Wizualizacja fluorescencji pojedynczej cząsteczki dynamiki polimerazy DNA w G-kwadrupleksach
April 4th, 2025
Ten protokół opisuje test replikacji pojedynczej cząsteczki DNA oparty na mikroskopii fluorescencyjnej, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym interakcji między polimerazami DNA a przeszkodami, takimi jak struktury G-quadruplex.
Nasze prace koncentrują się na rozwoju i wykorzystaniu metodologii jednocząsteczkowej do badania dynamiki w złożonych systemach biologicznych. W szczególności interesuje nas, jak zachowują się polimerazy DNA po napotkaniu przeszkód, w tym przypadku G-kwadrupleksów. Opracowaliśmy metodę jednocząsteczkową opartą na wizualizacji fluorescencji, która pozwala nam zobaczyć zachowanie poszczególnych polimeraz DNA po napotkaniu G-quadruplex.
Dzięki naszemu testowi zidentyfikowaliśmy wcześniej niescharakteryzowaną ścieżkę wymiany delta polimerazy DNA po uderzeniu w G-kwadrupleksy, w których polimeraza odpadnie, a nowa ponownie się zwiąże. Po opracowaniu naszego protokołu w końcu odpowiedzieliśmy na pytanie: Jak zachowują się różne polimerazy DNA, gdy napotykają G-quadruplex, ponieważ możemy zobaczyć w czasie rzeczywistym, jak kinetyka i mechanika zmieniają się w czasie? Na początek wyjmij funkcjonalną szkiełko nakrywkowe z odkurzacza i umieść je na stojaku na mikroprobówki częściowo wypełnionym wodą, aby stworzyć wilgotne środowisko.
Odpipetować 100 mikrolitrów buforu blokującego do probówki, następnie dodać 25 mikrolitrów roztworu NeutrAwidin i dobrze wymieszać. Rozprowadzić roztwór na powierzchni szkiełka nakrywkowego i pozostawić do inkubacji przez 15 minut w temperaturze pokojowej w wilgotnym pojemniku. Następnie umyj szkiełko nakrywkowe wodą, a następnie wysusz je za pomocą gazowego azotu.
Umieść wykonany na zamówienie blok polidimetylosiloksanu na szkiełku nakrywkowym w uchwycie kuwety przepływowej. Włóż rurki polietylenowe do otworów w komorze przepływowej. Teraz podgrzej jednomililitrowe porcje buforu blokującego Tweena, 500 mikrolitrów buforu płuczącego i buforu replikacyjnego do 40 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby uwolnić gazy z roztworów.
Odgazuj roztwory w komorze próżniowej przez dodatkowe 15 minut przy ciśnieniu 800 milibarów poniżej ciśnienia atmosferycznego. Nałóż kroplę olejku na cel. Weź skonstruowaną komórkę przepływową i umieść ją na stoliku mikroskopu.
Następnie podnieś cel, aby stykał się z szkiełkiem nakrywkowym. Włóż rurkę wlotową do odgazowanego bufora blokującego Tween i podłącz wylot do pompy strzykawkowej. Następnie pociągnij strzykawkę do tyłu, aby przeciągnąć bufor blokujący animację przez rurkę do kanału.
Wlej 200 mikrolitrów odgazowanego buforu płuczącego do kanału z szybkością 100 mikrolitrów na minutę, aby wypłukać bufor blokujący Tweeen. Teraz rozcieńczyć roztwory matryc DNA do 0,5 pikomolaru w 500 mikrolitrach buforu replikacyjnego. Niech 150 mikrolitrów roztworu wpłynie do kanału z szybkością 10 mikrolitrów na minutę.
Oświetl próbkę za pomocą lasera 647 nm o mocy około 900 miliwatów na centymetr kwadratowy na płaszczyźnie próbki, aby uwidocznić poszczególne matryce DNA. Gdy widoczna jest wystarczająca gęstość plamek, przelej świeży roztwór buforu replikacyjnego, aby wypłukać nadmiar DNA. Przejdź do nowego pola widzenia i uchwyć obraz DNA, aby określić stopień kolokalizacji między znakowaną polimerazą a substratem DNA.
Po zakończeniu zwiększ moc lasera, aby fotowybielać pozostałe plamy. Następnie przygotuj roztwór polimerazy zawierający ditiotreitol, dNTP i sondę fluorescencyjną w buforze replikacyjnym. Wlej 100 mikrolitrów roztworu polimerazy z szybkością pięciu mikrolitrów na minutę do kanału.
Gdy próbka jest już zogniskowana, a całkowity kąt fluorescencji odbicia wewnętrznego zostanie dostosowany, ustaw moc lasera 647-nanometrowego na około 900 miliwatów na centymetr kwadratowy na płaszczyźnie próbki. Rozpocznij obrazowanie pola widzenia przez żądany okres czasu. Sekwencja G-quadruplex blokowała syntezę delta polimerazy, na co wskazuje obecność pasma 60 nukleotydów w żelu stronicowym, podczas gdy substrat kontrolny bez G-kwadrupleksu wytwarzał pasmo 100 nukleotydów.
Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek potwierdziła, że polimeraza delta miała krótszy czas przebywania wynoszący sześć plus minus dwie sekundy na podłożu G-quadruplex, w porównaniu z substratem kontrolnym, który miał czas przebywania 11 plus minus trzy sekundy. Liczba zdarzeń wiązania polimerazy delta była znacznie wyższa na substracie G-quadruplex w porównaniu z kontrolą, co sugeruje wiele cykli wiązania i rozwiązywania z powodu blokady syntezy.
Przegląd
Niniejsze badania badają dynamikę polimeraz DNA podczas ich spotkań ze strukturami G-czworaków, które stanowią znaczące przeszkody podczas replikacji DNA. Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząstek, badanie wizualizuje zachowanie pojedynczej polimerazy DNA delta podczas jej interakcji z tymi złożonymi strukturami, ujawniając wcześniej niezidentyfikowany szlak wymiany.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Dynamika replikacji DNA
- Metodologia pojedynczej cząsteczki
- Techniki mikroskopiczne
Tło
- Rola polimeraz DNA w replikacji
- Wpływ struktur G-czworaków na aktywność polimeraz
- Znaczenie wizualizacji w czasie rzeczywistym w procesach biologicznych
Zastosowane metody
- Asej fluorescencyjny oparty na mikroskopi
- Asej replikacji DNA pojedynczej cząsteczki
- Niestandardowe ustawienie eksperymentalne z komórkami przepływowymi i oświetleniem laserowym
Główne wyniki
- Zidentyfikowano nową ścieżkę wymiany dla polimerazy delta po spotkaniu z G-czworakami
- Zaobserwowano krótszy czas przebywania na podłożu G-czworaków w porównaniu z kontrolą
- Sugeruje się wielokrotne cykle wiązania i rozwiązywania z powodu blokady syntezy
Wnioski
- To badanie pokazuje skomplikowane zachowanie polimeraz DNA w odpowiedzi na przeszkody replikacyjne
- Wyniki poprawiają zrozumienie mechanizmów replikacji DNA i pomagają w przyszłych badaniach genetycznych
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Single-molecule fluorescence visualization of DNA polymerase dynamics at G-quadruplexes addresses a critical challenge in understanding replication fidelity and genome stability. This method enables direct observation of polymerase behavior at DNA obstacles, informing mechanistic de-risking and predictive confidence in early discovery. The approach supports portfolio decisions by clarifying how replication machinery responds to complex DNA structures relevant to disease and therapeutic targeting.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of DNA polymerase response to G-quadruplex roadblocks.
- Clarifies mechanistic pathways underlying replication stalling and exchange events.
- Supports functional target validation for proteins involved in genome maintenance.
- Improves predictive confidence in selecting targets affected by DNA secondary structures.
Screening & Assay Development
- Facilitates development of quantitative single-molecule assays for polymerase activity.
- Enables reproducible measurement of binding kinetics and dwell times at DNA obstacles.
- Supports assay standardization for evaluating protein-DNA interactions under defined conditions.
- Prepares validated systems for downstream screening of modulators affecting polymerase dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Provides mechanistic insight into replication stress relevant to disease models.
- Aligns with translational biomarker strategies by linking polymerase behavior to genomic instability.
- Supports continuity from molecular discovery to preclinical validation of genome maintenance targets.
- Enables risk-adjusted advancement of candidates modulating DNA replication fidelity.
Pipeline & Workflow Integration
This single-molecule fluorescence method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical model validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on polymerase stalling and exchange at G-quadruplexes.
- Screening: Provides quantitative readouts of binding events and dwell times for assay readiness.
- Analytics: Delivers statistical outputs on polymerase kinetics for condition comparison.
- Translational Research: Connects molecular mechanisms to disease-relevant replication stress models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for studying diverse DNA-protein interactions at single-molecule resolution.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in replication biology.
- Operational Value: Standardizes single-molecule assays for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying target engagement at DNA obstacles.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genome maintenance targets and pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule fluorescence microscopy and microfluidic assay design.
- Demands specialized instrumentation for real-time imaging and quantitative analysis.
- Necessitates cross-team standardization of assay protocols and data interpretation.
- May require adaptation for different DNA substrates or protein targets.
- Throughput and scalability are limited by imaging and analysis capacity.
