Name: Wytwarzanie wierzchołkowych organoidów jelitowych i ocena szybkości proliferacji organoidów za pomocą znakowania EdU (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T14:57:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania wierzchołkowych organoidów jelitowych z komórek macierzystych psów i oceny szybkości proliferacji za pomocą znakowania EdU. Protokół umożliwia badanie polaryzacji i dynamiki komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez zasoby VetImaging Core Facility (VetCore, Vetmeduni, Austria). Pragniemy podziękować Ursuli Reichart za jej wsparcie w zakresie półilościowej analizy obrazu. GC jest stypendystą DOC (numer grantu 26349) Austriackiej Akademii Nauk (ÖAW) na Wydziale Chorób Wewnętrznych Małych Zwierząt w Vetmeduni.

Użyto organoidów jelitowych pochodzących od dorosłych komórek macierzystych od psów, ustalonych według Kramer et al., 202014. Zgodnie z wytycznymi uczelnianej komisji bioetycznej, wykorzystanie materiału tkankowego pobranego podczas wycięcia terapeutycznego lub sekcji zwłok jest ujęte w "zgodzie właściciela na leczenie" uczelni, która została podpisana przez wszystkich właścicieli pacjentów.
1. Hodowla organoidów
<ol>
	<li>Hoduj organoidy jelitowe pochodzące z dorosłych komórek macierzystych osadzone w wybranej matrycy ekstraktu z błony podstawnej (BME) na 24-dołkowych płytkach i dziel je mechanicznie za pomocą szklanych pipet, jak opisano szczegółowo w Pleguezuelos et al., 202015. 
	UWAGA: W opisanym tutaj protokole Geltrex został użyty jako BME.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć rafinowane podłoże (Tabela 1) z organoidów osadzonych w BME.</li>
	<li>Dodać 500 μl 0,05% trypsyny-EDTA do studzienki i odłączyć wszystkie kopuły matrycy od studzienki, wielokrotnie pipetując w górę i w dół. Przenieść organoidy do probówki o pojemności 15 ml i dobrze zawiesić, aby całkowicie zdysocjować matrycę hydrożelową.</li>
	<li>Inkubować organoidy z 0,05 % trypsyną-EDTA w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej, aż wszystkie organoidy zostaną zdysocjowane na pojedyncze komórki lub małe skupiska komórek.</li>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę trypsyny/komórek podłożem podstawowym (Tabela 1). Użyj co najmniej dwa razy więcej podłoża podstawowego niż trypsyny.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 8 °C przy 420 × g przez 5 min. Usunąć jak najwięcej supernatantu.</li>
	<li>Komórki nasienne osadzone w BME w tylu studzienkach, ile użyto do trypsynizacji w kroku 1.3. i dostarczyć im rafinowaną pożywkę (Tabela 1).</li>
	<li>Inkubować komórki przez 3 dni w inkubatorze do hodowli komórkowych i przejść do kroku 2.1.</li>
</ol>
2. Indukcja odwrócenia polaryzacji i etykietowanie EdU
<ol>
	<li>Ostrożnie usunąć pożywkę z organoidów osadzonych w BME.</li>
	<li>Dodać 500 μl roztworu do zbierania organoidów do każdej studzienki i odłączyć wszystkie kopuły matrycy od studzienki, wielokrotnie pipetując w górę i w dół. Przenieść organoidy do probówki o pojemności 15 ml i dobrze zawiesić, aby całkowicie zdysocjować matrycę hydrożelową.</li>
	<li>Inkubować probówkę o pojemności 15 ml na lodzie przez 1,5 godziny. Dobrze wstrząsać probówką co 10 minut, aby zapobiec zbrylaniu się organoidów i zapewnić równomierną dysocjację pozostałych składników hydrożelu.</li>
	<li>Podczas inkubacji pokryć 96-dołkową płytkę roztworem zapobiegającym przywieraniu. Dla każdego dołka 24-dołkowej płytki trypsynizowanej w kroku 1.3 pokryj 8 dołków 96-dołkowej płytki. Inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Do probówki o pojemności 15 ml dodać co najmniej dwa razy więcej PBS niż użyto roztworu do zbioru organoidów i odwirować w temperaturze 8 °C przy 150 × g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić organoidy w 1 ml PBS.</li>
	<li>Przenieść 500 μl zawiesiny organoidu/PBS do oddzielnej probówki o pojemności 15 ml i ponownie odwirować obie probówki w temperaturze 8 °C przy 150 × g przez 5 minut.</li>
	<li>Usuń cały roztwór zapobiegający przywieraniu z płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Po odwirowaniu usunąć jak najwięcej supernatantu.</li>
	<li>Użyj jednej z probówek do generowania organoidów pływających na zewnątrz (BO), a drugiej probówki do organoidów wierzchołkowych (AO).</li>
	<li>W przypadku organoidów BO dodać 100 μl rafinowanej pożywki zawierającej 7,5% BME na dołek 96-dołkowej płytki do jednej probówki. Dobrze wymieszać i równomiernie rozprowadzić organoidy w żądanej liczbie dołków wstępnie pokrytej płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>W przypadku organoidów AO dodać 100 μl zwykłej rafinowanej pożywki (bez dodatku BME) na dołek 96-dołkowej płytki do drugiej probówki. Dobrze wymieszać i równomiernie rozprowadzić organoidy w żądanej liczbie dołków wstępnie pokrytej płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Inkubować organoidy w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 3 dni. 
	UWAGA: Różnice morfologiczne zaczną być widoczne po 1 dniu. Jednak wcześniej opublikowane wyniki pokazują, że zdecydowana większość organoidów potrzebuje około 3 dni, aby wykazać polarność wierzchołkową13.</li>
	<li>W określonych punktach czasowych, np. 24 h/48 h/72 h po indukcji odwrócenia polaryzacji, dodać 50 μl 3 μM EdU rozcieńczonych w rafinowanym podłożu do wszystkich studzienek organoidów, które mają być znakowane, aby otrzymać końcowe stężenie 1 μM EdU w każdym dołku.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1,5 godziny. </li>
	<li>Zbierz organoidy znakowane EdU za pomocą końcówek o szerokim otworze i przenieś je do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodać równą ilość 4% PFA do każdej probówki (organoidy BO i AO; końcowe stężenie PFA = 2%) i dokładnie wymieszać.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Dodać co najmniej dwa razy więcej PBS niż objętość probówki o pojemności 15 ml i odwirować w temperaturze 8 °C przy 80 × g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić organoidy w 1 ml PBS.</li>
	<li>Ponownie odwirować w temperaturze 8 °C i temperaturze 80 × g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant, ponownie zawiesić organoidy w 1 ml PBS i przenieść je do probówki o pojemności 1,5 ml. Przechowywać organoidy w temperaturze 4 °C do czasu przeprowadzenia reakcji barwienia EdU (patrz punkt 3).</li>
	<li>Powtórz kroki 2.14-2.22 dla każdego punktu czasowego, który ma być analizowany.</li>
</ol>
3. Reakcja barwienia Click-it EdU i barwienie Hoechst 33342
<ol>
	<li>Odwirować utrwalone organoidy (od kroku 2.22) w probówce o pojemności 1,5 ml w temperaturze 4 °C i 50 × g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić organoidy w 1 ml 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) rozcieńczonej w PBS za pomocą końcówek o szerokim otworze.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.1 i 3.2 (kroki prania).</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić organoidy w 1 ml 0,5% Triton X-100 rozcieńczonego w PBS.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
	<li>Odwirować organoidy w temperaturze pokojowej w temperaturze 50 × g przez 5 min.</li>
	<li>W świeżej probówce przygotuj 1x dodatek buforowy, mieszając 45 μl H2O z 5 μl 10x dodatku buforowego.</li>
	<li>W innej probówce przygotuj koktajl reakcyjny, mieszając następujące składniki: 385,8 μl H2O, 43 μl 10 x buforu reakcyjnego, 20 μl CuSO 4,1,2 μl azydku Alexa Fluor 647 i 50 μl o 1x dodatek buforowy (od kroku 3.7.). 
	UWAGA: Ta mieszanina jest wystarczająca dla pięciu reakcji i może być skalowana w górę i w dół zgodnie z wymaganą liczbą reakcji barwienia.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 3.1. i 3.2 dwukrotnie (etapy prania).</li>
	<li>Usunąć supernatant i dodać 100 μl koktajlu reakcyjnego (krok 3.8.) do każdej probówki z organoidami.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.1 i 3.2 (kroki prania).</li>
	<li>Odwirować organoidy w stężeniu 50 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zawiesić organoidy w 1 ml 10 μg/ml Hoechst33342 rozcieńczonym w PBS.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut w ciemności.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.1 i 3.2 (kroki prania).</li>
	<li>Odwirować organoidy w temperaturze 50 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Organoidy nasienne w wybranej matrycy BME do szkiełka kompatybilnego z mikroskopią konfokalną (np. μ-Slide 18 basen)</li>
	<li>Obrazowanie organoidów pod mikroskopem konfokalnym.</li>
</ol>
4. Półautomatyczna analiza obrazu
UWAGA: Do tej analizy użyto arivis Pro w wersji 4.2.2 (oprogramowanie do analizy obrazu).
<ol>
	<li>Zaimportuj obrazy z mikroskopu konfokalnego do oprogramowania do analizy obrazu i zdefiniuj folder, w którym zostanie zapisany plik analizy. Użyj opcji Obrazy jako punkty czasowe, aby zaimportować wiele obrazów (replikuj obrazy, różne punkty czasowe, różne zabiegi itp.). Każdy obraz będzie wtedy traktowany jako pojedynczy punkt czasowy, co umożliwi łatwe przełączanie między poszczególnymi obrazami.</li>
	<li>Otwórz panel analizy i zaimportuj potok analizy dostarczony jako plik uzupełniający 1 (arivis_EdU_pipeline).</li>
	<li>Użyj narzędzia Umieść nowe obiekty i Sfery ze znacznikiem Organoid, aby łatwo otoczyć wszystkie dobrze oddzielone organoidy.</li>
	<li>Przełącz się na następny obraz, tj. następny punkt czasowy, i przystąp do oznaczania organoidów dla wszystkich obrazów.</li>
	<li>W przypadku organoidów, które znajdują się bardzo blisko siebie i dlatego nie można ich rozdzielić w trybie Sphere, otwórz listę obiektów i aktywuj tag Organoid.</li>
	<li>Kontynuuj korzystanie z narzędzia Rysuj obiekty w trybie wielokąta, aby ręcznie zaznaczać kontury organoidów. 
	UWAGA: Na liście obiektów wszystkie organoidy są teraz oznaczone i przypisane do określonego punktu czasowego. Ten punkt czasowy odpowiada kolejności obrazów zaimportowanych w kroku 4.1. Nazwy tych punktów czasowych można teraz zmienić, aby pasowały do oryginalnej nazwy obrazu, jeśli jest to preferowane.</li>
	<li>Na liście obiektów zaznacz wszystkie obiekty (=organoidy) i kliknij prawym przyciskiem myszy, a następnie kliknij Usuń znaczniki, aby usunąć znacznik Manual ze wszystkich obiektów.</li>
	<li>Dezaktywuj znacznik Organoid na liście obiektów i zaznacz wszystkie obszary w obrębie wcześniej zdefiniowanych obiektów, które powinny zostać wykluczone z analizy, za pomocą narzędzia Rysuj obiekty w trybie wielokąta. Obszary te mogą obejmować martwe komórki w świetle organoidu lub rozmyte obszary, które mogą zniekształcić analizę.</li>
	<li>Otwierając listę obiektów, upewnij się, że wszystkie organoidy są wymienione z tagiem Organoid, a wszystkie obszary, które powinny zostać wykluczone, mają znacznik Ręczny.</li>
	<li>Uruchom potok analizy, klikając strzałkę w lewym górnym panelu. 
	UWAGA: Oprogramowanie segmentuje teraz wszystkie jądra w kanałach Hoechst33342 i EdU. Ten potok analizy uwzględnia tylko segmentowane jądra Hoechst33342+ i EdU+ o wielkości większej niż 15μm2 (tj. obszar w segmencie jądra), aby zapewnić, że małe jądra, najprawdopodobniej pochodzące z martwych komórek, są wyłączone z analizy.</li>
	<li>Wyniki analizy można znaleźć na liście obiektów, klikając znacznik Kolumny elementów.</li>
	<li>Przełącz się na główny widok szczegółowy i wybierz znacznik Organoidy w górnym panelu oraz funkcję Pierwszy punkt czasowy.</li>
	<li>W dolnym panelu wybierz cechy, które mają być wyświetlane dla każdego organoidu. Użyj obszaru projekcji (x/y/z) (woksel), średniej intensywności #1 (kanał EdU) i intensywności SD #1.</li>
	<li>Wyeksportuj wyniki (główny raport szczegółowy) za pomocą funkcji eksportu programu Excel.</li>
	<li>Zapisz plik analizy i zamknij oprogramowanie.</li>
</ol>
5. Określanie tempa proliferacji organoidów
<ol>
	<li>Otwórz plik głównego raportu szczegółowego wyeksportowany w kroku 4.14.</li>
	<li>Dla każdego analizowanego obrazu znajduje się jedna osobna zakładka. Oblicz sumę powierzchni/wokseli dla jąder i barwienia EdU dla każdego obrazu. Następnie skopiuj wszystkie wynikowe dane do nowej karty zbiorczej i pogrupuj wszystkie dane odnoszące się do tego samego punktu czasowego.</li>
	<li>Następnie oblicz całkowitą powierzchnię jąder komórkowych (tj. sumę obszaru Hoechst33342+ i obszaru EdU+) dla każdego obrazu.</li>
	<li>Następnie podziel całkowitą powierzchnię przez siebie (= 100%), a średnią powierzchnię EdU+ przez całkowitą powierzchnię (= procent DNA EdU+).</li>
	<li>Wykreślić procentową zawartość proliferacyjnego DNA organoidów BO i AO na osi y i różne punkty czasowe na osi x.</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+suppresses+Wnt+signaling+via+the+Bcl11b-regulated+NuRD+complex+to+maintain+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">BMP suppresses Wnt signaling via the Bcl11b-regulated NuRD complex to maintain intestinal stem cells.</a> EMBO J. 43 (23), 6032-6051 (2024).</li>
<li>Gaowa, A., Leangpanich, S., Park, E. J., Kawamoto, E., Shimaoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irisin+promotes+intestinal+epithelial+cell+proliferation+via+Wnt%2F%CE%B2-catenin+and+focal+adhesion+kinase+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Irisin promotes intestinal epithelial cell proliferation via Wnt/β-catenin and focal adhesion kinase signaling pathways.</a> Sci Rep. 14, 25702(2024).</li>
<li>Basak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+quiescence+of+Lgr5%2B+stem+cells+in+intestinal+organoids+enables+differentiation+of+hormone-producing+enteroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190 (2017).</li>
<li>Ludikhuize, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+define+intestinal+stem+cell+differentiation+downstream+of+a+FOXO%2FNotch+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Mitochondria define intestinal stem cell differentiation downstream of a FOXO/Notch axis.</a> Cell Metab. 32 (5), 889-900.e7 (2020).</li>
<li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%281979%29%22%5BJournal%5D)">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science (1979). 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+bat+and+human+intestinal+organoids+by+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2.</a> Nat Med. 26 (7), 1077-1083 (2020).</li>
<li>Joo, S. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+intestinal+apical-out+organoid+model+for+gut+function+study%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study.</a> Animals. 12 (3), 372(2022).</li>
<li>Co, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+epithelial+polarity%3A+A+human+enteroid+model+for+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions.</a> Cell Rep. 26, 2509-2520.e4 (2019).</li>
<li>Sasaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+scalable+coculture+system+for+gut+anaerobes+and+human+colon+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Development of a scalable coculture system for gut anaerobes and human colon epithelium.</a> Gastroenterology. 159 (1), 388-390.e5 (2020).</li>
<li>Mayorgas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+to+study+the+invasive+capability+of+adherent-invasive+escherichia+coli+by+using+human+primary+organoid-derived+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">A novel strategy to study the invasive capability of adherent-invasive escherichia coli by using human primary organoid-derived epithelial monolayers.</a> Front Immunol. 12, 646906(2021).</li>
<li>Csukovich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralising+effects+of+different+antibodies+on+clostridioides+difficile+toxins+TcdA+and+TcdB+in+a+translational+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Neutralising effects of different antibodies on clostridioides difficile toxins TcdA and TcdB in a translational approach.</a> Int J Mol Sci. 24 (4), 3867(2023).</li>
<li>Csukovich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+reversal+of+canine+intestinal+organoids+reduces+proliferation+and+increases+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Polarity reversal of canine intestinal organoids reduces proliferation and increases cell death.</a> Cell Prolif. 57 (2), e13544(2023).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+differentiating+and+long-living+intestinal+organoids+reflecting+the+cellular+diversity+of+canine+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of differentiating and long-living intestinal organoids reflecting the cellular diversity of canine intestine.</a> Cells. 9 (4), 822(2020).</li>
<li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106(2020).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., O'Connor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+infection+in+3D+tissue-derived+human+organoid+culture+systems+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Studying infection in 3D tissue-derived human organoid culture systems by microinjection.</a> J Vis Exp. (151), e59610(2019).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+SLC26A3+expression+and+function+in+intestinal+epithelial+cells+in+response+to+Cryptosporidium+parvum+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Decreased SLC26A3 expression and function in intestinal epithelial cells in response to Cryptosporidium parvum infection.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 317 (6), C1205-C1212 (2019).</li>
<li>Dutta, D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+to+study+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems to study host-pathogen interactions.</a> Curr Opin Immunol. 48, 15-22 (2017).</li>
<li>Csukovich, G., Pratscher, B., Burgener, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+world+of+organoids%3A+Gastrointestinal+disease+modelling+in+the+age+of+3R+and+one+health+with+specific+relevance+to+dogs+and+cats%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">The world of organoids: Gastrointestinal disease modelling in the age of 3R and one health with specific relevance to dogs and cats.</a> Animals. 12 (18), 2461(2022).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+a+more+perfect+union%3A+Modeling+intestinal+bacteria-epithelial+interactions+using+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Creating a more perfect union: Modeling intestinal bacteria-epithelial interactions using organoids.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 12 (2), 769-782 (2021).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+porcine+intestinal+organoids%3A+an+apical-out+organoid+model+for+swine+enteric+virus+infection+and+immune+response+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations.</a> J Virol. 94 (21), e01006-e01020 (2020).</li>
<li>Smith, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+ovine+gastric+and+intestinal+organoids+for+studying+ruminant+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The development of ovine gastric and intestinal organoids for studying ruminant host-pathogen interactions.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 733811(2021).</li>
<li>Nash, T. J., Morris, K. M., Mabbott, N. A., Vervelde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inside-out+chicken+enteroids+with+leukocyte+component+as+a+model+to+study+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Inside-out chicken enteroids with leukocyte component as a model to study host-pathogen interactions.</a> Commun Biol. 4 (1), 377(2021).</li>
<li>Hanson, K. I., Weiss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+tissue+response+to+Shiga+toxin+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Intestinal tissue response to Shiga toxin exposure.</a> mBio. 15 (9), e0123224(2024).</li>
<li>Hovhannisyan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+human+organoids+supports+an+intestinal+niche+for+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Infection of human organoids supports an intestinal niche for Chlamydia trachomatis.</a> PLoS Pathog. 20 (8), e1012144(2024).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Protokół ten opisuje szczegółowo, w jaki sposób indukować odwrócenie polaryzacji w standardowych hodowlach organoidów jelitowych pochodzących z dorosłych komórek macierzystych. Organoidy wierzchołkowe służą do uzyskania dostępu do powierzchni komórki wierzchołkowej, która jest zwykle zorientowana w kierunku światła organoidu. Możliwość zbadania powierzchni wierzchołkowej może mieć duże znaczenie w niektórych zastosowaniach, ponieważ jest to część błony komórkowej, która jest narażona na działanie całej zawartości przewod...

Organoidy jelitowe to trójwymiarowe modele in vitro rekapitulujące nabłonek jelitowy składający się z różnych typów komórek. Te organoidy można łatwo ustalić z dorosłych komórek macierzystych wyizolowanych z krypt jelitowych1. Ponieważ organoidy są znacznie bliższe nabłonkowi in vivo, stają się coraz ważniejsze w badaniach biomedycznych. Organoidy jelitowe są wykorzystywane nie tylko do analizy mechanizmów fizjologicznych (np. sygnalizacja niszy jelitowej2,3 i różnicowanie komórek4,5), ale także do badań nad chorobami zakaźnymi6,7. Jednak hodowla spolaryzowanych komórek w 3D otaczających centralne światło jest wyzwaniem, ponieważ powierzchnia komórki wierzchołkowej staje się niedostępna w świetle organoidu. Badanie różnic między wierzchołkowymi i podstawno-bocznymi powierzchniami komórek może być ważne w badaniach metabolicznych, czego przykładem są różnice w wychwytywaniu kwasów tłuszczowych8 i infectious disease research9,10,11,12.
Generowanie tak zwanych organoidów wierzchołkowych jest łatwą opcją na pokonanie tego problemu. Usuwając macierz zewnątrzkomórkową ze standardowych kultur organoidów (tj. organoidów osadzonych w macierzy) i umieszczając te organoidy w pożywce wolnej od matrycy, można wywołać zmianę polaryzacji9.
Jak już wcześniej pisaliśmy, większość organoidów odwraca swoją polaryzację w ciągu 12 godzin. Jednak uzyskanie kultury zawierającej ponad 90% organoidów wierzchołkowych zajmuje 48-72 godziny. Pomimo swojej zalety polegającej na umożliwieniu dostępu do powierzchni komórki wierzchołkowej, organoidy wierzchołkowe wykazują znacznie zmniejszoną proliferację po odwróceniu polaryzacji, podczas gdy tempo śmierci komórki wzrasta13. Czynnik aktywności proliferacyjnej może stanowić zmienną zakłócającą w różnych analizach i należy go pamiętać podczas projektowania eksperymentu.
Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół tworzenia wierzchołkowych kultur organoidowych i pływających organoidów kontrolnych bazalnych do dalszych analiz. Ponadto opisujemy znakowanie 5-etynylo-2'-deoksyurydyną (EdU), włączoną do nowo zsyntetyzowanego DNA, a tym samym oznaczającą aktywnie proliferujące komórki. Dalej opisujemy półautomatyczną analizę obrazu tempa proliferacji organoidów za pomocą oprogramowania arivis Pro (Zeiss) poprzez kwantyfikację komórek EdU+. Schemat tego procesu jest przedstawiony w Rysunek 1.

<table><tbody><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>Biologix</td><td>07-6024</td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I człowiek, &ge; 95% (HPLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-9145</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide 18-dołkowy szklany dno</td><td>ibidi</td><td>81817</td><td></td></tr><tr><td>100X Suplement penicyliny-streptomycyny dla Media</td><td>Gibco/Thermo</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>A 83-01&nbsp;</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2939/10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Płyn do płukania zapobiegający przywieraniu</td><td>StemCell Technologies</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>arivis Pro&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Version 4.2.2</td><td></td></tr><tr><td>B27 SerumFree Supplement (50X), płynny</td><td>Gibco/Thermo</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342)</td><td>Abcam</td><td>ab145597</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do proliferacji komórek Click-iT EdU do obrazowania, barwnik Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Scientific</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Suplement Gibco/Thermo</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Gibco/Thermo</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>Gibco/Thermo</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy HEPES 1 M, płynny</td><td>Gibco/Thermo</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF-basic</td><td>PeproTech</td><td>100-18B-100&micro; G</td><td></td></tr><tr><td>Człowiek HGF&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>100-39-100&mikro; G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki IGF-I&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>100-11-100&mikro; G</td><td></td></tr><tr><td>Człowiek NOGGIN (ssak)&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>120-10C-200&mikro; G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina, testowana hodowla komórkowa, BioReagent&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do zbierania organoidów</td><td>Thermo</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>Triton(TM) X-100, do biologii molekularnej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Gibco/Thermo</td><td>25300054</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie wierzchołkowych organoidów jelitowych i ocena szybkości proliferacji organoidów za pomocą znakowania edu

Generation of Apical-Out Intestinal Organoids and Assessment of Organoid Proliferation Rate Using EdU-Labeling

Tutaj opisujemy generowanie pływających kultur organoidów jelitowych z wierzchołkowych kultur organoidów jelitowych osadzonych w hydrożelu. Równolegle ustanawia się pływające hodowle organoidów typu bazal-out w celu bezpośredniego porównania organoidów wierzchołkowych i bazowych. Organoidy wierzchołkowe i bazowe są następnie poddawane działaniu analogu tymidyny 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU), który jest integrowany z nowo zsyntetyzowanym DNA podczas fazy S podziału komórki. To włączenie do DNA można uwidocznić w morfologicznie nienaruszonych organoidach za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej. Komórki znakowane za pomocą Hoechst33342 i EdU są następnie oznaczane ilościowo w sposób półautomatyczny za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Obliczanie procentowego udziału komórek EdU-dodatnich w całkowitej liczbie komórek pozwala na analizę proliferacji komórek w organoidach trójwymiarowych (3D). Pomimo tego, że protokół ten jest stosowany tutaj do analizy proliferacji w organoidach jelitowych, ma zastosowanie do analizy różnego rodzaju barwień specyficznych dla jądra w innych organoidach lub dwuwymiarowych hodowlach komórkowych.

Organoidy hodowane przez 3 dni po trypsynizacji powinny mieć idealnie rozmiar od 50-250 µm, jak przedstawiono na Rysunku 2A. Organoidy znacznie większe od tej wartości mogą nie odwracać polarności w sposób efektywny. Większe organoidy mogą również zacząć pączkować, a zauważyliśmy, że organoidy te również mogą mieć problemy z efektywną zmianą polarności. Organoidy z polarnością basal-out oraz apical-out wykazują wyraźne różnice morfologiczne już w obrazowaniu w polu jasny...

Tutaj opisujemy protokół generowania organoidów wierzchołkowych z jelit ze standardowych kultur organoidów osadzonych w matrycy. Przedstawiono również późniejsze włączenie EdU do aktywnie proliferujących komórek i półautomatyczną kwantyfikację komórek EdU-dodatnich.

Wytwarzanie wierzchołkowych organoidów jelitowych i ocena szybkości proliferacji organoidów za pomocą znakowania EdU

Here, we describe the generation of floating cultures of apical-out intestinal organoids from hydrogel-embedded intestinal organoid cultures. ...

Dzięki temu protokołowi przedstawiamy łatwą metodę indukowania odwrócenia polaryzacji organoidów pochodzących z dorosłych komórek macierzystych i wyjaśniamy, jak ocenić proliferację. Jednym z głównych wyzwań związanych z wykorzystaniem organoidów jelitowych jest to, że powierzchnia komórki wierzchołkowej pozostaje ukryta wewnątrz i zwykle jest trudna do zbadania. Organoidy wierzchołkowe prezentują powierzchnię komórki wierzchołkowej na zewnątrz i udostępniają ją. W porównaniu z często stosowanymi monowarstwami pochodzącymi z organoidów i systemami nośnymi Transwell, organoidy wierzchołkowe zachowują strukturę 3D.[Instruktor] Na początek pobierz od psów kulturę organoidów jelitowych pochodzących z dorosłych komórek macierzystych. Ostrożnie odpipetować pożywkę z organoidów osadzonych w ekstrakcie z błony podstawnej. Dodaj 500 mikrolitrów roztworu do zbioru organoidów do każdej studzienki. Kilkakrotnie pipetować zawiesinę w górę i w dół, aby odłączyć wszystkie kopułki matrycy od plastikowej powierzchni. Teraz przenieś organoidy do 15-mililitrowej probówki. Dobrze zawiesić, aby całkowicie zdysocjować pozostałą matrycę hydrożelową. Inkubować probówkę na lodzie przez 1,5 godziny. Dobrze wstrząsaj probówką co 10 minut, aby zapobiec zbrylaniu się organoidów i zapewnić równomierną dysocjację pozostałych składników hydrożelu. Podczas inkubacji probówki pokryj 96-dołkową płytkę roztworem zapobiegającym przywieraniu. Dla każdego dołka trypsynizowanej płytki 24-dołkowej pokryj osiem dołków płytki 96-dołkowej, a następnie inkubuj. Następnie dodaj co najmniej dwukrotność objętości PBS niż roztwór do zbioru organoidów użyty do 15-mililitrowej probówki. Wirować w temperaturze ośmiu stopni Celsjusza przy 150 g przez pięć minut. Odpipetować supernatant i ponownie zawiesić organoidy w jednym mililitrze PBS. Teraz przenieś 500 mikrolitrów zawiesiny do osobnej 15-mililitrowej probówki i ponownie odwiruj. Usunąć cały roztwór zapobiegający przywieraniu z płytki 96-dołkowej, a następnie usunąć jak najwięcej supernatantu po odwirowaniu. Użyj jednej rurki do generowania pływających organoidów bazowych, a drugiej do organoidów wierzchołkowych. W przypadku organoidów bazowych dodaj 100 mikrolitrów rafinowanej pożywki zawierającej 7,5% ekstraktu z błony podstawnej na dołek 96-dołkowej płytki do jednej 15-mililitrowej probówki. Dobrze wymieszaj i równomiernie rozprowadź organoidy w żądanej liczbie dołków. W przypadku organoidów wierzchołkowych dodać 100 mikrolitrów zwykłego rafinowanego podłoża na dołek 96-dołkowej płytki do drugiej 15-mililitrowej probówki. Dobrze wymieszaj i równomiernie rozprowadź organoidy w żądanej liczbie dołków. Inkubuj organoidy w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy dni. W określonych punktach czasowych w odstępach 24-godzinnych dodać 50 mikrolitrów trzymikromolowego EdU rozcieńczonego w rafinowanym podłożu do wszystkich studzienek zawierających organoidy. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 1,5 godziny. Zbierz organoidy znakowane EdU za pomocą końcówek o szerokim otworze i przenieś je do 15-mililitrowej probówki. Dodaj równą objętość 4% PFA do każdej probówki. Pipetuj w górę iw dół, aby dobrze wymieszać. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 15 minut dodać dwie objętości PBS do probówki i odwirować. Odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić organoidy w jednym mililitrze PBS przed kolejną rundą wirowania. Ponownie zawiesić organoidy w jednym mililitrze PBS po usunięciu supernatantu i przenieść zawiesinę do 1,5-mililitrowej probówki. Przechowuj organoidy w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu przeprowadzenia reakcji barwienia EdU. Bardzo specyficzną cechą hodowli zawiesinowych wierzchołkowych jest liczba martwych komórek unoszących się wokół organoidów. Wynika to z tego, że organoidy wierzchołkowe wytłaczają ostatecznie zróżnicowane i martwe komórki do otaczającego podłoża, podczas gdy organoidy podstawowe gromadzą martwe komórki w świetle organoidu. Orientacje polaryzacji base-out i apical-out wpływają na organizację strukturalną organoidów, przy czym struktury podstawowe wykazują większą proliferację komórek w czasie. Obrazy konfokalne ujawniły dobrze zdefiniowane struktury komórkowe z barwieniem jądrowym, potwierdzając zorganizowaną polaryzację w organoidach podstawnych. Kwantyfikacja komórek EdU-dodatnich wykazała, że organoidy podstawowe miały znacznie wyższe tempo proliferacji, osiągając szczyt po 48 godzinach.

generation-apical-out-intestinal-organoids-assessment-organoid

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisana jest prosta metoda ustalania pierwotnego organoidu guza jelita grubego u myszy. Metoda ta wykorzystuje tę cechę, że komórki nowotworowe jelita grubego przeżywają i rosną w organoidy w pożywkach zawierających ograniczone czynniki wzrostu, podczas gdy normalny nabłonek okrężnicy nie.

Metody in vitro Hodowla organoidowa pierwotnych guzów jelita grubego myszy

Tutaj opisany jest protokół zbierania, utrzymywania i leczenia organoidów jelita cienkiego myszy z wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (PAMP) i Listeria monocytogenes, a także nacisk na ekspresję genów i właściwe techniki normalizacji białka.

Hodowla ex vivo i stymulacja receptorów rozpoznawania wzorców organoidów jelitowych myszy

Hodowle organoidów jelitowych są tworzone z całych krypt i nie pozwalają na analizę samoodnowy i różnicowania w sposób specyficzny dla komórki. Protokół ten opisuje rekonstrukcję posortowanych komórek macierzystych (Lgr5+) i niszowych (Paneth), które dają początek organoidom, umożliwiając jednocześnie ich wcześniejszą modyfikację biochemiczną i genetyczną oraz analizę funkcjonalną.

Test rekonstytucji organoidów (ORA) do analizy funkcjonalnej jelitowych komórek macierzystych i niszowych

Gruczoł sutkowy to dwuwarstwowa struktura, składająca się z zewnętrznych komórek nabłonka mięśniowego i wewnętrznego nabłonka światła. Przedstawiono protokół otrzymywania organoidów z wykorzystaniem trypsynizacji różnicowej. Ta skuteczna metoda pozwala naukowcom oddzielnie manipulować tymi dwoma typami komórek w celu zbadania pytań dotyczących ich roli w formie i funkcji gruczołu sutkowego.

Wytwarzanie organoidów mozaikowych sutków przez trypsynizację różnicową

Ten protokół pozwala na różnicowanie ludzkich komórek pluripotencjalnych w organoidy jelitowe. Protokół naśladuje normalny rozwój człowieka poprzez różnicowanie komórek w populację ostatecznej endodermy, endodermy jelita tylnego, a następnie nabłonka jelitowego. To sprawia, że protokół nadaje się zarówno do badania rozwoju jelit, jak i zastosowań modelowania chorób.

Generowanie organoidów jelitowych pochodzących z hiPSC do zastosowań w modelowaniu rozwoju i choroby

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Tutaj prezentujemy dwa protokoły, które pozwalają na modelowanie interakcji specyficznych dla wierzchołka jelita. Monowarstwy jelitowe pochodzące z organoidów i kultury interfejsu powietrze-ciecz (ALI) ułatwiają wytwarzanie dobrze zróżnicowanego nabłonka dostępnego zarówno od strony luminalnej, jak i podstawnej, podczas gdy organoidy jelitowe z odwróconą polaryzacją odsłaniają swoją wierzchołkową stronę i są podatne na testy o wysokiej przepustowości.

Metody hodowli do badania interakcji specyficznych dla wierzchołka przy użyciu modeli organoidów jelitowych

Tutaj prezentujemy protokół do generowania organoidów jelitowych szczurów i używania ich w kilku dalszych zastosowaniach. Szczury są często preferowanym modelem przedklinicznym, a solidny układ organoidów jelitowych wypełnia zapotrzebowanie na system in vitro towarzyszący badaniom in vivo.

Wytwarzanie i manipulowanie organoidami jelitowymi szczurów

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D organoidów wieprzowych pochodzących z jelita cienkiego i grubego. Wzrost tych monowarstw charakteryzuje się rosnącymi wartościami TEER, co wskazuje na solidną integralność nabłonka. Dodatkowo, te monowarstwy wykazują fizjologiczne reakcje wydzielnicze w eksperymentach w komorze Ussing po zastosowaniu forskoliny.

Dwuwymiarowe organoidy jelitowe świń odzwierciedlające fizjologiczne właściwości rodzimego jelita

Ten protokół wyjaśnia pierwotną hodowlę organoidów z dodatnim Lgr5 i późniejszą transdukcję retrowirusową. Umożliwia to indukowaną przez Cre nadekspresję lub knockdown dostarczonego transgenu i umożliwia prowadzenie badań funkcjonalnych w nowym systemie modeli organotypowych in vitro.

Protokół wideo infekcji retrowirusowej w pierwotnej hodowli organoidów jelitowych

Poznaj metodę wytwarzania wierzchołkowych organoidów jelitowych z komórek macierzystych psów i oceny szybkości proliferacji za pomocą znakowania EdU. Protokół umożliwia badanie polaryzacji i dynamiki komórkowej.

Wytwarzanie wierzchołkowych organoidów jelitowych i ocena szybkości proliferacji organoidów za pomocą znakowania EdU

Przeglądaj więcej filmów