Zwierzęcy model zakażeń związanych z implantami u myszy

Stworzenie stabilnego modelu zwierzęcego zapewnia nam niezawodne platformy do testowania terapii zakażeń związanych z implantami przy jednoczesnym badaniu patologicznych statystyk i odpowiedzi immunologicznej w mikrośrodowisku infekcji. W walce z leczeniem PGI pojawiające się rozwiązania techniczne, takie jak obrazowanie fluorescencyjne, mikroskop elektronowy, transkryptomika, oferują potężny wybór do badania cykli życiowych i przyszłości bakterii w PGI. Najpierw jednak musimy stworzyć wysokiej jakości i powtarzalny model zwierzęcy ChOG.

Wyzwaniem jest teraz skonstruowanie stabilnego, powtarzalnego modelu, który naśladuje złożone mikrośrodowisko in vivo, które jest rzeczywistością kliniczną w przypadku zakażeń związanych z implantami. Lepsze od modeli ropnia podskórnego, modele infekcji związane z implantami oferują większe znaczenie kliniczne, utrzymują infekcje, poprawiają odtwarzalność i zwiększają bezpieczeństwo biologiczne. Ta metoda modelowania jest wysoce bezpieczna i niezawodna, daje nam kompleksowe badanie mechanizmów patofizjologicznych i inicjuje rozwój kryteriów diagnostycznych z ukierunkowanymi odcinkami terapeutycznymi.

Na początek uzyskaj kultury Staphylococcus aureus. Usunąć pętlę kultury za pomocą pętli do zaszczepiania, rozprowadzić zawiesinę na płytce z agarem z krwią i inkubować. Wybierz pojedynczą, okrągłą i gładką niezależną kolonię o złotożółtej pigmentacji i wyraźnej strefie hemolizy.

Za pomocą sterylnej pętli zaszczepij go w 15-mililitrowej sterylnej probówce wirówkowej zawierającej pięć mililitrów sterylnego tryptycznego bulionu sojowego. Umieść probówkę w inkubatorze wytrząsającym ustawionym na 37 stopni Celsjusza i wytrząsaj z prędkością 200 obrotów na minutę przez 12 godzin. Rozcieńczyć zawiesinę bakteryjną tryptycznym bulionem sojowym w stosunku jeden do 50 i ponownie inkubować.

Następnie użyj spektrofotometru, aby zmierzyć i zarejestrować gęstość optyczną przy 600 nanometrach, aby potwierdzić, że bakterie osiągnęły logarytmiczną fazę wzrostu. Następnie odpipetować trzy mililitry zawiesiny bakteryjnej do probówki. Wymieszaj go z trzema mililitrami zimnego sterylnego PBS.

Odwirować mieszaninę w temperaturze 3000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą pipety wyrzucić supernatant i delikatnie zawiesić osad bakteryjny w PBS. Ponownie zawiesić przemyty osad bakteryjny w PBS w celu dalszych eksperymentów.

Losowo podziel 20 myszy typu dzikiego C57BL bar 6J na dwie grupy infekcji związanych z implantem i grupę z ropniem podskórnym. Zastosuj odrębne kolczyki do każdej myszy, aby uzyskać indywidualną identyfikację. Po znieczuleniu i przygotowaniu skóry zwierząt, użyj sterylnych ostrzy chirurgicznych, aby wykonać jednocentymetrowe nacięcie w okolicy grzbietowej każdej myszy.

Następnie należy wprowadzić sterylny implant tytanowy do kieszonki podskórnej utworzonej przez nacięcie. Teraz użyj sterylnej strzykawki o pojemności jednego mililitra, aby wstrzyknąć 100 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej Staphylococcus aureus bezpośrednio na powierzchnię tytanu. W przypadku grupy ropni podskórnych należy wykonać, zdezynfekować i zszyć nacięcie bezpośrednio, bez wprowadzania implantu.

Wstrzyknąć 100 mikrolitrów zawiesiny Staphylococcus aureus w miejsce nacięcia za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności jednego mililitra. Aby ocenić infekcje w tkance obwodowej, umieść pobraną próbkę tkanki w sterylnej probówce. Do każdej probówki dodać równą masę sterylnego PBS i trzy sterylne stalowe koraliki szlifierskie.

Homogenizować tkanki w trzech cyklach z częstotliwością 70 Hz przez 60 sekund każdy, z 20-sekundową przerwą między cyklami. Po homogenizacji próbki należy wirować przez pięć minut. Teraz należy przygotować seryjne rozcieńczenia homogenatu tkankowego za pomocą PBS.

Za pomocą mikropipety upuść 15 mikrolitrów każdego rozcieńczonego homogenatu na wyznaczone fragmenty płytek z agarem do krwi. Następnie inkubuj płytki z agarem z krwią w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez wstrząsania przez 24 godziny. W grupie zakażeń związanych z implantami doszło do widocznego pęknięcia rany w trzecim dniu.

W dniu 10 obie grupy myszy wykazywały oznaki gojenia się rany, przy czym grupa z ropniem podskórnym wykazała wyraźniejsze wyzdrowienie niż grupa z infekcją związaną z implantem w dniu 14. Hodowle bakterii z zakażonej tkanki wykazały utrzymujący się wysoki wzrost bakterii w grupie infekcji związanej z implantem we wszystkich punktach czasowych, podczas gdy grupa z ropniem podskórnym wykazywała postępujące zmniejszanie kolonii bakteryjnych od trzeciego do 14 dnia. Skaningowa mikroskopia elektronowa wykazała coraz gęstsze pokrycie bakteryjne na arkuszach tytanu w grupie infekcji związanej z implantami od trzeciego do czternastego dnia.

Barwienie Giemsy wykazało wyraźny spadek liczby bakterii w grupie ropnia podskórnego do 14 dnia, podczas gdy grupa infekcji związanej z implantami utrzymywała wysoką obecność bakterii przez cały okres. Barwienie hematoksyliną i eozyną wykazało, że naciek komórek zapalnych w grupie ropnia podskórnego znacznie zmniejszył się do 14 dnia, podczas gdy grupa infekcji związanej z implantem wykazywała utrzymującą się gęstą infiltrację komórkową. Badanie histologiczne tkanek serca, wątroby, śledziony, płuc i nerek nie wykazało widocznych zmian ani nieprawidłowości w grupie zakażonej implantem w porównaniu z grupą kontrolną.