Leczenie izolowanych wysp trzustkowych i pomiar apoptozy

Moje badania koncentrują się na zrozumieniu czynników, które prowadzą do rozwoju i progresji cukrzycy typu pierwszego oraz na opracowaniu nowych terapii, aby zapewnić opcje leczenia dla pacjentów z cukrzycą typu 1. Nasze laboratorium wykorzystuje zaprojektowane biomateriały jako narzędzie do badania cukrzycy typu pierwszego w tkankach ludzkich oraz do opracowywania spersonalizowanych terapii dostarczania leków dla każdego stadium cukrzycy typu 1. Nasz protokół dostarcza szczegółowych informacji na temat mechanizmów i lokalizacji przestrzennej śmierci komórek w nienaruszonych wyspach trzustkowych, co pomaga nam lepiej zrozumieć przyczyny śmierci wysp trzustkowych w cukrzycy typu 1.

[Narrator] Na początek zdobądź mysie wysepki i za pomocą mikropipety o pojemności 10 mikrolitrów wyizoluj je w pożywce hodowlanej. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby umożliwić regenerację po stresie izolacyjnym przed leczeniem cytokinami. Dodaj dwa mililitry wysterylizowanej pożywki do hodowli wysp trzustkowych o grubości 35 milimetrów, nietkankowych, poddanych kulturze szalek Petriego. Oznacz naczynia odpowiednio, aby odróżnić potrawy traktowane cytokinami od niepoddanych działaniu cytokin. W przypadku potraw poddanych działaniu cytokin usuń sześć mikrolitrów pożywki hodowlanej. Zastąp dwoma mikrolitrami każdej cytokiny z roztworu podstawowego, aby osiągnąć pożądane stężenie końcowe. Po 12 do 24 godzinach od izolacji pobierz od 10 do 20 wysepek za pomocą mikropipety pod mikroskopem świetlnym. Przenieś wysepki do przygotowanych potraw i inkubuj w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Aby wykonać pomiar żywotności wysp trzustkowych przy użyciu FDA i PI, dodaj po 20 mikrolitrów roztworów podstawowych FDA i PI do 960 mikrolitrów buforu BMHH zawierającego 0,1% albuminy surowicy bydlęcej. Podać 100 mikrolitrów roztworu barwiącego na siedmiomilimetrową szklaną płytkę Petriego z nietkankowym dnem, poddaną kulturze. Po 24 godzinach od inkubacji z cytaokinami ostrożnie przenieść co najmniej sześć wysepek z każdego zabiegu na płytkę Petriego ze szklanym dnem. Inkubuj wysepki przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, przykrywając naczynie folią. Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z obiektywem 40-krotnym zanurzeniem w wodzie. Uzyskaj obrazy w ciągu 15 minut od barwienia dioctanem fluoresceiny i jodkiem propidyny. W przypadku pomiaru apoptozy za pomocą barwienia najpierw dodaj osiem mikrolitrów YOPRO-1 z jednomilimolowego roztworu podstawowego do 992 mikrolitrów buforu obrazowego BMHH. Porcję pięciu 500 mikrolitrów roztworu barwiącego umieścić na 14-milimetrowej szklanej dnie, nietkankowej, poddanej kulturze szalce Petriego. Po 24 godzinach od inkubacji z cytokinami ostrożnie przenieść co najmniej sześć wysepek z każdego zabiegu na płytkę Petriego ze szklanym dnem. Inkubuj wysepki przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności, przykrywając naczynie folią. Po 20 minutach inkubacji dodaj 20 mikrolitrów barwnika jądrowego NucBlue do każdej płytki Petriego ze szklanym dnem. Kontynuuj inkubację, aby osiągnąć całkowity czas inkubacji wynoszący jedną godzinę w przypadku YOPRO-1 i 40 minut w przypadku barwienia jądrowego. Następnie przenieś wysepki do siedmiomilimetrowego, nietkankowego, poddanego kulturze Petriego ze szklanym dnem ze 100 mikrolitrami świeżego buforu do obrazowania BMHH zawierającego 0,1% BSA. Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z obiektywem 40-krotnym zanurzeniem w wodzie. Użyj laserów wzbudzających o określonych długościach fal, aby wykryć emisje fluorescencji barwników. Dodaj dwie krople lub 40 mikrolitrów plamy jądrowej do jednego mililitra buforu wiążącego aneksynę. Porcję 100 mikrolitrów roztworu rozmieścić na siedmiomilimetrowej szklanej płytce Petriego z dnem bez tkanki, poddanej kulturze. Po 24 godzinach od inkubacji z cytokinami, przy użyciu mikropipety o pojemności 10 mikrolitrów, ostrożnie przepłukać co najmniej sześć wysp trzustkowych z każdego zabiegu w PBS, trzykrotnie pipetując w górę i w dół. Przenieść wysepki na szalkę Petriego ze szklanym dnem zawierającą roztwór barwienia jądrowego i inkubować przez 40 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności, przykrywając naczynie folią. Po 25 minutach inkubacji dodać pięć mikrolitrów koniugatu Annexin V Alexa Fluor 488 do każdej płytki Petriego ze szklanym dnem. Kontynuować inkubację, aby osiągnąć całkowity czas inkubacji wynoszący 40 minut w przypadku barwienia jądrowego i 15 minut w przypadku załącznika V. Po 40 minutach inkubacji przenieść wysepki do świeżego bufora obrazowania BMHH bez aneksyny V lub barwienia jądrowego na siedmiomilimetrowej szklanej szalce Petriego. Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu 40-krotnego obiektywu zanurzającego w wodzie i laserów wzbudzających o określonych długościach fal. Dodać dwa mikrolitry roztworu podstawowego AM ze wskaźnikiem selektywnym jonów do 998 mikrolitrów buforu obrazującego BMHH do końcowego stężenia 0,2 mikromola. Porcję 500 mikrolitrów roztworu barwiącego do 14-milimetrowej szklanej płytki Petriego z dnem o grubości 14 milimetrów, nietkankowej, poddanej kulturze Petriego. Po 24 godzinach od inkubacji z cytokinami ostrożnie przenieść co najmniej sześć wysepek z każdego zabiegu na płytkę Petriego ze szklanym dnem. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności, przykrywając naczynie folią. Po 20 minutach inkubacji dodaj 20 mikrolitrów barwnika jądrowego do każdej szalki Petriego i kontynuuj inkubację, jak wspomniano. Następnie przenieś wysepki do siedmiomilimetrowego, nietkankowego, poddanego kulturze Petriego ze szklanym dnem ze 100 mikrolitrami świeżego buforu do obrazowania BMHH zawierającego 0,1% BSA. Dodaj dwa mikrolitry roztworu podstawowego PI, aby osiągnąć końcowe stężenie 20 mikrogramów na mililitr i inkubować przez 10 minut. Rejestruj obrazy w ciągu 15 minut od barwienia jodkiem propidyny za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z 40-krotnym obiektywem zanurzonym w wodzie i laserami wzbudzającymi o określonych długościach fal. Po podwójnym barwieniu za pomocą FDA i PI, zdrowe wysepki z nieleczonej grupy kontrolnej wykazywały silną zieloną fluorescencję, co wskazuje na wysoką żywotność z nienaruszonymi błonami komórkowymi. Wyspy trzustkowe traktowane cytokinami wykazywały wyraźną czerwoną fluorescencję, co oznaczało zwiększoną śmierć komórek z powodu naruszonej integralności błony. Zależny od dawki wzrost śmierci komórek wysp trzustkowych obserwowano wraz ze wzrostem stężenia cytokin, przy czym większa ekspozycja prowadziła do zwiększonej czerwonej fluorescencji. Po YOPRO-1 i barwieniu jądrowym, nieleczone wysepki wykazywały silną niebieską fluorescencję jądrową bez zielonego zabarwienia, potwierdzając obecność żywotnych komórek nieapoptotycznych. Wyspy trzustkowe traktowane cytokinami wykazywały zieloną fluorescencję z YOPRO-1 wraz z niebieskim barwieniem jądrowym, co wskazuje na komórki apoptotyczne. Analiza ilościowa wykazała, że ponad 30% wysp trzustkowych uległo apoptozie w ciągu 24 godzin od ekspozycji na cytokiny. Barwienie aneksyną V również potwierdziło apoptozę, przy czym około 40% wysp trzustkowych wykazało dodatnie barwienie dla wczesnych i postępujących komórek apoptotycznych. Wskaźnik selektywności wykazał dyskretne punktowe barwienie w nieleczonych wyspach trzustkowych, co wskazuje na wiązanie z związanym z insuliną w granulkach wydzielniczych. Wyspy trzustkowe traktowane cytokinami wykazywały dodatkową czerwoną i niebieską fluorescencję, co pozwalało na precyzyjną wizualizację śmierci komórek beta. Dane ilościowe wykazały, że cytokiny zniszczyły około 63% komórek beta produkujących insulinę w ciągu 24 godzin od ekspozycji.