Name: Obrazowanie transferu energii rezonansu Förstera w żywych komórkach metabolicznie regulowanej dynamiki aktywacji Akt w komórkach HepG2 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Poznaj obrazowanie FRET do badania aktywacji kinazy Akt w żywych komórkach HepG2 w czasie rzeczywistym. Ta metoda pozwala analizować szlaki sygnałowania insuliny i regulacji metabolicznej w komórkach nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były częściowo wspierane przez Fundację Nauk Przyrodniczych w Shenzhen (JCYJ20240813113606009), Strefę Współpracy Shenzhen-Hongkong na rzecz Technologii i Innowacji (HZQB-KCZYB-2020056), Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (32070681), Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2019YFA0906002) oraz Shenzhen Peacock Plan (KQTD2016053117035204).

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Protokół obrazowania żywych komórek FRET w celu monitorowania fosforylacji Akt w komórkach HepG2 obejmuje kilka kluczowych etapów w celu zapewnienia wiarygodnych i powtarzalnych wyników. Pierwszym krytycznym krokiem jest hodowla komórkowa, która obejmuje rutynową konserwację komórek, powlekanie naczyń obrazowych i wysiewanie komórek. Właściwa powłoka jest niezbędna do przyczepienia komórek podczas eksperymentów z obrazowaniem poklatkowym, ponieważ zapewnia stabilne przyleganie komórek, zapobiega odklejaniu się i minimali...

Cukrzyca stanowi poważne globalne wyzwanie zdrowotne, charakteryzujące się insulinoopornością i upośledzoną homeostazą glukozy1. Kompleksowe zrozumienie szlaków sygnałowych insuliny ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia patofizjologii tej choroby, ponieważ insulina odgrywa kluczową rolę w metabolizmie glukozy, wzroście komórek i przeżyciu2. Liczne badania wykazały, że sygnalizacja insulinowa znacząco wpływa na różne nowotwory, łącząc insulinooporność z progresją guza i złymi wynikami leczeniapacjentów 3,4,5,6. Komórki HepG2, powszechnie stosowana linia komórkowa raka wątrobowokomórkowego, służą jako cenny model do badania insulinooporności i zależności między dysregulacją metaboliczną a rozwojem raka7. Tradycyjnie, naukowcy postrzegali reakcje na insulinę jako stopniowane; Jednak ostatnie badania wykazały, że poszczególne komórki mogą wykazywać odpowiedzi bistabilne, wykazując istotne przejścia między brakiem odpowiedzi a pełną odpowiedzią występującą przy określonych progach stężenia insuliny 8,9.
Obrazowanie rezonansowego transferu energii metodą Förstera (FRET) jest potężnym narzędziem do badania czasoprzestrzennego rozkładu biomolekuł w żywych komórkach10. Wydobywając informacje z dynamiki molekularnej, FRET zapewnia wgląd w procesy takie jak aktywacja Akt w czasie rzeczywistym, co czyni go nieocenioną techniką do badania żywych komórek11,12. Ta metoda obrazowania okazała się niezbędna w badaniu dynamiki komórek, szczególnie w chorobach metabolicznych i nowotworach, gdzie precyzyjne interakcje molekularne mają kluczowe znaczenie13. FRET umożliwia również monitorowanie interakcji molekularnych w czasie rzeczywistym, rzucając światło na mechanizmy, takie jak insulinooporność i progresja nowotworu14,15. Bioczujniki FRET mają kluczowe znaczenie w badaniach nad rakiem w badaniu mikrośrodowisk guza, oporności na leki i zaburzeń metabolicznych16. Metody wykrywania FRET, takie jak emisja uczulona (SE), wybielanie akceptorowe (AB), mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) i spektroskopia, oferują wyraźne korzyści w ilościowym określaniu interakcji molekularnych17. SE mierzy transfer energii między fluoroforami donorowymi i akceptorowymi, co skutkuje mierzalnym przesunięciem widm emisyjnych, które koreluje z bliskością oddziałujących biomolekuł18. AB wykorzystuje selektywne fotowybielanie fluoroforu akceptorowego i śledzi zmiany we fluorescencji donora, co pozwala naukowcom ocenić kinetykę interakcji i odległości19. FLIM ocenia szybkość zaniku fluorescencji fluoroforu donorowego, na który bezpośredni wpływ ma wydajność FRET, aby zapewnić precyzyjne pomiary interakcji molekularnych w nanoskali20.
Korzystając z technik FRET, niedawno wykazaliśmy bistabilną odpowiedź insulinową w miotubach pochodzących z C2C12 8,9,21,22,23,24. Odrębne progi włączania i wyłączania aktywacji Akt, jak odkryliśmy, sugerują, że stopniowana odpowiedź na dawkę insuliny w całym ciele przeczy złożoności subkomórkowej kaskady sygnalizacyjnej, począwszy od bodźca insulinowego, który kończy się odpowiedzią "wszystko albo nic" na poziomie pojedynczej komórki 21,22,23,24. Aby przetestować obecność bistabilności w innych typach komórek, stymulowaliśmy komórki HepG2 insuliną i rejestrowaliśmy ich odpowiedź za pomocą obrazowania pojedynczych komórek FRET. Stymulowaliśmy komórki HepG2 o różnych stężeniach insuliny i monitorowaliśmy aktywność Akt na poziomie pojedynczej komórki za pomocą biosensora Akt. Bioczujnik Akt składa się ze wzmocnionego białka fluorescencyjnego cyjanu (ECFP)25 jako fluoroforu dawcy i najjaśniejszego wariantu białka żółtej fluorescencji (YPet)26 jako fluoroforu akceptorowego, połączonych łącznikiem Eevee zawierającym sekwencję peptydową SGRPRTTTFADSCKP. Peptyd ten działa jako substrat dla fosforylowanego Akt (pAkt), zoptymalizowanego z ludzkiej kinazy syntazy glikogenu 3β (GSK3β). W stanie nieufosforylowanym przestrzenna separacja między fluoroforami donorowymi i akceptorowymi przekracza promień Förstera, co hamuje transfer energii. Po stymulacji insuliną dochodzi do fosforylacji Akt, która prowadzi do fosforylacji SGRPRTTTFADSCKP. Proces ten indukuje zmianę konformacyjną, która przenosi donor i akceptor w promień Förstera, umożliwiając FRET27. W rezultacie intensywność sygnału FRET koreluje z ilością fosforylowanych cząsteczek Akt i umożliwia ilościowe określanie w czasie rzeczywistym odpowiedzi komórkowych za pośrednictwem insuliny.
Protokół ten, początkowo opracowany do badania sygnalizacji insuliny w miotubkach pochodzących z C2C12, został z powodzeniem zastosowany do komórek HepG2 i wykorzystany na różnych platformach sprzętowych i programowych, demonstrując w ten sposób jego zastosowanie, zdolność adaptacji i wszechstronność. Komórki HepG2 wykazują konstytutywną aktywność Akt, co czyni je idealnym modelem in vitro do badania specyficznej dla wątroby sygnalizacji insuliny i procesów metabolicznych. Kluczowe cechy protokołu są opisane krok po kroku w sekcji protokołu.

<table><tbody><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>Kot#25200-056</td><td>Użyj lodowatego PBS do mycia komórek</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórek ze szkła o średnicy 15 mm</td><td>GNIAZDO</td><td>Kot#801001</td><td></td></tr><tr><td>2&nbsp; mL fiolki kriogeniczne Nalgene</td><td>Thermo Scientific</td><td>Kot#5012-0020</td><td></td></tr><tr><td>5 ml pipet serologicznych pasiastych</td><td>Corning</td><td>Kot#4487</td><td></td></tr><tr><td>95% etanolu</td><td>Kermel (powiat Kermelski)</td><td>Kot#C028005</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny A1 HD25/A1R HD25</td><td>Nikon</td><td>https://www.nikon.com/</td><td>Powiększenie: 40&times;, Przysłona numeryczna (NA): 1.30, Czas przebywania piksela: 2.4 ms, Rozmiar piksela: 1024</td></tr><tr><td>Ampicyliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kot#A9393</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>VWR Nauki przyrodnicze</td><td>Kot#N208-10g</td><td></td></tr><tr><td>Corning 25&nbsp; CM2 Prostokątne kolby hodowlane</td><td>Corning</td><td>Kot#430639</td><td></td></tr><tr><td>Hrabina 3 automatyczny licznik komórek</td><td>Thermo Scientific</td><td>http://www.thermofisher.com/#AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka komory zliczania komórek hrabiny</td><td>Thermo Scientific</td><td>http://www.thermofisher.com/#C10228</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowe mieszalniki wirowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kot#D2650</td><td></td></tr><tr><td>Rurki Eppendorf Safe-Lock 1.5&nbsp; Ml</td><td>Eppendorf powiedział:</td><td>Kot#022363204</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania mykoplazmy EZ-PCR</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>Kot# 20-700-20</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu, kwalifikowana, Australia</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>Kot#10099141</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>Kot#35050061</td><td></td></tr><tr><td>Grafton Pryzmat 9</td><td>Oprogramowanie GraphPad</td><td>https://www.graphpad.com/</td><td></td></tr><tr><td>Wirus HepG2</td><td>Krajowa Kolekcja Uwierzytelnionych Kultur Komórkowych</td><td>#CSTR:19375.09.3101HUMSCSP510&nbsp; http://www.cellbank.org.cn/</td><td></td></tr><tr><td>Olejek immersyjny Typ 37</td><td>Laboratoria Cargille</td><td>Kot #16237</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kot#I5500-50MG</td><td>Ciepły do 37 stopni; C przed użyciem</td></tr><tr><td>Rosół LB (1x)</td><td>Invitrogen</td><td>Kot#10855001</td><td></td></tr><tr><td>Minimalna zawartość niezbędnego podłoża (MEM)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>Kot#11095080</td><td>Ciepły do 37 stopni; C przed użyciem</td></tr><tr><td>mySPIN 12&nbsp; mini wirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Scientific</td><td>https://www.thermofisher.com</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Plan Fluor 40&times;/1.30 Soczewka olejowa</td><td>Nikon</td><td>https://www.nikon.com/</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elementy-AR</td><td>Nikon</td><td>https://www.nikon.com/</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne (NEAA) (100x)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>Kot#11140050</td><td></td></tr><tr><td>Płytki agarowe One Shot LB&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Kot#A55802</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 kompetentny chemicznie E.&nbsp; Coli</td><td>Invitrogen</td><td>Kot#C737303</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM</td><td>Kot#B8R05606</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>Kot#10010023</td><td></td></tr><tr><td>pEevee-iAkt-NES (7,033&nbsp; bp)</td><td>Miura et&nbsp; AL31</td><td>https://benchling.com/s/seq-q46zFYCfl0swLAun0t28/edit</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>Kot#15070063</td><td></td></tr><tr><td>Profilaktyka plazmocyny</td><td>InvivoGen</td><td>Kot#ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-L-lizyny&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kot#P4832</td><td></td></tr><tr><td>Wanny precyzyjne ogólnego przeznaczenia</td><td>Thermo Scientific</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do miniprzygotowania wirowania QIAprep</td><td>QIAGEN powiedział:</td><td>Kot#27106</td><td></td></tr><tr><td>SnapGene (Szybki gen)</td><td>SnapGene firmy Dotmatics</td><td>https://www.snapgene.com</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100 mM)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>Kot#11360070</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy, 0.22&nbsp; &mu; m</td><td>Milipory</td><td>Kot#SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Górny inkubator etapowy Tokai Hit</td><td>TOKAI HIT</td><td>https://www.tokaihit-livecell.com/stagetopincubator</td><td></td></tr><tr><td>Ultraczysta woda destylowana wolna od DNaz/RNaz</td><td>Invitrogen</td><td>Kot#10977015</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Xfect</td><td>Życiorys Takary</td><td>Kot#631317</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie transferu energii rezonansu förstera w żywych komórkach metabolicznie regulowanej dynamiki aktywacji akt w komórkach hepg2

Live-Cell F&#246;rster Resonance Energy Transfer Imaging of Metabolically Regulated Akt Activation Dynamics in HepG2 Cells

Metabolicznie regulowana aktywacja Akt jest krytycznym węzłem w kaskadzie sygnalizacji insuliny i dostarcza cennych informacji na temat związku między cukrzycą a rakiem. Aby precyzyjnie określić ilościowo aktywność Akt w komórkach HepG2, opracowaliśmy solidny, powtarzalny protokół wykorzystujący rezonansowy transfer energii Förster (FRET) z genetycznie kodowanymi bioczujnikami specyficznymi dla Akt. Protokół ten przedstawia szczegółowe kroki hodowli komórek, przygotowania naczynia do obrazowania i transfekcji komórek HepG2 w celu ekspresji bioczujników opartych na FRET, a także szczegółowe wytyczne dotyczące konfiguracji sprzętu i oprogramowania laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Wyniki wykazały unikalne wzorce sygnalizacji insulinowej w komórkach HepG2, które wykazują nieodwracalny przełącznik charakteryzujący się konstytutywną aktywacją Akt z określonym progiem włączenia, ale bez progu wyłączenia. W przeciwieństwie do tego, myotubes wyświetlają odwracalny przełącznik. Utrzymująca się aktywacja Akt w komórkach HepG2 sugeruje mechanizmy leżące u podstaw insulinooporności i rozregulowania metabolicznego w komórkach wątroby, z szerszymi implikacjami dla zrozumienia progresji zaburzeń metabolicznych i raka. Protokół ten stanowi cenną podstawę do badania szlaków sygnałowych i zachowań komórkowych związanych z Aktem w różnych kontekstach chorobowych.

Aby zbadać aktywację Akt w komórkach HepG2, komórki wysiano na uprzednio powlekane szalki do obrazowania i transfekowano biosensorem opartym na metodzie FRET pEevee-iAkt-NES (Rysunek 2A), zaprojektowanym w celu umożliwienia monitorowania fosforylacji Akt w czasie rzeczywistym. Po transfekcji komórki poddano 4-godzinnemu głodzeniu surowiczemu w medium bezsurowiczym, aby zsynchronizować ich stan metaboliczny i zminimalizować podstawową sygnalizację insulinową.
Nastę...

W tym miejscu przedstawiamy protokół ilościowego określenia czasoprzestrzennej dynamiki aktywacji i fosforylacji Akt w żywych komórkach HepG2. Obrazowanie metodą rezonansowego transferu energii metodą Förster (FRET) jest potężnym narzędziem, które dostarcza cennych informacji na temat szlaków sygnalizacji insuliny i regulacji metabolicznej w komórkach nowotworowych.

Obrazowanie transferu energii rezonansu Förstera w żywych komórkach metabolicznie regulowanej dynamiki aktywacji Akt w komórkach HepG2

Metabolically regulated Akt activation is a critical node in the insulin signaling cascade and provides valuable insights into the relationship between ...

Heterogeniczność komórkowa jest przeszkodą w dokładnym opisie zawiłości dynamiki komórkowej, które są zasadniczo uśrednione. Dlatego jesteśmy tutaj, aby obrazować pojedyncze komórki. Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznie kodowanych bioczujników FRET poprawiły specyficzność i zrewolucjonizowały śledzenie Akt w czasie rzeczywistym w komórkach, co ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia heterogenetyki i opracowania spersonalizowanych terapii lekowych.Rak i cukrzyca przechodzą przez złożone szlaki metaboliczne. Aby zdekodować biozłożoność szlaku sygnalizacji insuliny w nowotworach, używamy najnowocześniejszego obrazowania FRET z żywymi komórkami w rozdzielczości pojedynczej komórki. Odkryliśmy, że optymalizacja mikroskopu konfokalnego, konfiguracji sprzętu i oprogramowania wraz z precyzyjnym dostrojeniem mocy lasera i dostosowaniem wzmocnienia detektora mają kluczowe znaczenie dla zminimalizowania wszelkich szumów i przesłuchów spektralnych w sygnałach FRET.Tradycyjne metody masowe, takie jak western blotting, nie mają przestrzennych szczegółów czasowych i maskują niejednorodność komórkową. Nasz protokół wypełnia tę lukę, wykorzystując obrazowanie FRET z żywymi komórkami do uchwycenia odpowiedzi komórkowej z wysoką precyzją i dokładnością. Na początek dodaj jeden mililitr 0,1 miligrama na mililitr roztworu poli-L-lizyny do naczynia do obrazowania i kołysz naczyniem, aby pokryć całą powierzchnię.Po całonocnej inkubacji odessać nadmiar roztworu poli-L-lizyny z naczynia. Delikatnie spłucz powierzchnię PBS 3 razy, odpoczywając przez pięć minut każdy, aby całkowicie usunąć niezwiązaną poli-L-lizynę. Zassać PBS i wysuszyć powlekaną naczynie do obrazowania w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej trzy godziny.Następnie umieść komórki HepG2 we wstępnie powlekanej misce obrazowej na 24 do 48 godzin przed transfekcją, aby upewnić się, że osiągną 70 do 90% konfluencji. Rozmrozić i odwirować odczynnik do transfekcji wraz z plazmidem kodującym biosensor Forster Resonance Energy Transfer. Wykonaj krótkie wirowanie, aby zebrać całą mieszaninę na dnie tuby.Wymieszać osiem mikrogramów plazmidu z buforem reakcyjnym do końcowej objętości 100 mikrolitrów za pomocą wiru przez pięć sekund z dużą prędkością. Wykonaj krótkie wirowanie, aby zebrać mieszaninę na dnie tuby. Dodać 2,4 mikrolitra polimeru transfekcyjnego do probówki zawierającej rozcieńczone DNA osocza i dobrze wymieszać.Inkubować mieszaninę biosensora i polimeru w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby umożliwić utworzenie kompleksów nanocząstek. Wiruj probówkę przez pięć sekund przy 5 000 G, aby zebrać zawartość na dnie. Dodaj kroplami całe 100 mikrolitrów złożonego roztworu nanocząstek do pożywki do hodowli komórkowej i delikatnie kołysz płytką w przód iw tył, aby wymieszać.Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny do nocy. Po usunięciu kompleksów nanocząstek z komórek, zastąp roztwór dwoma mililitrami świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza do czasu analizy.Przeanalizuj komórki pod mikroskopią fluorescencyjną. Wyjmij pożywkę hodowlaną z naczynia do obrazowania i dwukrotnie wypłucz naczynie 1X PBS, pozwalając, aby każde płukanie trwało pięć minut. Dodaj dwa mililitry pożywki głodowej do każdego naczynia wokół krawędzi naczynia.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Następnie włącz komputer, a następnie kolejno włączaj jednostkę główną mikroskopu konfokalnego i akcesoria. Następnie aktywuj system laserowy, przekręcając kluczyk do pozycji włączonej i przestawiając przełączniki uruchamiania lasera.Następnie obróć przełączniki zamka laserowego zgodnie z ruchem wskazówek zegara do pozycji włączonej dla obu linii laserowych. Na koniec włącz zasilanie kontrolera systemu. Uruchom oprogramowanie NIS-Elements AR z pulpitu.Kliknij A1 w celu akwizycji, aby rozpocząć konfigurację obrazowania i wybrać odpowiednie konfiguracje optyczne w oparciu o wymagania eksperymentalne. Zamontuj górny inkubator ze stopniem mikroskopu i zabezpiecz go. Napełnij wewnętrzną łaźnię wodną sterylną, podwójnie destylowaną wodą.Następnie zainstaluj górną grzałkę i włącz zasilanie stage grzałka, grzałka wannowa i grzałka obiektywu. Przetrzyj soczewkę zanurzeniową z olejkiem 40X papierem do soczewek zwilżonym 95% etanolem i umieść małą kroplę olejku immersyjnego na soczewce obiektywu. Następnie umieść miskę obrazowania zawierającą komórki HepG2 na stoliku mikroskopu i zabezpiecz ją uchwytem.Zamknij komorę i inkubuj komórki przez jedną do dwóch godzin, aby umożliwić równowagę. Uruchom okno akwizycji ND z menu File (Plik) rozszerzenia NIS-Elements. Wybierz kartę Czas, aby ustawić interwał, czas trwania i pętle dla obrazowania poklatkowego. Kliknij kartę XY i naciśnij przycisk Dodaj, aby dołączyć komórki HepG2 do obrazowania pod ostrością.Następnie zaznacz pole Z, aby ustawić pozycję Z. Kliknij przycisk Przeglądaj, aby wybrać folder docelowy. Wprowadź nazwę eksperymentu w polu Nazwa pliku.Kliknij przycisk Uruchom teraz, aby rozpocząć akwizycję i rozpocząć proces obrazowania poklatkowego. Rejestruj pomiary wyjściowe przez okres do 30 minut bez pożywek suplementowanych insuliną. Przerywaj obrazowanie w regularnych odstępach czasu.Delikatnie wyjmij pożywkę z naczynia ze szklanym dnem i dodaj jeden mililitr pożywki uzupełnionej o odpowiednie stężenie insuliny. Wznów pobieranie obrazu i kliknij przycisk Zakończ na końcu eksperymentu, aby go zamknąć. Na koniec twórz kopie zapasowe i bezpiecznie przechowuj pozyskane obrazy do analizy.Zależny od dawki wzrost fosforylacji Akt zaobserwowano po stymulacji insuliną, przy czym gwałtowny wzrost nastąpił po podaniu 300 insuliny pikomolarnej. Powyżej tego stężenia poziom fosforylacji utrzymywał się na stałym poziomie i nie spadał nawet po zmniejszeniu dawki insuliny. Znormalizowany współczynnik FRET wykazywał podobny trend, z rosnącym sygnałem po stymulacji insuliną i brakiem powrotu do wartości wyjściowej po odstawieniu insuliny.Po sekwencyjnej stymulacji insuliną zaobserwowano postępujący wzrost znormalizowanego współczynnika FRET, co wspierało zależną od dawki odpowiedź na aktywację Akt.

live-cell-frster-resonance-energy-transfer-imaging-metabolically

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Reportery oparte na FRET są coraz częściej wykorzystywane do monitorowania aktywności kinaz i fosfataz w żywych komórkach. W niniejszej pracy opisujemy metodę wykorzystania reporterów opartych na FRET do oceny zmian w fosforylacji celu zależnych od cyklu komórkowego.

Monitorowanie aktywności kinaz i fosfataz w cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego FRET

Bogate w leucynę kinazy powtórzeniowe 1 i 2 (LRRK1 i LRRK2) są wielodomenowymi białkami, które kodują zarówno domeny GTPazy, jak i kinazy, i które są fosforylowane w komórkach. W tym miejscu przedstawiamy protokół znakowania LRRK1 i LRRK2 w komórkach za pomocą ortofosforanu 32P, zapewniając w ten sposób sposób sposób sposób sposób na pomiar ich ogólnego poziomu fosforylacji komórkowej.

Znakowanie metaboliczne bogatych w leucynę kinaz powtórzeniowych 1 i 2 radioaktywnym fosforanem

MRP4 reguluje różne cykliczne zdarzenia sygnalizacyjne zależne od nukleotydów, w tym niedawno wyjaśnioną rolę w migracji komórek. Opisujemy bezpośrednie, ale wieloaspektowe podejście do rozwikłania dalszych celów molekularnych MRP4, co skutkuje identyfikacją unikalnego interaktomii MRP4, który odgrywa kluczową rolę w precyzyjnej regulacji migracji fibroblastów.

Metody badania kompleksów makromolekularnych zawierających Mrp4 w regulacji migracji fibroblastów

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania komórek wyrażających receptory angiotensyny typu 1a znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym podczas endocytozy zainicjowanej przez leczenie angiotensyną II. Technika ta obejmuje znakowanie lizosomów drugim markerem fluorescencyjnym, a następnie wykorzystanie oprogramowania do analizy kolokalizacji receptora i lizosomu w trzech wymiarach w czasie.

Obrazowanie żywych komórek i analiza 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Ściśle skoncentrowany laser femtosekundowy może dostarczać precyzyjną stymulację komórkom poprzez połączenie z mikroskopią konfokalną, umożliwiając obserwację w czasie rzeczywistym i fotostymulację. Fotostymulacja może aktywować zdarzenia molekularne komórki, w tym szlak sygnałowy ERK i mitochondrialne błyski reaktywnych form tlenu.

Fotostymulacja laserem femtosekundowym aktywuje sygnalizację kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) lub zdarzenia mitochondrialne w komórkach docelowych

Hematopoetyczne komórki progenitorowe (HSPC) przechodzą ze stanu spoczynku do stanu różnicowania dzięki ich plastyczności metabolicznej podczas tworzenia krwi. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną metodę pomiaru oddychania mitochondrialnego i glikolizy HSPC.

Analiza metabolizmu krwiotwórczych komórek macierzystych

Protokoły testów opartych na komórkach rezonansu rezonansu Förstera z rozdzielczością czasową są opisane dla prostej, specyficznej, czułej i solidnej kwantyfikacji endogennych fosforylowanych białek przetwornika sygnału i aktywatora transkrypcji (STAT) 1/3/4/5/6 w lizatach komórkowych w formacie 384-dołkowym.

Czasowo-rozdzielcze rezonansowe testy transferu energii Förstera do pomiaru endogennych fosforylowanych białek STAT w komórkach ludzkich

Test przepływu metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym mierzy zużycie tlenu i stopień zakwaszenia zewnątrzkomórkowego, co odpowiada produkcji mitochondrialnego i glikolitycznego trifosforanu adenozyny, przy użyciu czujników pH i tlenu. W manuskrypcie wyjaśniono metodę pozwalającą zrozumieć stan energetyczny osteoblastów oraz charakterystykę i interpretację statusu bioenergetycznego komórek.

Wykorzystanie analizatora strumienia metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym do monitorowania bioenergetyki osteoblastów

Ten protokół opisuje obrazowanie fluorescencyjne i analizę endogennych koenzymów metabolicznych, zredukowanego dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (fosforanu) (NAD(P)H) i utlenionego dinukleotydu flawinoadeninowego (FAD). Obrazowanie autofluorescencyjne NAD(P)H i FAD zapewnia bezznacznikową, nieniszczącą metodę oceny metabolizmu komórkowego.

Obrazowanie autofluorescencyjne w celu oceny metabolizmu komórkowego

Prezentujemy protokół do bezpośredniej wizualizacji aktywności metabolicznej w komórkach regulowanych przez aminokwasy za pomocą mikroskopii stymulowanego rozpraszania Ramana (DO-SRS) z tlenkiem deuteru (ciężka wodaD2O), która jest zintegrowana z mikroskopią fluorescencyjną wzbudzenia dwufotonowego (2PEF).

Bioortogonalne obrazowanie chemiczne metabolizmu komórkowego regulowanego przez aminokwasy aromatyczne

Protokół ten integruje niestandardowy system bioreaktora z hiperspolaryzowaną spektroskopią NMR ¹³C w celu pomiaru metabolizmu pirogronianu w czasie rzeczywistym w żywych komórkach, poprawiając odtwarzalność i dokładność kinetyczną w badaniach metabolicznych i badaniach przesiewowych leków.

Detekcja metaboliczna w czasie rzeczywistym w żywych komórkach przy użyciu hiperpolaryzowanego 13C NMR

Poznaj obrazowanie FRET do badania aktywacji kinazy Akt w żywych komórkach HepG2 w czasie rzeczywistym. Ta metoda pozwala analizować szlaki sygnałowania insuliny i regulacji metabolicznej w komórkach nowotworowych.

Obrazowanie transferu energii rezonansu Förstera w żywych komórkach metabolicznie regulowanej dynamiki aktywacji Akt w komórkach HepG2 (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie transferu energii rezonansu Förstera w żywych komórkach metabolicznie regulowanej dynamiki aktywacji Akt w komórkach HepG2

Przeglądaj więcej filmów