Name: Badanie interakcji między komórkami szpikowymi a limfocytami CAR T in vitro i in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 14 s
Description: Poznaj uproszczone modele in vitro i in vivo do badania interakcji między ludzkimi makrofagami a komórkami CAR T w kontekście chłoniaka płaszcza. Metoda umożliwia testowanie terapii immunologicznych skierowanych przeciwko makrofagom.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to zostało częściowo sfinansowane przez Mayo Clinic Comprehensive Cancer Center (SSK), Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK), Mayo Clinic Center for Regenerative Biotherapeutics (SSK), grant National Institutes of Health R37CA266344-01 (SSK) oraz grant Departamentu Obrony CA201127 (SSK).

<ol><li>Yun, K., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Who+wins+the+combat%2C+CAR+or+TCR%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Who wins the combat, CAR or TCR.</a> Leukemia. 37 (10), 1953-1962 (2023).</li>
<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axicabtagene+Ciloleucel+CAR+T-Cell+Therapy+in+Refractory+Large+B-Cell+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+J+Med%22%5BJournal%5D)">Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma.</a> New England J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li>
<li>Shah, N. N., Fry, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+resistance+to+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of resistance to CAR T cell therapy.</a> Nat Rev Clin Oncol. 16 (6), 372-385 (2019).</li>
<li>Kiss, M., Caro, A. A., Raes, G., Laoui, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Reprogramming+of+Monocytes+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Fronti+Oncol%22%5BJournal%5D)">Systemic Reprogramming of Monocytes in Cancer.</a> Fronti Oncol. 10, (2020).</li>
<li>Rodriguez-Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cell-mediated+depletion+of+immunosuppressive+tumor-associated+macrophages+promotes+endogenous+antitumor+immunity+and+augments+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">cell-mediated depletion of immunosuppressive tumor-associated macrophages promotes endogenous antitumor immunity and augments adoptive immunotherapy.</a> Nat Commun. 12 (1), (2021).</li>
<li>Kankeu Fonkoua, L. A., Sirpilla, O., Sakemura, R., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cell+therapy+and+the+tumor+microenvironment%3A+Current+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Oncolyt%22%5BJournal%5D)">CAR T cell therapy and the tumor microenvironment: Current challenges and opportunities.</a> Mol Ther Oncolyt. 25, 69-77 (2022).</li>
<li>Stroncek, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elutriated+lymphocytes+for+manufacturing+chimeric+antigen+receptor+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Trans+Med%22%5BJournal%5D)">Elutriated lymphocytes for manufacturing chimeric antigen receptor T cells.</a> J Trans Med. 15 (1), (2017).</li>
<li>Stroncek, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+cells+in+peripheral+blood+mononuclear+cell+concentrates+inhibit+the+expansion+of+chimeric+antigen+receptor+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Myeloid cells in peripheral blood mononuclear cell concentrates inhibit the expansion of chimeric antigen receptor T cells.</a> Cytotherapy. 18 (7), 893-901 (2016).</li>
<li>Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+crispr%2Fcas9+to+knock+out+gm-csf+in+car-t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells.</a> J Vis Exp. (149), e59629(2019).</li>
<li>Ali, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+blockade+and+CDK4%2F6+inhibition+augment+nonoverlapping+features+of+T+cell+activation+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">PD-1 blockade and CDK4/6 inhibition augment nonoverlapping features of T cell activation in cancer.</a> J Exp Med. 220 (4), e20220729(2023).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+and+Metabolomic+Characterization+of+SARS-CoV-2-Infected+Cynomolgus+Macaque+at+Early+Stage%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Proteomic and Metabolomic Characterization of SARS-CoV-2-Infected Cynomolgus Macaque at Early Stage.</a> Front Immunol. 13, 954121(2022).</li>
<li>Ruella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+the+immunosuppressive+tumor+microenvironment+of+Hodgkin+lymphoma+using+chimeric+antigen+receptor+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Dis%22%5BJournal%5D)">Overcoming the immunosuppressive tumor microenvironment of Hodgkin lymphoma using chimeric antigen receptor T cells.</a> Cancer Dis. 7 (10), 1154-1167 (2017).</li>
<li>Sakemura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Clinically+Relevant+Reporter+for+Chimeric+Antigen+Receptor+T-cell+Expansion+Trafficking%2C+and+Toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a Clinically Relevant Reporter for Chimeric Antigen Receptor T-cell Expansion Trafficking, and Toxicity.</a> Cancer Immunol Res. 9 (9), 1035-1046 (2021).</li>
<li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. 133 (7), 697-709 (2019).</li>
<li>Smith, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Three-Dimensional+Skin+Disease+Model+to+Assess+Macrophage+Function+in+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Meth%22%5BJournal%5D)">A Novel Three-Dimensional Skin Disease Model to Assess Macrophage Function in Diabetes.</a> Tissue Eng Meth. 27 (2), 49-58 (2021).</li>
<li>Nowak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+monocyte+profile+in+patients+with+major+depressive+disorder+and+suicide+behaviour+and+how+ketamine+induces+anti-inflammatory+M2+macrophages+by+NMDAR+and+mTOR%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory M2 macrophages by NMDAR and mTOR.</a> EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).</li>
<li>Ajith, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+Mouse+Model+as+a+Novel+Approach+in+the+Assessment+of+Human+Allogeneic+Responses+in+Organ+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Humanized Mouse Model as a Novel Approach in the Assessment of Human Allogeneic Responses in Organ Transplantation.</a> Front Immunol. 12, 687715(2021).</li>
<li>Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+signs+monitoring+during+injectable+and+inhalant+anesthesia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Animals%22%5BJournal%5D)">Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice.</a> Exp Animals. 64 (1), 57-64 (2015).</li>
<li>Hickman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+Exposure+Times+for+Irreversible+Euthanasia+with+Carbon+Dioxide+in+Mice+and+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Animal+Sci%22%5BJournal%5D)">Minimal Exposure Times for Irreversible Euthanasia with Carbon Dioxide in Mice and Rats.</a> J Am Assoc Lab Animal Sci. 61 (3), 283-286 (2022).</li>
<li>Zhou, R., Mei, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhou%2C+R+%22Neural+Development%3A+Methods+and+Protocols%22">Neural Development: Methods and Protocols</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. (2013).</li>
<li>Gutierrez-Ruiz, O. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+DOCK8+regulates+lysosome-mediated+pancreatic+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of DOCK8 regulates lysosome-mediated pancreatic tumor cell invasion.</a> Cell Rep. 42 (9), 113042(2023).</li>
<li>Kirkiles-Smith, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Humanized+Mouse+Model+to+Study+the+Role+of+Macrophages+in+Allograft+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Development of a Humanized Mouse Model to Study the Role of Macrophages in Allograft Injury.</a> Transplantation. 87 (2), 189-197 (2009).</li>
<li>Chuprin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mouse+models+for+immuno-oncology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Humanized mouse models for immuno-oncology research.</a> Nat Rev Clin Oncol. 20 (3), 192-206 (2023).</li>
<li>Yun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+immunosuppressive+features+of+monocytes+suppress+CAR-T19+through+IL-1+pathway+modulation+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic immunosuppressive features of monocytes suppress CAR-T19 through IL-1 pathway modulation in mantle cell lymphoma.</a> Mol Ther Oncol. 33 (2), 200985(2025).</li>
</ol>

SSK jest wynalazcą patentów w dziedzinie immunoterapii CAR, które są licencjonowane przez Novartis (na mocy umowy między Mayo Clinic, University of Pennsylvania i Novartis), MustangBio (poprzez Mayo Clinic) i Sendero (poprzez Mayo Clinic). RLS i SSK są wynalazcami patentów w dziedzinie immunoterapii CAR, które są licencjonowane przez Humanigen (za pośrednictwem Mayo Clinic). KY, RLS, TH, BK, ES i SSK są wynalazcami patentów w dziedzinie immunoterapii CAR, na które firma Immix posiada licencję. SSK otrzymuje fundusze na badania od Kite, Gilead, Juno, BMS, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis/Viracta, LifEngine Animal Health Laboratories Inc., Incyte i Lentigen. SSK uczestniczyło w spotkaniach doradczych z Kite/Gilead, Humanigen, Juno/BMS, Capstan Bio i Novartis. SSK zasiadała w radzie ds. bezpieczeństwa danych i monitorowania w firmach Humanigen i Carisma. SSK pełniła funkcję konsultanta dla firm Torque, Calibr, Novartis, Capstan Bio, Carisma i Humanigen.

Terapia komórkowa CART wykazała liczne sukcesy kliniczne w leczeniu podgrup pacjentów z nowotworami hematologicznymi, ale u większości pacjentów dochodzi do nawrotu choroby w ciągu 1-2 lat po infuzji CART 1,2. Zidentyfikowano różne potencjalne mechanizmy oporności na CART i stwierdzono, że immunosupresyjne komórki szpikowe odgrywają ważną rolę w immunosupresji TME i wynikającej z niej niewydolności CART 3,4,5,6,7,8.<sup class="x...

Terapia autologicznymi komórkami T z chimerycznym receptorem antygenu antygenowego (CART) osiągnęła sukcesy kliniczne w leczeniu nawrotowych lub opornych na leczenie nowotworów hematologicznych, co doprowadziło do zatwierdzenia przez amerykańską FDA sześciu produktów CART ukierunkowanych na CD19 lub antygen dojrzewania komórek B (BCMA)1. Pomimo imponującej początkowej aktywności terapii komórkami CART, u większości pacjentów dochodzi do nawrotu choroby w ciągu pierwszych 1-2 lat po leczeniu2. Zidentyfikowano kilka mechanizmów oporności na CART, w tym nieoptymalne dopasowanie limfocytów T, ucieczkę antygenu i słabą trwałość CART, a także hamowanie, w którym pośredniczy immunosupresyjne mikrośrodowisko guza (TME)2,3. Komórki mieloidalne, takie jak monocyty i makrofagi, często stanowią znaczną część TME i wykazano, że są głównymi inhibitorami innych komórek odpornościowych, w tym limfocytów T 4,5. Szkodliwy wpływ komórek szpikowych w kontekście skuteczności terapeutycznej komórek CART opisano w modelach przedklinicznych oraz w badaniach klinicznych zarówno guzów hematologicznych, jak i litych 3,6. Hamowanie za pośrednictwem szpiku może zachodzić od początku procesu wytwarzania CART - wykazano, że monocyty w początkowym produkcie aferezy hamują ekspansję CART ex vivo 7,8. Biorąc pod uwagę gromadzące się dowody na hamowanie CART za pośrednictwem szpiku, wiele badań miało na celu zmodyfikowanie komórek CART w celu celowania i eliminowania immunosupresyjnych makrofagów w TME w celu uzyskania lepszej odpowiedzi immunologicznej5. Jednak mechanizmy stojące za interakcjami między komórkami CART a makrofagami immunosupresyjnymi nadal nie są w pełni wyjaśnione. Ponadto istnieje ograniczona liczba publicznie dostępnych modeli ksenoprzeszczepów tych interakcji. W związku z tym istnieje pilne zapotrzebowanie na modele badające interakcje między ludzkimi makrofagami a komórkami CART, zarówno in vitro, jak i na modelach mysich.
Tutaj opisujemy metodę, w której ludzkie komórki CART (CART19) ukierunkowane na CD19 są hodowane wspólnie z komórkami nowotworowymi CD19 + i spolaryzowanymi ex vivo makrofagami podobnymi do M2. Ponadto opisujemy mysi model ksenoprzeszczepu, w którym myszy z niedoborem odporności są podskórnie wszczepiane zarówno komórkami docelowymi, jak i ludzkimi makrofagami, co pozwala na ocenę interesujących immunoterapii w warunkach z makrofagami immunosupresyjnymi. W szczególności przeanalizowaliśmy proliferację specyficzną dla antygenu CART w obecności lub braku immunosupresyjnych makrofagów in vitro, wykazując znaczne hamowanie ekspansji limfocytów T zarówno na płytkach transwell, jak i bezpośrednich kokulturach. W naszym modelu ksenoprzeszczepu myszom NSG wszczepiono podskórnie komórki nowotworowe i ludzkie makrofagi zawieszone w Matrigel w celu przeprowadzenia badań przesiewowych terapii. Ten model zwierzęcy z powodzeniem wykazał, że zróżnicowane immunosupresyjne ludzkie makrofagi ex vivo były w stanie promować progresję guza u myszy NSG. Postępując zgodnie z tym protokołem, można przetestować skuteczność leków immunosupresyjnych ukierunkowanych na makrofagi, w tym leków małocząsteczkowych, biologicznych i innych terapii komórkowych. Jednak ze względu na ograniczenia związane z wykorzystaniem myszy z niedoborem odporności do badania ludzkiego TME, proponowane modele najlepiej nadają się do badań potwierdzających słuszność koncepcji.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 0,5 ml</td><td>Fisher Naukowy</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówka do mikrowirówek</td><td>Eppendorf powiedział:</td><td>1415-2508&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rurka stożkowa 15 ml</td><td>Nauki przyrodnicze Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka transwell (0,4 &mu; m)</td><td>Nauki przyrodnicze Corning</td><td>3397</td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 50 ml</td><td>Nauki przyrodnicze Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzki CD206 sprzężony z APC/Cy7</td><td>Legenda biologiczna</td><td>321119</td><td>Przeciwciało przepływowe</td></tr><tr><td>Anty-ludzki CD14 sprzężony z APC</td><td>Legenda biologiczna</td><td>325607</td><td>Przeciwciało przepływowe</td></tr><tr><td>Anty-ludzki CD3 sprzężony z APC</td><td>Legenda biologiczna</td><td>344811</td><td>Przeciwciało przepływowe</td></tr><tr><td>Roztwór do płukania autoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>Klasowy bufor do izolacji monocytów&nbsp;</td></tr><tr><td>Matryca membrany podstawnej</td><td>Nauki przyrodnicze Corning</td><td>CLS356237</td><td>Solubilizowana matryca błony podstawnej</td></tr><tr><td>Pożywki do hodowli komórkowych</td><td></td><td></td><td>10% ludzka surowica AB 1% penicylina-streptomycyna-glutamina w X-VIVO 15 Pożywka z komórek krwiotwórczych bez surowicy</td></tr><tr><td>Klasyczny zestaw do izolacji monocytów, ludzki</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-117-337</td><td></td></tr><tr><td>System CytoFLEX&nbsp; B5-R3-V5</td><td>Beckman Coulter</td><td>Zobacz materiał C04652</td><td>Cytometr przepływowy</td></tr><tr><td>D-lucyferyna</td><td>Złoto Biotechnologia</td><td>SZCZĘŚCIE-1G</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>14190250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Maść do oczu</td><td>Rybak termiczny</td><td>19-090-832</td><td></td></tr><tr><td>Bufor FACS</td><td></td><td></td><td>2% FBS 1% azydek sodu w PBS</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Nauki przyrodnicze Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>Płaska płytka 96-dołkowa</td><td>Nauki przyrodnicze Corning</td><td>CLS3997</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie pula ludzkiej surowicy AB&nbsp;</td><td>Innowacyjne badania</td><td>4931</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki TruStain FcX (roztwór blokujący receptor Fc)</td><td>Legenda biologiczna</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran w płynie&nbsp; &nbsp;</td><td>Piramal Pharma Sp. z o.o.</td><td>66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania in vivo IVIS Spectrum</td><td>PerkinElmer powiedział:</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Pożywki do hodowli linii komórkowych JeKo-1</td><td></td><td></td><td>10% FBS 1% penicylina-streptomycyna-glutamina w pożywce RPMI-1640</td></tr><tr><td>Żywy/martwy zestaw do naprawy Aqua Dead Cell Stain Kit, do wzbudzenia 405 nm</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Negatyw zaznaczenie ściegu</td></tr><tr><td>Preparat limfatyczny</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>07811</td><td>Gradient gęstości średni</td></tr><tr><td>Roztwór podstawowy MACS BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>Klasowy bufor do izolacji monocytów&nbsp;</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-ludzkie CD206 sprzężone z AF546&nbsp;</td><td>Biotechnologia Santa Cruz</td><td>SC-376232 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>SKINIENIE. Cg-Prkdcscid&nbsp; Myszy Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)</td><td>Laboratorium Jacksona&nbsp;</td><td>5557</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzki CD16 sprzężony z PE</td><td>Legenda biologiczna</td><td>302007</td><td>Przeciwciało przepływowe</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna-Glutamina (100x), Płyn</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzki CD163 sprzężony z PerCP</td><td>Legenda biologiczna</td><td>333625</td><td>Przeciwciało przepływowe</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-ludzkie iNOS sprzężone z AF647&nbsp;</td><td>Technologia białkowa</td><td>CL647-18985</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki GM-CSF</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>78015</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 średni</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SepMate-50 IVD</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>85450</td><td>Izolacja PBMC metodą centrowania w gradicypinie gęstości&nbsp;</td></tr><tr><td>Azek sodu, 5% (w/v)</td><td>Ricca Chemiczny</td><td>7144.8-16</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 48-dołkowa poddana działaniu hodowli tkankowej</td><td>Nauki przyrodnicze Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>Analizator żywotności komórek Vi-cell XR</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Licznik komórek</td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Pożywka z komórek krwiotwórczych bez surowicy</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie interakcji między komórkami szpikowymi a limfocytami car t in vitro i in vivo

Studying Interactions between Myeloid Cells and CAR T Cells In Vitro and In Vivo

Terapia komórkami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CART) doprowadziła do niezwykłych sukcesów klinicznych w leczeniu nowotworów hematologicznych. Jednak u większości pacjentów dochodzi do nawrotu w ciągu 1-2 lat. Zidentyfikowano kilka mechanizmów prowadzących do oporności na CART, w tym hamowanie limfocytów T przez immunosupresyjne komórki szpikowe. Coraz więcej dowodów wskazuje, że monocyty i makrofagi w mikrośrodowisku guza (TME) przyczyniają się do słabej wydajności CART i wyników klinicznych. Modele przedkliniczne do badania interakcji między ludzkimi makrofagami a komórkami CART są ograniczone. W tym miejscu omawiamy podejścia do zrozumienia wpływu ludzkich makrofagów na komórki CART zarówno in vitro , jak i in vivo. Opisujemy modele kokultury in vitro , aby pokazać, że makrofagi immunosupresyjne hamują funkcje CART. Dodatkowo przedstawiamy model ksenoprzeszczepu, w którym ludzkie makrofagi i komórki nowotworowe są podskórnie wszczepiane myszom NSG w celu zbadania interakcji makrofagów podobnych do M2 z komórkami CART i komórkami nowotworowymi. Modele te mogą być wykorzystane do oceny roli makrofagów w TME i testowania immunoterapii przeciwnowotworowych ukierunkowanych na makrofagi.

Celem tego protokołu jest ustanowienie modeli zarówno in vitro , jak i in vivo w celu zbadania interakcji między ludzkimi makrofagami immunosupresyjnymi a komórkami CART ze względu na złożony charakter i dynamikę interakcji oraz ograniczone istniejące modele ksenoprzeszczepów. Zgodnie z protokołem, izolowane ludzkie klasyczne monocyty są różnicowane w celu uzyskania fenotypów podobnych do M2 i stają się funkcjonalnie immunosupresyjne.
Aby potwierdzić czystość izolowanych ludz...

Biorąc pod uwagę ograniczone modele ksenoprzeszczepów dostępne do badania interakcji między ludzkim CART-em a komórkami szpikowymi, stworzyliśmy modele in vitro i in vivo , aby zrozumieć wpływ ludzkich makrofagów na komórki CART. Wyniki można potencjalnie uogólnić, aby ocenić rolę makrofagów w mikrośrodowisku guza i przetestować immunoterapie ukierunkowane na makrofagi.

Badanie interakcji między komórkami szpikowymi a limfocytami CAR T in vitro i in vivo

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has led to remarkable clinical successes treating hematological malignancies. However, most patients ...

Nasze badanie dostarcza uproszczonych modeli in vitro i in vivo, aby zrozumieć wpływ ludzkich makrofagów immunosupresyjnych na aktywność przeciwnowotworową CA 19 w kontekście chłoniaka z komórek płaszcza. Najczęściej stosowanym modelem do badania ludzkich makrofagów i monocytów in vivo jest wszczepienie hematopoetycznych komórek macierzystych myszom z wyeliminowanym niedoborem odporności. Wszczepianie myszom z niedoborem odporności ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych w celu zbadania ludzkich komórek szpikowych u myszy może być czasochłonne i kosztowne.Skuteczność wszczepienia może być również ograniczona. Tworzymy bardziej uproszczone modele in vitro i in vivo do badania interakcji między ludzkimi makrofagami, CAR T i komórkami nowotworowymi. Może być również stosowany do testowania innych immunoterapii ukierunkowanych na makrofagi.Na początek odwiruj wyizolowane 10 milionów ludzkich klasycznych monocytów o masie 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej do końcowego stężenia 1 miliona komórek na mililitr. Dodaj ludzki rekombinowany GM-CSF do zawiesiny, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 nanogramów na mililitr i dokładnie wymieszaj.Przenieś monocyty do kolby do hodowli tkankowej T25 i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez siedem dni. Siódmego dnia energicznie pipetuj komórki na lodzie co 10 minut, sprawdzając pod mikroskopem, aż większość makrofagów się oderwie. Przenieś oderwane komórki do 15-mililitrowej stożkowej rurki na lodzie.Następnie umyj komórki lodowatym PBS, aby poluzować pozostałe komórki i połączyć je w stożkowej probówce. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i odwiruj je z stężeniem 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odessać supernatant, a następnie umyć i ponownie zawiesić osad pięcioma mililitrami lodowatego PBS.Po ponownym odwirowaniu probówki i zassaniu supernatantu, ponownie zawieś końcowe osady komórkowe w lodowatym PBS, aby osiągnąć stężenie 20 milionów komórek na mililitr. Przenieś roztwór do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej i trzymaj go na lodzie. Następnie przenieś przygotowane 15 milionów komórek JeKo z dodatnim udziałem lucyferazy do 15-mililitrowej stożkowej probówki.Po odwirowaniu komórek JeKo odessać supernatant. Ponownie zawiesić osad w lodowatym PBS do stężenia 40 milionów komórek na mililitr. Teraz wymieszaj te same objętości zawiesiny makrofagów i zawiesiny komórek nowotworowych w świeżej 1,5 mililitrowej probówce wirówkowej.Dodać taką samą objętość rozpuszczonej matrycy błony podstawnej i dokładnie wymieszać na lodzie. Jako kontrolę, wymieszaj pozostałe komórki JeKo z tą samą objętością PBS w nowej probówce do mikrowirówki. Dodaj taką samą objętość rozpuszczonej macierzy błony podstawnej i wymieszaj na lodzie.Po znieczuleniu myszy umieść je na podgrzanym etapie z stożkami nosowymi. Nałóż maść okulistyczną na oba oczy myszy, aby zapobiec uszkodzeniu rogówki. Ogol prawy bok każdej myszy, aby odsłonić skórę.Załaduj 100 mikrolitrów mieszaniny makrofagów JeKo do strzykawki o pojemności 0,5 mililitra i usuń pęcherzyki powietrza. Delikatnie unieś odsłoniętą skórę i włóż igłę w uniesiony obszar skóry, jednocześnie wywierając nacisk palcem na to miejsce. Powoli wstrzyknąć komórki do warstwy podskórnej i delikatnie wycofać igłę.Aby ocenić wpływ makrofagów immunosupresyjnych in vivo, postęp obciążenia guzem śledzono za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego u myszy NSG, wszczepionych komórkami JeKo samodzielnie lub w połączeniu ze zróżnicowanymi makrofagami. Obecność zróżnicowanych makrofagów znacznie przyspieszyła progresję guza in vivo, na co wskazuje znacznie większe obciążenie guzem u myszy współszczepionych do 17 dnia w porównaniu z samym JeKo.

studying-interactions-between-myeloid-cells-car-t-cells-vitro

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film demonstruje test in vitro w celu sprawdzenia aktywności limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR). Komórki chłoniaka z komórek B eksprymujące antygen CD19 i lucyferazy cytoplazmatycznej są hodowane wspólnie z komórkami CAR T specyficznymi dla CD19. Wiązanie CAR z CD19 na guzie indukuje limfocyty CAR T do uwalniania cytokin i toksyn, które powodują cytotoksyczność komórek nowotworowych. Aktywność limfocytów CAR T ocenia się poprzez ilościowe określenie uwolnionej cytokiny...

Test in vitro w celu oceny aktywności przeciwnowotworowej komórek CAR T specyficznych dla nowotworu

Tutaj prezentujemy protokół do określenia in vivo aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 naiwnych komórek T CD4 (limfocytów T) indukowanych przez komórki dendrytyczne (DC) pochodzące ze szpiku kostnego GM-CSF. Ponadto protokół ten opisuje izolację komórek BM i T, wytwarzanie prądu stałego oraz transfer adoptywny komórek DC i T.

Mysi model in vivo do pomiaru naiwnej aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 limfocytów T CD4 indukowanych przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego

Tutaj prezentujemy protokół produkcji i testów przedklinicznych mysich limfocytów T CD19 CAR metodą transdukcji retrowirusowej i wykorzystania jako terapii przeciwko ustalonemu syngenicznemu chłoniakowi B-komórkowemu A20 u myszy BALB/c z lub bez kondycjonowania wstępnego limfodepletingu.

Syngeniczny model chłoniaka z komórek B myszy do przedklinicznej oceny limfocytów T CD19 CAR

Tutaj opisujemy metodę wspólnej hodowli in vitro do rekurencyjnego wyzwania limfocytów T ukierunkowanych na nowotwór, co pozwala na fenotypową i funkcjonalną analizę aktywności przeciwnowotworowych limfocytów T.

Ponowne badanie komórek nowotworowych in vitro w celu predykcyjnej oceny funkcji przeciwnowotworowej komórek T receptora antygenu chimerycznego

Opisujemy podejście do niezawodnego generowania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) i testowania ich różnicowania i funkcji in vitro i in vivo.

Wytwarzanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) do immunoterapii adoptywnej

Ten protokół usprawnia produkcję wektorów retrowirusowych i transdukcję mysich limfocytów T, ułatwiając efektywne wytwarzanie mysich komórek CAR-T.

Wydajne wytwarzanie mysich chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-T

Ten protokół zapewnia metodę pierwotnej izolacji mysich limfocytów T i mikroskopii poklatkowej migracji limfocytów T w określonych warunkach środowiskowych z analizą ilościową.

Test migracji in vitro w czasie rzeczywistym dla pierwotnych mysich limfocytów T CD8 +

Obecny protokół opisuje eksperymentalny przebieg pracy, który pozwala na analizę ex vivo stymulacji ludzkich limfocytów T w allogenicznym systemie kohodowli z wcześniej leczonymi komórkami nowotworowymi.

Analiza aktywności ludzkich limfocytów T w allogenicznej kokulturze wstępnie leczonych komórek nowotworowych

Tutaj opisujemy metodę tworzenia kropelek podwójnej emulsji otaczających jedną limfocyt T i komórkę docelową raka, aby zbadać zabijanie komórek na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta pozwala na podwójną kwantyfikację zarówno cząsteczek cytotoksycznych, jak i apoptozy komórek docelowych w dużej populacji limfocytów T.

Test cytotoksyczności oparty na kropelkach w celu oceny limfocytów T receptora antygenu chimerycznego na poziomie pojedynczej komórki

Ten protokół opisuje kluczowe kroki uprawy pierwotnych komórek T, w tym ich izolację, aktywację, ekspansję oraz przejściową transfekcję przez elektroporację mRNA. Dodatkowo proponowany jest przepływ pracy i panel przeciwciał do analizy cytometrycznej fenotypu, markerów aktywacji, żywotności oraz ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych (CAR).

Izolacja, hodowla i przejściowa transfekcja pierwotnych ludzkich komórek T w celu wygenerowania komórek T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR)

Poznaj uproszczone modele in vitro i in vivo do badania interakcji między ludzkimi makrofagami a komórkami CAR T w kontekście chłoniaka płaszcza. Metoda umożliwia testowanie terapii immunologicznych skierowanych przeciwko makrofagom.

Badanie interakcji między komórkami szpikowymi a limfocytami CAR T in vitro i in vivo

Przeglądaj więcej filmów