Badanie przesiewowe CRISPR obejmujące cały genom do odkrywania genów radiowrażliwych i odpornych na promieniowanie

Badania te koncentrują się na badaniach przesiewowych CRISPR obejmujących cały genom i radioterapii. Udostępniamy protokół do przeglądania genów wrażliwych na promieniowanie i odpornych na promieniowanie za pomocą badania przesiewowego CRISPR całego genomu w komórce raka płuc po napromieniowaniu. Obecne wyzwania eksperymentalne obejmują efekty off-target, które są spowodowane ogromną złożonością genomu i potencjalnymi trudnościami w badaniu mechanizmów leżących u podstaw tego zjawiska. W porównaniu z tradycyjnymi metodami przesiewowymi, CRISPR osiąga trwałą modyfikację genetyczną i wykazuje się wyższą precyzją, co czyni go szczególnie cennym w funkcjonalnych badaniach genomicznych i odkrywaniu celów. W przyszłości nasz zespół skupi się na badaniu ekranu CRISPR in vivo, aby rozwiązać problemy, które pozostawiły po sobie te badania, i będziemy zaangażowani w optymalizację technologii CRISPR.

[Narrator] Na początek dostosuj gęstość przylegających komórek do pięć razy 10 do mocy pięciu komórek na mililitr. Za pomocą pipety rozprowadź dwa mililitry zawiesiny komórek w każdym 3,5-centymetrowym naczyniu hodowlanym do radioterapii w różnych dawkach. Umieść naczynia w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i inkubuj przez noc. Ponumeruj każde 3,5-centymetrowe naczynie hodowlane od jednego do pięciu za pomocą markera. Korzystając ze źródła promieniowania, podawaj dawki promieniowania odpowiednio 2, 4, 6 i 8 grejów do naczyń od drugiej do piątej. Dostosuj gęstość napromieniowanych komórek do jednego razy 10 do mocy pięciu komórek na mililitr. Wysiewaj 10 mikrolitrów na studzienkę, co odpowiada 1000 komórek na 100 mikrolitrów, na sześciodołkowe płytki z trzema powtórzeniami na dawkę promieniowania. Następnie wysiewaj 30 mikrolitrów na studzienkę, co odpowiada 3000 komórek na 100 mikrolitrów, na 96-dołkowe płytki z pięcioma powtórzeniami na dawkę promieniowania. Teraz wymieszaj odczynnik CCK-8 z podłożem RPMI 1640 bez FBS w stosunku od jednego do dziewięciu. Dodać mieszaninę do płytki 96-dołkowej i inkubować płytkę w ciemności przez godzinę. Następnie użyj czytnika mikropłytek, aby zmierzyć gęstość optyczną przy 450 nanometrach. Aby rozpocząć proces infekcji, ustaw logarytmiczny gradient stężenia dla lentiwirusa od zera do 800 jednostek na mililitr. Dodaj odpowiednią objętość lentiwirusa do dwóch mikrolitrów polibrenu na naczynie i pozwól mu zachować równowagę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Powoli wlej mieszaninę polibrenu lentiwirusa do każdej studzienki. Dostosuj gęstość komórek rodzicielskich do trzy razy 10 do mocy pięciu komórek na mililitr i zaszczepij jeden mililitr do każdej studzienki 12-dołkowej płytki. Dodaj puromycynę w gradiencie stężeń do studzienek. Po 72 godzinach od zakażenia należy zastąpić pożywkę w każdym dołku kompletną pożywką zawierającą minimalne stężenie puromycyny do zabijania komórek. Oblicz wielokrotność infekcji dla każdej studzienki na podstawie komórek, które przeżyły. Dostosuj gęstość przylegających komórek do jednego razy 10 do mocy siedmiu komórek na mililitr. Dodaj lentiwirusa w ilości równej 0,3 do 30 mikrolitrów na naczynie polibrenu i pozwól mu zrównoważyć się w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Powoli wlej mieszaninę lentiwirusa i polibrenu do 15-centymetrowego naczynia hodowlanego. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Na drugi dzień po zakażeniu odessać pożywkę z szalki hodowlanej i zastąpić ją 15 mililitrami kompletnej pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% FBS. Powtórzyć ten sam zabieg dla niezakażonych komórek rodzicielskich jako kontrolę ujemną i kontynuować hodowlę przez 72 godziny. Teraz strawij komórki z jednej 15-centymetrowej płytki hodowlanej, używając 0,25% trypsyny. Ponownie zawieś komórki w kompletnym podłożu RPMI 1640 z 10% PBS i policz liczbę komórek. Po ekstrakcji genomowego DNA dla dnia zero, użyj spektrofotometru UV NanoDrop, aby zmierzyć stężenie i czystość DNA. Podać odpowiednią dawkę promieniowania do komórek w grupie leczonej i pozostawić komórki grupy kontrolnej nieleczone, aby mogły się normalnie rozmnażać. Po 14 dniach leczenia należy strawić zarówno komórki grupy leczonej, jak i kontrolnej, stosując 0,25% trypsyny. Zawieś ogniwa w kompletnym podłożu RPMI 1640 z 10% FBS. Odwirować komórki w temperaturze 300 G przez pięć minut i odrzucić supernatant. Zawiesić granulat w jednym mililitrze PBS. Po powtórzeniu etapu wirowania wyekstrahować genomowe DNA z dnia 14 z osadu i określić stężenie DNA. Następnie przygotuj wymagane startery i rozcieńcz je do 10 mikromolowców. Po dodaniu składników w celu utworzenia systemu reakcyjnego o pojemności 20 mikrolitrów, należy krótko odwirować probówkę przy 300 G przez pięć sekund. W przypadku elektroforezy w żelu agarozowym przygotuj żel, wyjmij z niego grzebień i napełnij zbiornik do elektroforezy wystarczającym buforem, aby pokryć żel. Dodaj bufor ładujący do próbki DNA i dobrze wymieszaj. Na koniec załaduj mieszaninę do studzienek i rozpocznij elektroforezę: tworzenie kolonii po 14 dniach wykazało, że ekspozycja na promieniowanie o wartości dwóch Grayów znacznie zmniejszyła liczbę ocalałych kolonii w porównaniu z zerem Graya. Test CCKA wykazał znaczny spadek żywotności komórek przy dwóch Grayach z dalszym spadkiem przy wyższych dawkach promieniowania. Leczenie rosnącym stężeniem puromycyny przez 72 godziny wykazało, że jeden mikromol był minimalnym stężeniem wymaganym do wyeliminowania komórek A549. Walidacja PCR wykazała wyraźne prążki w 231 parach zasad, potwierdzając oczekiwaną długość sekwencji sgRNA w bibliotece CRISPR. Analiza sekwencjonowania wykazała, że około 60% odczytów udało się zmapować do genomu referencyjnego. Liczba odczytów sgRNA była zgodna z rozkładem Poissona, co odpowiada teoretycznym oczekiwaniom dotyczącym badania przesiewowego w skali genomu. Analiza PCA i mapy cieplnej wykazały wysoką zmienność międzygrupową i niską zmienność międzygrupową, co potwierdza spójność eksperymentalną. Analiza ontologii genów zidentyfikowała odpowiedź na uszkodzenie DNA jako najbardziej wzbogacony szlak spośród 15 najważniejszych wyników.