Name: Fluorescencyjne wykrywanie aktywności nukleazy FEN1 i badania przesiewowe inhibitorów drobnocząsteczkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Poznaj fluorescencyjną metodę wykrywania aktywności nukleazy FEN1 i przesiewania inhibitorów drobnocząsteczkowych. To podejście umożliwia badania nad terapiami nowotworowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Prace te były wspierane przez Innowacyjny Zespół Badawczy ds. Nauki i Technologii Instytucji Szkolnictwa Wyższego Jiangsu (2021), Program Centrum Badań Technologii Inżynieryjnych Jiangsu Vocational College (2023), Kluczowy Program Technologiczny Projektów Technologicznych Ludności Suzhou (SYWD2024099), Projekt Państwowego Kluczowego Laboratorium Medycyny Radiacyjnej i Ochrony, Uniwersytet Soochow (GZK12023013), Programy Wyższej Szkoły Zdrowia Zawodowego w Suzhou (SZWZYTD202201, SZWZYTD202205) oraz projekt Qing-Lan w prowincji Jiangsu w Chinach (2021, 2022).

Odczynniki i sprzęt używany w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Oczyszczanie ekspresji białka FEN1
<ol>
	<li>Oczyszczanie białek<ol>
		<li>Usunąć materiał bakteryjny zawierający docelowy plazmid (patrz tabela materiałów) z temperatury −80 °C. Rozmrozić w temperaturze pokojowej i zaszczepić 200 μl z zamrożonych 1,5 ml mikroprobówek wirówkowych do 20 ml LB pożywki zawierającej 50 μg/ml kanamycyny za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl. UWAGA: Szczep to E. coli BL21(DE3)-FEN1.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 160 obr./min przez 12 godzin.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę bakteryjną do kolby Erlenmeyera o pojemności 200 ml zawierającej pożywkę LB uzupełnioną 50 μg/ml kanamycyny. Kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 160 obr./min przez 2-3 godziny.</li>
		<li>Gdy OD600 w kulturze osiągnie około 0,6, dodaj 2 ml IPTG (końcowe stężenie: 1 mM). Kontynuować inkubację w temperaturze 25 °C, 160 obr./min przez 10 godzin.</li>
		<li>Przenieść indukowaną kulturę do wstępnie zważonej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Wirować w temperaturze 4 °C i 2500 × g przez 15 min. Odrzucić supernatant. Zważyć probówkę zawierającą osad i odjąć masę pustej probówki, aby obliczyć masę osadu.</li>
		<li>Dodać 7 ml buforu do lizy na gram osadu z mokrymi komórkami. Za pomocą pipety dokładnie zawiesić osad, pipetując w górę i w dół. UWAGA: Bufor do lizy (łącznie 10 ml) zawiera 20 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 2% Triton X-100 i ddH2O. Wykonaj ten krok w dygestorium, aby zapewnić bezpieczne obchodzenie się z odczynnikami chemicznymi.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę bakteryjną w buforze do lizy do zamrażarki o temperaturze −80 °C i zamrozić przez noc. Następnego dnia zawiesinę rozmrażać na wytrząsarce o temperaturze 4 °C przez 1 godzinę, aby zwiększyć skuteczność lizy.</li>
		<li>Lizuj komórki za pomocą ultradźwięków o mocy 75% przez 45 min. Odwirować lizat o stężeniu 12 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w celu oddzielenia supernatantu od osadu. UWAGA: Jeśli lizat pozostaje mętny, zwiększ objętość buforu do lizy lub powtórz cykle zamrażania i rozmrażania. Można również dodać inhibitor nukleazy, aby zachować integralność białka i zapobiec degradacji.</li>
		<li>Nałożyć oczyszczony supernatant wzdłuż ścianki probówki zawierającej przygotowaną żywicę oczyszczającą białko. Przemyć 10 ml buforu elucyjnego w celu usunięcia niespecyficznie związanych białek. UWAGA: Bufor elucyjny zawiera 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 250 mM NaCl, 2% Triton X-100, 200 mM imidazolu i wodę destylowaną.</li>
		<li>Eluować białko FEN1, dodając 5 ml buforu elucyjnego wzdłuż wewnętrznej ścianki probówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identyfikacja białek docelowych za pomocą szybkiego barwienia na błękit brylantowy Coomassie<ol>
		<li>Przygotuj żele SDS-PAGE używając 12% żelu separującego i 5% żelu do układania w stosy zgodnie z oczekiwanym rozmiarem FEN1.</li>
		<li>Wymieszać docelową próbkę białka i wzorzec BSA z buforem 5× próbki w stosunku 1:4. Podgrzewać mieszaninę w temperaturze 95 °C przez 5 minut, aby całkowicie zdenaturować białka.</li>
		<li>Załadować po 20 μl każdej z próbek białka wzorcowego BSA i denaturowanych do oddzielnych studzienek żelu SDS-PAGE.</li>
		<li>Podłączyć aparat do elektroforezy. Ustaw napięcie na 90 V i pracuj przez 1 godzinę i 40 minut.</li>
		<li>Po elektroforezie przenieś żel do pojemnika barwiącego. Spłucz wodą dejonizowaną, a następnie dodaj 30 ml roztworu do barwienia białek i bejcuj przez 25 minut. Odzyskaj roztwór barwiący, spłucz żel 20 ml wody dejonizowanej i odbarwij przez noc na poziomym wytrząsarce.</li>
		<li>Po odbarwieniu umieść żel na przezroczystej plastikowej płytce i obserwuj pasma białkowe w białym świetle. UWAGA: Jeśli pasma są słabe lub stężenie białka jest niskie, należy zagęścić próbkę za pomocą rurek ultrafiltracyjnych. Ten krok usuwa nadmiar rozpuszczalnika i małe cząsteczki, poprawiając stężenie białka i zapewniając dokładną analizę w kolejnych eksperymentach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie substratu DNA znakowanego FEN1 TAMRA
<ol>
	<li>Przygotowanie substratu DNA znakowanego TAMRA<ol>
		<li>Projektowanie nici oligonukleotydowych DNA w oparciu o specyficzną aktywność rozszczepienia FEN1, odnosząc się do opublikowanych metod17 (patrz tabela 1). Koniec 5′ sekwencji D1 jest modyfikowany za pomocą fluorescencyjnego znacznika TAMRA.</li>
		<li>Dodać mieszane jednoniciowe oligonukleotydy DNA do 10 μl buforu do wyżarzania w następujących objętościach: 5 μl D1 (10 pmol/μL), 10 μL T1 (10 pmol/μL) i 7,5 μl U2 (10 pmol/μL). Dodaj wodę dejonizowaną, aby uzyskać całkowitą objętość do 50 μl. UWAGA: Bufor do wyżarzania zawiera 100 mM Tris-HCl (pH 7,5) i 10 mM MgCl2.</li>
		<li>Podgrzewać mieszaninę reakcyjną w łaźni metalowej w temperaturze 100 °C przez 1 minutę, a następnie natychmiast przenieść ją do temperatury 72 °C na 10 minut18. UWAGA: Końcowy substrat DNA ma długość 80 nukleotydów. Wysoka temperatura początkowa (100 °C) zapewnia denaturację, a temperatura wyżarzania (72 °C) sprzyja dokładnemu parowaniu pasm.</li>
		<li>Wyłącz źródło ciepła i pozwól roztworowi stopniowo ostygnąć do temperatury pokojowej, tworząc kompletny dwuniciowy substrat DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test substratu DNA znakowany TAMRA<ol>
		<li>Przygotuj 12% denaturujący żel poliakrylamidowy, mieszając 4,8 ml 30% akrylamidu (29:1), 4,32 ml 6 M mocznika, 2,4 ml 5× TBE, 50 μl 10% APS, 5 μl TEMED i 0,48 ml wody dejonizowanej. Dokładnie wymieszaj, aby przygotować żel.</li>
		<li>Umieść żel w piekarniku o temperaturze 37 °C na 30 minut, aby stężał.</li>
		<li>W celu wykrycia należy odpipetować 2 μl zsyntetyzowanego substratu DNA do 18 μl wody destylowanej i dodać 7,7 μl buforu zatrzymującego.</li>
		<li>Dla porównania, odpipetować 2 μl D1 znakowanego TAMRA do 18 μl wody destylowanej i dodać 7,7 μl buforu zatrzymującego.</li>
		<li>Załaduj 20 μl każdej przygotowanej próbki na żel i wykonaj elektroforezę SDS-PAGE w celu analizy tworzenia substratu DNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test aktywności nukleazy FEN1
<ol>
	<li>Test aktywności enzymu FEN1<ol>
		<li>Przygotować 20 μl mieszaniny reakcyjnej, łącząc 2 μl substratu DNA z nukleazą FEN1 w buforze reakcyjnym. UWAGA: Bufor reakcyjny składa się ze 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,2 mg/ml BSA i wody dejonizowanej.</li>
		<li>Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C w łaźni metalowej przez 15 minut.</li>
		<li>Zakończyć reakcję, dodając 20 μl 2× buforu terminacyjnego.</li>
		<li>Załadować 20 μl przereagowanej próbki na wstępnie przygotowany 12% denaturujący żel poliakrylamidowy i przeprowadzić elektroforezę pod napięciem 100 V przez 60 minut.</li>
		<li>Po elektroforezie zwizualizuj wyniki za pomocą systemu obrazowania fluorescencyjnego (ścieżka 600).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Badania przesiewowe małocząsteczkowych inhibitorów nukleazy FEN1
<ol>
	<li>Badania przesiewowe inhibitorów drobnocząsteczkowych<ol>
		<li>Za pomocą pipety przenieś 2 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Dodać 2 μl nukleazy FEN1 i 10 μl 2× buforu reakcyjnego do probówki.</li>
		<li>Dokładnie wymieszaj i inkubuj mieszaninę na lodzie przez 10 minut.</li>
		<li>Dodać 2 μl substratu DNA i 4 μl wody dejonizowanej, dokładnie wymieszać, aby całkowita objętość reakcji wyniosła 20 μl.</li>
		<li>Przygotować robocze rozcieńczenie inhibitora nukleazy FEN1, FEN1-IN-4, wykonując dwukrotne seryjne rozcieńczenie 1 M roztworu podstawowego w DMSO.</li>
		<li>Odpipetować 2 μl nukleazy FEN1 (0,03 μg/μl) i 2 μl rozcieńczonego inhibitora FEN1-IN-4 do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 10 μl 2× buforu reakcyjnego i 4 μl wody dejonizowanej. Delikatnie wymieszać i inkubować na lodzie przez 10 minut, aby zapewnić wystarczającą interakcję między inhibitorem a enzymem.</li>
		<li>Dodać 2 μl substratu DNA do probówki, aby utworzyć końcową mieszaninę reakcyjną o objętości 20 μl.</li>
		<li>Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C w łaźni metalowej przez 15 minut.</li>
		<li>Zakończyć reakcję, dodając 20 μl 2× buforu terminacyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Ocena siły hamującej małocząsteczkowego inhibitora FEN1--IN-4
<ol>
	<li>Za pomocą mikropipety pobrać 10 μl 2× buforu reakcyjnego i dodać go do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 2 μl nukleazy FEN1 o stężeniu 0,03 μg/μL, a także 2 μl inhibitora FEN1 FEN1-IN-4 w innym stężeniu. UWAGA: Należy ustalić wiele gradientów stężeń zgodnie z wymaganiami doświadczalnymi.</li>
	<li>Dodać 4 μl wody dejonizowanej i dokładnie wymieszać roztwór. Umieścić probówkę mikrowirówkową o pojemności 1,5 ml na lodzie i inkubować przez 10 minut.</li>
	<li>Dodać 2 μl dwuniciowego substratu DNA do probówki, aby utworzyć 20 μl układu reakcyjnego.</li>
	<li>Umieść probówkę EP w metalowej kąpieli o temperaturze 37 °C na 15 minut.</li>
	<li>Po zakończeniu reakcji dodać 20 μl buforu 2× stop do mieszaniny reakcyjnej, aby zakończyć reakcję.</li>
	<li>Obserwuj wyniki za pomocą urządzenia do obrazowania fluorescencyjnego i wykreśl krzywą IC50 19. UWAGA: Kwantyfikację intensywności fluorescencji przeprowadzono przy użyciu Fiji/ImageJ20, a następnie analizę statystyczną i wizualizację za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów i analiz21.</li>
</ol>

<ol><li>Xu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell-virus-virophage+tripartite+infection+systems+discovered+in+the+freshwater+lake+Dishui+Lake+in+Shanghai%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Novel cell-virus-virophage tripartite infection systems discovered in the freshwater lake Dishui Lake in Shanghai, China.</a> J Virol. 94 (11), e00149(2020).</li>
<li>Mougari, S., Sahmi-Bounsiar, D., Levasseur, A., Colson, P., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virophages+of+giant+viruses%3A+An+update+at+eleven%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Virophages of giant viruses: An update at eleven.</a> Viruses. 11 (8), 733(2019).</li>
<li>Paez-Espino, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+evolution%2C+and+classification+of+virophages+uncovered+through+global+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Diversity, evolution, and classification of virophages uncovered through global metagenomics.</a> Microbiome. 7 (1), 157(2019).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regulation+of+FEN1+nuclease+and+its+link+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Functional regulation of FEN1 nuclease and its link to cancer.</a> Nucleic Acids Res. 39 (3), 781-794 (2011).</li>
<li>Yang, F., Hu, Z., Guo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+targeting+FEN1+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors targeting FEN1 for cancer therapy.</a> Biomolecules. 12 (7), 946(2022).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+FEN1+promotes+DNA+damage+and+enhances+chemotherapeutic+response+in+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of FEN1 promotes DNA damage and enhances chemotherapeutic response in prostate cancer cells.</a> Med Oncol. 40 (8), 242(2023).</li>
<li>Abdel-Fatah, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+protein+expression+analysis+reveals+flap+endonuclease+1+%28FEN1%29+as+a+key+biomarker+in+breast+and+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Genomic and protein expression analysis reveals flap endonuclease 1 (FEN1) as a key biomarker in breast and ovarian cancer.</a> Mol Oncol. 8 (7), 1326-1338 (2014).</li>
<li>Guo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FEN1+endonuclease+as+a+therapeutic+target+for+human+cancers+with+defects+in+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FEN1 endonuclease as a therapeutic target for human cancers with defects in homologous recombination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (32), 19415-19424 (2020).</li>
<li>Zhao, E., Zhou, C., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flap+endonuclease+1+%28FEN1%29+as+a+novel+diagnostic+and+prognostic+biomarker+for+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Res+Hepatol+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Flap endonuclease 1 (FEN1) as a novel diagnostic and prognostic biomarker for gastric cancer.</a> Clin Res Hepatol Gastroenterol. 45 (1), 101455(2021).</li>
<li>Finger, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3%27-flap+pocket+of+human+flap+endonuclease+1+is+critical+for+substrate+binding+and+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 3'-flap pocket of human flap endonuclease 1 is critical for substrate binding and catalysis.</a> J Biol Chem. 284 (33), 22184-22194 (2009).</li>
<li>Liu, R., Qiu, J., Finger, L. D., Zheng, L., Shen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-protein+interaction+modes+of+FEN-1+with+gap+substrates+and+their+implication+in+preventing+duplication+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The DNA-protein interaction modes of FEN-1 with gap substrates and their implication in preventing duplication mutations.</a> Nucleic Acids Res. 34 (6), 1772-1784 (2006).</li>
<li>McWhirter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+high-throughput+fluorescence+polarization+DNA+cleavage+assay+for+the+identification+of+FEN1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Development of a high-throughput fluorescence polarization DNA cleavage assay for the identification of FEN1 inhibitors.</a> J Biomol Screen. 18 (5), 567-575 (2013).</li>
<li>Dorjsuren, D., Kim, D., Maloney, D. J., Wilson, D. M. 3rd, Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+non-radioactive+assays+for+investigation+of+human+flap+endonuclease+1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Complementary non-radioactive assays for investigation of human flap endonuclease 1 activity.</a> Nucleic Acids Res. 39 (2), e11(2011).</li>
<li>Van Pel, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+synthetic+lethal+interaction+network+identifies+FEN1+as+a+broad-spectrum+target+for+anticancer+therapeutic+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved synthetic lethal interaction network identifies FEN1 as a broad-spectrum target for anticancer therapeutic development.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003254(2013).</li>
<li>Tumey, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+and+optimization+of+a+N-hydroxy+urea+series+of+flap+endonuclease+1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">The identification and optimization of a N-hydroxy urea series of flap endonuclease 1 inhibitors.</a> Bioorg Med Chem Lett. 15 (2), 277-281 (2005).</li>
<li>Tang, Y., Wei, W., Liu, Y., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+assay+of+FEN1+activity+with+nicking+enzyme-assisted+signal+amplification+based+on+ZIF-8+for+imaging+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent assay of FEN1 activity with nicking enzyme-assisted signal amplification based on ZIF-8 for imaging in living cells.</a> Anal Chem. 93 (11), 4960-4966 (2021).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fragment+maturation+involves+%CE%B1-segment+error+editing+by+the+mammalian+FEN1%2FMutS%CE%B1+functional+complex%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">fragment maturation involves α-segment error editing by the mammalian FEN1/MutSα functional complex.</a> EMBO J. 34 (13), 1829-1843 (2015).</li>
<li>Zheng, L., Dai, H., Qiu, J., Huang, Q., Shen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+FEN-1%2FPCNA+interaction+results+in+DNA+replication+defects%2C+pulmonary+hypoplasia%2C+pancytopenia%2C+and+newborn+lethality+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Disruption of the FEN-1/PCNA interaction results in DNA replication defects, pulmonary hypoplasia, pancytopenia, and newborn lethality in mice.</a> Mol Cell Biol. 27 (8), 3176-3186 (2007).</li>
<li>Hilda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate-based+3D+cell+culture+technique+to+evaluate+the+half-maximal+inhibitory+concentration%3A+An+in+vitro+model+of+anticancer+drug+study+for+anaplastic+thyroid+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Thyroid+Res%22%5BJournal%5D)">Alginate-based 3D cell culture technique to evaluate the half-maximal inhibitory concentration: An in vitro model of anticancer drug study for anaplastic thyroid carcinoma.</a> Thyroid Res. 14 (1), 10(2021).</li>
<li>Nadine, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Microstructure+analysis+of+polymer+amended+fluid+fine+tailings+using+Fiji-ImageJ+image+analysis+software%22">Microstructure analysis of polymer amended fluid fine tailings using Fiji-ImageJ image analysis software</a>. , Carleton University Theses and Dissertations. (2022).</li>
<li>Pablo, T. Quantifications figures 2-6 & supplemental fig. 1 (GraphPad Prism 8.1 files). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPablo%2C+T+%22Figshare%22">Figshare</a>. , (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Test aktywności nukleazy FEN1 i badania przesiewowe inhibitorów małych cząsteczek mają kluczowe znaczenie dla badań nad naprawą uszkodzeń DNA i rozwojem raka. W porównaniu z tradycyjnymi technikami znakowania radioaktywnego, obecna metoda stanowi opłacalną, wydajną, łatwą w obsłudze i bezpieczniejszą alternatywę. Dodatkowo, w przeciwieństwie do testów FEN1 opartych na wybuchach fluorescencji, podejście to zapewnia bardziej intuicyjną wizualizację rozszczepienia substratu, umożliwiając w ten sposób dokładniejszą ocenę akt...

Replikacja DNA nie zawsze jest bezbłędna i może zostać zakłócona zarówno przez czynniki wewnętrzne, jak i zewnętrzne. W związku z tym mechanizmy replikacji DNA i naprawy uszkodzeń mają kluczowe znaczenie dla przetrwania komórek i stabilności genomu. W tym procesie kluczową rolę odgrywa ludzka endonukleaza specyficzna dla struktury rozgałęzionej FEN1 (endonukleaza klapowa 1), nukleaza rdzenia DNA 1,2,3.
FEN1 bierze przede wszystkim udział w replikacji DNA i jest niezbędny do dojrzewania fragmentów Okazaki na opóźnionej nici 4,5. Zapewnia to efektywną progresję replikacji DNA i dokładną naprawę uszkodzonego DNA. Jednak nieprawidłowy wzrost poziomu FEN1 jest ściśle związany z rozwojem różnych nowotworów 6,7, takich jak rak płuc i piersi7. W związku z tym FEN1 jest nie tylko niezbędny do replikacji i naprawy DNA, ale przyciągnął również znaczną uwagę jako biomarker do diagnozowania raka i potencjalny cel terapeutyczny 8,9. Wykrywanie aktywności FEN1 ma zasadnicze znaczenie dla wczesnej diagnostyki nowotworów i postępu w badaniach nad terapiami celowanymi.
Biorąc pod uwagę znaczenie FEN1 i potrzebę zbadania jego aktywności we wczesnej diagnostyce raka i rozwoju terapii celowanej, głównym celem metody opracowanej w tym eksperymencie był dokładny i skuteczny pomiar aktywności nukleazy FEN1. Metoda ta ma na celu zapewnienie niezawodnej platformy do badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych ukierunkowanych na FEN1. Osiągając te cele, badanie ma na celu przyczynienie się do lepszego zrozumienia roli FEN1 w leczeniu nowotworów oraz ułatwienie odkrycia nowych strategii terapeutycznych.
Istnieje wiele technik wykrywania aktywności nukleazy FEN1, z których każda ma odrębne cechy, zasady, zalety, ograniczenia i możliwe do zastosowania scenariusze. Na przykład elektroforeza żelowa i metody rozdzielania substratów oparte na HPLC zapewniają intuicyjne wyniki, ale wiążą się z kłopotliwymi procedurami i niską przepustowością10,11. Testy polaryzacji fluorescencyjnej (FP) napotykają wyzwania w ocenie aktywności FEN1 z powodu interferencji autofluorescencji związków lub rozpraszania światła, które wpływają na sygnały FP. Chociaż strategie kontrbadań przesiewowych mogą częściowo wykluczyć wyniki fałszywie dodatnie, około 15% głównych związków aktywnych jest nadal błędnie identyfikowanych z powodu zakłóceń technicznych12. Łączne zastosowanie par donor/wygaszacz fluorescencji (np. TAMRA/BHQ-2) i chemiluminescencji AlphaScreen ma wady, takie jak wysoki koszt syntezy złożonych substratów fluorescencyjnych z potrójną klapą, co szczególnie ogranicza ich użyteczność w badaniach przesiewowych na dużą skalę. Co więcej, dwupłatkowa struktura substratów może utrudniać optymalne wiązanie z FEN1, zmniejszając wydajność rozszczepienia enzymatycznego i pogarszając czułość wykrywania. Ponadto podejście to w dużym stopniu opiera się na specjalistycznych instrumentach (np. ViewLux, EnVision), co ogranicza jego zastosowanie w laboratoriach o ograniczonych zasobach 13,14,15. Metody detekcji fluorescencyjnej oparte na dwuklapowych nanosondach DNA w kształcie hantli funkcjonalizowanych nanoklastrami srebra (DNA-AgNCs) cierpią z powodu zmienności między partiami ze względu na ich zależność od precyzyjnych etapów wyżarzania i zarodkowania in situ, co utrudnia odtwarzalność i skalowalność. Wysokie koszty i długotrwałe procedury dodatkowo ograniczają ich praktyczne zastosowanie16.
W tym artykule opracowano test oparty na znakowaniu fluorescencyjnym w celu rozwiązania obecnych ograniczeń technicznych i zaspokojenia rosnącego zapotrzebowania na bezpieczniejsze, dostępne dla użytkownika metody badania aktywności FEN1. Technika ta wykorzystuje specyficzność i wysoką czułość detekcji fluorescencji, a także zdolność do inżynierii substratów DNA o określonych strukturach, które mogą być rozpoznane i rozszczepione przez FEN1 (Figura 1). Metoda ta usprawnia procedury eksperymentalne przy zachowaniu wysokiej dokładności oceny aktywności nukleazy FEN1. W porównaniu z tradycyjną elektroforezą żelową i technikami opartymi na HPLC oferuje uproszczoną obsługę i szybszą realizację. W przeciwieństwie do testów polaryzacji fluorescencyjnej, podejście to umożliwia szybkie jakościowe badania przesiewowe związków, ustanawiając skuteczną strategię wstępnej oceny enzymatycznej.
Metoda ta nadaje się do badania aktywności nukleazy FEN1 w warunkach laboratoryjnych, w których dostęp do materiałów promieniotwórczych jest ograniczony. Doskonale nadaje się również do badań przesiewowych dużej liczby małocząsteczkowych inhibitorów w stosunkowo krótkim czasie, zwłaszcza gdy wymagana jest wysoka czułość i swoistość. Nie jest to jednak idealne rozwiązanie dla badań wymagających bezwzględnej kwantyfikacji z bardzo dużą precyzją lub dla laboratoriów pozbawionych podstawowego sprzętu do wykrywania fluorescencji i wiedzy specjalistycznej w zakresie analizy sygnałów fluorescencyjnych. W przypadku badań koncentrujących się na zastosowaniach in vivo , w których na zachowanie FEN1 mogą wpływać złożone czynniki biologiczne, które nie są replikowane w obecnych projektach testów in vitro , konieczne może być dalsze udoskonalenie lub metody alternatywne.
Ten test fluorescencyjny jest bardzo czuły i specyficzny, zapewniając bezpieczne, wygodne i skuteczne narzędzie do badania aktywności FEN1 i opracowywania jego inhibitorów.

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCL</td><td>Beyotime</td><td>Zobacz materiał ST774</td><td></td></tr><tr><td>30% Acr-Bis (29:1)</td><td>Beyotime</td><td>ST003-500ml</td><td></td></tr><tr><td>5M Nacl</td><td>Beyotime</td><td>Zobacz materiał ST347</td><td></td></tr><tr><td>BeyoBlue Plus</td><td>Beyotime</td><td>P0003S</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)-FEN1</td><td>Wazyme</td><td>Zobacz materiał C504-F1</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Beyotime</td><td>Zobacz materiał P0007</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka odbarwiająca</td><td>Kylin-Bell powiedział:</td><td>TS-100</td><td></td></tr><tr><td>DL-ditiotreitol</td><td>Beyotime</td><td>Zobacz materiał ST041</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do suchej kąpieli</td><td>RUICHENG powiedział:</td><td>DH200 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Aparatura do elektroforezy</td><td>Biotechnologia Bei Jing Liuyi</td><td>DDY-6D</td><td></td></tr><tr><td>FEN1-W-4</td><td>CelMOL</td><td>Zobacz materiał T8545 TGL</td><td></td></tr><tr><td>Protokół IPTG</td><td>Takaba Takaba</td><td>9030</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna Slufate</td><td>Ostrze biologiczne</td><td>Zobacz materiał BS152</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka laboratoryjna</td><td>Thermo</td><td>Zobacz materiał SL 16R</td><td></td></tr><tr><td>Rosół LB</td><td>Solarbio (Słoneczna Biologia)</td><td>L8291</td><td></td></tr><tr><td>Żywica Ni-NTA His Bind</td><td>7SE Biotechnologia</td><td>PANF001-001C</td><td></td></tr><tr><td>Odyseja FC</td><td>ODYSEJA</td><td>Akumulator litowo-prądowy (LI-KOR)</td><td></td></tr><tr><td>STRONA SDS</td><td>Beyotime</td><td>Zobacz materiał P0015L</td><td></td></tr><tr><td>Wyczerpanie-x-100</td><td>Dzielnica Shyuanye</td><td>Zobacz materiał S15022</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescencyjne wykrywanie aktywności nukleazy fen1 i badania przesiewowe inhibitorów drobnocząsteczkowych

Fluorescence-Based Detection of FEN1 Nuclease Activity and Screening of Small-Molecule Inhibitors

FEN1 (Flap Endonuclease 1) jest kluczową nukleazą DNA biorącą udział w replikacji DNA i naprawie uszkodzeń, odgrywającą kluczową rolę w utrzymaniu stabilności genomu. Podwyższony poziom aktywności FEN1 jest ściśle związany z rozwojem różnych nowotworów, co sprawia, że FEN1 jest uznanym biomarkerem i celem leków w przypadku raka płuc, piersi i prostaty. Konwencjonalne metody znakowania radioizotopów do wykrywania aktywności nukleazy FEN1 stanowią wyzwanie pod względem wygody i bezpieczeństwa. W tym badaniu zsyntetyzowano substrat fragmentu DNA o strukturze płatowej in vitro. Substrat ten jest znakowany fluoroforem na końcu klapy 5', co pozwala nukleazie FEN1 specyficznie rozpoznać i rozszczepić wyznaczone miejsce. Aktywność FEN1 określono następnie poprzez wykrycie sygnału fluoroforowego po elektroforezie żelowej. Metoda ta umożliwia szybką i skuteczną ocenę aktywności nukleazy FEN1 oraz badania przesiewowe jej inhibitorów. Zapewnia czułe i specyficzne podejście do analizy aktywności FEN1 i oceny skuteczności inhibitorów małocząsteczkowych. Ponadto w znacznym stopniu przyczynia się do badań nad naprawą uszkodzeń DNA i rozwojem nowotworów, oferując nowatorską strategię badań klinicznych nad mechanizmami choroby i wykrywaniem substancji genotoksycznych.

Jak pokazano na Ryc. 2A, odczynnik barwiący wiąże się z białkiem, powodując pojawienie się go w postaci niebieskiego prążka na żelu. Pierwsza ścieżka zawiera znakowane białko służące jako marker masy cząsteczkowej, w którym prążek standardowego białka BSA odpowiada masie cząsteczkowej 70 kDa, a prążek białka kwasów nukleinowych FEN1 odpowiada masie cząsteczkowej 45 kDa. Wyniki eksperymentalne wykazały, że nukleaza FEN1 występuje jako wyraźny prążek przy około 45 kDa, co wskazuje na pomyślną ...

Protokół ten opisuje test biochemiczny przesunięcia żelu do pomiaru aktywności FEN1 (endonukleazy płatowej 1) i rozwoju inhibitora.

Fluorescencyjne wykrywanie aktywności nukleazy FEN1 i badania przesiewowe inhibitorów drobnocząsteczkowych

FEN1 (Flap Endonuclease 1) is a key DNA nuclease involved in DNA replication and damage repair, playing a crucial role in maintaining genomic stability. ...

Opracowaliśmy opartą na fluorescencji metodę wykrywania aktywności nukleazy FEN1 i badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych, posuwając naprzód diagnostykę i ukierunkowane badania terapeutyczne.Obecne wyzwania związane z odciąganiem pokarmu obejmują złożoność i obawy dotyczące bezpieczeństwa konwencjonalnych metod, a także wysokie koszty i specjalistyczny sprzęt wymagany w istniejących technikach opartych na fluorescencji.Protokół ten rozwiązał problem tradycyjnych metod radiologicznych i kosztownych technik fluorescencji, zapewniając bezpieczniejsze, wydajne i łatwe w użyciu rozwiązanie do wykrywania.Nasze laboratorium skupi się na optymalizacji wysokoprzepustowej platformy przesiewowej w celu zbadania zastosowań i mechanizmów działania inhibitorów FEN1 w terapii nowotworów in vivo.[Instruktor] Na początek zaprojektuj nici oligonukleotydowe DNA w oparciu o specyficzną aktywność rozszczepienia FEN1. Wymieszaj jednoniciowe oligonukleotydy DNA w buforze do wyżarzania. Dodaj 10 mikrolitrów buforu do wyżarzania i wody dejonizowanej, aby uzyskać łączną objętość 50 mikrolitrów. Następnie podgrzej mieszaninę reakcyjną w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez jedną minutę w metal

fluorescence-based-detection-fen1-nuclease-activity-screening-small

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano nową metodę badania kinetyki enzymatycznej, wykorzystującą ilościową analizę sygnałów FRET (Förster Resonance Energy Transfer). Wyznaczono wartości KM oraz kcat dla hydrolizy domeny katalitycznej SENP1 (proteazy 1 specyficznej dla SUMO/Sentryny) w odniesieniu do pre-SUMO1 (małego modyfikatora podobnego do ubikwityny). Ogólne zasady tego ilościowego badania kinetyki proteaz w oparciu o technikę FRET mogą zostać zastosowane do innych proteaz.

Ilościowa analiza FRET (Förster Resonance Energy Transfer) w celu oznaczenia kinetyki proteazy SENP1

Egzonukleazy odgrywają kluczową rolę w zapewnieniu stabilności genomu. Utrata funkcji egzonukleazy WRN powoduje przedwczesne starzenie się. Badanie substratów i innych wymagań nukleazy in vitro może pomóc w wyjaśnieniu jej roli in vivo. Tutaj demonstrujemy szybki i powtarzalny test oparty na fluorescencji do pomiaru jego aktywności nukleazy.

Test egzonukleazy oparty na fluorescencji w celu scharakteryzowania DmWRNexo, ortologu ludzkiej egzonukleazy progeroidalnej WRN i jej zastosowania do innych nukleaz

Ta praca przedstawia metodę wysokoprzepustowych badań przesiewowych przy użyciu uniwersalnego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych, który teoretycznie można zastosować do ponad 200 enzymów. W tym przypadku pojedynczy system przesiewowy identyfikuje trzy różne enzymy (lipazę, celulazę i fosfatazę alkaliczną), po prostu zmieniając zastosowany substrat (octan p-nitrofenylu, p-nitrofenylo-β-D-celobiozyd i fosforan fenylu).

Badania przesiewowe wielu enzymów przy użyciu wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych

Prezentujemy otwarty instrument do analizy wysokiej zawartości (HCA) wykorzystujący automatyczne obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) do oznaczania interakcji białek za pomocą odczytów opartych na transferze energii rezonansu Förstera (FRET). Akwizycja danych dla tego urządzenia openFLIM-HCA jest kontrolowana przez oprogramowanie napisane w μManager, a analiza danych odbywa się w FLIMfit.

Analiza Open Source o wysokiej zawartości z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Testy aktywności oparte na NMR zostały opracowane w celu identyfikacji i scharakteryzowania inhibitorów dwóch nukleozydowych enzymów rybohydrolazy. Przedstawiono protokoły dla początkowych testów związków chemicznych przy 500 μM i 250 μM, testów dawka-odpowiedź do oznaczania wartości IC50, testów przesiewowych licznika detergentów, testów przesiewowych licznika rozcieńczeń skokowych oraz testów w całych komórkach E. coli.

Testy aktywności oparte na NMR do określania inhibicji związku, wartości IC50, aktywności artefaktów i aktywności całych komórek rybohydrolaz nukleozydowych

Zmieniona aktywność nukleazy jest związana z różnymi schorzeniami ludzkimi, co potwierdza jej potencjał jako biomarkera. Modułowa i łatwa do wdrożenia metodologia badań przesiewowych przedstawiona w tym artykule pozwala na wybór konkretnych sond kwasów nukleinowych do wykorzystania aktywności nukleazy jako biomarkera choroby.

Kinetyczne badanie przesiewowe aktywności nukleazy za pomocą sond kwasów nukleinowych

Monitorowanie zmian temperatury topnienia docelowego białka (np. test przesunięcia termicznego, TSA) jest efektywną metodą badania bibliotek fragmentów kilkuset związków. Przedstawiamy protokół TSA implementujący wspomaganą robotyką nanoróżnicową fluorymetrię skaningową (nano-DSF) do monitorowania wewnętrznej fluorescencji tryptofanu i rozpraszania wstecznego światła w celu badania przesiewowego fragmentów.

Nanoróżnicowa fluorymetria skaningowa do badań przesiewowych w wykrywaniu odprowadzeń na podstawie fragmentów

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

RASopatie to wielosystemowe zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją szlaku RAS-MAPUK. Potencjalnie patogenne warianty oczekujące na walidację pojawiają się nieustannie, podczas gdy słabe dowody przedkliniczne ograniczają terapię. Tutaj opisujemy nasz protokół in vivo polegający na testowaniu i krzyżowej weryfikacji poziomów aktywacji ERK związanych z RASopatią oraz jego modulacji farmakologicznej podczas embrigenezy za pomocą obrazowania FRET na żywo u danio danio młodego typu Teen-reporter.

Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji

Protokół ten wprowadza fluorometryczną metodologię przesiewania zoptymalizowaną do identyfikacji produktów naturalnych/inhibitorów małych cząsteczek syntezy białek. Jego praktyczność sprawia, że nadaje się zarówno do nauczania technik odkrywania leków na poziomie licencjackim, jak i do wdrażania w kampaniach chemii medycznej.

Protokół oparty na fluorescencji do wstępnego badania inhibitorów syntezy białek pochodzących z naturalnych źródeł

Tu opisujemy metodę wizualizowania opartych na komórkach, lokalizacji subkomórkowej i analizy ilościowej ognisk wzbogaconych poli(ADP-rybozą) (PAR) w fiksowanych komórkach ssaków. Ten test umożliwia ilościową ocenę miejsc aktywacji PARP indukowanej uszkodzeniem DNA, w tym związaną z naprawą po wycinaniu zasad lub naprawą pojedynczych rozerwaniach łańcucha, w jądrach komórek narażonych na genotoksyczne substancje.

Wizualizacja i ilościowa analiza aktywacji PARP1/PARP2 indukowanej genotoksinami w komórkach z wykorzystaniem reportera opartego na białku fuzyjnym fluorescencyjnym

Poznaj fluorescencyjną metodę wykrywania aktywności nukleazy FEN1 i przesiewania inhibitorów drobnocząsteczkowych. To podejście umożliwia badania nad terapiami nowotworowymi.

Fluorescencyjne wykrywanie aktywności nukleazy FEN1 i badania przesiewowe inhibitorów drobnocząsteczkowych

Przeglądaj więcej filmów