Procedura kraniotomii w celu przewlekłego obrazowania mózgu

Techniki obrazowania stają się coraz ważniejsze w badaniach nad funkcjami mózgu. Wśród nich mikroskopia laserowa dwufotonowa wyłoniła się jako niezwykle użyteczna metoda, ponieważ pozwala na badanie żywego mózgu przy zastosowaniu odpowiednich preparatów. Technika ta umożliwia chroniczną obserwację tego samego obszaru kory mózgowej w przedziałach czasowych od kilku minut do wielu miesięcy.

W tym filmie przedstawiamy metodę przygotowania do przewlekłego obrazowania in vivo mózgu z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej. Dr Carl Voda, badacz z Howard Hughes Medical Institute w Janelia Farm, był pionierem opracowania metody przygotowania okna czaszkowego, którą zaprezentujemy dzisiaj. Przedstawiam Ricardo Musta z laboratorium Carlosa Porter Cayo w Katedrze Neurologii na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę tworzenia okna czaszkowego do przewlekłego obrazowania in vivo. Ta metoda przygotowania jest bardzo użyteczna, ponieważ pozwala na obrazowanie głębokich struktur mózgu przy użyciu dwufotonowego mikroskopu laserowego. Przejdźmy zatem do realizacji.

Przed rozpoczęciem operacji myszy są znieczulane izofluranem: 4% w celu indukcji oraz od 1,5% do 2% podczas zabiegu, zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez I-A-C-U-C. Ważne jest stosowanie ucisku ogona i/lub palców stopy, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni oszołomione. Za pomocą trymera do gryzoni usuwa się sierść od karku aż do oczu.

Po zgoleniu sierści mysz umieszcza się w aparacie stereotaksycznym, na kocu z recyrkulacją wody ustawionym na 37 °C; głowę stabilizuje się za pomocą prętów usznych. Następnie aplikuje się maść do oczu, aby zapobiec wysychaniu gałek ocznych zwierzęcia. W kolejnym kroku podaje się podskórnie deksametazon w dawce 0,2 mg/kg oraz karprofen w dawce 5 mg/kg.

W celu zapobiegania obrzękowi mózgu oraz odpowiednio odpowiedzi zapalnej. Przed rozpoczęciem operacji należy wysterylizować pole operacyjne, przecierając skórę naprzemiennie trzema gazikami nasączonymi 70% alkoholem i Betadine. Wszystkie instrumenty chirurgiczne zostały wstępnie wysterylizowane w sterylizatorze koralikowym, a nożyczki spryskane etanolem.

Skórę z górnej części czaszki usuwa się, zaczynając od cięcia poziomego wzdłuż podstawy głowy, a następnie wykonuje dwa cięcia w kierunku rostralnym, docierając niemal do powiek. Następnie wykonuje się dwa cięcia ukośne, które zbiegają się w linii środkowej. W tym momencie na okostną nanosi się kroplę roztworu lidokainy i epinefryny, aby uniknąć nadmiernego krwawienia, a następnie za pomocą skalpela odsuwa się okostną do krawędzi czaszki.

Mięśnie karku są również lekko odciągnięte. Następnie całą odsłoniętą powierzchnię czaszki delikatnie zdrapuje się skalpelem, aby uzyskać suchą powierzchnię. Jest to bardzo ważne, ponieważ pozwoli to na lepsze przyleganie kleju podczas jego późniejszego nakładania.

Po wyborze miejsca obrazowania można przystąpić do wykonania okna czaszkowego. Za pomocą pneumatycznego wiertła stomatologicznego delikatnie wyznacza się okrąg o średnicy około 4 mm. Po lekkim wywierceniu na powierzchnię czaszki ponownie nanosi się roztwór lidokainy z epinefryną.

Wiercenie zostaje przerwane, gdy pozostanie bardzo cienka warstwa kości, zazwyczaj o grubości jednego włosa. Etap ten rozpoznaje się, delikatnie naciskając środek otworu trepanacyjnego, aby wyczuć, jak ulega on odkształceniu pod kroplą soli fizjologicznej, wykorzystując przy tym strukturę beleczek kostnych – gąbczastą budowę kości.

Fragment czaszki po kraniotomii zostaje uniesiony za pomocą pęsety z bardzo cienkimi końcówkami. Sól fizjologiczna jest istotna, ponieważ pomaga unieść fragment czaszki i zapobiega krwawieniu opony twardej. Następnie na oponę twardą nakłada się gąbkę żelową, uprzednio namoczoną w soli fizjologicznej, aby zatamować niewielkie krwawienie, które czasami występuje podczas usuwania fragmentu czaszki.

Po osuszeniu powierzchni opony twardej i upewnieniu się, że nie występuje krwawienie, na oponę twardą delikatnie nakłada się sterylne szkiełko nakrywkowe o średnicy pięciu milimetrów. Kroplę kleju na bazie cyjanoakrylanu nanosi się na przeciwległą półkulę czaszki. Za pomocą igły klej jest delikatnie rozprowadzany wokół okna, dbając o to, aby nie dostał się on pod szkiełko.

Teraz można nałożyć cienką warstwę kleju na całą powierzchnię czaszki. Po wyschnięciu kleju należy wymieszać akryl dentystyczny i nałożyć go na całą powierzchnię czaszki, pokrywając również niewielki brzeg szkiełka nakrywki w celu jego zabezpieczenia. Po utrwaleniu szkiełka nakrywki, za pomocą akrylu dentystycznego należy utworzyć wokół okna małą studzienkę.

W akrylu dentystycznym osadza się również tytanowy pręt. Pręt ten zostanie później wykorzystany do bezpiecznego przymocowania myszy do stolika mikroskopu. W celu obrazowania ważne jest, aby upewnić się, że pręt jest wypoziomowany, tak aby znajdował się równolegle do okna czaszkowego.

Umieszczenie kawałka papieru pod szyną pozwala na zachowanie jej poziomu podczas twardnienia akrylu; akryl stomatologiczny utwardza się przez 10 minut, aż szyna tytanowa zostanie unieruchomiona w odpowiedniej pozycji. Następnie zwierzę umieszcza się w ogrzewanej klatce do czasu wybudzenia. Po wybudzeniu z narkozy obrazowanie zwierzęcia może zostać przeprowadzone tego samego dnia.

Film ten przedstawia stos 160 obrazów wykonanych w odstępach pięciu mikronów za pomocą naszego specjalnie skonstruowanego mikroskopu dwufotonowego przez okno czaszkowe umieszczone nad korą somatosensoryczną trzymiesięcznej myszy GFPM. Ta transgeniczna linia myszy wykazuje ekspresję GFP w niewielkiej podgrupie neuronów piramidalnych. W warstwie piątej oraz warstwach drugiej i trzeciej obrazy zostały wykonane przy użyciu obiektywu imersyjnego w wodzie 40x o aperturze numerycznej 0,8, stosując długość fali wzbudzenia 910 nanometrów.

Na obrazach z bardziej powierzchownych warstw łatwo rozpoznać drzewka dendrytyczne dendrytów apikalnych komórek parametalnych. Apikalny kępkowiec dendrytów każdego neuronu zbiega się w jeden duży dendryt apikalny. Widoczne są również mniejsze dendryty skośne odchodzące od tego głównego dendrytu apikalnego, a także aksony przecinające pole widzenia.

Jest to stos 12 obrazów wykonanych co półtora mikrona przy użyciu tego samego obiektywu 40 x w większym powiększeniu; pokazano na nich powierzchniową dendrytę w rozdzielczości wystarczającej do rozróżnienia pojedynczych kolców dendrytycznych. Właśnie przedstawiliśmy sposób przygotowania okna czaszkowego do przewlekłego obrazowania mózgu z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej. Jest to niezwykle skuteczna metoda badania mózgu, ponieważ pozwala na analizę zarówno struktury, jak i funkcji żywego mózgu, nie tylko podczas pojedynczej sesji obrazowania, ale także w sposób przewlekły, poprzez wielokrotne obrazowanie w okresach liczonych w miesiącach.

Kolejną zaletą przygotowania okna czaszkowego jest możliwość obrazowania szerokiego pola widzenia, co pozwala na obrazowanie dużych struktur, takich jak cały akson lub drzewo dendrytyczne, na obszarze wielu milimetrów. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o pracy w jak najczystszych i najbardziej sterylnych warunkach oraz o zachowaniu bardzo pewnej ręki. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.