa wstrzymaj nagrywanie i usuń płytkę ze stacji na laminarny maskę.</li>
			<li>Powoli dodawaj 150 μL podgrzanego medium do dołków za pomocą pipety wielokanałowej, unikając zakłóceń monowarstwy komórki; zwróć płytę na Stację.</li>
			<li>Konsumuj Krok 3 , klikając Start na zakładce Harmonogram . Sygnały impedancji są mierzone nieprzerwanie co 15 minut przez cały okres szczepienia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Obliczenie TCID50 w trakcie lub po zakończeniu testu TCID50<ol>
			<li>Na zakładce Analiza danych wybierz i dodaj wszystkie studnie użyte w testie do wykresu wykresowego. Oś y wykresu jest określana przez opcję wybraną z rozwijanego menu osi Y .</li>
			<li>Przejdź do sekcji Parametry . Wybierz TCID50 z listy rozwijanej Parametrów, aby rozpocząć obliczenia TCID50.</li>
			<li>Wybierz wykres słupkowy do obliczeń TCID50 w określonym punkcie czasowym lub wybierz Zależny od czasu TCID50 , aby wygenerować przebieg TCID50 w pożądanym okresie podczas szczepienia. TCID50/mL zostanie obliczony i wyświetlony po kliknięciu przycisku wykonania.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test Crystal Violet-TCID50
<ol>
	<li>Osiew komórki permisywne na mikropłycie z 96 dołkami przy optymalnej gęstości zasiewniczej, opisanej w teście TCID50 opartym na impedancji (kroki 1-2).</li>
	<li>Wykonaj przygotowanie i inokulację seryjnego rozcieńczania wirusa zgodnie z definicją testu TCID50 opartego na impedancji.</li>
	<li>Utrwalanie i barwienie<ol>
		<li>Po zakończeniu badania delikatnie usuń supernatant z każdego dołka i dodaj 100 μL 4% formdehydu w celu utrwalenia komórek.</li>
		<li>Inkubuj w 4 °C przez 1 godzinę, a następnie usuń utrwalacz.</li>
		<li>Usztywnione komórki pofarbuj 0,5% Crystal Violet przygotowanym w PBS. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
		<li>Myj talerz wodą z kranu, aż tło się oczyści. Pozwól talerzowi całkowicie wyschnąć na powietrzu przed nacięciem. UWAGA: Odpady kryształowego fioletu są uznawane za niebezpieczne zarówno według RCRA, jak i Kalifornijskiego Kodeksu Regulacyjnego (CCR 66261.24). Zbieraj wszystkie zużyte roztwory fioletowe, zanieczyszczone materiały (np. ręczniki papierowe, rękawiczki) i płucz odpady w wyznaczonym pojemniku na odpady niebezpieczne. Utylizuj odpady za pośrednictwem Organizacji ds. Zdrowia Środowiskowego i Bezpieczeństwa (EH&S) lub licencjonowanego wykonawcy utylizacji odpadów niebezpiecznych w Twojej instytucji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Punktacja i obliczenia TCID50<ol>
		<li>Sprawdź wizualnie każdy odwiert pod kątem CPE. Pozytywny odcinek pokazuje częściowe lub całkowite zniszczenie monowarstwy oraz jaśniejsze przebarwienie. Studnia negatywna zachowuje nienaruszoną monowarstwę z ciemnofioletowym barwieniem.</li>
		<li>Policz liczbę studni dodatniej i ujemnej dla każdego rozcieńczenia.</li>
		<li>Ręcznie oblicz TCID50/mL metodą Reed-Muench, na podstawie objętości inokulacji 150 μL.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Smither, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+plaque+assay+and+50%25+tissue+culture+infectious+dose+assay+as+methods+for+measuring+filovirus+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of the plaque assay and 50% tissue culture infectious dose assay as methods for measuring filovirus infectivity.</a> J Virol Methods. 193 (2), 565-571 (2013).</li>
<li>Pourianfar, H. R., Javadi, A., Grollo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric-based+accurate+method+for+the+determination+of+enterovirus+71+titer%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Virol%22%5BJournal%5D)">A colorimetric-based accurate method for the determination of enterovirus 71 titer.</a> Indian J Virol. 23 (3), 303-310 (2012).</li>
<li>Hochdorfer, D., Businger, R., Hotter, D., Seifried, C., Solzin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+label-free+TCID50+assay+to+determine+the+infectious+titer+of+virus-based+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated, label-free TCID50 assay to determine the infectious titer of virus-based therapeutics.</a> J Virol Methods. 299, 114318(2022).</li>
<li>Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Calculation+of+TCID50+for+quantitation+of+virus+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+Sin%22%5BJournal%5D)">On the Calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity.</a> Virol Sin. 36 (1), 141-144 (2021).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromotion+of+mammalian+cells+measured+electrically%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Micromotion of mammalian cells measured electrically.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (17), 7896-7900 (1991).</li>
<li>Atienza, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+label-free+cell-based+assays+using+the+real-time+cell+electronic+sensing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Dynamic and label-free cell-based assays using the real-time cell electronic sensing system.</a> Assay Drug Dev Technol. 4 (5), 597-607 (2006).</li>
<li>Cheung, C. Y., Leung, C. K., Peiris, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+the+real-time+and+label-free+cell+sensor+impedance+technology+to+transform+cell-based+infectivity+assays+for+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+Other+Respir+Viruses%22%5BJournal%5D)">Potential of the real-time and label-free cell sensor impedance technology to transform cell-based infectivity assays for influenza viruses.</a> Influenza Other Respir Viruses. 5 (Suppl 1), 151-154 (2011).</li>
<li>Ebersohn, K., Coetzee, P., Venter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+determining+virucidal+efficacy+of+a+chemical+disinfectant+using+an+electrical+impedance+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method for determining virucidal efficacy of a chemical disinfectant using an electrical impedance assay.</a> J Virol Methods. 199, 25-28 (2014).</li>
<li>Goh, V. S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+three+alternative+methods+to+the+plaque+reduction+neutralizing+assay+for+measuring+neutralizing+antibodies+to+dengue+virus+serotype+2%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+J%22%5BJournal%5D)">Evaluation of three alternative methods to the plaque reduction neutralizing assay for measuring neutralizing antibodies to dengue virus serotype 2.</a> Virology J. 21 (1), (2024).</li>
<li>Crisostomo, L., Soriano, A. M., Mendez, M., Graves, D., Pelka, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+dynamics+of+adenovirus+5+gene+expression+in+normal+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Temporal dynamics of adenovirus 5 gene expression in normal human cells.</a> PLOS One. 14 (1), e0211192(2019).</li>
<li>Wang, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+cytopathic+effects+%28CPE%29+induced+by+influenza+virus+infection+using+deep+convolutional+neural+networks+%28CNN%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of cytopathic effects (CPE) induced by influenza virus infection using deep convolutional neural networks (CNN).</a> PLoS Comput Biol. 16 (5), e1007883(2020).</li>
<li>Witkowski, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+impedance+measurement+as+a+new+tool+for+poxvirus+titration%2C+antibody+neutralization+testing+and+evaluation+of+antiviral+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances.</a> Biochem Biophys Res Commun. 401 (1), 37-41 (2010).</li>
<li>Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+flavivirus+induced+cytopathogenesis+using+cell+electric+impedance+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology.</a> J Virol Methods. 173 (2), 251-258 (2011).</li>
<li>Marlina, S., Shu, M. -H., Abubakar, S., Zandi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+real-time+cell+analysing+%28RTCA%29+method+as+a+fast+and+accurate+screen+for+the+selection+of+chikungunya+virus+replication+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Development of a real-time cell analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors.</a> Parasites & Vectors. 8 (1), (2015).</li>
<li>Charretier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+real-time+cell+analysis+method+for+determining+viral+infectious+titers+during+development+of+a+viral+vaccine+production+process%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process.</a> J Virol Methods. 252, 57-64 (2018).</li>
<li>Lebourgeois, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+real-time+cell+analysis+%28RTCA%29+method+as+a+fast+and+accurate+method+for+detecting+infectious+particles+of+the+adapted+strain+of+Hepatitis+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a real-time cell analysis (RTCA) method as a fast and accurate method for detecting infectious particles of the adapted strain of Hepatitis A virus.</a> Front Cell Infect Microbiol. 8, (2018).</li>
<li>Suryadevara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+cell+analysis%3A+A+high-throughput+approach+for+testing+SARS-CoV-2+antibody+neutralization+and+escape%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Real-time cell analysis: A high-throughput approach for testing SARS-CoV-2 antibody neutralization and escape.</a> STAR Protoc. 3 (2), 101387(2022).</li>
</ol>

W tym badaniu wykazano zastosowanie impedancji do wyznaczania miarza wirusa za pomocą modeli adenowirusa-HEK293A oraz wirusa grypy A-MDCK. Inni potwierdzili także solidne i wiarygodne wykrywanie CPE indukowanego wirusem za pomocą systemów RTCA w szerokim zakresie wirusów, w tym ortopoxwirusie12, wirusie zachodniego Nilu (WNV) i zapaleniu mózgu St. Louis (SLEV)13, wirusie chikungunya14, wirusie zakaźnego bursalu8, chimerycznej żółtej febry dengi15, wirusie zapalenia wątroby typuA 16, SARS-CoV-217 oraz wirusie dengi9.
Rejestracja CPE w czasie rzeczywistym poprzez impedancję umożliwia wykrywanie specyficznych dla wirusa spadków wartości CI zależnych od czasu w niektórych modelach komórek dopuszczających wirusa. Fang i in. jako pierwsi wykazali, że parametr kinetyczny charakteryzujący CPE indukowany przez flawiwirusa, CIT50 — definiowany jako czas do 50% spadku impedancji komórkowej — jest odwrotnie proporcjonalny do dawki zakaźnej wirusa w określonym zakresie. Wykazano również, że CIT50 jest proporcjonalny do odwrotności miana przeciwciał neutralizujących13. Od tego czasu Charretier i in. z Sanofi Pasteur badali metodę analizy komórek w czasie rzeczywistym opartą na impedancji (RTCA) do określania miarów zakaźnych wirusa podczas opracowywania szczepionki i procesu15 przeciwko chimerycznej żółtej febrze i dengze (CYD). Charretier i in.15 dodatkowo potwierdzili tę impedancyjną dawkę zakaźną 50% (CCID50) za pomocą testu CCID50 opartego na barwieniu immunobarwnym. Wykazano, że metoda RTCA oparta na impedancji jest około 5 razy mniej pracochłonna i 3,5 razy bardziej opłacalna niż standardowy test CCID50 w warunkach przemysłowych. W naszym badaniu udowodniono walidację TCID50 opartej na impedancji względem tradycyjnego testu Crystal Violet TCID50 dla CPE indukowanego przez IAV. Ponadto wykorzystano moduł oprogramowania Virology w oprogramowaniu RTCA. Studnie CPE-dodatnie były automatycznie identyfikowane na podstawie kryteriów zdefiniowanych przez użytkownika dla studni CPE-dodatnich w oprogramowaniu; w naszym przypadku stopień CI spada w porównaniu do kontrol ujemnych. TCID50 był następnie obliczany przez oprogramowanie odpowiednio, co umożliwiło dokładne określenie miana bez polegania na CIT50 i ryzyka, że próbka wypadnie poza optymalny zakres. Ustalenie odpowiedniego progu dla dołków CPE-dodatnich jest kluczowe, ponieważ bezpośrednio wpływa na czułość i swoistość testu. Zaleca się, aby użytkownicy określali kryteria specyficzne dla wirusa, porównując zmiany indeksu komórkowego z wynikami zwalidowanej metody konwencjonalnej. Te empirycznie wyprowadzone progi można następnie konfigurować i udoskonalać w module Virologia oprogramowania.
Podobnie jak w innych testach komórkowych, stan komórek permisywnych stosowanych w testach TCID50 opartych na impedancji jest kluczowy dla oceny sukcesu testu i jakości wyników. Aby zapewnić wysoką proliferację i żywotność komórek, zaleca się świeże, niskoprzepuszczalne komórki. Dodatkowo, utworzenie banku komórek permisywnych w tym samym przejściu może poprawić powtarzalność w różnych eksperymentach. Jak wskazano na Rysunku 3A, gdy komórki permisywne znajdowały się w optymalnych warunkach, generowały stabilne i spójne sygnały impedancji w niezainfekowanych kontrolach przez cały okres testu. Stanowiła wiarygodną bazową referencję do ustalenia progu dla dołków CPE, co skutkowało precyzyjnym określeniem miaru wirusowego. Ponadto test TCID50 oparty na impedancji jest wyjątkowo zdolny do przeprowadzania kontroli jakości komórek permisywnych przed oceną miarza wirusa. Charakterystyczny kinetyczny profil CI zdrowych komórek permisywnych służy jako wiarygodny wskaźnik kontroli jakości, zapewniając, że do ilościowego określenia wirusa wykorzystywane są wyłącznie żywotne i spójne populacje komórek, co zwiększa powtarzalność i dokładność testu.
Dla każdego nowego wirusa przed wdrożeniem należy również przeprowadzić optymalizację i walidację testu impedancyjnego TCID50. Kluczowe czynniki, takie jak warunki hodowli komórkowej, w tym ośrodek podstawowy i stężenie FBS, są kluczowe dla uzyskania powtarzalnych danych impedancji komórkowej oraz zwiększenia czułości detekcji CPE, co podkreśliły wcześniejsze badania 6,16. W tym kontekście technologia oparta na impedancji bez etykiet i impedancji w czasie rzeczywistym okazała się prostym, wydajnym i cennym narzędziem do optymalizacji warunków hodowli komórkowych podczas opracowywania testu16.
Ograniczeniem testu impedancji-TCID50 są wirusy, które nie powodują CPE, ponieważ test opiera się na CPE do generowania zmian w odczytzie impedancji, co stanowi podstawę obliczeń TCID50. W takich przypadkach może być konieczne zidentyfikowanie alternatywnego modelu komórek permisywnych, który może wykazywać CPE indukowane wirusem, lub zastosowanie metody immunodostainingu, pod warunkiem posiadania odpowiedniego przeciwciała przeciwko danemu antygenowi wirusowemu. Niemniej jednak badanie wykazało zdolność systemu RTCA MP do wychwytywania zależnego od dawki CPE i skutecznego rozróżniania populacji komórek zakażonych od niezakażonych za pomocą obiektywnego i czułego odczytu impedancji.
Wprowadzenie analizy zależnej od czasu TCID50 stanowi istotny postęp w porównaniu z tradycyjnymi pomiarami punktów końcowych. Upraszcza proces optymalizacji testu TCID50, ponieważ optymalny punkt czasu na obliczenie i raportowanie miana wirusowego można łatwo uzyskać z jednego testu w czasie rzeczywistym. Chociaż testy TCID50 oparte na obrazowaniu i bez etykiet mogą również dostarczać wartości TCID50 o rozdzielczości czasowej, ich zastosowanie ogranicza się do modeli komórek wirusowych, które wykazują CPE rozpoznawalne przez algorytmy oprogramowania obrazowania, co pokazano w modelu IAV-MDCK (Rysunek 6A). Ponadto stosowanie impedancji bez etykiet do wykrywania CPE eliminuje komplikacje związane z używaniem różnych odczynników i wieloetapowych przepływów pracy, które mogą zwiększać ryzyko błędów ludzkich. Oprócz uproszczenia przepływu pracy, moduł Virologia w oprogramowaniu systemu usprawnia również proces testowania. Najpierw zaczyna się od łatwego harmonogramu eksperymentów do automatycznego nagrywania sterowanego przez system. Po każdym pomiarze następuje spontaniczne, spontaniczne wyróżnianie CPE-dodatnie, a kończy się automatycznym obliczeniem TCID50 dla prostego ilościowego określenia cząstek wirusa zakaźnego (Rysunek 7). Ta automatyzacja znacznie skraca czas pracy praktycznej, co jest kluczowym usprawnieniem, zwłaszcza przy obsłudze wysoce zakaźnych wirusów.

W miarę szybkiego rozwoju badań wirusologicznych, dokładne określenie zakaźności wirusa pozostaje kluczowe dla zrozumienia mechanizmów wirusowych, opracowywania terapii przeciwwirusowych oraz oceny skuteczności szczepionek. Jednym z najważniejszych zabiegów jest pomiar miana wirusowego, czyli stężenia cząstek wirusowych w próbce. Test TCID50, który określa liczbę cząstek wirusa zakaźnego potrzebnego do produkcji CPE w 50% zaszczepionych komórek, jest jedną z najczęściej stosowanych metod określania funkcjonalnego miara wirusa. Ten szeroko stosowany test końcowy jest szczególnie cenny dla wirusów, które nie tworzą blaszek i może stanowić alternatywę dla testu płytkowego1.
Ogólnie test TCID50 trwa od 2 do 14 dni, w zależności od wirusa i komórek dopuszczających. CPE, w tym zmiany w proliferacji komórek, morfologii i żywotności, ocenia się za pomocą (1) pomiaru kolorymetrycznego po dodaniu odczynników, takich jak test MTT (3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5-difenylotetrazolium) oraz MTS (3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-5-(3-karboksymetoksyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium), przy użyciu czytnika płytek2, lub (2) wizualną ocenę morfologicznych lub związanych z hodowlą zmian za pomocą platform obrazowania optycznego – na przykład ocenę CPE poprzez pomiar procentu konfluencji3, lub (3) wizualne wykrywanie CPE przez barwienie fioletowe kryształów po utrwaleniu dołków objętych wirusem formaliną lub paraformaldehydem (PFA). Dodatnia częstotliwość infekcji wirusowych, uzyskana na podstawie liczby replik pozytywnych CPE przy każdym rozcieńczeniu wirusa, stanowi podstawę obliczeń TCID50. Rozcieńczenie, przy którym 50% hodowli wykazuje CPE, jest statystycznie obliczane przy użyciu ustalonych wzorów4, takich jak Reed-Muench, Spearman-Karber i Improved-Karber, a wynik podaje się jako TCID50 na mililitr (TCID50/mL).
Tradycyjne testy TCID50 i płytki nazębnej są powszechnie uznawane za złoty standard funkcjonalnej ilościowej ilościowej analizy i mogą dostarczyć nieocenionych informacji. Jednak te testy są często żmudne, czasochłonne i wymagają ręcznego barwienia do wizualizacji CPE, co skutkuje niską przepustowością, zwiększonym ryzykiem błędów ludzkich oraz subiektywnością. W przypadku wysoce zakaźnych lub śmiertelnych wirusów minimalizacja czasu narażenia na nie oraz redukcja odpadów zawierających wirusy w dodatkowych etapach, takich jak barwienie, są ważnymi czynnikami poprawiającymi bezpieczeństwo biologiczne. Z wyjątkiem testu TCID50 opartego na obrazowaniu bez oznakowania, większość testów TCID50 i blaszki nazębnej to również testy końcowe, co może skutkować nieoptymalnym czasem oceny miana i ograniczać możliwość obserwacji dynamicznych interakcji między wirusami a komórkami gospodarza. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano i wprowadzono uproszczeniony, wolny od oznakowania i działający w czasie rzeczywistym test TCID50. Chociaż koncepcyjnie podobny do konwencjonalnego testu TCID50, nowa metoda wykorzystuje odczyty impedancji komórkowej, rejestrowane i analizowane przez system RTCA MP, aby obiektywnie i nieprzerwanie monitorować infekcje w czasie.
Udowodniono i zweryfikowano, że biosensoryzacja oparta na impedancji zapewnia jakościowy i ilościowy odczyt złożonego z liczby komórek, morfologii oraz siły przyczepności do substratu komórkowegow sposób wolny od oznakowania, nieinwazyjny 5,6. Wcześniejsze badania wykazały, że CPE indukowane wirusem można dokładnie zmierzyć w czasie rzeczywistym za pomocą pomiarów impedancji RTCA 7,8,9. Zamiast raportować surowe wartości impedancji, systemy używają parametru bezjednostkowego zwanego Indeksem Komórki (CI), który odzwierciedla zmiany impedancji spowodowane zdarzeniami komórkowymi. Na przykład, gdy komórki przylegają do dna, rozprzestrzeniają się i rosną na dnie studni, CI wzrasta. Natomiast gdy komórki obumierają, kurczą się lub odłączają się, na przykład podczas infekcji wirusowej, CI maleje.
Biorąc pod uwagę obiecujące raporty wykorzystujące impedancję do pomiaru CPE, celem tego badania było wykazanie, że test TCID50 oparty na impedancji jest wiarygodną i dokładną alternatywą dla konwencjonalnej ilościowej analizy wirusa. Moduł Virology w oprogramowaniu systemu umożliwia automatyczne obliczanie TCID50 przez cały pomiar CPE w czasie rzeczywistym, usprawniając i skracając proces testowania, jednocześnie dostarczając cennych informacji na temat kinetyki replikacji wirusów i ich interakcji z komórkami permisywnymi.

<table><tbody><tr><td>0,05% trypsyna 0,53 mM EDTA&nbsp; (1x)</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>12 zbiorników odczynników kanałowych</td><td>VistaLab Technologies</td><td>3054-1011</td><td></td></tr><tr><td>Adenowirus-GFP</td><td>Vector Biolabs&nbsp;</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>Medium DMEM</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Tablica E-Plate VIEW 96</td><td>Agilent</td><td>300601020</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydła płodowa</td><td>Avantor</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>Komórka Hek293A</td><td>Thermo Fisher Scientific &nbsp;</td><td>&nbsp; R70507</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny i streptomycyny</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowa sól fizjologiczna (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza plakowa</td><td>Lonza</td><td>50101</td><td></td></tr><tr><td>system xCELLigence RTCA eSight</td><td>Agilent</td><td>S2833AA</td><td></td></tr><tr><td>System xCELLigence RTCA MP</td><td>Agilent</td><td>380601040</td><td></td></tr></tbody></table>

uproszczony, bezoznakowy, w czasie rzeczywistym 50% testu zakaźnego hodowli tkanek (tcid50) z impedancją do automatycznego ilościowania miana wirusowego

A Streamlined, Label-Free Real-Time 50% Tissue Culture Infectious Dose (TCID50) Assay using Impedance for Automated Viral Titer Quantification

Pomiar miana wirusowego, czyli stężenia wirusa w próbce, jest podstawową procedurą w badaniach wirusologicznych. Choć są niezbędne, tradycyjne metody, takie jak test płytki nazębnej czy test TCID50, mogą być czasochłonne, wymagają barwienia lub oznakowania odczynników i często wymagają subiektywnej interpretacji, zwłaszcza gdy efekty cytopatyczne (CPE) są subtelne lub trudne do zmierzenia za pomocą obrazowania. Na przykład testy TCID50 mogą wykorzystywać barwniki żywotności, takie jak MTT czy MTS, podczas gdy testy na płytkach nazębnych opierają się na obrazowaniu i barwieniu do wizualizacji blaszek wirusowych, co może wprowadzać zmienność. Co więcej, te tradycyjne metody oferują jedynie statyczny obraz zakaźności wirusów, ograniczając zdolność do wychwycenia dynamicznych interakcji między wirusami a komórkami permisywnymi. Aby przezwyciężyć obecne ograniczenia w pomiarze miaru wirusa, opracowano uprościony test TCID50 wykorzystujący technologię opartą na impedancji, który obiektywnie, nieinwazyjnie i w czasie rzeczywistym mierzy CPE, eliminując potrzebę etykietowania. W tym badaniu do weryfikacji testu impedancji-TCID50 użyto dwóch modeli komórek dopuszczających do wirusa: adenowirusa znakowanego przez GFP (Adv-GFP) w komórkach HEK293A oraz wirusa grypy A (IAV) w komórkach MDCK. Proces pracy jest prosty i obejmuje siewowanie komórek, szczepienie przeciwwirusów, monitorowanie w czasie rzeczywistym oraz automatyczną analizę TCID50 przez oprogramowanie. Przez cały okres infekcji wartości TCID50 były automatycznie obliczane przez oprogramowanie systemu przy użyciu wzoru Reed-Muench we wszystkich zarejestrowanych punktach czasowych. Wartości TCID50 IAV uzyskane za pomocą odczytów impedancji były porównywalne z tymi uzyskanymi przez konwencjonalny test TCID50 oparty na barwieniu kryształowym fioletem. Wyniki te pokazują, że ilościowość wirusa można precyzyjnie i efektywnie osiągnąć za pomocą pomiaru impedancji w połączeniu z modułem wirusologii oprogramowania systemu. Nowy test usprawnia tradycyjne metody, jednocześnie dostarczając lepszego wglądu w dynamikę wirusa, wspierając tym samym zaawansowane badania wirusologiczne i rozszerzając potencjalne zastosowania kliniczne.

Opisany tutaj test TCID50 wykorzystuje bezoznakowe pomiary impedancji w czasie rzeczywistym oraz moduł Virology systemu, aby obiektywnie monitorować efekty cytopatyczne (CPE) wywołane wirusem w czasie rzeczywistym. Ten uprościony test znacznie skraca czas pracy praktycznej, jednocześnie wspierając wysokoprzepustowe, ilościowe pomiary kinetyczne CPE oraz umożliwiając zautomatyzowane, w czasie rzeczywistym obliczenia TCID50.

Uproszczony, bezoznakowy, w czasie rzeczywistym 50% testu zakaźnego hodowli tkanek (TCID50) z impedancją do automatycznego ilościowania miana wirusowego

Measuring the viral titer, the concentration of a virus in a sample, is a fundamental procedure in virology research. While essential, traditional methods ...

Celem naszych badań było opracowanie metody przyspieszającej proces kwantyfikacji wirusa, skracając czas pracy praktycznej oraz umożliwiając wysokoprzepustowe śledzenie efektów cytopatycznych w czasie rzeczywistym. Nasz protokół rozwiązuje brak prostej, szybkiej, bezpiecznej i wysoce spójnej metody w porównaniu z konwencjonalnymi testami miarek drutych. Aby rozpocząć pomiar impedancji tła płyty biosensora, użyj pipety wielokanałowej, aby ostrożnie przenieść 50 mikrolitrów podgrzanego medium do każdego dołka płyty.Stosuj technikę pipetowania odwrotnego, aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków i zapewnić stałą ilość oddawania pęcherzyków. Włóż płytkę do stacji płytowej, następnie uruchom oprogramowanie systemowe i wybierz moduł wirusologiczny. Wprowadź odpowiednie notatki w zakładce notatek eksperymentalnych i wprowadź informacje o komórce, w tym nazwę i numer komórki, w podzakładce komórki zakładki układu po wybraniu odpowiednich studni.Następnie na zakładce harmonogramu kliknij dodaj krok, aby utworzyć pierwszy etap przeznaczony do pomiaru tła płyt. Następnie kliknij start, aby rozpocząć nagrywanie. Zdejmij płytkę ze stanowiska talerza i umieść ją w laminarnym okapie do siewu komórek.Dodaj dwa mililitry trypsyny, aby odłączyć komórki permisywne od kolby T-75. Po zliczeniu komórek dostosuj zawiesinę komórek do pożądanego stężenia. Pipeta 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej jamki płytki biosensora.Po 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej przenieś płytkę do stacji płytowej wewnątrz inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Przejdź do zakładki harmonogram i dodaj krok drugi, używając domyślnych ustawień nagrywania 100 przebiegów i 15-minutowego interwału. Aby przygotować rozcieńczenie seryjne wirusa, oblicz całkowitą objętość medium potrzebnego do rozcieńczenia.Podgrzej podłoże w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Szybko rozmroź fiolkę z wirusem aliquot w kąpieli wodnej na jedną do dwóch minut, aż wszystkie kryształy lodu stopią się. Przygotuj dziesięciokrotnie seryjne rozcieńczenie wirusa, przelewając 20 mikrolitrów zapasów wirusa do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra, zawierającej 180 mikrolitrów podgrzanego medium na każdym etapie.Rozmieszaj pipetą w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać wirusa z podłożem. Aby wyrównać rozcieńczenia wirusa, inkubuj rozcieńczone próbki wirusa w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla przez 20 minut przed szczepieniem się. Następnie na zakładce "układ" oprogramowania wybierz dołki przeznaczone do leczenia miarek wirusowych.Wprowadź początkową wartość rozcieńczenia 0,001. Wpisz 10 to współczynnik rozcieńczenia i wybierz kierunek rozcieńczenia od lewej do prawej. Następnie wprowadź objętość szczepienia przeciwwirusa i kliknij zastosuj, aby zapisać informacje o leczeniu.Przypisz studnie kontroli ujemnej, wybierając odpowiednie doły i sprawdzając w zakładce typu odwiertu z ujemną kontrolą. Aby zaszczepić wirusa, kliknij pauzę w oprogramowaniu, aby zatrzymać pozyskiwanie danych. Zdejmij płytkę ze stanowiska talerza i umieść ją w laminarnym osłonie.Używając pipety wielokanałowej, ostrożnie usuń podłoże hodowlane z każdego dołka. Delikatnie dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczenia wirusa na wierzch monowarstwy komórki, unikając zakłóceń w funkcjonowaniu komórek. Włóż talerz z powrotem do stanowiska płytowego.Na zakładce harmonogram dodaj krok trzeci, używając domyślnych ustawień nagrywania, aby wznowić nagrywanie impedancją. Po dwóch godzinach szczepienia przeciwwirusa wstrzymaj nagrywanie i usuń płytkę ze stanowiska płytowego do laminarnego okapu. Za pomocą pipety wielokanałowej powoli dodawaj 150 mikrolitrów podgrzanego medium do każdego dołku, unikając zakłóceń monowarstwy komórki.Zwróć płytę na stanowisko tablicy i kontynuuj nagrywanie, klikając start. Aby obliczyć dawkę zakaźną 50 z hodowli tkankowej, przejdź do zakładki analizy danych i dodaj wszystkie dołki testowe do wykresu. W sekcji parametrów wybierz TCID50 z listy rozwijanej, aby rozpocząć obliczenia.Wybierz wykres słupkowy, aby obliczyć TCID50 w określonym punkcie czasowym, lub wybierz zależny od czasu TCID50, aby wygenerować kurs TCID50 w wybranym okresie. W niezakażonych komórkach HEK 293A znormalizowany wskaźnik komórkowy wzrastał w ciągu pierwszych 48 godzin po szczepieniu, a następnie ustabilizował się, co wskazuje na kontynuację proliferacji komórek, a następnie konfluencję. W komórkach HEK 293A zakażonych adenowiwirusowym GFP, znormalizowany indeks komórek spadł poniżej kontroli niezakażonej około 50 godzin po szczepieniu i spadł do zera o 100 godzin, co wskazuje na efekty cytopatyczne wywołane wirusem.Wirusowa ekspresja zielonego fluorescencyjnego białka wzrastała odwrotnie wraz z normalizowanym wskaźnikiem komórkowym, który spadał w ciągu pierwszych 100 godzin po inokulacji w komórkach HEK 293A zakażonych adenowiwirusem GFP. Obrazowanie żywych komórek wykazało kontynuację wzrostu komórek przez pierwsze 48 godzin po infekcji, po czym nastąpiła zmniejszona konfluencja i wzrost sygnału zielonego fluorescencyjnego białka w miarę postępu infekcji wirusowej, a utrata żywotnych komórek obserwowana była w ciągu około 100 godzin. Zakażenie adenowirycznym GFP powodowało zależny od dawki spadek znormalizowanego indeksu komórkowego, a wyższe stężenia wirusów powodowały wcześniejsze i gwałtowniejsze spadki w odwiertach replikowanych.Przy 10 podniesionym do potęgi 8 rozcieńczenia adenowirycznego GFP, znormalizowany indeks komórkowy wykazywał wysoką zmienność między dołkami replikacyjnymi, co wskazuje na częściowe efekty cytopatyczne. Adenowirowy GFP TCID50 wzrastał z czasem i osiągał plateau około 150 godzin po szczepieniu. W komórkach MDCK zakażonych wirusem grypy A pomiary impedancji wykazały zależne od dawki zmiany w indeksie normalizowanym komórki w porównaniu z kontrolą niezakażoną.Nasz protokół oferuje w pełni zautomatyzowane, wolne od etykiet, obiektywne rozwiązania ilościowe wirusów w czasie rzeczywistym, oparte na technologii impedancji i wspierane przez zintegrowane oprogramowanie wirusologiczne. Obecne wyzwania to długotrwała ekspozycja na wirusy oraz poleganie na barwieniu tymi toksycznymi odczynnikami wymaganymi w konwencjonalnych testach miarek drutych oraz subiektywność i analiza zmienności związanej z metodami obrazowania bez oznakowania.

a-streamlined-label-free-real-time-50-tissue-culture-infectious-dose

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie prezentujemy alternatywną metodę wykrywania i mianowania wirusów przy użyciu enzymatycznej techniki wykrywania antygenów, znanej jako test immunoperoksydazowy. Pokażemy, jak pobierać próbki wirusowe, przygotować komórki do testów, a następnie przeprowadzić test immunoperoksydazowy z wykorzystaniem rozcieńczeń seryjnych w celu oznaczenia miana wirusa.

Miareczkowanie ludzkich koronawirusów z wykorzystaniem testu immunoperoksydazowego

W celu wytworzenia lentiwirusów wektory DNA są transfekowane do ludzkich komórek 293. Po zbiorze i skoncentrowaniu naddatku miano wirusa jest określane na podstawie ekspresji fluorescencji przy użyciu cytometru przepływowego.

Produkcja lentiwirusa

Metoda ta opisuje zastosowanie systemu obrazowania opartego na barwnikach w podczerwieni do wykrywania H1N1 w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) zakażonych myszy z wysoką czułością. Metodykę tę można przeprowadzić na płytce 96- lub 384-dołkowej, wymaga ona objętości materiału badawczego &lt;10 μl i umożliwia jednoczesny screening wielu patogenów.

Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

W tym filmie omawiamy korelację między CIT50 a mnogością infekcji wirusowych. Komórki zakażone wirusem wykazują działanie cytopatyczne, powodując ich śmierć i oderwanie od złotej mikroelektrody, co z kolei zmniejsza impedancję.

Test komórkowy oparty na impedancji do pomiaru wielości infekcji wirusem grypy

Ten artykuł przedstawia wysokoprzepustową metodę miareczkowania różnych wirusów RNA i DNA opartą na ekspresji lucyferazy przy użyciu automatycznych i ręcznych płynów.

Wysokoprzepustowe miareczkowanie rekombinowanych wirusów eksprymujących lucyferazy

To badanie opisuje test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu, aby przeanalizować relacje antygenowe między wirusami. Protokół wykorzystuje skaner płaski i składa się z czterech etapów, w tym miareczkowania, miareczkowania, neutralizacji i kwantyfikacji neutralizacji. Test działa dobrze z obecnymi krążącymi wirusami grypy A(H1N1)pdm09, A(H3N2) i B.

Optymalizacja ilościowego testu mikroneutralizacji

Zgłoszono tutaj protokół do ilościowego oznaczania zakaźnych cząsteczek wirusa za pomocą monitorowania w czasie rzeczywistym impedancji elektrycznej zainfekowanych komórek. Praktyczne zastosowanie tej metody przedstawiono poprzez ilościowe określenie rozpadu wirusa grypy A przy różnych parametrach fizykochemicznych naśladujących warunki środowiskowe.

Monitorowanie przeżywalności wirusa grypy poza gospodarzem za pomocą analizy komórek w czasie rzeczywistym

Ten protokół pokazuje dokładne i obiektywne podejście do wizualizacji miareczkowania wirusa za pomocą fioletu krystalicznego, porównując go z mikroskopią optyczną i barwieniem immunocytochemicznym.

Zastosowanie fioletu krystalicznego w celu poprawy wizualnego odczytu opartego na efekcie cytopatycznym do miareczkowania wirusów przy użyciu testów TCID50

Obecny protokół opisuje rozprzestrzenianie się wirusa Zika (ZIKV) w komórkach nerkowych afrykańskiej zielonej małpy Vero oraz kwantyfikację ZIKV za pomocą komórkowych metod immunodetekcji kolorymetrycznej w formatach 24-dołkowych i 96-dołkowych (o wysokiej przepustowości).

Namnażanie wirusa i kwantyfikacja kolorymetryczna na podstawie komórek

Tutaj pokazujemy użycie komórkowej impedancji elektrycznej (CEI) jako bardzo łatwej i prostej metody badania infekcji wirusem Zika i jego replikacji w ludzkich komórkach w czasie rzeczywistym. Ponadto test CEI jest przydatny do oceny związków przeciwwirusowych.

Komórkowa platforma impedancji elektrycznej do oceny inhibitorów wirusa Zika w czasie rzeczywistym

Poznaj uproszczony test TCID50 z impedancją w czasie rzeczywistym do automatycznego ilościowania miana wirusowego. Ta metoda bezoznakowa umożliwia szybkie monitorowanie cytopatycznych efektów infekcji wirusowej.

Uproszczony, bezoznakowy, w czasie rzeczywistym 50% testu zakaźnego hodowli tkanek (TCID50) z impedancją do automatycznego ilościowania miana wirusowego (Wideo) | JoVE Journal

Uproszczony, bezoznakowy, w czasie rzeczywistym 50% testu zakaźnego hodowli tkanek (TCID50) z impedancją do automatycznego ilościowania miana wirusowego

Przeglądaj więcej filmów