Name: Implantacja przeszczepu naczyniowego z wykorzystaniem inżynierii tkankowej w tętnicy szyjnej myszy za pomocą techniki mankietowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T13:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Poznaj technikę mankietową implantacji inżynierowanych przeszczepów naczyniowych w tętnicę szyjną myszy. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów regeneracji tkanek naczyniowych w modelu zwierzęcym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tego badania zostało zapewnione przez projekty Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 32101098, 32071356 i 82272158) oraz Fundusz Innowacji CAMS dla Nauk Medycznych (nr 2022-I2M-1-023).

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Eksperymentów na Zwierzętach Instytutu Medycyny Radiacyjnej, Chińskiej Akademii Nauk Medycznych, i były zgodne z Wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. W badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6 w wieku 8-10 tygodni o masie ciała 25-30 g. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli materiałów.
1. Wytwarzanie przeszczepów naczyniowych o małej średnicy
UWAGA: Wytwarzaj przeszczepy naczyniowe PCL o małej średnicy, korzystając z techniki elektroprzędzenia13.
<ol>
	<li>Przygotować roztwory PCL o stężeniu 10%, 15% i 20% (w/v) w heksafluoroizopropanolu (HFIP) w temperaturze pokojowej (RT) przez 12 godzin.</li>
	<li>Załadować roztwory PCL do strzykawki o pojemności 10 ml i umieścić strzykawkę za pomocą igły ze stali nierdzewnej o sile 21 G.</li>
	<li>Umieść trzpień ze stali wolframowej (o średnicy 0.7 mm, długości 20 cm) na przyrządzie do zbierania.</li>
	<li>Wykonaj dziewięć grup przeszczepów naczyniowych PCL za pomocą techniki elektroprzędzenia. Podłącz zasilacz wysokonapięciowy do igły. Umieścić pręt ze stali wolframowej o średnicy wewnętrznej 0,7 mm w stałej odległości przed igłą jako urządzenie odbiorcze. 
	UWAGA: Opis grup przeszczepów naczyniowych znajduje się w Tabeli 1, a parametry przeszczepów naczyniowych są szczegółowo opisane w Tabeli 2.</li>
	<li>Sfabrykowane przeszczepy naczyniowe należy poddać procesowi ewakuacji. Umieść przeszczepy naczyniowe w piecu do suszenia próżniowego na 72 godziny, aby usunąć pozostałości rozpuszczalników.</li>
	<li>Wysterylizuj przeszczepy, zanurzając je w alkoholu medycznym na 30 minut i wystawiając na działanie światła UV przez noc.</li>
	<li>Obserwuj mikroskopową morfologię przeszczepów naczyniowych za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Przymocuj przeszczepy naczyniowe do etapu próbki SEM za pomocą kleju przewodzącego i umieść je w urządzeniu do napylania złota w celu powlekania.
	<ol>
		<li>Obserwować strukturę i morfologię włókien przeszczepów naczyniowych za pomocą SEM przy napięciu przyspieszającym 15 kV. Zmierz średnicę włókna i wielkość porów na podstawie obrazów SEM (n = 5) za pomocą oprogramowania ImageJ.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń właściwości mechaniczne (właściwości rozciągające i elastyczne) przeszczepów naczyniowych za pomocą maszyny do prób rozciągania. Zacisnąć górny i dolny koniec przeszczepu naczyniowego za pomocą stałych zacisków oddalonych od siebie o 1 cm.
	<ol>
		<li>Rozciągnąć przeszczep naczyniowy z prędkością 10 mm/min aż do pęknięcia. Zbierz krzywą naprężenie-odkształcenie z maszyny do prób rozciągania.</li>
		<li>Oblicz parametry mechaniczne, w tym maksymalne obciążenie (2-15 N), naprężenie przy zerwaniu (5-30 MPa), odkształcenie przy zerwaniu (200%-1500%) i moduł sprężystości (1-20 MPa)14.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonuj analizy statystyczne za pomocą oprogramowania statystycznego i do tworzenia wykresów. Wyraż dane jako średnią ± odchylenie standardowe. Analizuj i porównuj różnice jednowymiarowe między wieloma grupami za pomocą testu post hoc Tukeya w jednoczynnikowej ANOVA. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.</li>
</ol>
2. Wysiewanie makrofagów na przeszczepy naczyniowe
UWAGA: Upewnij się, że wszystkie roztwory i materiały są sterylne. Przeprowadzaj wszystkie operacje w pomieszczeniu do hodowli komórkowych.
<ol>
	<li>Hodowla RAW264.7 (makrofag monocytów myszy) w kolbach w warunkach przylegania (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A). Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych przy użyciu kompletnej zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 1% penicyliny-streptomycyny i 10% płodowej surowicy bydlęcej. Umieścić kolby w inkubatorze o temperaturze 37 °C zawierającym 5% dwutlenku węgla.</li>
	<li>Zbierz makrofagi za pomocą skrobaka do komórek. Wyrzucić pożywkę za pomocą pipety o pojemności 1 ml i przemyć komórki PBS.
	<ol>
		<li>Dodać 2 ml świeżej pożywki do kolby hodowlanej i delikatnie zeskrobać powierzchnię za pomocą skrobaka do komórek. Zebrane komórki przenieść do probówki i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić 5 × 106 komórek w 100 μl kompletnego podłoża.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić przeszczep naczyniowy PCL (o długości 1 cm) w probówce o pojemności 15 ml wypełnionej DMEM i odwirować przy 4 000 x g przez 5 minut. Powtórz ten proces kilka razy, aż przeszczep opadnie na dno probówki, zapewniając całkowitą infiltrację materiału DMEM.</li>
	<li>Przygotuj 10 cm szalkę Petriego wyłożoną warstwą bibuły filtracyjnej. Umieść zwilżony przeszczep naczyniowy PCL na bibule filtracyjnej i zwiń go w celu usunięcia nadmiaru pożywki.</li>
	<li>Pobrać 10 μl zawiesiny komórkowej za pomocą pipety o pojemności 10 μl i wstrzyknąć ją na jeden koniec przeszczepu naczyniowego. Obrócić przeszczep naczyniowy nad bibułą filtracyjną, aby ułatwić równomierne rozprowadzenie zawiesiny. Wstrzyknąć każdy koniec pięć razy, co daje w sumie dziesięć wstrzyknięć (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B, C).</li>
	<li>Umieścić przeszczep naczyniowy obciążony makrofagami na 24-dołkowej płytce zawierającej 1 ml kompletnej pożywki i inkubować przez 2 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych przed implantacją.</li>
	<li>Określ rozmieszczenie komórek w ścianie przeszczepu. Osadź przeszczep naczyniowy obciążony makrofagami w związku optycznej koherentnej tomografii (OCT) do kriosekcji. Wybarwić jądra komórek 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) i obserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>
3. Model implantacji tętnicy szyjnej myszy
UWAGA: Utrzymuj sterylne miejsce do zabiegów na zwierzętach. Przed zabiegiem wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne i jednorazówki.
<ol>
	<li>Wybierz trzy zdrowe samce myszy C57BL/6, z których każda waży 25-30 g. Wszczep jeden przeszczep naczyniowy każdemu zwierzęciu, co daje w sumie trzy przeszczepy.</li>
	<li>Zbuduj mankiety z nylonowej rurki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A) i przedstaw schemat ideowy techniki mankietu naczyniowego w <silna klasa="xfig">Rysunek 2B.</li>
	<li>Znieczulenie myszy należy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu w stężeniu 50 mg/kg (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Potwierdź głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi. Zapewnij wsparcie termiczne (poduszka grzewcza o temperaturze 37 °C) i nałóż maść okulistyczną z wazeliną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Ustaw mysz w pozycji leżącej na stole operacyjnym i usuń włosy na szyi. Zdezynfekuj skórę kilka razy naprzemiennymi rundami jodoforu i alkoholu. Przykryj obszar niechirurgiczny sterylną gazą, aby utrzymać sterylne środowisko (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A).</li>
	<li>Za pomocą ostrza chirurgicznego wykonaj nacięcie w linii środkowej (1,5-2 cm długości) od żuchwy do mostka. Podnieś lewe gruczoły ślinowe i wytnij lewy mięsień obojczykowo-sutkowy, aby zwiększyć pole widzenia operacji. Odsłoń lewą tętnicę szyjną wspólną za pomocą mikropęsety (<silna klasa="xfig">Ryc. 3B).</li>
	<li>Odizoluj lewą tętnicę szyjną za pomocą mikrokleszczyków (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C).</li>
	<li>Podwiązać tętnicę szyjną w dwóch miejscach w środkowej części za pomocą szwu 9-0. Przeciąć tętnicę między dwiema ligaturami za pomocą mikronożyczek. Przełóż mankiet przez tętnice na każdym końcu i zabezpiecz tętnicę i mankiet razem za pomocą klipsów tętniczych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3D).</li>
	<li>Obróć tętnicę na zewnątrz, aby zakryć korpus mankietu i przymocuj ją do mankietu za pomocą szwu 9-0 z mikrokleszczami (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3E).</li>
	<li>Wszczepić przeszczep naczyniowy między dwoma końcami tętnicy szyjnej, przesuwając końce przeszczepu po mankiecie tętnicy i zabezpieczając je szwami 9-0 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3F). 
	UWAGA: Dane wymiarowe mankietu, tętnicy szyjnej i przeszczepu naczyniowego przedstawiono w tabeli 3. Chociaż średnice przeszczepu i mankietu są ściśle zbliżone do średnic tętnic szyjnych myszy, istnieje niezgodność między średnicą światła zespolenia a średnicą przeszczepu. Średnicę światła zespolenia oblicza się, odejmując dwukrotność grubości ściany tętnicy szyjnej (0,1 mm) od wewnętrznej średnicy mankietu (0,5 mm), co daje średnicę światła 0,3 mm. Przeszczep naczyniowy ma średnicę wewnętrzną 0,7 mm, co prowadzi do niedopasowania około 2,3 razy (0,7 mm / 0,3 mm = 2,3).</li>
	<li>Usuń klipsy tętnicze na obu końcach i przepłucz miejsce implantacji solą fizjologiczną. Oceń drożność przeszczepu naczyniowego, obserwując dystalną pulsację tętnic (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3G).</li>
	<li>Zmień położenie lewego gruczołu ślinowego i zamknij pole operacyjne za pomocą szwów 6-0 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3H).</li>
</ol>
4. Opieka i analiza pozabiegowa
<ol>
	<li>Przenieść mysz do inkubatora o temperaturze 37 °C i stale monitorować jej parametry życiowe, aż do momentu odzyskania przytomności.</li>
	<li>Podawać 5 mg/kg ketoprofenu przezotrzewnowo 30 minut przed rozpoczęciem zabiegu. Następnie, bezpośrednio po zakończeniu szycia, wstrzyknąć podskórnie 0,1 mg/kg butorfanolu i powtarzać co 8 godzin przez 24 godziny.</li>
	<li>Monitoruj mysz w okresie rekonwalescencji i nie zwracaj jej do mieszkania grupowego, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.</li>
	<li>Znieczulenie myszy należy przeprowadzić miesiąc po implantacji i pobrać próbki przeszczepu naczyniowego do analizy histologicznej9.</li>
	<li>Przeprowadzić eutanazję poprzez uduszenie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z wytycznymi etycznymi.</li>
</ol>

<ol><li>Adhikary, D., Barman, S., Ranjan, R., Stone, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+of+major+cardiovascular+risk+factors%3A+A+growing+global+health+concern%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">A systematic review of major cardiovascular risk factors: A growing global health concern.</a> Cureus. 14 (10), e30119(2022).</li>
<li>Alexander, J. H., Smith, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary-artery+bypass+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Coronary-artery bypass grafting.</a> N Engl J Med. 374 (20), 1954-1964 (2016).</li>
<li>Jeong, Y., Yao, Y., Yim, E. K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+intimal+hyperplasia+and+effect+of+compliance+in+synthetic+small+diameter+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Current understanding of intimal hyperplasia and effect of compliance in synthetic small diameter vascular grafts.</a> Biomater Sci. 8 (16), 4383-4395 (2020).</li>
<li>Lawson, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+human+acellular+vessels+for+dialysis+access+in+patients+with+end-stage+renal+disease%3A+Two+phase+2+single-arm+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Bioengineered human acellular vessels for dialysis access in patients with end-stage renal disease: Two phase 2 single-arm trials.</a> Lancet. 387 (10032), 2026-2034 (2016).</li>
<li>Kirkton, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+human+acellular+vessels+recellularize+and+evolve+into+living+blood+vessels+after+human+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Bioengineered human acellular vessels recellularize and evolve into living blood vessels after human implantation.</a> Sci Transl Med. 11 (485), eaau6934(2019).</li>
<li>Wang, C., Li, Z., Zhang, L., Sun, W., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+results+of+triple-layered+small+diameter+vascular+grafts+in+sheep+carotid+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Eng+Phys%22%5BJournal%5D)">Long-term results of triple-layered small diameter vascular grafts in sheep carotid arteries.</a> Med Eng Phys. 85, 1-6 (2020).</li>
<li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+small-diameter+silk+vascular+grafts+implanted+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22JTCVS+Open%22%5BJournal%5D)">Evaluation of small-diameter silk vascular grafts implanted in dogs.</a> JTCVS Open. 6, 148-156 (2021).</li>
<li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+small-diameter+tissue-engineered+vascular+grafts+electrospun+from+heparin+end-capped+PCL+and+evaluation+in+a+rabbit+carotid+artery+replacement+model%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Preparation of small-diameter tissue-engineered vascular grafts electrospun from heparin end-capped PCL and evaluation in a rabbit carotid artery replacement model.</a> Macromol Biosci. 19 (8), e1900114(2019).</li>
<li>Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+small-diameter+in+situ+tissue+engineered+vascular+grafts+with+core%2Fshell+fibrous+structure+and+a+one-year+evaluation+via+rat+abdominal+vessel+replacement+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Adv%22%5BJournal%5D)">Fabrication of small-diameter in situ tissue engineered vascular grafts with core/shell fibrous structure and a one-year evaluation via rat abdominal vessel replacement model.</a> Biomater Adv. 165, 214018(2024).</li>
<li>Wei, Y., Wang, F., Guo, Z., Zhao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+vascular+grafts+and+regeneration+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered vascular grafts and regeneration mechanisms.</a> J Mol Cell Cardiol. 165, 40-53 (2022).</li>
<li>Cleary, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+tissue+engineering%3A+The+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Vascular tissue engineering: The next generation.</a> Trends Mol Med. 18 (7), 394-404 (2012).</li>
<li>Roh, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+vascular+grafts+transform+into+mature+blood+vessels+via+an+inflammation-mediated+process+of+vascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered vascular grafts transform into mature blood vessels via an inflammation-mediated process of vascular remodeling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (10), 4669-4674 (2010).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+thick+fibers+and+large+pores+of+electrospun+poly%28%CE%B5-caprolactone%29+vascular+grafts+on+macrophage+polarization+and+arterial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of thick fibers and large pores of electrospun poly(ε-caprolactone) vascular grafts on macrophage polarization and arterial regeneration.</a> Biomaterials. 35 (22), 5700-5710 (2014).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-tethered+vascular+grafts+enable+blood+vessel+regeneration+via+endogenous+cell+recruitment+and+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Compos+B+Eng%22%5BJournal%5D)">Peptide-tethered vascular grafts enable blood vessel regeneration via endogenous cell recruitment and neovascularization.</a> Compos B Eng. 252, 110504(2023).</li>
<li>Hu, Y., Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+graft+atherosclerosis+in+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Vessel graft atherosclerosis in murine models.</a> Curr Drug Targets. 9 (3), 239-250 (2008).</li>
<li>Qin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+electrospun+vascular+grafts+with+optimized+structure+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Implantation of electrospun vascular grafts with optimized structure in a rat model.</a> J Vis Exp. (136), e57340(2018).</li>
<li>Geelhoed, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+engineering+autologous+non-thrombogenic+in+situ+tissue-engineered+blood+vessels+for+arteriovenous+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A novel method for engineering autologous non-thrombogenic in situ tissue-engineered blood vessels for arteriovenous grafting.</a> Biomaterials. 229, 119577(2020).</li>
<li>Wu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+vascular+graft+with+circumferentially+oriented+microchannels+for+improving+artery+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Construction of vascular graft with circumferentially oriented microchannels for improving artery regeneration.</a> Biomaterials. 242, 119922(2020).</li>
<li>Vasquez, E. C., Peotta, V. A., Gava, A. L., Pereira, T. M., Meyrelles, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+and+vascular+phenotypes+in+the+apolipoprotein+e-deficient+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">Cardiac and vascular phenotypes in the apolipoprotein e-deficient mouse.</a> J Biomed Sci. 19 (1), 22(2012).</li>
<li>Garcia, V., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+nos%3A+Perspective+and+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Endothelial nos: Perspective and recent developments.</a> Br J Pharmacol. 176 (2), 189-196 (2019).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+precision+of+genetic+lineage+tracing+using+dual+recombinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Enhancing the precision of genetic lineage tracing using dual recombinases.</a> Nat Med. 23 (12), 1488-1498 (2017).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+improves+regeneration+and+prevents+calcification+in+bio-hybrid+vascular+grafts+via+regulation+of+vascular+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide improves regeneration and prevents calcification in bio-hybrid vascular grafts via regulation of vascular stem/progenitor cells.</a> Cell Rep. 39 (12), 110981(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów finansowych.

Zastosowanie techniki mankietowej do wszczepiania przeszczepów naczyniowych za pomocą inżynierii tkankowej w tętnicy szyjnej myszy stanowi znaczący postęp w badaniach nad układem sercowo-naczyniowym15. Kluczowe etapy tej techniki obejmują wysiew komórek i implantację przeszczepu. W badaniu tym zastosowano podejście oparte na adsorpcji perfuzyjnej w celu zwiększenia gęstości wysiewu makrofagów w celu rozwiązania problemów związanych z niejednorodnym wysiewem komórek i niską żywotnością komórek. Ta ...

Częstość występowania i śmiertelność chorób sercowo-naczyniowych wzrasta na całym świecie, stanowiąc poważny problem zdrowia publicznego1. Pomostowanie naczyniowe jest skuteczną interwencją w przypadku ciężkiej choroby niedokrwiennej serca i choroby naczyń obwodowych2. Stosowanie sztucznych przeszczepów naczyniowych o średnicy przekraczającej 6 mm zostało dobrze udokumentowane w warunkach klinicznych. I odwrotnie, osoby o średnicy poniżej 6 mm są podatne na zakrzepicę i przerost błony wewnętrznej, co może prowadzić do znacznego ryzyka restenozy3. Pomimo znacznych postępów w badaniach i rozwoju przeszczepów naczyniowych o małej średnicy w ostatnich latach, z kilkoma produktami zbliżającymi się do zastosowania klinicznego, nadal istnieje wiele wyzwań4,5. Należą do nich stosunkowo niski wskaźnik drożności długoterminowej, ograniczona regeneracja naczyń krwionośnych i niewystarczające zrozumienie mechanizmu regeneracji.
Przedkliniczna ocena nowych przeszczepów naczyniowych o małej średnicy opiera się na implantacji in vivo w różnych modelach zwierzęcych. Najczęściej używane modele obejmują modele implantacji tętnicy szyjnej owcy, tętnicy udowej psa, tętnicy szyjnej królika i implantacji tętnicy brzusznej szczura6,7,8,9. Drożność przeszczepów naczyniowych można ocenić u średnich i dużych zwierząt, takich jak owce, świnie i psy. Badania te wiążą się jednak ze znacznymi kosztami ze względu na wymaganą wiedzę specjalistyczną i sprzęt. Dodatkowo ich złożoność techniczna stanowi wyzwanie do wdrożenia. Z kolei małe modele zwierzęce, takie jak króliki i szczury, nie mają dobrze ugruntowanych gatunków transgenicznych o jasno określonym pochodzeniu genetycznym, co stanowi poważną przeszkodę w badaniu mechanizmów regeneracji naczyń krwionośnych.
W porównaniu do wyżej wymienionych modeli zwierzęcych, model mysi oferuje stosunkowo prostą procedurę chirurgiczną, dobrze ugruntowaną metodologię generowania genetycznie modyfikowanych myszy oraz jasno określone tło genetyczne. Jednak mała średnica naczyń krwionośnych myszy sprawia, że zespolenie typu end-to-end w przeszczepie naczyniowym jest technicznie skomplikowane, wymaga znacznej wiedzy specjalistycznej i zapewnia stosunkowo niski wskaźnik sukcesu. Aby zmniejszyć złożoność procedury i poprawić wskaźnik powodzenia implantacji przeszczepu naczyniowego, w niniejszym badaniu zastosowano technikę mankietu w modelu implantacji tętnicy szyjnej myszy.
Po implantacji in vivo, przeszczepy naczyniowe mogą rekrutować endogenne komórki, które przyczyniają się do regeneracji tkanki naczyniowej. Obecność tych komórek ułatwia śródbłonek i regenerację warstwy mięśni gładkich przeszczepów. 10. Jednak źródło i typ komórek biorących udział w regeneracji tkanki naczyniowej pozostają niejasne, a wiele konkurencyjnych teorii jest w trakcie badania11. Wśród nich badania koncentrowały się na roli komórek zapalnych i macierzystych. Breuer i wsp. posadzili monocyty pochodzące z ludzkiego szpiku kostnego (hBMC) na przeszczepach naczyniowych i odkryli, że wysiewane komórki rekrutują komórki gospodarza do ściany przeszczepu poprzez uwalnianie białka chemoatraktantu monocytów-1 (MCP-1), promując w ten sposób regenerację tkanki naczyniowej12. W tym badaniu zaproponowano skuteczną metodę wysiewu komórek adsorpcji perfuzyjnej, którą z powodzeniem zastosowano do wysiewu makrofagów na przeszczepy naczyniowe o małej średnicy z polikaprolaktonu (PCL). Po implantacji komórki te wykazywały trwałą żywotność.
Ten artykuł szczegółowo opisuje metodologię przygotowania przeszczepów naczyniowych metodą inżynierii tkankowej oraz procedury implantacji tętnicy szyjnej u myszy przy użyciu techniki mankietowej. Proces rozpoczyna się od wytworzenia przeszczepów naczyniowych PCL o małej średnicy o określonych parametrach za pomocą wirowania elektrostatycznego. Następnie przeszczepy uznane za nadające się do implantacji poddawane są testom mechanicznym. Makrofagi są następnie wysiewane na przeszczepy naczyniowe metodą adsorpcji perfuzyjnej. Na koniec przeszczepy naczyniowe wysiane makrofagami są wszczepiane do tętnicy szyjnej myszy za pomocą techniki mankietowej, a drożność i właściwości regeneracyjne są analizowane po miesiącu implantacji in vivo.
Ta technika ma potencjał do zwiększenia skuteczności i skuteczności przeszczepów naczyniowych w modelach mysich. Co więcej, model może być wykorzystany do zbadania mechanizmów leżących u podstaw źródeł komórkowych, kluczowych genów i aktywnych czynników w regeneracji naczyń krwionośnych, zapewniając teoretyczne i metodologiczne wsparcie dla funkcjonalnej modyfikacji i rozwoju nowych przeszczepów naczyniowych o małej średnicy.

<table><tbody><tr><td>1% penicylina-streptomycyna</td><td>Solarbio</td><td>P1400</td><td></td></tr><tr><td>10% płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol</td><td>Tianjin Chemical Reaggent Company</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw myszom CD31 primary </td><td>BD Bioscience</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>Klipsy tętnicze</td><td>RWD Life Science</td><td>R31005-06</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>myszy Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże orła (DMEM)</td> <td>Gibco</td><td>11966025</td><td></td></tr><tr><td>Elektrostatyczna maszyna przędzalnicza</td><td>Yunfan Technology</td><td>DP30</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-szczurza IgG (Alexa Fluor 555)</td> <td>Invitrogen</td><td>A-21434</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina i eozyna (H& E)</td> <td>Solarbio</td><td>G1120</td><td></td></tr><tr><td>Heksafluoroizopropanol (HFIP)</td><td>McClean</td><td>H811026</td><td></td></tr><tr><td>Jodofor</td><td>LIRCON</td><td>V273068</td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki</td><td>Świat Instrumenty precyzyjne</td><td>14124</td><td></td></tr><tr><td>Mikropęsety</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>500338</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td></td><td>Boster AR0009</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna normalna</td><td>Cisen Firma farmaceutyczna</td><td>H20113369</td><td></td></tr><tr><td>Nylonowa rurka do mankietu</td><td>Portex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optymalna temperatura cięcia (OCT)</td><td>Sakara</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td>Sigma</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Solarbio</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>Poli(&epsilon;- kaprolakton) (PCL) granulki (Mn = 80 000)</td><td>Makrofagi Sigma</td><td>704067</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7</td><td>Biyuntian Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy (SEM)</td><td>Zeiss</td><td>PHENOM-XL-G2</td><td></td></tr><tr><td>Szwy chirurgiczne 6-0</td><td>Fabryka mikroaparatów Ningbo Chenghe</td><td>220919</td><td></td></tr><tr><td>Szwy chirurgiczne 9-0</td><td>Fabryka mikroaparatów Ningbo Chenghe</td><td>221006</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Changqiang Urządzenia medyczne&nbsp; &nbsp;</td><td>0197</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do prób rozciągania</td><td>Instron</td><td>WDW-5D</td><td></td></tr></tbody></table>

implantacja przeszczepu naczyniowego z wykorzystaniem inżynierii tkankowej w tętnicy szyjnej myszy za pomocą techniki mankietowej

Implantation of Tissue-Engineered Vascular Graft in Mouse Carotid Artery via Cuff Technique

Rozwój przeszczepów naczyniowych o małej średnicy był globalnym przedsięwzięciem, z licznymi grupami badawczymi przyczyniającymi się do rozwoju tej dziedziny. Doświadczenia na zwierzętach odgrywają kluczową rolę w ocenie skuteczności i bezpieczeństwa przeszczepów naczyniowych, szczególnie w przypadku braku zastosowań klinicznych. W porównaniu z alternatywnymi modelami zwierzęcymi, model implantacji myszy oferuje kilka zalet, w tym dobrze zdefiniowane tło genetyczne, dojrzałą metodę budowy modelu choroby i prosty zabieg chirurgiczny. Opierając się na tych zaletach, w niniejszym badaniu opracowano prostą technikę mankietową do implantacji przeszczepów naczyniowych za pomocą inżynierii tkankowej w tętnicy szyjnej myszy. Technika ta rozpoczęła się od wytworzenia polikaprolaktonu (PCL) przeszczepów naczyniowych o małej średnicy za pomocą wirowania elektrostatycznego, a następnie wysiewu makrofagów na przeszczepy poprzez adsorpcję perfuzyjną. Następnie komórkowe, zmodyfikowane tkankowo przeszczepy naczyniowe przeszczepiono do tętnicy szyjnej myszy przy użyciu techniki mankietu w celu oceny drożności i zdolności regeneracyjnych. Po 30 dniach od implantacji in vivo stwierdzono, że drożność naczyń jest zadowalająca, z dowodami na regenerację tkanek nowotworowych i utworzenie warstwy śródbłonka w świetle przeszczepów. Wszystkie dane zostały przeanalizowane za pomocą oprogramowania statystycznego i graficznego. W ramach tego badania udało się stworzyć model implantacji tętnicy szyjnej myszy, który można wykorzystać do zbadania komórkowych źródeł regeneracji naczyń krwionośnych i mechanizmów działania substancji czynnych. Ponadto stanowi teoretyczne wsparcie dla rozwoju nowatorskich przeszczepów naczyniowych o małej średnicy.

Z powodzeniem przygotowano protezy naczyniowe o małej średnicy o różnych parametrach poprzez elektroprzędzenie. Obrazy SEM wykazały, że włókna były rozmieszczone równomiernie i tworzyły nieregularną strukturę w obrębie ściany przeszczepu, z obecnością struktur porowatych (Rycina 4). Wraz ze wzrostem stężenia PCL zwiększała się zarówno średnica włókien, jak i wielkość porów. Konkretne wartości dla każdej grupy protez naczyniowych przedstawiono w Tabela 2Wyniki badań ...

Tutaj przedstawiono protokół implantacji przeszczepu naczyniowego z wykorzystaniem inżynierii tkankowej do tętnicy szyjnej myszy za pomocą techniki mankietowej, dostarczając odpowiedniego modelu zwierzęcego do badania mechanizmów regeneracji tkanki naczyniowej.

Implantacja przeszczepu naczyniowego z wykorzystaniem inżynierii tkankowej w tętnicy szyjnej myszy za pomocą techniki mankietowej

The development of small-diameter vascular grafts has been a global endeavor, with numerous research groups contributing to this field. Animal ...

Zajmuję się biomateriałem sercowo-naczyniowym i medycyną regeneracyjną. Staramy się rozwiązać problem niskiej drożności przeszczepów naczyniowych o małej średnicy.Opracowane niedawno biorurki składają się ze szkieletów z włókien polimerowych i zwierzęcej macierzy zewnątrzkomórkowej i są obecnie w trzeciej fazie badań klinicznych.Obecnie źródła komórek i mechanizm zaangażowany w regenerację naczyń krwionośnych nie są jasne i wymagają odpowiednich badań naukowych, aby rzetelnie zrozumieć te procesy. Wyprodukowałem przeszczepy naczyniowe o małej średnicy, zmodyfikowane różnymi substancjami bioaktywnymi przy użyciu techniki elektroprzędzenia, co poprawiło ich drożność w chorych modelach zwierzęcych. Technika jest łatwa w obsłudze i może poprawić ich wydajność i wskaźnik sukcesu.W przyszłości nasza grupa badawcza skupi się na mechanizmie działania naczyniowych komórek macierzystych w utrzymaniu drożności naczyń i procesie regeneracji naczyń krwionośnych.[Narrator] Aby rozpocząć, załaduj roztwór polikaprolaktonu lub PCL do 10-mililitrowej strzykawki i umieść ją za pomocą igły ze stali nierdzewnej o rozmiarze 21. Umieść trzpień ze stali wolframowej o średnicy 0.7 milimetra i długości 20 centymetrów na przyrządzie do zbierania. Wykonaj dziewięć grup przeszczepów naczyniowych PCL za pomocą techniki elektroprzędzenia. Podłącz zasilacz wysokiego napięcia do igły, a następnie umieść pręt ze stali wolframowej o średnicy wewnętrznej 0,7 milimetra w ustalonej odległości przed igłą, aby służył jako urządzenie odbiorcze. Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra wyrzuć pożywkę z kultury i umyj komórki PBS. Teraz dodaj dwa mililitry świeżej pożywki do kolby hodowlanej i delikatnie zeskrob powierzchnię skrobakiem do komórek. Przenieść zebrane komórki do probówki i odwirować przy 1000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zamieszaj pięć razy 10 do mocy sześciu ogniw w 100 mikrolitrach kompletnego podłoża. Następnie umieść przeszczep naczyniowy PCL o długości jednego centymetra w 15-mililitrowej probówce wypełnionej DMEM. Odwirować probówkę o stężeniu 4 000 G przez pięć minut. Następnie przygotuj 10-centymetrową szalkę Petriego wyłożoną warstwą bibuły filtracyjnej. Umieść zwilżony przeszczep naczyniowy PCL na bibule filtracyjnej i zwiń go w celu usunięcia nadmiaru pożywki. Teraz, za pomocą pipety P10, weź 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej i wstrzyknij zawiesinę na jeden koniec przeszczepu naczyniowego. Obrócić przeszczep naczyniowy nad bibułą filtracyjną, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie zawiesiny. Umieść przeszczep naczyniowy obciążony makrofagami w 24-dołkowej płytce zawierającej jeden mililitr kompletnego podłoża. Inkubować płytkę przez dwie godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych przed implantacją. Umieść znieczuloną mysz na wznak na stole operacyjnym. Po wykonaniu nacięcia w linii środkowej podnieś lewe gruczoły ślinowe i wytnij lewy mięsień obojczykowy, aby poprawić chirurgiczne pole widzenia. Następnie odsłoń lewą tętnicę szyjną wspólną za pomocą mikropęsety. Teraz odizoluj lewą tętnicę szyjną za pomocą mikrokleszczy. Podwiązać tętnicę szyjną w dwóch miejscach w środkowej części za pomocą szwu 9-0 i przeciąć tętnicę między dwiema ligaturami za pomocą mikronożyczek. Przełóż mankiet przez tętnice na każdym końcu. Następnie zabezpiecz tętnicę i mankiet razem za pomocą klipsów tętniczych. Następnie obróć tętnicę na zewnątrz, aby zakryć korpus mankietu i przymocuj tętnicę do mankietu za pomocą szwu 9-0 z mikrokleszkami. Ostrożnie wszczepić przeszczep naczyniowy między dwoma końcami tętnicy szyjnej i nasunąć końce przeszczepu na mankiet tętnicy. Następnie zabezpiecz przeszczepy szwami 9-0. Następnie usuń zaciski tętnicze na obu końcach przed przepłukaniem miejsca implantacji solą fizjologiczną. Następnie obserwuj dystalną pulsację tętnicy, aby ocenić drożność przeszczepu naczyniowego. Na koniec zmień położenie lewego gruczołu ślinowego i zamknij pole operacyjne za pomocą szwów 6-0. Przeszczepy naczyniowe o małej średnicy wykazywały równomierny rozkład włókien z nieregularnym układem i obecnością struktur porowych. Wraz ze wzrostem stężenia PCL zwiększyła się zarówno średnica włókna, jak i wielkość porów. Badania mechaniczne wykazały, że wszystkie przeszczepy naczyniowe spełniają wymagane normy mechaniczne. Maksymalne obciążenie i odkształcenie przy zerwaniu wzrastało wraz ze wzrostem stężeń PCL i większą grubością ściany naczynia, podczas gdy moduł sprężystości zmniejszał się. Makrofagi udało się wszczepić do przeszczepów naczyniowych metodą adsorpcji perfuzyjnej, a ich równomierne rozmieszczenie potwierdzono za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Obrazowanie przekrojowe wykazało, że makrofagi infiltrowały ze światła do ściany przeszczepu. Po 30 dniach implantacji in vivo wskaźnik przeżycia wynosił 100%, a dwa z trzech przeszczepów naczyniowych pozostały nietknięte, bez tętniaków lub włóknistej otoczki. Barwienie hematoksyliną i eozyną wykazało znaczną infiltrację komórkową i tworzenie się tkanki neo w świetle przeszczepu, barwienie immunofluorescencyjne CD31 potwierdziło regenerację tkanki śródbłonka z nienaruszonym pokryciem komórek śródbłonka.

implantation-tissue-engineered-vascular-graft-mouse-carotid-artery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy technikę, w której fragment aorty brzusznej myszy jest przeszczepiany ortotopowo tuż poniżej tętnic nerkowych u biorcy allogenicznego lub syngenicznego. Technika ta może być przydatna w badaniach, w których za korzystne uznaje się przeszczepienie dużych tętnic o jednolitym rozmiarze.

Ortotopowy przeszczep aorty u myszy do badań nad chorobami naczyniowymi

Model przeszczepu mysiego serca szyjnego doskonale nadaje się do badań immunologicznych i niedokrwiennych uszkodzeń reperfuzyjnych. Zmodyfikowaliśmy procedurę przy użyciu techniki mankietu bez szwów i przeprowadziliśmy ponad 1000 udanych przeszczepów przy użyciu tego podejścia. Niniejszym podajemy dodatkowe szczegóły tej techniki, aby uzupełnić film.

Mysi model przeszczepu szyjki macicy przy użyciu zmodyfikowanej techniki mankietowej

Aby poszerzyć naszą wiedzę na temat komórkowego i molekularnego tworzenia się nowotworów, niedawno opracowano mysi model TEVG. Przeszczepy wszczepiono jako przeszczepy z interpozycją żyły głównej podnerkowej u myszy C57BL/6. Model ten osiąga wyniki podobne do tych osiągniętych w naszym badaniu klinicznym, ale w znacznie krótszym czasie.

Implantacja przeszczepu interpozycji żyły głównej dolnej w modelu mysim

Protokół krok po kroku do międzypozycyjnego umieszczania naczyń TEV (Tissue Engineered Departments) w tętnicy szyjnej owcy za pomocą zespolenia end-to-end i cyfrowej oceny w czasie rzeczywistym in vivo, aż do uśmiercenia zwierzęcia.

Technika chirurgiczna implantacji przeszczepów naczyniowych wykorzystujących inżynierię tkankową, a następnie monitorowanie in vivo

Tutaj prezentujemy protokół do generowania przeszczepów naczyń krwionośnych z inżynierii tkankowej, które są funkcjonalne do szczepienia myszom poprzez podwójne wysiewanie częściowo indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (PiPSC) - pochodzących komórek mięśni gładkich i PiPSC - pochodzących komórek śródbłonka na bezkomórkowym bioreaktorze rusztowania naczyń krwionośnych.

Wytwarzanie i przeszczepianie naczyń krwionośnych metodą inżynierii tkankowej w modelu mysim

Technika mankietowa skraca i ułatwia model heterotopowego przeszczepu szyjki macicy u myszy, unikając technicznie trudnych zespoleń szwów w małych naczyniach. Szczegóły techniczne przedstawione w tym artykule wideo powinny pozwolić naukowcom na ustalenie tego modelu w swoich laboratoriach.

Heterotopowy przeszczep szyjki macicy u myszy

Tutaj prezentujemy protokół heterotopowego przeszczepu aorty u myszy przy użyciu techniki mankietu bez szwów w mysim modelu szyjki macicy. Model ten może być wykorzystany do badania patologii leżącej u podstaw przewlekłej waskulopatii przeszczepu allogenicznego (CAV) i może pomóc w ocenie nowych środków terapeutycznych w celu zapobiegania jej powstawaniu.

Mysi model przeszczepu aorty szyjnej przy użyciu zmodyfikowanej techniki mankietu bez szwów

W obecnym protokole, model przeszczepu serca myszy jest używany do badania mechanizmu odrzucania przeszczepu alloprzeszczepu serca. W tym heterotopowym modelu przeszczepu serca poprawia się efektywność operacji, a przeżycie przeszczepów serca jest zapewnione dzięki zespoleniu implantacji serca w szyjce macicy od końca do końca przy użyciu zmodyfikowanej techniki Cuff.

Zmodyfikowana technika mankietowa dla heterotopowego modelu przeszczepu szyjki macicy serca u myszy

Modele transplantacji serca u myszy stanowią cenne narzędzia badawcze do badania immunologii transplantacyjnej. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje heterotopowy przeszczep serca szyjki macicy u myszy, który polega na umieszczeniu mankietów na wspólnej tętnicy szyjnej biorcy i pniu tętnicy płucnej dawcy, aby umożliwić laminarny przepływ krwi.

Heterotopowy przeszczep szyjki macicy u myszy z wykorzystaniem mankietów naczyniowych

Ten protokół dostarcza informacji technicznych dotyczących rekonstrukcji naczyń krwionośnych przy użyciu techniki mankietowej w ortotopowym przeszczepie wątroby u myszy.

Rekonstrukcja naczyń krwionośnych techniką mankietową w ortotopowym przeszczepie wątroby u myszy

Ten protokół przedstawia uproszczoną technikę anastomozy szwu końcowo-bocznego do przeszczepu serca szyjnego u myszy, zapewniając solidny i możliwy do powtórzenia model do badania immunologii przeszczepów.

Przeszczepienie heterotopowe serca mysiego w okolicy szyjnej z zastosowaniem techniki anastomozy końca z boku w celu badania immunologii przeszczepów

Poznaj technikę mankietową implantacji inżynierowanych przeszczepów naczyniowych w tętnicę szyjną myszy. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów regeneracji tkanek naczyniowych w modelu zwierzęcym.

Implantacja przeszczepu naczyniowego z wykorzystaniem inżynierii tkankowej w tętnicy szyjnej myszy za pomocą techniki mankietowej (Wideo) | JoVE Journal

Implantacja przeszczepu naczyniowego z wykorzystaniem inżynierii tkankowej w tętnicy szyjnej myszy za pomocą techniki mankietowej

Przeglądaj więcej filmów