Name: Leczenie izolowanych wysp trzustkowych i pomiar apoptozy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Poznaj metodę leczenia wysp trzustkowych i pomiaru apoptozy u myszy przy użyciu wielobarwnej fluorescencji. Technika ta pozwala badać mechanizmy śmierci komórek beta w cukrzycy typu 1.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Następujące granty zapewniły fundusze na tę pracę: NIDDK award R01 DK137221, JDRF 3--2023-1367-S-B dla N.L.F., oraz ADA 7-20-JDF-020 dla N.L.F. Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony Centrum Badań nad Cukrzycą na Uniwersytecie Kolorado Anschutz Campus P30-DK116073 i powiązanych podstawowych obiektów wykorzystanych do wspierania tych prac.

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały zatwierdzone przez University of Colorado Denver Institutional Animal Care and Use Committee (Protokoły 000929). Myszy C57Bl/6 użyte w tym eksperymencie zostały zakupione w Jackson Laboratory i umieszczone w obiekcie o kontrolowanej temperaturze w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z dostępem do jedzenia i wody ad libitum. Izolowane mysie wyspy trzustkowe uzyskano przy użyciu protokołu trawienia kolagenazy, który został wcześniej opisany5,18.
1. Przygotowanie roztworów i pożywek hodowlanych
UWAGA: Pożywki hodowlane, zapasy cytokin i inne odczynniki powinny być przygotowywane w sterylnych warunkach.
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę do hodowli wysp trzustkowych, dodając 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 10 000 U/ml penicyliny i 10 000 μg/ml streptomycyny do 500 ml pożywki 1640 RPMI.</li>
	<li>Przygotować 1x buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej (PBS), pH 7,4. Przygotować 1000-krotny roztwór podstawowy koktajlu cytokin mysich, 10 μg/ml TNF-α 10 μg/ml, 5 μg/ml IL-1β i 100 μg/ml IFN-γ w sterylnym PBS zawierającym 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i przechowywać roztwór w 10 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować 46 μM (50x) roztwór podstawowy FDA w acetonie i przechowywać go w 1 ml porcji w temperaturze -20°C. Przygotować roztwór podstawowy 1,434 mM (50x) PI w PBS i przechowywać go w 1 ml podwielokrotności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 500 ml modyfikowanego wodorowęglanami buforu Krebs-Henseleit HEPES (BMHH) ze 125 mM NaCl, 5,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2 i 10 mM HEPES w 500 ml dH2O. Dostosować pH do 7,4.</li>
	<li>Przygotować 100 ml buforu wiążącego Aneksynę-V z 10 mM HEPES, 140 mM NaCl i 2,5 mM CaCl2 w 100 ml dH2O. Dostosować pH do 7,4.</li>
	<li>Przygotować 1mM Zn2+ selektywny roztwór podstawowy wskaźnika w DMSO i przechowywać w 10 μl podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Barwniki fluorescencyjne są wrażliwe na światło, więc przechowywanie i inkubacja muszą odbywać się w ciemności.</li>
</ol>
2. Leczenie izolowanych wysp trzustkowych cytokinami
<ol>
	<li>Wyizolować mysie wyspy trzustkowe za pomocą mikropipety o pojemności 10 μl do pożywki hodowlanej i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu odzyskania sił po stresie izolacyjnym przed podaniem cytokin.</li>
	<li>Dodać 2 ml wysterylizowanej pożywki do hodowli wysp trzustkowych o średnicy 35 mm na szalkach Petriego niepoddanych hodowli tkankowej i odpowiednio je oznaczyć, aby odróżnić szalki poddane działaniu cytokin i niepoddane działaniu cytokin bez cytokin</li>.
	<li>W przypadku potraw traktowanych cytokinami należy usunąć 6 μl pożywki hodowlanej i zastąpić ją 2 μl każdej cytokiny z roztworu podstawowego, aby uzyskać końcowe względne stężenie cytokin 10 ng / ml TNF-α, 5 ng / ml IL-1β i 100 ng / ml IFN-γ (1x RCC). 
	UWAGA: Dolny RCC wynoszący 0,5x i 0,1x można wytworzyć przez rozcieńczenie roztworów podstawowych sterylnym PBS zawierającym 0,1% BSA odpowiednio w stosunku 1:1 i 1:9.</li>
	<li>Po 12 godz.-24 godz. od izolacji pobrać 10-20 wysepek za pomocą mikropipety pod mikroskopem świetlnym i przenieść do szalek i inkubować w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5%CO2 przez 24 godziny 
	UWAGA: Czas inkubacji może się różnić w zależności od konkretnych celów eksperymentalnych.</li>
</ol>
3. Pomiar żywotności wysp trzustkowych za pomocą FDA/PI
<ol>
	<li>Dodać po 20 μl roztworów podstawowych FDA i PI do 960 μl buforu BMHH zawierającego 0,1% BSA, aby uzyskać końcowe stężenie odpowiednio 0,46 μM i 14,34 μM barwników fluorescencyjnych.</li>
	<li>Podwielokrotność 100 μl roztworu barwiącego na płytkę Petriego o średnicy 7 mm ze szklanym dnem, niepoddaną działaniu kultur tkankowych.</li>
	<li>Po 24 godzinach od inkubacji z cytokinami ostrożnie przenieść co najmniej 6 wysepek z każdego zabiegu na szalkę Petriego ze szklanym dnem. Inkubować przez 5 - 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności (przykryć folią).</li>
	<li>Rób zdjęcia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z obiektywem 40-krotnym zanurzeniem w wodzie. Rób zdjęcia w ciągu 15 minut od barwienia FDA/PI.</li>
	<li>Użyj laserów wzbudzających o długości fali 488 nm i 514 nm, aby wykryć emisje fluorescencji odpowiednio dla FDA (520 nm) i PI (620 nm).</li>
	<li>Wysepki obrazu jako stos z składający się z trzech obrazów oddalonych od siebie o 10 μm. Obrazuj tylko dolną 1/3 - 1/2 wysepki, aby zmniejszyć utratę sygnału z powodu problemów z rozpraszaniem światła w wysepce.</li>
	<li>Policz żywe zielone (FDA-dodatnie) i martwe czerwone (PI-dodatnie) komórki ręcznie w ImageJ (NIH) dla co najmniej 5 wysepek na mysz (n = 3). Oblicz procent śmierci komórki w następujący sposób: 
	Procent śmierci wysepek = liczba martwych komórek/ (liczba martwych komórek + liczba żywych komórek) x 100%</li>
</ol>
4. Pomiar apoptozy za pomocą barwienia
<ol>
	<li>Dodać 8 μl YOPRO-1 (1mM roztwór) do 992 μl buforu obrazowego BMHH, aby uzyskać końcowe stężenie 0,8 μM.</li>
	<li>Porcję 500 μl roztworu barwiącego na płytkę Petriego o średnicy 14 mm ze szklanym dnem, niepoddaną kulturze tkankowej.</li>
	<li>Po 24 godzinach od inkubacji z cytokinami ostrożnie przenieść co najmniej 6 wysepek z każdego zabiegu na szklaną płytkę Petriego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w ciemności (przykryć folią).</li>
	<li>Po 20 minutach inkubacji dodać kroplę NucBlue (barwienie jądrowe, 20 μl) do każdej płytki Petriego ze szklanym dnem i kontynuować inkubację. Całkowity czas inkubacji wynosi 1 godzinę dla YOPRO-1 i 40 minut dla barwienia jądrowego.</li>
	<li>Po 1 godzinie inkubacji przenieść wyspy trzustkowe do świeżego buforu do obrazowania BMHH zawierającego 0,1% BSA (100 μl) na 7-milimetrowej płytce Petriego ze szklanym dnem, niepoddanej hodowli tkankowej.</li>
	<li>Rób zdjęcia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z obiektywem 40-krotnym zanurzeniem w wodzie. Użyj laserów wzbudzających o długości fali 405 nm i 488 nm, aby wykryć emisje fluorescencyjne odpowiednio barwnika jądrowego (460 nm) i YOPRO-1 (509 nm).</li>
	<li>Wysepki obrazu jako stos z składający się z trzech obrazów oddalonych od siebie o 10 μm. Obrazuj tylko dolną 1/3 - 1/2 wysepki, aby zmniejszyć utratę sygnału z powodu problemów z rozpraszaniem światła w wysepce.</li>
	<li>Policz żywe niebieskie (dodatnie barwienie jądrowe) i apoptotyczne zielone (YOPRO-1-dodatnie) komórki ręcznie w ImageJ (NIH) dla co najmniej 5 wysepek na mysz (n = 3). Oblicz procent komórek apoptotycznych wysp trzustkowych w następujący sposób: 
	Procent komórek apoptotycznych wysp trzustkowych = liczba komórek apoptotycznych / (liczba komórek apoptotycznych + liczba żywych komórek) x 100%</li>
</ol>
5. Pomiar apoptozy za pomocą Aneksyny V/ plamy jądrowej
<ol>
	<li>Dodać 2 krople barwnika jądrowego (40 μl) do 1 ml buforu wiążącego aneksynę. Podwielokrotność 100 μl roztworu umieścić na płytce Petriego o średnicy 7 mm ze szklanym dnem, niepoddanej hodowli tkankowej.</li>
	<li>Po 24 godzinach od inkubacji z cytokinami ostrożnie spłukać, pipetując w górę i w dół 3 razy co najmniej 6 wysp trzustkowych z każdego zabiegu w PBS, pipetując trzykrotnie w górę i w dół za pomocą mikropipety o pojemności 10 μl. Przenieść wysepki na płytkę Petriego ze szklanym dnem z roztworem barwienia jądrowego i inkubować je przez 40 minut w temperaturze 37 °C w ciemności (przykryć folią).</li>
	<li>Po 25 minutach inkubacji dodać 5 μl koniugatu Annexin V Alexa Flour 488 do każdej płytki Petriego ze szklanym dnem i kontynuować inkubację. Całkowity czas inkubacji wynosi 40 minut dla barwienia jądrowego i 15 minut dla Aneksyny V.</li>
	<li>Po 40 minutach inkubacji przenieść wysepki do świeżego bufora do obrazowania BMHH (bez aneksyny V lub barwienia jądrowego) na płytce Petriego o średnicy 7 mm ze szklanym dnem.</li>
	<li>Rób zdjęcia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z obiektywem 40-krotnym zanurzeniem w wodzie. Użyć laserów wzbudzających o długości fali 405 nm i 488 nm, aby wykryć emisje fluorescencyjne odpowiednio barwienia jądrowego (460 nm) i koniugatu aneksyny V (515 nm).</li>
	<li>Wysepki obrazu jako stos z składający się z trzech obrazów oddalonych od siebie o 10 μm. Obrazuj tylko dolną 1/3 - 1/2 wysepki, aby zmniejszyć utratę sygnału z powodu problemów z rozpraszaniem światła w wysepce.</li>
	<li>Policz żywe niebieskie (dodatnie barwienie jądrowe) i apoptotyczne zielone (aneksyna V-dodatnia) komórki ręcznie w ImageJ (NIH) dla co najmniej 5 wysepek na mysz (n = 3). Oblicz procent komórek apoptotycznych wysp trzustkowych w następujący sposób: 
	Procent komórek apoptotycznych = liczba komórek apoptotycznych / (liczba komórek apoptotycznych + liczba żywych komórek) x 100%</li>
</ol>
6. Pomiar śmierci komórek β za pomocą wskaźnika selektywnego Zn2+ / barwienie jądrowe / PI
<ol>
	<li>Dodać 2 μl roztworu podstawowego Zn2+ o selektywnym wskaźnikuAM do 998 μl buforu do obrazowania BMHH, aby uzyskać końcowe stężenie 0,2 μM. Podwielokrotność 500 μl roztworu barwiącego do 14-milimetrowej płytki Petriego ze szklanym dnem, niepoddanej hodowli tkankowej.</li>
	<li>Po 24 godzinach od inkubacji z cytokinami ostrożnie przenieść co najmniej 6 wysepek z każdego zabiegu na szalkę Petriego ze szklanym dnem. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w ciemności z roztworem AM o wskaźniku selektywnym Zn2+ (przykryć folią).</li>
	<li>Po 20 minutach inkubacji dodać kroplę barwnika jądrowego (20 μl) do każdej płytki Petriego ze szklanym dnem, zgodnie z instrukcjami producenta i kontynuować inkubację. Całkowity czas inkubacji wynosi 1 h dla wskaźnika selektywnego Zn2+ i 40 min dla barwienia jądrowego.</li>
	<li>Po 1 godzinie inkubacji przenieść wyspy trzustkowe do świeżego buforu do obrazowania BMHH zawierającego 0,1% BSA (100 μl) na 7-milimetrowej płytce Petriego ze szklanym dnem, niepoddanej hodowli tkankowej. Dodawać 2 μl roztworu podstawowego PI przez 10 minut, aby uzyskać końcowe stężenie 20 μg/ml.</li>
	<li>Rób zdjęcia w ciągu 15 minut od barwienia PI za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z obiektywem 40-krotnym zanurzeniem w wodzie. Użyj laserów wzbudzających o długości fali 405 nm, 488 nm i 514 nm, aby wykryć emisje fluorescencji barwienia jądrowego (460 nm), odpowiednio wskaźnika selektywnego Zn2+ (516 nm) i PI (620 nm).</li>
	<li>Wysepki obrazu jako stos z składający się z trzech obrazów oddalonych od siebie o 10 μm. Obrazuj tylko dolną 1/3 - 1/2 wysepki, aby zmniejszyć utratę sygnału z powodu problemów z rozpraszaniem światła w wysepce.</li>
	<li>Policz żywe komórki niebieskie (dodatnie barwienie jądrowe), zielone cynkowe (Zn2+ selektywny wskaźnik-dodatni) i martwe czerwone (PI-dodatnie) komórki ręcznie w ImageJ (NIH) dla co najmniej 5 wysepek na mysz (n = 3). Oblicz procent śmierci komórek β w następujący sposób: 
	procent śmierci komórek β = liczba komórek cynkowo-dodatnich i PI-dodatnich / (liczba martwych + żywych komórek wysp trzustkowych) x 100% 
	lub 
	procent śmierci komórek β-dodatnich = liczba komórek cynkowo-dodatnich i PI-dodatnich / (liczba komórek cynkowo-dodatnich) x 100%</li>
</ol>

<ol><li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cells+of+the+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clinical+medicine%22%5BJournal%5D)">The cells of the islets of Langerhans.</a> J Clinical medicine. 7 (3), 54(2018).</li>
<li>Grunnet, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+cytokines+activate+the+intrinsic+apoptotic+pathway+in+%CE%B2-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory cytokines activate the intrinsic apoptotic pathway in β-cells.</a> Diabetes. 58 (8), 1807-1815 (2009).</li>
<li>Delaney, C. A., Pavlovic, D., Hoorens, A., Pipeleers, D. G., Eizirik, D. cL. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+induce+deoxyribonucleic+acid+strand+breaks+and+apoptosis+in+human+pancreatic+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Cytokines induce deoxyribonucleic acid strand breaks and apoptosis in human pancreatic islet cells.</a> Endocrinology. 138 (6), 2610-2614 (1997).</li>
<li>Farnsworth, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gap+junction+coupling+within+the+islet+of+langerhans+during+the+development+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of gap junction coupling within the islet of langerhans during the development of type 1 diabetes.</a> Front Physiol. 13, 913611(2022).</li>
<li>Collins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+protein+kinase+c+%CE%B4+by+caspase-3+mediates+proinflammatory+cytokine-induced+apoptosis+in+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cleavage of protein kinase c δ by caspase-3 mediates proinflammatory cytokine-induced apoptosis in pancreatic islets.</a> J Biol Chem. 300 (9), 107611(2024).</li>
<li>Farnsworth, N. L., Walter, R., Piscopio, R. A., Schleicher, W. E., Benninger, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exendin-4+overcomes+cytokine-induced+decreases+in+gap+junction+coupling+via+protein+kinase+A+and+Epac2+in+mouse+and+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Exendin-4 overcomes cytokine-induced decreases in gap junction coupling via protein kinase A and Epac2 in mouse and human islets.</a> J Physiol. 597 (2), 431-447 (2019).</li>
<li>NIH CIT Consortium Chemistry Manufacturing Controls Monitoring Committee. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+human+pancreatic+islet-viability+estimation+of+islet+using+fluorescent+dyes+%28FDA%2FPI%29%3A+Standard+operating+procedure+of+the+NIH+clinical+islet+transplantation+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22CellR4+Repair+Replace+Regen+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Purified human pancreatic islet-viability estimation of islet using fluorescent dyes (FDA/PI): Standard operating procedure of the NIH clinical islet transplantation consortium.</a> CellR4 Repair Replace Regen Reprogram. 3 (1), e1378(2015).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis+flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Meth%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled annexin V.</a> J Immunol Meth. 184 (1), 39-51 (1995).</li>
<li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+annexin+V%2Fpropidium+iodide+apoptosis+assay+for+accurate+assessment+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death.</a> J Vis Exp. (50), e2597(2011).</li>
<li>Emdin, S., Dodson, G., Cutfield, J., Cutfield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+zinc+in+insulin+biosynthesis%3A+some+possible+zinc-insulin+interactions+in+the+pancreatic+B-cell%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Role of zinc in insulin biosynthesis: some possible zinc-insulin interactions in the pancreatic B-cell.</a> Diabetologia. 19, 174-182 (1980).</li>
<li>ZA, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+staining+fresh+and+cultured+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A simple method of staining fresh and cultured islets.</a> Transplantation. 45 (4), 827-830 (1988).</li>
<li>Zalewski, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+image+analysis+of+labile+zinc+in+viable+pancreatic+islet+cells+using+a+specific+fluorescent+probe+for+zinc%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Video image analysis of labile zinc in viable pancreatic islet cells using a specific fluorescent probe for zinc.</a> J Histochem Cytochem. 42 (7), 877-884 (1994).</li>
<li>Jindal, R. M., Taylor, R. P., Gray, D. W., Esmeraldo, R., Morris, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+quantification+of+islets+by+measurement+of+zinc+content%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">A new method for quantification of islets by measurement of zinc content.</a> Diabetes. 41 (9), 1056-1062 (1992).</li>
<li>Jayaraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+detection+of+viable+human+pancreatic+beta+cells+by+flow+cytometry+using+fluorophores+that+selectively+detect+labile+zinc%2C+mitochondrial+membrane+potential+and+protein+thiols%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols.</a> Cytometry A. 73 (7), 615-625 (2008).</li>
<li>Lukowiak, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+purification+of+functional+human+%CE%B2-cells+by+a+new+specific+zinc-fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Identification and purification of functional human β-cells by a new specific zinc-fluorescent probe.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 519-527 (2001).</li>
<li>Gee, K. R., Zhou, Z. L., Qian, W. J., Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+imaging+of+zinc+secretion+from+pancreatic+%CE%B2-cells+using+a+new+fluorescent+zinc+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Detection and imaging of zinc secretion from pancreatic β-cells using a new fluorescent zinc indicator.</a> J Am Chem Soc. 124 (5), 776-778 (2002).</li>
<li>Gyulkhandanyan, A. V., Lee, S. C., Bikopoulos, G., Dai, F., Wheeler, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zn2%2B-transporting+pathways+in+pancreatic+%CE%B2-cells%3A+a+role+for+the+L-type+voltage-gated+Ca2%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Zn2+-transporting pathways in pancreatic β-cells: a role for the L-type voltage-gated Ca2+ channel.</a> J Biol Chem. 281 (14), 9361-9372 (2006).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+pancreatic+islet+cell-based+screening+for+diabetogenic+environmental+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A murine pancreatic islet cell-based screening for diabetogenic environmental chemicals.</a> J Vis Exp. (136), e57327(2018).</li>
<li>Farnsworth, N. L., Walter, R. L., Hemmati, A., Westacott, M. J., Benninger, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+level+pro-inflammatory+cytokines+decrease+connexin36+gap+junction+coupling+in+mouse+and+human+islets+through+nitric+oxide-mediated+protein+kinase+C%CE%B4%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Low level pro-inflammatory cytokines decrease connexin36 gap junction coupling in mouse and human islets through nitric oxide-mediated protein kinase Cδ.</a> J Biol Chem. 291 (7), 3184-3196 (2016).</li>
<li>Dalle, S., Abderrahmani, A., Renard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+inhibitors+of+%CE%B2-cell+dysfunction+and+death+as+therapeutics+for+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological inhibitors of β-cell dysfunction and death as therapeutics for diabetes.</a> Front Endocrinol. 14, 1076343(2023).</li>
<li>Collins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-coated+polycaprolactone-Benzalkonium+chloride+nanocapsules+for+targeted+drug+delivery+to+the+pancreatic+%CE%B2-Cell%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Bio+Mater%22%5BJournal%5D)">Peptide-coated polycaprolactone-Benzalkonium chloride nanocapsules for targeted drug delivery to the pancreatic β-Cell.</a> ACS Appl Bio Mater. 7 (10), 6451-6466 (2024).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Badanie to wykazało skuteczność metod wielobarwnych z barwnikami fluorescencyjnymi i mikroskopią konfokalną w ocenie żywotności komórek wysp trzustkowych, apoptozy i przeżycia komórek β pod wpływem stresu wywołanego cytokinami. Barwienie FDA/PI ujawniło zależny od dawki wzrost śmierci komórek w wyspach trzustkowych wystawionych na działanie cytokin, co widać po czerwonej fluorescencji oznaczającej komórki z naruszoną błoną, potwierdzając cytotoksyczny wpływ cytokin na żywotność komórek. Barwienie FDA/PI identyfikuje równ...

Wyspy trzustkowe, znane również jako wysepki Langerhansa, to zbiór komórek endokrynnych znajdujących się w trzustce. Komórki β produkujące insulinę są najliczniejszym i najbardziej znaczącym funkcjonalnie składnikiem wysp trzustkowych. Te β-komórki wydzielają insulinę, hormon, który odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy glukozy1. W cukrzycy typu 1 (T1D) układ odpornościowy atakuje wyspy trzustkowe i infiltruje je, niszcząc komórki β produkujące insulinę. W tym ataku autoimmunologicznym pośredniczą przede wszystkim cytokiny prozapalne, w tym interleukina-1β (IL-1β), czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-α) i interferon-gamma (IFN-γ) 2. Cytokiny te inicjują kaskadę zdarzeń sygnalizacyjnych w komórkach β, które ostatecznie wywołują apoptozę3. Apoptoza, czyli zaprogramowana śmierć komórki, jest ściśle regulowanym procesem obejmującym aktywację kaspaz, fragmentację DNA i dezintegrację komórkową. Przyczynia się do stopniowej utraty masy i funkcji komórek β podczas wystąpienia cukrzycy typu 1D3.
Zrozumienie mechanizmów molekularnych, które napędzają apoptozę komórek β, jest kluczowe dla określenia strategii zapobiegania lub łagodzenia β-komórkowej destrukcji w cukrzycy typu 1. Aby to osiągnąć, izolowane wyspy trzustkowe z modeli eksperymentalnych lub ludzkich zwłok służą jako solidny i dobrze ugruntowany system modelowy do badania patologii komórek β2,3. Traktując te izolowane wyspy trzustkowe cytokinami prozapalnymi, naukowcy mogą odtworzyć środowisko charakteryzujące wczesną cukrzycę typu 1, co pozwala na szczegółowe badanie dysfunkcji komórek β i śmierci in vitro4,5. Eksperymenty te dostarczają kluczowych informacji na temat wrażliwości i przeżywalności komórek β w warunkach związanych z chorobą, a także służą jako platforma do testowania interwencji terapeutycznych mających na celu ochronę lub ratowanie komórek β przed apoptozą wywołaną cytokinami. Wykorzystując ten system in vitro, możemy skutecznie analizować, w jaki sposób wysepki różnych gatunków reagują na różne warunki, zapewniając lepsze zrozumienie funkcjonalnych i apoptotycznych różnic między gatunkami.
Poprzednie badania wykazały, że mysie i ludzkie wyspy trzustkowe leczone przez 24 godziny koktajlem (1x = 10 ng/mL TNF-α, 5 ng/mL IL-1β i 100 ng/mL IFN-γ) cytokin pochodzenia mysiego i ludzkiego, odpowiednio, skutkowały znaczną śmiercią komórek wysp trzustkowych4,5,6. Żywotność wysp trzustkowych została potwierdzona przez barwienie komórek traktowanych cytokinami dioctanem fluoresceiny (FDA) i jodkiem propidyny (PI)5,6. Na całym świecie żywotność wysepek jest oceniana przy użyciu standardowej techniki wykluczania barwnika wiążącego kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA) z FDA i PI7. Barwienia fluorescencyjne lub substraty sprzężone z barwnikiem oceniają żywotność komórek na podstawie integralności błony i przepuszczalności. FDA, barwnik przepuszczalny dla komórek, jest przekształcany przez żywe komórki w zieloną fluorescencję (fluoresceinę). W przeciwieństwie do tego, PI, barwnik nieprzepuszczalny dla komórek, barwi tylko jądra martwych komórek z uszkodzonymi błonami7. Komórki są następnie analizowane za pomocą dwukolorowego obrazowania pod mikroskopem konfokalnym, gdzie zielone i czerwone fluorescencje oznaczają odpowiednio żywe i martwe komórki.
Ograniczeniem protokołu barwienia FDA/PI jest to, że PI dostaje się tylko do komórek, które utraciły selektywność błonową, co oznacza, że nie może rozróżnić wczesnych komórek apoptotycznych. Co więcej, metoda ta nie jest w stanie rozróżnić podzbiorów komórek, co czyni ją nieodpowiednią do selektywnej oceny żywotności komórek β. Protokół Annexin V/ PI jest powszechnie używany do badania komórek apoptotycznych, a protokół został zmodyfikowany w celu poprawy jego dokładności8. Wczesne etapy apoptozy obejmują translokację fosfatydyloseryny z wewnętrznej do zewnętrznej warstwy błony plazmatycznej. Aneksyna V, białko zależne od wapnia, wiąże się z wysokim powinowactwem do tej eksponowanej fosfatydyloseryny. Barwienie PI przeprowadza się wraz z aneksyną-V w celu odróżnienia komórek apoptotycznych (tylko aneksyna V-dodatnia) od komórek martwiczych (dodatnich zarówno dla aneksyny-V, jak i PI), ponieważ komórki martwicze również wykazują fosfatydyloserynę z powodu naruszonej integralności błony9. Inne barwniki, takie jak YOPRO-1, są również używane do ilościowego określania apoptozy komórek wysp trzustkowych. Błona komórkowa żywotnych komórek jest nieprzepuszczalna dla YOPRO-1, w przeciwieństwie do aneksyny-V, która nie może określić ilościowo żywych komórek ulegających apoptozie.
Aby ocenić śmierć komórek trzustki β, potrzebne są specyficzne barwniki skierowane tylko do komórek produkujących insulinę. Charakterystyczną cechą komórek β trzustki jest to, że część wewnątrzkomórkowego Zn2 + jest przechowywana w pęcherzykach jako kompleks insuliny Zn2 + (stosunek 2:1) 10. Wolny Zn2+ występuje również w przestrzeni pozaziarnistej wokół komórek β jako rezerwuary. Wolne Zn2+ i Zn2+ luźno związane z insuliną w granulkach wydzielniczych można uwidocznić za pomocą barwników wiążących. Ditizone, barwnik wiążący, jest powszechnie stosowany do oceny czystości wysp trzustkowych, ale nie może być łączony z barwnikami fluorescencyjnymi używanymi do oceny żywotności i funkcji komórek β11. Sondy UV, takie jak TSQ i Zinquin, które są wysoce selektywne w stosunku do Zn2+, zostały opracowane do ilościowego oznaczania komórek β poprzez obrazowanie i pomiar wolnego wewnątrzkomórkowego Zn2+ 12,13. Jednak ich zastosowanie jest ograniczone przez słabą rozpuszczalność, nierównomierne obciążenie komórek, wymóg wzbudzenia UV i podział na kwaśne pęcherzyki14. Sondy fluorescencyjne o widzialnej długości fali, takie jak Newport green i selektywny wskaźnik Zn2+, również zostały opracowane w celu przezwyciężenia tych ograniczeń i są obecnie szeroko stosowane do wykrywania komórek β w izolowanych ludzkich wysepkach15,16. FluoZin-3 (selektywny wskaźnik Zn2+) ma wyższe powinowactwo do Zn2+ i lepszą wydajność kwantową niż Newport Green i okazał się skuteczny w obrazowaniu Zn2+ uwalnianego jednocześnie z insuliną w izolowanych wyspach trzustkowych14,17.
Używanie barwników fluorescencyjnych, takich jak FDA, PI, Annexin V, YOPRO-1 i wskaźnik selektywny Zn2+, umożliwia pomiar i różnicowanie między komórkami żywymi, apoptozycznymi i całkowicie martwymi. Połączenie kompatybilnych i wysoce selektywnych sond oferuje również ukierunkowaną metodę oceny i ilościowego określania żywotności i apoptozy komórek β, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia i złagodzenia niszczenia komórek β w badaniach nad cukrzycą i opracowywaniu leków.

<table><tbody><tr><td>Szalka Petriego ze szklanym dnem 14 mm</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>1640 RPMI</td><td>Corning</td><td>10-041-CV</td><td></td></tr><tr><td>35 mm szalka Petriego</td><td>Celltreat</td><td>229638</td><td></td></tr><tr><td>7 mm szalka Petriego ze szklanym dnem</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-7-C</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V, mąka Alexa 488</td><td>Thermo Fisher (Invitrogen)</td><td>A13201</td><td>ex488/em515</td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodny sulfotlenek dimetylu</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Flouzin-3, AM</td><td>Thermo Fisher (Invitrogen)</td><td>F24195</td><td>ex488/em516</td></tr><tr><td>Dioctan fluoresceiny (FDA)</td><td>Thermo Fisher (Invitrogen)</td><td>F1303</td><td>ex488/em520</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu</td><td>NIH</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik NucBlue Live ReadyProbes (Hoechst 33342)</td><td>Thermo Fisher (Invitrogen)</td><td>R37605</td><td>ex360/em460</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>15-140-122&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki soli fizjologicznej buforowane fosforanami</td><td>Fisher</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu, granulowany</td><td>Macron</td><td>6858-04</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Thermo Fisher (Invitrogen)</td><td>P1304MP</td><td>ex535/em620</td></tr><tr><td>Rekombinowane białko myszy Białko IFN-gamma R</td><td>& D Systems</td><td>485-MI-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>Mysz rekombinowana IL-1 beta/IL-1F2&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>401-ML-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane białko TNF-alfa (aa 80-235) myszy</td><td>R& D Systems</td><td>410-MT-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu, kryształ</td><td>Macron</td><td>7581-12</td><td></td></tr><tr><td>Stellaris Mikroskop konfokalny z detektorami spektralnymi</td><td>Leica</td><td>DMI-8</td><td>&nbsp; 40-krotny obiektyw do zanurzenia w wodzie.</td></tr><tr><td>Yopro-1 Jodek</td><td>Thermo Fisher (Invitrogen)</td><td>Y3603</td><td>ex488/em509</td></tr></tbody></table>

leczenie izolowanych wysp trzustkowych i pomiar apoptozy

Isolated Pancreatic Islet Treatment and Apoptosis Measurement

To badanie bada wpływ cytokin prozapalnych na wyspy trzustkowe, szczególnie na β komórki produkujące insulinę, używając kombinacji technik barwienia fluorescencyjnego i mikroskopii konfokalnej do oceny żywotności komórek, apoptozy i śmierci specyficznej dla β komórki. Izolowane mysie wyspy trzustkowe traktowano koktajlem cytokin o różnych stężeniach, w tym TNF-α, IL-1β i IFN-γ, aby naśladować apoptozę o podłożu immunologicznym podczas rozwoju cukrzycy typu 1. Żywotność komórek wysp trzustkowych oceniano za pomocą podwójnego barwienia FDA/PI, gdzie konwersja FDA do fluoresceiny wskazywała na żywe komórki, a komórki z naruszoną błoną oznaczaną PI. YOPRO-1 i barwienie jądrowe dostarczyły dodatkowych danych na temat apoptozy, a Aneksyna-V potwierdziła wczesne komórki apoptotyczne. Analiza ilościowa wykazała znaczny wzrost apoptozy i śmiertelności komórek w wyspach trzustkowych traktowanych cytokinami. Aby specyficznie ocenić wpływ na komórki β, zastosowano selektywne barwienie wskaźnikowe Zn2+ do znakowania komórek produkujących insulinę poprzez asocjację w granulkach insuliny, ujawniając znaczną utratę komórek β po leczeniu wysp trzustkowych cytokinami prozapalnymi przez 24 godziny. Te protokoły wielobarwne skutecznie wychwytują i określają ilościowo zakres uszkodzeń wysp trzustkowych wywołanych cytokinami i mogą być wykorzystane do oceny terapii zaprojektowanych w celu zapobiegania apoptozie komórek β we wczesnej cukrzycy typu 1.

Do oceny żywotności wysepek poddanych działaniu cytokin zastosowano podwójne barwienie FDA i PI. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach (n = 3), a dane uzyskano z wielu obrazów z serii z-stack w odstępach 10 µm, przy czym każda replika zawierała średnie dane z 5 lub 6 wysepek, aby zapewnić powtarzalność i umożliwić porównanie statystyczne między wysepkami traktowanymi a nietraktowanymi. Rycina 1A przedstawia zdrowe wyspki z nietraktowanej grupy kontrolnej, wykazujące wy...

To badanie wykorzystuje wielobarwne markery fluorescencji śmierci komórki i apoptozy w połączeniu z mikroskopią konfokalną do oceny apoptozy wywołanej cytokinami i śmierci specyficznej dla komórek β w wyspach trzustkowych. Ujawnia przestrzenne i czasowe zmiany w śmierci komórki i apoptozie w odpowiedzi na bodźce zewnątrzkomórkowe.

Leczenie izolowanych wysp trzustkowych i pomiar apoptozy

This study investigates the effect of pro-inflammatory cytokines on pancreatic islets, particularly insulin-producing &#946;-cells, using a combination of ...

Moje badania koncentrują się na zrozumieniu czynników, które prowadzą do rozwoju i progresji cukrzycy typu pierwszego oraz na opracowaniu nowych terapii, aby zapewnić opcje leczenia dla pacjentów z cukrzycą typu 1. Nasze laboratorium wykorzystuje zaprojektowane biomateriały jako narzędzie do badania cukrzycy typu pierwszego w tkankach ludzkich oraz do opracowywania spersonalizowanych terapii dostarczania leków dla każdego stadium cukrzycy typu 1. Nasz protokół dostarcza szczegółowych informacji na temat mechanizmów i lokalizacji przestrzennej śmierci komórek w nienaruszonych wyspach trzustkowych, co pomaga nam lepiej zrozumieć przyczyny śmierci wysp trzustkowych w cukrzycy typu 1.[Narrator] Na początek zdobądź mysie wysepki i za pomocą mikropipety o pojemności 10 mikrolitrów wyizoluj je w pożywce hodowlanej. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby umożliwić regenerację po stresie izolacyjnym przed leczeniem cytokinami. Dodaj dwa mililitry wysterylizowanej pożywki do hodowli wysp trzustkowych o grubości 35 milimetrów, nietkankowych, poddanych kulturze szalek Petriego. Oznacz naczynia odpowiednio, aby odróżnić potrawy traktowane cytokinami od ni

isolated-pancreatic-islet-treatment-and-apoptosis-measurement

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Uzyskanie wysokiej jakości i odpowiedniej ilości ludzkich wysepek jest jednym z głównych warunków pomyślnego przeszczepienia wysepek. W tym filmie krok po kroku opisujemy procedury izolacji ludzkich wysepek trzustkowych (część II: oczyszczanie i hodowla ludzkich wysepek) z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody zautomatyzowanej.

Izolacja ludzkich wysepek trzustkowych: Część II: Oczyszczanie i hodowla ludzkich wysepek

Dostępność wysepek trzustkowych od osób z cukrzycą typu 2 do celów badawczych jest niewystarczająca. Przedstawiamy tutaj nasz protokół izolacji wysepek od pacjentów poddawanych częściowej pankreatektomii. Podejście to stanowi unikalną możliwość pozyskania wysepek od osób z cukrzycą typu 2 oraz klinicznie dopasowanych osób niediabetycznych w liczbie odpowiedniej do badań podstawowych i klinicznych.

Izolacja wysepek trzustkowych człowieka od pacjentów po częściowej pankreatektomii

Wyspy trzustkowe, zwane również wysepkami Langerhansa, to skupisko komórek endokrynnych, które produkują hormony do regulacji poziomu glukozy i innych ważnych funkcji biologicznych. Ten protokół wyjaśnia metodę izolowania wysp trzustkowych poprzez najpierw perfuzję kolagenazy przez Ampulla Vatera w celu trawienia zewnątrzwydzielniczej tkanki trzustki i uproszczone wirowanie gradientu gęstości w celu oczyszczenia wysp trzustkowych od myszy.

Izolacja wysp trzustkowych poprzez perfuzję kolagenazy: enzymatyczna metoda izolowania komórek wysp trzustkowych

Badanie in vitro funkcji komórek β przy użyciu izolowanych mysich wysepek Langerhansa jest ważnym elementem badań nad patofizjologią i terapią cukrzycy. Chociaż dostępnych jest wiele dalszych zastosowań, protokół ten szczegółowo opisuje pomiar wewnątrzkomórkowego cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP) jako podstawowego parametru określającego funkcję komórek β.

Metoda izolacji wysp trzustkowych myszy i wewnątrzkomórkowego oznaczania cAMP

Kluczowe wyzwania dla dziedziny badań nad cukrzycą to zrozumienie mechanizmów molekularnych regulujących replikację komórek β wysp trzustkowych oraz opracowanie metod stymulowania regeneracji komórek β. W niniejszym artykule przedstawiono metodę badań przesiewowych o wysokiej zawartości w celu identyfikacji i oceny aktywności małych cząsteczek wspomagającej replikację komórek β.

Platforma odkrywania replikacji β komórek wysp trzustkowych o wysokiej zawartości in vitro

Ten protokół przedstawia metodę analizy ilościowej tworzenia kompleksu białek mitofagii, szczególnie w komórkach beta z pierwotnych próbek ludzkich wysp trzustkowych. Technika ta pozwala zatem na analizę mitofagii z ograniczonego materiału biologicznego, który ma kluczowe znaczenie w cennych próbkach ludzkich komórek beta trzustki.

Wizualizacja endogennych kompleksów mitofagii in situ w ludzkich komórkach beta trzustki z wykorzystaniem testu ligacji zbliżeniowej

Tutaj prezentujemy protokół do generowania wysokiej jakości, wielkoskalowych danych transkryptomu pojedynczych komórek z izolowanych ludzkich wysp trzustkowych przy użyciu technologii sekwencjonowania mikroprzepływowego jednokomórkowego RNA opartej na kropelkach.

Sekwencjonowanie i analiza RNA pojedynczych komórek ludzkich wysp trzustkowych

Ten protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący pobierania trzustki świni do izolacji i oczyszczania wysp trzustkowych.

Chirurgiczna perfuzja i izolacja trzustki świni w celu izolacji wysp trzustkowych

W tym miejscu podajemy szczegółowe informacje na temat stymulowanego glukozą wydzielania insuliny (GSIS) poprzez perfuzję przez naczynia krwionośne myszy z nienaruszoną trzustką jako dodatkową technikę oceny funkcji endokrynnej trzustki z redukcją możliwych czynników zakłócających.

Stymulowane glukozą wydzielanie insuliny poprzez perfuzję przez naczynia krwionośne myszy z nienaruszoną trzustką

Protokół ten opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgicznego pobierania brań, trawienia enzymatycznego oraz oczyszczania wysetek trzustkowych szczurów Lewisa w gęście, umożliwiając przygotowania o wysokiej wydajności i wysokiej czystości do bezpośredniego zastosowania w przeszczepach lub badaniach in vitro .

Izolacja i oczyszczanie wysepek trzustkowych od szczurów Lewisa za pomocą trawienia enzymatycznego i rozdzielania gęstościowo-gradientowego

Poznaj metodę leczenia wysp trzustkowych i pomiaru apoptozy u myszy przy użyciu wielobarwnej fluorescencji. Technika ta pozwala badać mechanizmy śmierci komórek beta w cukrzycy typu 1.

Leczenie izolowanych wysp trzustkowych i pomiar apoptozy

Przeglądaj więcej filmów