Fluorescencyjne wykrywanie aktywności nukleazy FEN1 i badania przesiewowe inhibitorów drobnocząsteczkowych

Opracowaliśmy opartą na fluorescencji metodę wykrywania aktywności nukleazy FEN1 i badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych, posuwając naprzód diagnostykę i ukierunkowane badania terapeutyczne.

Obecne wyzwania związane z odciąganiem pokarmu obejmują złożoność i obawy dotyczące bezpieczeństwa konwencjonalnych metod, a także wysokie koszty i specjalistyczny sprzęt wymagany w istniejących technikach opartych na fluorescencji.

Protokół ten rozwiązał problem tradycyjnych metod radiologicznych i kosztownych technik fluorescencji, zapewniając bezpieczniejsze, wydajne i łatwe w użyciu rozwiązanie do wykrywania.

Nasze laboratorium skupi się na optymalizacji wysokoprzepustowej platformy przesiewowej w celu zbadania zastosowań i mechanizmów działania inhibitorów FEN1 w terapii nowotworów in vivo.

[Instruktor] Na początek zaprojektuj nici oligonukleotydowe DNA w oparciu o specyficzną aktywność rozszczepienia FEN1. Wymieszaj jednoniciowe oligonukleotydy DNA w buforze do wyżarzania. Dodaj 10 mikrolitrów buforu do wyżarzania i wody dejonizowanej, aby uzyskać łączną objętość 50 mikrolitrów. Następnie podgrzej mieszaninę reakcyjną w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez jedną minutę w metalowej kąpieli. Natychmiast przenieś probówkę do 72 stopni Celsjusza i inkubuj przez 10 minut. Następnie wyłącz źródło ciepła i pozwól roztworowi stopniowo schłodzić się do temperatury pokojowej, aby utworzyć kompletny dwuniciowy substrat DNA. W przypadku testu aktywności nukleazy FEN1 należy najpierw połączyć dwa mikrolitry substratu DNA z nukleazą FEN1 w buforze reakcyjnym. Mieszaninę reakcyjną inkubować w metalowej łaźni w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Dodaj 20 mikrolitrów bufora terminacyjnego 2X, aby zatrzymać reakcję. Następnie załaduj 20 mikrolitrów zakończonej próbki na wstępnie przygotowany 12% denaturujący żel poliakrylamidowy. Elektroforezę żelu pod napięciem 100 woltów przez 60 minut. Po zakończeniu wizualizuj wyniki elektroforezy w systemie obrazowania fluorescencyjnego. Za pomocą pipety przenieś dwa mikrolitry dimetylosulfotlenku do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Dodaj dwa mikrolitry nukleazy FEN1 i 10 mikrolitrów buforu reakcyjnego 2X do probówki i sześć mikrolitrów wody dejonizowanej. Dokładnie wymieszaj roztwór, a następnie inkubuj go na lodzie przez 10 minut. Po inkubacji odpipetować dwa mikrolitry substratu DNA, aby osiągnąć końcową objętość reakcji 20 mikrolitrów. Następnie należy przygotować robocze rozcieńczenie inhibitora nukleazy FEN1 FEN1-IN-4, wykonując dwukrotne seryjne rozcieńczenie z jednomolowego roztworu podstawowego w dimetylosulfotlenku. Odpipetować po dwa mikrolitry nukleazy FEN1 i rozcieńczonego inhibitora FEN1-IN-4 do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Następnie odpipetować 10 mikrolitrów buforu reakcyjnego 2X i cztery mikrolitry wody dejonizowanej. Delikatnie wymieszaj i inkubuj mieszaninę na lodzie przez 10 minut. Teraz dodaj dwa mikrolitry substratu DNA do probówki, aby uzyskać ostateczną objętość do 20 mikrolitrów. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w metalowej łaźni przez 15 minut. Następnie zakończ reakcję, dodając 20 mikrolitrów buforu terminacyjnego. Przezroczyste pasmo białkowe o mocy około 45 kilodaltonów potwierdziło pomyślne oczyszczenie nukleazy FEN1 z indukowanej ekspresji. Znakowany fluoresceiną dwuniciowy substrat DNA pojawił się w ilości 80 kilodaltonów, potwierdzając udaną syntezę w porównaniu z jednoniciowym substratem o mocy 59 kilodaltonów. Nukleaza FEN1 rozszczepiła 80-nukleotydowy, dwuniciowy substrat DNA w sposób zależny od dawki, z całkowitym rozszczepieniem obserwowanym przy 0,5 mikrograma na mikrolitr. Związek FEN1-IN-4 znacząco hamował rozszczepianie dwuniciowego substratu DNA przez FEN1, o czym świadczy zachowanie pasma 80-nukleotydowego. FEN1-IN-4 zmniejszał aktywność nukleazy FEN1 w sposób zależny od stężenia, z połową maksymalnego stężenia hamującego wynoszącego 14,03 mikromola.