Badanie interakcji między komórkami szpikowymi a limfocytami CAR T in vitro i in vivo
25 lipca 2025
Biorąc pod uwagę ograniczone modele ksenoprzeszczepów dostępne do badania interakcji między ludzkim CART-em a komórkami szpikowymi, stworzyliśmy modele in vitro i in vivo , aby zrozumieć wpływ ludzkich makrofagów na komórki CART. Wyniki można potencjalnie uogólnić, aby ocenić rolę makrofagów w mikrośrodowisku guza i przetestować immunoterapie ukierunkowane na makrofagi.
Nasze badanie dostarcza uproszczonych modeli in vitro i in vivo, aby zrozumieć wpływ ludzkich makrofagów immunosupresyjnych na aktywność przeciwnowotworową CA 19 w kontekście chłoniaka z komórek płaszcza. Najczęściej stosowanym modelem do badania ludzkich makrofagów i monocytów in vivo jest wszczepienie hematopoetycznych komórek macierzystych myszom z wyeliminowanym niedoborem odporności. Wszczepianie myszom z niedoborem odporności ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych w celu zbadania ludzkich komórek szpikowych u myszy może być czasochłonne i kosztowne.
Skuteczność wszczepienia może być również ograniczona. Tworzymy bardziej uproszczone modele in vitro i in vivo do badania interakcji między ludzkimi makrofagami, CAR T i komórkami nowotworowymi. Może być również stosowany do testowania innych immunoterapii ukierunkowanych na makrofagi.
Na początek odwiruj wyizolowane 10 milionów ludzkich klasycznych monocytów o masie 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej do końcowego stężenia 1 miliona komórek na mililitr. Dodaj ludzki rekombinowany GM-CSF do zawiesiny, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 nanogramów na mililitr i dokładnie wymieszaj.
Przenieś monocyty do kolby do hodowli tkankowej T25 i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez siedem dni. Siódmego dnia energicznie pipetuj komórki na lodzie co 10 minut, sprawdzając pod mikroskopem, aż większość makrofagów się oderwie. Przenieś oderwane komórki do 15-mililitrowej stożkowej rurki na lodzie.
Następnie umyj komórki lodowatym PBS, aby poluzować pozostałe komórki i połączyć je w stożkowej probówce. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i odwiruj je z stężeniem 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odessać supernatant, a następnie umyć i ponownie zawiesić osad pięcioma mililitrami lodowatego PBS.
Po ponownym odwirowaniu probówki i zassaniu supernatantu, ponownie zawieś końcowe osady komórkowe w lodowatym PBS, aby osiągnąć stężenie 20 milionów komórek na mililitr. Przenieś roztwór do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej i trzymaj go na lodzie. Następnie przenieś przygotowane 15 milionów komórek JeKo z dodatnim udziałem lucyferazy do 15-mililitrowej stożkowej probówki.
Po odwirowaniu komórek JeKo odessać supernatant. Ponownie zawiesić osad w lodowatym PBS do stężenia 40 milionów komórek na mililitr. Teraz wymieszaj te same objętości zawiesiny makrofagów i zawiesiny komórek nowotworowych w świeżej 1,5 mililitrowej probówce wirówkowej.
Dodać taką samą objętość rozpuszczonej matrycy błony podstawnej i dokładnie wymieszać na lodzie. Jako kontrolę, wymieszaj pozostałe komórki JeKo z tą samą objętością PBS w nowej probówce do mikrowirówki. Dodaj taką samą objętość rozpuszczonej macierzy błony podstawnej i wymieszaj na lodzie.
Po znieczuleniu myszy umieść je na podgrzanym etapie z stożkami nosowymi. Nałóż maść okulistyczną na oba oczy myszy, aby zapobiec uszkodzeniu rogówki. Ogol prawy bok każdej myszy, aby odsłonić skórę.
Załaduj 100 mikrolitrów mieszaniny makrofagów JeKo do strzykawki o pojemności 0,5 mililitra i usuń pęcherzyki powietrza. Delikatnie unieś odsłoniętą skórę i włóż igłę w uniesiony obszar skóry, jednocześnie wywierając nacisk palcem na to miejsce. Powoli wstrzyknąć komórki do warstwy podskórnej i delikatnie wycofać igłę.
Aby ocenić wpływ makrofagów immunosupresyjnych in vivo, postęp obciążenia guzem śledzono za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego u myszy NSG, wszczepionych komórkami JeKo samodzielnie lub w połączeniu ze zróżnicowanymi makrofagami. Obecność zróżnicowanych makrofagów znacznie przyspieszyła progresję guza in vivo, na co wskazuje znacznie większe obciążenie guzem u myszy współszczepionych do 17 dnia w porównaniu z samym JeKo.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie wprowadza uproszczone modele in vitro i in vivo służące do badania wpływu ludzkich makrofagów immunosupresyjnych na aktywność przeciwnowotworową komórek CAR T w chłoniaku komórek płaszcza. Modele te mają na celu pogłębienie wiedzy na temat oddziaływań makrofagów w mikrośrodowisku guza oraz ułatwienie testowania immunoterapii ukierunkowanych na makrofagi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Onkologia
Wstęp
- Makrofagi ludzkie odgrywają kluczową rolę w mikrośrodowisku nowotworu.
- Obecne modele badania ludzkich komórek mieloidalnych są złożone i kosztowne.
- Zrozumienie interakcji makrofagów z komórkami CAR T jest niezbędne dla usprawnienia strategii immunoterapii.
- Istniejące modele ksenoprzeszczepowe wykazują ograniczenia pod względem wydajności i praktyczności.
Cel badania
- Opracowanie bardziej wydajnych modeli do badania interakcji między ludzkimi makrofagami a komórkami CAR T.
- Ocena roli makrofagów w kontekście chłoniaka komórek płaszcza.
- Ułatwienie testowania immunoterapii celowanych w makrofagi.
Zastosowane metody
- Tworzenie modeli in vitro do badania oddziaływań makrofagów.
- Opracowanie modeli in vivo z wykorzystaniem uproszczonych technik wszczepiania.
- Ocena aktywności komórek CAR T w obecności ludzkich makrofagów.
- Ocena potencjalnych terapii skierowanych przeciwko makrofagom.
Główne wyniki
- Nowe modele zapewniają bardziej dostępny sposób badania ludzkich makrofagów.
- Wykazano interakcje między komórkami CAR T a ludzkimi makrofagami.
- Wyniki potwierdzają potencjał immunoterapii celowanej w makrofagi.
- Modele mogą zostać dostosowane do dalszych badań w dziedzinie immunologii nowotworów.
Wnioski
- Ustanowione modele pogłębiają zrozumienie roli makrofagów w nowotworach.
- Oferują one praktyczne podejście do testowania nowych immunoterapii.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu usprawnienia strategii leczenia.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Oporność na terapię komórkami CAR-T w nowotworach hematologicznych jest często napędzana przez immunosupresyjne komórki mieloidalne w mikrośrodowisku guza, co osłabia trwałość odpowiedzi klinicznych. Niniejsze badanie przedstawia usprawnione modele in vitro i in vivo służące do badania mechanistycznego wpływu ludzkich makrofagów na funkcję komórek CAR-T, co bezpośrednio odnosi się do krytycznego ryzyka biologicznego w procesach opracowywania immunoterapii. Modele te umożliwiają zespołom translacyjnym ograniczenie ryzyka związanego z opornością indukowaną przez makrofagi oraz pomagają w opracowywaniu strategii skojarzonych celujących w makrofagi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę supresji aktywności komórek CAR T wywołanej przez makrofagi w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
- Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie roli komórek mieloidalnych w oporności terapeutycznej.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla czynników modulujących makrofagi w portfolio immuno-onkologicznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia powtarzalne modele kokultury i ksenoprzeszczepów do ilościowej oceny skuteczności komórek CAR T w obecności immunosupresyjnych makrofagów.
- Umożliwia standaryzowaną ewaluację kandydackich terapii celowanych w makrofagi w celu przeprowadzenia przesiewu kombinatorycznego.
- Wspiera opracowanie analiz do pomiaru obciążenia nowotworowego i oddziaływań komórek odpornościowych z wykorzystaniem bioluminescencji oraz kwantyfikacji komórek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uzgadnia modelowanie przedkliniczne ze złożonością ludzkiego mikrośrodowiska guza poprzez włączenie ludzkich makrofagów do systemów ksenoprzeszczepów.
- Umożliwia translacyjne odkrywanie biomarkerów poprzez śledzenie progresji guza i modulacji immunologicznej in vivo.
- Wspiera dostosowane do ryzyka wdrażanie kandydatów na immunoterapię poprzez modelowanie klinicznie istotnych mechanizmów oporności.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Modele te stanowią pomost pomiędzy wczesną fazą odkryć a walidacją przedkliniczną, umożliwiając testowanie interakcji między makrofagami a komórkami CAR-T oraz interwencji terapeutycznych w oparciu o sformułowane hipotezy.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotezy zerowej w zakresie inhibicji komórek CAR-T pośredniczonej przez makrofagi oraz wyjaśnianie szlaków sygnałowych.
- Przesiewy: Zapewnia ilościowe, powtarzalne wyniki służące do porównywania warunków terapeutycznych w testach kokultury i ksenoprzeszczepów.
- Analityka: Dostarcza odczyty bioluminescencji i liczby komórek w celu wsparcia analizy statystycznej obciążenia nowotworowego oraz funkcji komórek odpornościowych.
- Badania translacyjne: Modeluje złożoność ludzkiego TME na potrzeby przedklinicznej oceny strategii immunoterapii.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje adaptacyjne platformy do ciągłej oceny terapii CAR-T oraz terapii celujących w komórki mieloidalne w ramach programów onkologicznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie skuteczności immunoterapii poprzez modelowanie kluczowych mechanizmów oporności.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje procesy przedkliniczne dzięki uproszczonym, skalowalnym systemom in vitro i in vivo.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) nad kombinowanymi immunoterapiami celującymi w mikrośrodowisko guza.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka w obszarze oporności pośredniczonej przez makrofagi.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie izolacji, różnicowania i technik kokultury ludzkich komórek odpornościowych.
- Niezbędny jest dostęp do modeli myszy z niedoborem odporności oraz infrastruktury do obrazowania bioluminescencyjnego w badaniach in vivo.
- Wymagana jest standaryzacja protokołów przygotowania komórek, szczepienia oraz odczytów pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Adaptacja do innych modeli nowotworowych lub typów komórek odpornościowych może wymagać optymalizacji protokołu.
- Ograniczenia obejmują efektywność szczepienia oraz konieczność uważnej interpretacji danych z ksenoprzeszczepów ludzko-mysich.
![Dynamiczne obrazowanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej [18F] tetrafluoroboranu / tomografii komputerowej](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62334.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A24%253A38.282Z&w=384&q=75)
