Zabieg kraniotomii w przewlekłym obrazowaniu mózgu

Techniki obrazowania stają się coraz ważniejsze w badaniu funkcji mózgu. Wśród nich dwie fotonowe mikroskopia laserowa okazała się niezwykle przydatną metodą, ponieważ pozwala na badanie żywego mózgu anta i przy odpowiednich przygotowaniach. Technika ta pozwala na obserwację tego samego obszaru kory mózgowej przewlekle od kilku minut do miesięcy.

W tym filmie pokazujemy przygotowanie do przewlekłego obrazowania mózgu in vivo za pomocą dwóch mikroskopów fotograficznych. Dr Carl Voda, badacz z Instytutu Medycznego Howarda Hughesa w Janelia Farm, początkowo był pionierem w przygotowaniu okna czaszkowego, które zademonstrujemy dzisiaj. Cześć I Ricardo musi z laboratorium Carlosa Portera Cayo na Wydziale Neurologii Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles.

Dzisiaj pokażemy Ci procedurę tworzenia okna czaszkowego do przewlekłego obrazowania in vivo. Preparat ten jest bardzo przydatny, ponieważ pozwala na zobrazowanie głębokiego wnętrza mózgu za pomocą fotonowego mikroskopu laserowego. Więc zacznijmy.

Przed rozpoczęciem operacji myszy są znieczulane izofluorem. 4% w przypadku indukcji, jeden punkt od pół do 2% w przypadku operacji, przy użyciu procedur zatwierdzonych przez I-A-C-U-C, ważne jest, aby użyć szczypania ogona i/lub palców u nóg, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni uspokojone. Za pomocą trymera do gryzoni goli się włosy od tyłu szyi do oczu.

Po goleniu mysz umieszcza się na stereotaktycznej ramie, spoczywając na kocu z recyrkulacją wody W temperaturze 37 stopni Celsjusza głowa jest mocno zabezpieczona za pomocą nauszników. Następnie nakłada się maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oka zwierzęcia. Następnie podskórnie podaje się deksametazon w dawce 0,2 miligrama na kilogram i karprofen w dawce 5 miligramów na kilogram.

Aby zapobiec obrzękowi mózgu i / lub reakcji zapalnej odpowiednio. Przed rozpoczęciem zabiegu należy wysterylizować obszar operacyjny, przecierając skórę trzema naprzemiennymi wacikami z 70% alkoholem i betadyną. Wszystkie narzędzia chirurgiczne zostały wstępnie wysterylizowane za pomocą sterylizatora z kulkami szklanymi za pomocą nożyczek, które zostały spryskane etanolem.

Skóra nad czubkiem czaszki jest usuwana, zaczynając od poziomego cięcia wzdłuż podstawy głowy, a następnie dwóch cięć w kierunku rostralnym, prawie sięgając powiek. Następnie dwa ukośne cięcia, które zbiegają się w linii środkowej. W tym momencie kroplę roztworu lidokainy i epinefryny nakłada się na okostną, aby uniknąć nadmiernego krwawienia lub bólu skalpelem, okostną cofa się do krawędzi czaszki.

Mięśnie tylnej części szyi są również lekko cofnięte. Cały odsłonięty obszar czaszki jest następnie delikatnie zeskrobywany skalpelem, aby uzyskać suchą powierzchnię. Jest to bardzo ważne, ponieważ pozwoli to klejowi lepiej przylegać, gdy zostanie później nałożony.

Po wybraniu miejsca obrazowania można najpierw utworzyć okno czaszki. Okrąg o średnicy około czterech milimetrów jest delikatnie rysowany za pomocą pneumatycznej wiertarki dentystycznej. Po lekkim wierceniu roztwór lidokainy i epinefryny jest ponownie nakładany na powierzchnię czaszki.

Wiercenie przerywa się, gdy pozostaje bardzo cienka warstwa kości, zwykle jeden nos. Ten etap osiąga się poprzez delikatne naciskanie na środek kraniotomii, aby poczuć, jak ustępuje pod kroplą soli fizjologicznej i wykorzystanie beleczki kostnej. Gąbczasta struktura kości.

Kraniotomia jest odsuwana od czaszki za pomocą bardzo cienkich kleszczy. Sól fizjologiczna jest ważna, ponieważ pomoże podnieść czaszkę i zapobiegnie krwawieniu opony twardej. Następnie piankę żelową, która została wcześniej nasączona solą fizjologiczną, nakłada się na oponę twardą w celu zatrzymania niewielkiego krwawienia, które czasami występuje po usunięciu czaszki.

Po wysuszeniu powierzchni opony twardej i upewnieniu się, że nie ma krwawienia, na wierzch opony twardej delikatnie kładzie się sterylny pięciomilimetrowy szklany szkiełko nakrywkowe. Kroplę kleju na bazie cyjanoakrylanu nakłada się na przeciwległą półkulę czaszki. Za pomocą igły klej nakłada się delikatnie dookoła okna, uważając, aby nie umieścić go pod szkłem.

Klej można teraz nakładać cienką warstwą na całą powierzchnię czaszki. Po wyschnięciu kleju akryl dentystyczny jest mieszany i nakładany na całą powierzchnię czaszki, pokrywając również małą krawędź szkiełka nakrywkowego, aby go zabezpieczyć. Po zabezpieczeniu szkiełka nakrywkowego wokół okna wykonuje się małą studzienkę z akrylem dentystycznym.

Tytanowy pręt jest również osadzony w akrylu dentystycznym. Ten pasek będzie później używany do bezpiecznego przymocowania myszy do stolika mikroskopu. W przypadku obrazowania ważne jest, aby upewnić się, że pręt jest wypoziomowany, tak aby był równoległy do okna czaszki.

Umieszczenie kawałka papieru pod prętem może pozwolić, aby pręt pozostał poziomy, podczas gdy akryl twardnieje, akryl dentystyczny może się utwardzić lub stwardnieć przez 10 minut, po czym tytanowy pręt zostanie zamocowany na miejscu. Zwierzę jest następnie umieszczane w ciepłej klatce, dopóki nie wyzdrowieje. Po wyzdrowieniu ze znieczulenia zwierzę można sfotografować tego samego dnia.

Ten film pokazuje stos 160 obrazów wykonanych w odstępach pięciu mikronów za pomocą naszego niestandardowego mikroskopu dwufotonowego przez okienko czaszki umieszczone nad korą somatosensoryczną trzymiesięcznej myszy GFPM. Ta transgeniczna linia myszy wykazuje ekspresję GFP w niewielkim podzbiorze neuronów parmalnych. W warstwie piątej i trzeciej obraz został wykonany za pomocą obiektywu 40x zanurzonego w wodzie z aperturą numeryczną 0,8 przy użyciu długości fali wzbudzenia 910 nanometrów.

Na bardziej powierzchownych obrazach łatwo jest rozpoznać dendrytyczne altany wierzchołkowych dendrytów komórek parametalicznych. Kępka wierzchołkowa dendrytów każdego neuronu zbiega się w pojedynczym dużym dendrycie wierzchołkowym. Widoczne są również mniejsze ukośne dendryty wychodzące z tego głównego wierzchołkowego aksonu dendrytowego przecinającego pole widzenia.

Jest to stos 12 zdjęć wykonujących co półtora mikrona przy użyciu tego samego 40-krotnego obiektywu przy większym powiększeniu, powierzchowny dendryt jest pokazany w wysokiej rozdzielczości wystarczającej do rozróżnienia pojedynczych kolców dendrytycznych. Właśnie pokazaliśmy, jak wykonać przygotowanie okna czaszkowego do przewlekłego obrazowania mózgu za pomocą mikroskopii fotograficznej. Jest to niezwykle potężna metoda badania mózgu, ponieważ pozwala badać zarówno strukturę, jak i funkcję żywego mózgu, nie tylko w jednej wyobraźni, ale także przewlekle poprzez wiele wyobrażeń przez okresy miesięcy.

Kolejną zaletą przygotowania okna czaszkowego jest to, że można obrazować duże wypełnienie pola widzenia, co umożliwia obrazowanie dużych struktur, takich jak cała akcja lub altana inri na przestrzeni milimetrów. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o pracy w możliwie najczystszych i bardziej sterylnych warunkach oraz o bardzo pewnej ręce. Dobra, i to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.