Wizualizacja fluorescencji pojedynczej cząsteczki dynamiki polimerazy DNA w G-kwadrupleksach

Nasze prace koncentrują się na rozwoju i wykorzystaniu metodologii jednocząsteczkowej do badania dynamiki w złożonych systemach biologicznych. W szczególności interesuje nas, jak zachowują się polimerazy DNA po napotkaniu przeszkód, w tym przypadku G-kwadrupleksów. Opracowaliśmy metodę jednocząsteczkową opartą na wizualizacji fluorescencji, która pozwala nam zobaczyć zachowanie poszczególnych polimeraz DNA po napotkaniu G-quadruplex.

Dzięki naszemu testowi zidentyfikowaliśmy wcześniej niescharakteryzowaną ścieżkę wymiany delta polimerazy DNA po uderzeniu w G-kwadrupleksy, w których polimeraza odpadnie, a nowa ponownie się zwiąże. Po opracowaniu naszego protokołu w końcu odpowiedzieliśmy na pytanie: Jak zachowują się różne polimerazy DNA, gdy napotykają G-quadruplex, ponieważ możemy zobaczyć w czasie rzeczywistym, jak kinetyka i mechanika zmieniają się w czasie? Na początek wyjmij funkcjonalną szkiełko nakrywkowe z odkurzacza i umieść je na stojaku na mikroprobówki częściowo wypełnionym wodą, aby stworzyć wilgotne środowisko.

Odpipetować 100 mikrolitrów buforu blokującego do probówki, następnie dodać 25 mikrolitrów roztworu NeutrAwidin i dobrze wymieszać. Rozprowadzić roztwór na powierzchni szkiełka nakrywkowego i pozostawić do inkubacji przez 15 minut w temperaturze pokojowej w wilgotnym pojemniku. Następnie umyj szkiełko nakrywkowe wodą, a następnie wysusz je za pomocą gazowego azotu.

Umieść wykonany na zamówienie blok polidimetylosiloksanu na szkiełku nakrywkowym w uchwycie kuwety przepływowej. Włóż rurki polietylenowe do otworów w komorze przepływowej. Teraz podgrzej jednomililitrowe porcje buforu blokującego Tweena, 500 mikrolitrów buforu płuczącego i buforu replikacyjnego do 40 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby uwolnić gazy z roztworów.

Odgazuj roztwory w komorze próżniowej przez dodatkowe 15 minut przy ciśnieniu 800 milibarów poniżej ciśnienia atmosferycznego. Nałóż kroplę olejku na cel. Weź skonstruowaną komórkę przepływową i umieść ją na stoliku mikroskopu.

Następnie podnieś cel, aby stykał się z szkiełkiem nakrywkowym. Włóż rurkę wlotową do odgazowanego bufora blokującego Tween i podłącz wylot do pompy strzykawkowej. Następnie pociągnij strzykawkę do tyłu, aby przeciągnąć bufor blokujący animację przez rurkę do kanału.

Wlej 200 mikrolitrów odgazowanego buforu płuczącego do kanału z szybkością 100 mikrolitrów na minutę, aby wypłukać bufor blokujący Tweeen. Teraz rozcieńczyć roztwory matryc DNA do 0,5 pikomolaru w 500 mikrolitrach buforu replikacyjnego. Niech 150 mikrolitrów roztworu wpłynie do kanału z szybkością 10 mikrolitrów na minutę.

Oświetl próbkę za pomocą lasera 647 nm o mocy około 900 miliwatów na centymetr kwadratowy na płaszczyźnie próbki, aby uwidocznić poszczególne matryce DNA. Gdy widoczna jest wystarczająca gęstość plamek, przelej świeży roztwór buforu replikacyjnego, aby wypłukać nadmiar DNA. Przejdź do nowego pola widzenia i uchwyć obraz DNA, aby określić stopień kolokalizacji między znakowaną polimerazą a substratem DNA.

Po zakończeniu zwiększ moc lasera, aby fotowybielać pozostałe plamy. Następnie przygotuj roztwór polimerazy zawierający ditiotreitol, dNTP i sondę fluorescencyjną w buforze replikacyjnym. Wlej 100 mikrolitrów roztworu polimerazy z szybkością pięciu mikrolitrów na minutę do kanału.

Gdy próbka jest już zogniskowana, a całkowity kąt fluorescencji odbicia wewnętrznego zostanie dostosowany, ustaw moc lasera 647-nanometrowego na około 900 miliwatów na centymetr kwadratowy na płaszczyźnie próbki. Rozpocznij obrazowanie pola widzenia przez żądany okres czasu. Sekwencja G-quadruplex blokowała syntezę delta polimerazy, na co wskazuje obecność pasma 60 nukleotydów w żelu stronicowym, podczas gdy substrat kontrolny bez G-kwadrupleksu wytwarzał pasmo 100 nukleotydów.

Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek potwierdziła, że polimeraza delta miała krótszy czas przebywania wynoszący sześć plus minus dwie sekundy na podłożu G-quadruplex, w porównaniu z substratem kontrolnym, który miał czas przebywania 11 plus minus trzy sekundy. Liczba zdarzeń wiązania polimerazy delta była znacznie wyższa na substracie G-quadruplex w porównaniu z kontrolą, co sugeruje wiele cykli wiązania i rozwiązywania z powodu blokady syntezy.