Standaryzowany modułowy montaż operonów policistronnych z klonowaniem modularnym (MoClo) z wykorzystaniem zestawu narzędzi In-Cloning

Opracowałem metody pozwalające na modułowe składanie DNA od małych, pojedynczych części molekularnych aż po konstrukcje o rozmiarze chromosomów oraz na przeprogramowanie komórek za pomocą tych sztucznych chromosomów. Jedną z ważnych innowacji w tej dziedzinie jest opracowanie modułowych zestawów narzędzi klonowania, które umożliwiają modułowe składanie wielogenowych konstrukcji z biblioteki standaryzowanych części molekularnych. Modułowe zestawy narzędzi klonowania są zazwyczaj projektowane do klonowania monocistronnych jednostek transkrypcyjnych.

Protokół ten demonstruje uogólniony sposób składania jednostek transkrypcji policistronnych za pomocą zestawu narzędzi do klonowania w środku. Ta strategia klonowania jednostki transkrypcji policistronnej pozwala na elastyczne wykorzystanie sekwencji kodujących zarówno w pojedynczej jednostce transkrypcji, jak i w układach policistronnych. Aby zacząć, wybierz części poziomu 0, które zostaną złożone w jednostkę transkrypcyjną.

Muszą one obejmować co najmniej RBS, sekwencję kodującą oraz terminator. Wybierz pozycję, w której jednostka transkrypcji zostanie złożona w operonie. Na podstawie wybranej pozycji wybierz odpowiedni plazmid akceptorowy i symuluj montaż Golden Gate w SnapGene.

W reakcji Golden Gate enzym SAP1 uwolni miejsce wiązania rybosomu, sekwencję kodującą i terminator z ich plazmidów i przecina plazmid akceptorowy. Złóż miejsce wiązania rybosomu, sekwencję kodującą i terminator w plazmid akceptora przeciętego. Następnie w reakcji Golden Gate użyj pipety, aby dodać 50 femtomoli, z każdej pożądanej inserwacji oraz 50 femtoli plazmidu akceptorowego.

Po jednym mikrolitrze 10x buforu ligazy T4, ligazy T4 i SAP1 do probówki reakcyjnej. Następnie dodaj wodę wolną od nukleazy, aby uzyskać końcową objętość do 10 mikrolitrów. Włóż rurkę do termocyklera.

Uruchom 25 cykli 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty, 16 stopni Celsjusza przez cztery minuty i 50 stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie przez 20 minut ciepło dezaktywuj enzymy w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Opcjonalnie należy pipetować 0,5 mikrolitra SAP1 do reakcji GG i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Pipetuj pipetą mieszankę reakcji na 50 mikrolitrów chemicznie kompetentnych komórek E. coli. Wykonaj transformację termiczną, zanurzając rurkę w kąpieli wodnej w 42 stopniach Celsjusza na 30 sekund, a następnie umieszczaj ją na lodzie na dwie minuty. Następnie inkubuj komórki w jednym mililitrze podłoża przez godzinę, aby wspomóc regenerację.

Nakładanie 100 mikrolitrów wyrostu transformacji na płytkę ślimakową LB zawierającą 100 mikrogramów ampicyliny na mililitr. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia wybierz dwie białe kolonie za pomocą pętli szczepionkowej lub końcówki pipety.

Każdy z nich należy zaszczepić do pięciu mililitrów podłoża LB zawierającego 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze drżącym z prędkością 250 obrotów na minutę. Wykonaj ekstrakcję w kratę zgodnie z instrukcjami producenta.

Strawij jeden mikrogram wyekstrahowanego DNA osocza, dodając jeden mikrolitr buforu trawienia 10x i jeden mikrolitr BBS1. Dodaj wodę wolną od nukleazy, aby uzyskać całkowitą objętość 10 mikrolitrów i inkubuj. Teraz załaduj strawiony plazmid na żel 1% agarozy i przeprowadź elektroforezę na 100 woltów przez 35 minut.

Następnie obrazuj żel i potwierdzaj prawidłowy montaż plazmidu. Aby złożyć konstrukcję poziomu M, wybierz jednostki transkrypcyjne poziomu 1, które mają być złożone. Symuluj zespół Golden Gate, uwalniając pierwszą i drugą jednostkę transkrypcyjną oraz końcowy łącznik za pomocą enzymu BBS1.

Jednocześnie rozciąć plazmid akceptorowy, a następnie złożyć wszystkie trzy części w plazmid akceptorowy, tworząc jednostkę transkrypcyjną policistronną. Ujemna kontrola dla zespołu plazmidów poziomu 1, który nie posiadał części terminatora, nie dała kolonii, podczas gdy cała reakcja dała 292 białe kolonie i brak kolonii czerwonych. Montaż konstrukcji wielogenowej bez drugiej kasety przy temperaturze 37 stopni Celsjusza dał tylko dwie białe kolonie, podczas gdy pełny zestaw dał dziewięć dużych kolonii i 435 małych kolonii.

Przy temperaturze 30 stopni Celsjusza negatywna kontrola dla wielogenowego montażu dała cztery białe kolonie, podczas gdy cała reakcja dała ponad 1 500 kolonii. Digest BSA1 akceptorowego plazmidu PMA60 daje oczekiwany pojedynczy pasmo przy 5 500 parach zasad. Trawienie plazmidów z 24 kolonii BSA1 wykazało, że 23 z 24 wykazały poprawny wzór restrykcji dwóch pasm przy około 4 300 parach zasad i 1 700 parach zasad.

Obrazowanie fluorescencyjne wykazało silną fluorescencję zieloną i cyjanową w koloniach z płytek zawierających induktor OC6, podczas gdy płytki bez induktora wykazywały minimalną lub żadną fluorescencję.