Badanie interakcji między komórkami szpikowymi a limfocytami CAR T in vitro i in vivo

Nasze badanie dostarcza uproszczonych modeli in vitro i in vivo, aby zrozumieć wpływ ludzkich makrofagów immunosupresyjnych na aktywność przeciwnowotworową CA 19 w kontekście chłoniaka z komórek płaszcza. Najczęściej stosowanym modelem do badania ludzkich makrofagów i monocytów in vivo jest wszczepienie hematopoetycznych komórek macierzystych myszom z wyeliminowanym niedoborem odporności. Wszczepianie myszom z niedoborem odporności ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych w celu zbadania ludzkich komórek szpikowych u myszy może być czasochłonne i kosztowne.

Skuteczność wszczepienia może być również ograniczona. Tworzymy bardziej uproszczone modele in vitro i in vivo do badania interakcji między ludzkimi makrofagami, CAR T i komórkami nowotworowymi. Może być również stosowany do testowania innych immunoterapii ukierunkowanych na makrofagi.

Na początek odwiruj wyizolowane 10 milionów ludzkich klasycznych monocytów o masie 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej do końcowego stężenia 1 miliona komórek na mililitr. Dodaj ludzki rekombinowany GM-CSF do zawiesiny, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 nanogramów na mililitr i dokładnie wymieszaj.

Przenieś monocyty do kolby do hodowli tkankowej T25 i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez siedem dni. Siódmego dnia energicznie pipetuj komórki na lodzie co 10 minut, sprawdzając pod mikroskopem, aż większość makrofagów się oderwie. Przenieś oderwane komórki do 15-mililitrowej stożkowej rurki na lodzie.

Następnie umyj komórki lodowatym PBS, aby poluzować pozostałe komórki i połączyć je w stożkowej probówce. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i odwiruj je z stężeniem 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odessać supernatant, a następnie umyć i ponownie zawiesić osad pięcioma mililitrami lodowatego PBS.

Po ponownym odwirowaniu probówki i zassaniu supernatantu, ponownie zawieś końcowe osady komórkowe w lodowatym PBS, aby osiągnąć stężenie 20 milionów komórek na mililitr. Przenieś roztwór do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej i trzymaj go na lodzie. Następnie przenieś przygotowane 15 milionów komórek JeKo z dodatnim udziałem lucyferazy do 15-mililitrowej stożkowej probówki.

Po odwirowaniu komórek JeKo odessać supernatant. Ponownie zawiesić osad w lodowatym PBS do stężenia 40 milionów komórek na mililitr. Teraz wymieszaj te same objętości zawiesiny makrofagów i zawiesiny komórek nowotworowych w świeżej 1,5 mililitrowej probówce wirówkowej.

Dodać taką samą objętość rozpuszczonej matrycy błony podstawnej i dokładnie wymieszać na lodzie. Jako kontrolę, wymieszaj pozostałe komórki JeKo z tą samą objętością PBS w nowej probówce do mikrowirówki. Dodaj taką samą objętość rozpuszczonej macierzy błony podstawnej i wymieszaj na lodzie.

Po znieczuleniu myszy umieść je na podgrzanym etapie z stożkami nosowymi. Nałóż maść okulistyczną na oba oczy myszy, aby zapobiec uszkodzeniu rogówki. Ogol prawy bok każdej myszy, aby odsłonić skórę.

Załaduj 100 mikrolitrów mieszaniny makrofagów JeKo do strzykawki o pojemności 0,5 mililitra i usuń pęcherzyki powietrza. Delikatnie unieś odsłoniętą skórę i włóż igłę w uniesiony obszar skóry, jednocześnie wywierając nacisk palcem na to miejsce. Powoli wstrzyknąć komórki do warstwy podskórnej i delikatnie wycofać igłę.

Aby ocenić wpływ makrofagów immunosupresyjnych in vivo, postęp obciążenia guzem śledzono za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego u myszy NSG, wszczepionych komórkami JeKo samodzielnie lub w połączeniu ze zróżnicowanymi makrofagami. Obecność zróżnicowanych makrofagów znacznie przyspieszyła progresję guza in vivo, na co wskazuje znacznie większe obciążenie guzem u myszy współszczepionych do 17 dnia w porównaniu z samym JeKo.