Name: Standaryzowany modułowy montaż operonów policistronnych z klonowaniem modularnym (MoClo) z wykorzystaniem zestawu narzędzi In-Cloning (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Poznaj metodę montażu operonów policistronowych za pomocą klonowania modularnego MoClo z zestawem narzędzi In-Cloning. Ten protokół umożliwia elastyczne łączenie sekwencji kodujących w wielogenowych konstruktach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

TAL, STdV i DS były wspierane przez Towarzystwo Maxa Plancka w ramach projektu MaxGENESYS.

UWAGA: Protokół ten opisuje projektowanie i montaż operonu policistronowego poprzez trzy poziomy standardu In-Cloning (0, 1 i M). Operon policistronny złożony tutaj zaczyna się od promotora, następnie do miejsca wiązania rybosomu (RBS), sekwencji kodującej (CDS), drugiego RBS, drugiego CDS, a na końcu terminatora (rysunek S1). Zdecydowanie zaleca się stosowanie oprogramowania do klonowania molekularnego do symulacji klonowania in silico, aby upewnić się, że zaprojektowana strategia klonowania jest poprawna. Przykładem złożenia promotora jako części poziomu 0, złożenia RBS z sekwencją kodującą i terminatorem w jednostkę transkrypcyjną poziomu 1 oraz montażu operonu bizystronicznego na poziomie M opisano tutaj, a schematyczny przegląd całego zespołu przedstawiono na rysunku S1.
1. Poziom 0: Udomowienie części
UWAGA: Termin "udomowienie" oznacza, że cząsteczka została zintegrowana z biblioteką części MoClo i może być składana na wszystkich poziomach zestawu MoClo. Zazwyczaj wszystkie miejsca rozpoznania enzymów restrykcyjnych typu II użytych w zestawie są usuwane z części przeznaczonej do udomowienia, np. poprzez ponowne kodowanie synonimowy.
<ol>
	<li>Projekt wkładki<ol>
		<li>Wybierz części molekularne, takie jak promotor, CDS i terminator, które zostaną złożone razem w operonie. UWAGA: W tym protokole operon inicjuje się od promotoraP-LuxB, który może być aktywowany przez białko LuxR w obecności związku indukcyjnego N-(β-ketokaproyl)-L-homoseriny laktonu (OC6)17. GFP jest pierwszym CDS operonu; jego RBS to iGEM BBa_B0064. GFP następuje łącznik nieterminalny, zwany "mostkiem terminatora". Drugi CDS to mTurquoise. Jego RBS został zaprojektowany przez kalkulator RBS18. Na koniec operon kończy się terminatorem L3S2P2119.</li>
		<li>Wybierz pozycję, w której część powinna być złożona, a przegląd przedstawiony jest na Rysunku 1. Na podstawie pozycji wybierz plazmid akceptorowy do użycia w GG. UWAGA: Części można udomowić do późniejszego wykorzystania w różnych pozycjach. Na przykład promotor może być złożony jako pojedyncza część później, łącząc się z częścią 5'UTR (pSL252), lub może być udomowiony z już zawartym 5'UTR (pSL099). CDS może być złożony w czterech plazmidach akceptorowych, który należy złożyć bez tagu (pSL102), z tagiem N-terminalowym (pSL104), z tagiem C-terminal (pSL101) lub z tagiem N-terminalowym i C-terminalem (pSL103). W danym przykładzie promotor zostaje udomowiony do pSL252, pierwszy RBS do pSL253, pierwszy CDS do pSL102, mostek terminatora do pSL106, drugi RBS do pSL099, drugi CDS do pSL102, a terminator do pSL106.</li>
		<li>Dodaj rozszerzenia do zaprojektowanej wkładki na podstawie wybranego plazmidu akceptorowego. Tabela 1 przedstawia przegląd rozszerzenia wymaganego do montażu GG na plazmid akceptorowy. Te rozszerzenia powinny być dodawane podczas projektowania starterów do PCR, projektowania oligosów w przypadku wyżarzania dwóch oligometrów w celu budowy części lub podczas syntezy genów. UWAGA: Aby część mogła zostać udomowiona, konieczne jest zapewnienie, że sama część nie zawiera miejsc rozpoznania enzymów typu IIS używanych w zestawie: SapI (5'-GCTCTTC-3'), BbsI (5'-GAAGAC-3') oraz BsaI (5'-GGTCTC-3'). Obecność miejsc rozpoznawczych w częściach znacznie obniża efektywność prawidłowego montażu, ponieważ produkt końcowy może być cięty przez użyty enzym typu IIS (patrz rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Reakcja GG<ol>
		<li>Do reakcji GG dodaj 50 fmol pożądanej inwenty, 50 fmol plazmidu akceptorowego, 1 μL buforu ligazy DNA 10x T4, 1 μL ligazy T4 oraz 1 μL BbsI. Dodaj wodę wolną od nukleazy do objętości 10 μL. Dodatkowo uwzględnij negatywną kontrolę z tą samą reakcją bez pożądanej inwentury.</li>
		<li>Uruchom następujący program w termocyklerze: 25 cykli po 37 °C przez 3 minuty (37 °C to optimalna temperatura enzymu restrykcyjnego) i 16 °C przez 4 minuty (16 °C to temperatura optymalna dla ligazy T4), po czym następuje końcowe trawienie w 50 °C przez 20 minut (w 50 °C), Ligaza T4 wykazuje bardzo niewielką lub żadną aktywność, podczas gdy enzym restrykcyjny nadal działa, co ogranicza ilość nieprzeciętego plazmidu akceptorowego w produkcie końcowym) oraz inaktywację cieplną enzymów w temperaturze 80 °C przez 20 minut (przy 80 °C wszystkie enzymy są inaktywowane ciepło i reakcja zostaje przerwana)6.</li>
		<li>Przekształcić reakcję GG, dodając 5 μL reakcji GG do 50 μL chemicznie kompetentnych komórek E. coli i przeprowadzić transformację szokową z etapem odzyskiwania opisanym w wcześniej opublikowanym protokole15.</li>
		<li>Rozłóż 100 μL wyrostu transformacyjnego na płycie agarowej Luria-Bertani (LB) z 100 μg/mL spektromycyny. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Porównaj efektywność transformacji kontroli ujemnej z całą grupą, licząc liczbę białych kolonii na obu płytach. Przechodź do kolejnego kroku, jeśli zgromadzenie ma około 10 razy (lub więcej) białych kolonii niż w kontroli ujemnej. UWAGA: Większość powstałych kolonii powinna być biała, z tylko niewielką częścią kolonii czerwonych. Plazmidy akceptorowe w zestawie narzędzi In-Cloning mają kasetę podwójnego wyboru, zawierającą albo mCherry (poziom 0 i poziom 1), albo LacZα (poziom M i poziom P), oraz gen ccdB kodujący inhibitor gyrazy. Transformacja reakcji GG odbywa się w komórkach E. coli wrażliwych na ccdB, dlatego mogą rosnąć tylko komórki z złożonym plazmidem, podczas gdy oryginalny plazmid akceptorowy nie może być propagowany. Przykładami szczepów wrażliwych na ccdB są DH5α i TOP10. mCherry/LacZα umożliwia wizualną identyfikację komórek uciekających z mechanizmu ccdB 16.</li>
		<li>Dla każdego zespołu uprawiaj dwie białe kolonie, zbierając część materiału z kolonii za pomocą pipety i zawieszając ją w 5 mL medium LB z 100 μg/mL spektromycyny każda, a następnie inkubuj przez noc w 37 °C w inkubatorze potrząsającym przy 250 obr./min. Wykonaj ekstrakcję plazmidową kolumną zgodnie z instrukcjami producenta. Zweryfikowaj, czy wyodrębniony plazmid ma oczekiwaną sekwencję za pomocą sekwencjonowania Sangera.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Poziom 1: Ustalanie pozycji
UWAGA: Poziom 1 to poziom pomiędzy udomowieniem części a złożeniem operonu policistronnego (Rysunek 2). Tutaj określa się pozycje zespołów pośrednich w końcowej konstrukcji. Pozycję zespołu poziomu 1 w operonie można zmienić, stosując inny plazmid akceptorowy poziomu 1. Przykład opisany opisuje montaż jednostki bistyktronicznej, ale dany schemat można łatwo dostosować do montażu do sześciu sekwencji kodujących (z każdym RBS). Składanie większej liczby sekwencji kodujących wymaga dodatkowo przełączania się między poziomem P a M. Podczas iteracyjnego cyklicznego cyklu między poziomem P a M nie ma stałego górnego limitu liczby sekwencji kodujących, które można złożyć w jeden operon.
<ol>
	<li>Wybór części i plazmidów akceptorowych<ol>
		<li>Wybierz części poziomu 0, które zostaną złożone w jednostkę transkrypcyjną. Co najmniej muszą one obejmować promotora, CDS i terminatora.</li>
		<li>Wybierz pozycję, w której jednostka transkrypcji powinna być złożona w operonie. Na podstawie tej pozycji wybierz odpowiedni plazmid akceptorowy. Przegląd przedstawiono na rysunku 2. UWAGA: 7 fragmentów DNA przeznaczonych do konstrukcji operonu bizystronicznego, pokazanych jako przykład, zostało złożonych w dwa konstrukty poziomu 1. Promotor, pierwszy RBS, pierwszy CDS oraz mostek terminatora są montowane w pSL68; drugi RBS, drugi CDS oraz terminator są składane w pSL69.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Reakcja GG<ol>
		<li>Do reakcji GG dodaj 50 fmol każdej z pożądanych wstawek, 50 fmol plazmidu akceptorowego, 1 μL buforu ligazy DNA 10x T4, 1 μL ligazy T4 oraz 1 μL SapI. Dodaj wodę wolną od nukleazy do całkowitej objętości 10 μL.</li>
		<li>Uruchom następujący program w termocyklerze: 25 cykli 37 °C przez 3 minuty i 16 °C przez 4 minuty, następnie końcowe trawienie w 50 °C przez 20 minut oraz inaktywacja cieplna enzymów w 80 °C przez20 minut 6 minut.</li>
		<li>Opcjonalnie: Dodaj 0,5 μL SapI do reakcji GG i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. UWAGA: SapI nie jest tak stabilny jak inne stosowane enzymy restrykcyjne typu IIS. Stwierdzono, że etap trawienia z użyciem SapI po reakcji GG zmniejsza liczbę kolonii przenoszących ponownie ligowany plazmid akceptorowy. SapI zawiera izoschizomer, BspQI, który może nie wymagać tego ostatniego etapu trawienia.</li>
		<li>Przekształcić 5 μL reakcji GG w 50 μL chemicznie kompetentnych komórek E. coli i przeprowadzić transformację termiczną, najlepiej z etapem odzyskiwania, jak w kroku 1.2.3.</li>
		<li>Płyta 100 μL wychodu przemiany na płytce agarowej LB z ampicyliną 100 μg/mL. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dla każdej z nich należy uprawiać dwie białe kolonie, zbierając część materiału z kolonii końcówką pipety i zawieszając ją ponownie w 5 mL podłoża LB z 100 μg/mL ampicyliny każda. Inkubuj przez noc w 37 °C w inkubatorze potrząsającym o 250 obr./min. Wykonaj ekstrakcję plazmidową kolumną zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Potwierdź poprawność montażu za pomocą digestu restrykcyjnego z BbsI, sprawdzając, czy rozmiar wycięcia odpowiada oczekiwanemu rozmiarowi wkładki. Trawić 1000 ng DNA plazmidowego, dodając 1 μL odpowiedniego buforu trawienia 10x oraz 1 μL BbsI. Dodaj wodę wolną od nukleazy do całkowitej objętości 10 μL. Inkubuj reakcję w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
		<li>Wykonaj elektroforezę żelową, ładując strawiony plazmid na żel agarozowy o stężeniu 1%, a następnie uruchom żel na napięciu 100 V przez 35 minut. UWAGA: Można przeprowadzić in silico trawienie oczekiwanego plazmidu w celu symulacji żelu agarozowego i przewidzenia wyniku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Poziom M: Montaż operonu policistronicznego
UWAGA: W tym etapie składany jest operon policistronny. W przedstawionym przypadku operonu bizystronicznego, dwa wkłady poziomu 1 są montowane na pozycjach 1 i 2. W związku z tym wybiera się akceptorowy plazmid pMA60. Ponadto wymagany jest link końcowy. Wszystkie plazmidy akceptorowe poziomu M i P mają nawis GGGA jako drugi przewis. Końcowe łączniki łączą wstawkę i plazmid akceptora oraz umożliwiają montaż konstrukcji poziomu P w poziomie M i odwrotnie. Dla zespołu poziomu P składającego się z dwóch wstawek poziomu 1 używany jest łącznik końcowy pMA668, który zajmuje trzecią i ostatnią pozycję. Przegląd poziomów M i P oraz wizualizacja etapu klonowania przedstawiono na Rysunku 3. Przy montażu wyłącznie na poziomie M (lub P) można sklonować operony do 6 sekwencji kodujących (pozycje 1-6). Pozycja 7 jest zajmowana przez końcowego łącznika. Możliwe jest złożenie większej liczby sekwencji kodujących w operonie, ale wymaga cyklicznego przejścia do poziomu M (lub P), który nie jest opisany w tym protokole.
<ol>
	<li>Do reakcji GG dodaj 50 fmol każdej pożądanej insetki, 50 fmol plazmidu akceptorowego, 1 μL buforu ligazy DNA 10x T4, 1 μL ligazy T4 oraz 1 μL BbsI. Dodaj wodę wolną od nukleazy do całkowitej objętości 10 μL.</li>
	<li>Uruchom następujący program w termocyklerze: 50 cykli 37 °C przez 3 minuty i 16 °C przez 4 minuty, następnie końcowe trawienie w 50 °C przez 20 minut i inaktywacja enzymów termiczną w 80 °C przez 20 minut6 minut.</li>
	<li>Przekształcić 5 μL reakcji GG w 50 μL chemicznie kompetentnych komórek E. coli i przeprowadzić transformację szokową z etapem odzyskiwania, jak w kroku 1.2.3.</li>
	<li>Rozproszyć 100 μL wyrastku transformacyjnego na płytkę agarową LB z 100 μg/mL spektromycyny. Inkubuj płytkę przez noc w 37 °C lub w 30 °C, jeśli spodziewasz się obciążenia metabolicznego lub toksyczności zespołu.</li>
	<li>Dla każdego zgromadzenia stwórz kulturę z dwóch białych kolonii. W tym celu zanurz końcówkę pipety w kolonii i użyj jej do inokulacji 5 mL LB 100 μg/mL spektrinomycyny. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C lub 30 °C w inkubatorze potrząsającym przy 250 obr./min. Wykonaj ekstrakcję plazmidową kolumną zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Potwierdź poprawne składanie za pomocą digestu restrykcyjnego z BsaI, sprawdzając, czy rozmiar wycięcia odpowiada oczekiwanemu rozmiarowi wkładki, jak wykonano w kroku 2.2.7. UWAGA: Konstrukcja może być zbyt długa, by potwierdzić ją sekwencjonowanie Sangera. Można to następnie potwierdzić za pomocą sekwencjonowania całego plazmidu, które jest dostępne jako komercyjna usługa od kilku dostawców usług sekwencjonowania.</li>
</ol>

<ol><li>James, J. S., Dai, J., Chew, W. L., Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+and+engineering+of+synthetic+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The design and engineering of synthetic genomes.</a> Nat Rev Genet. 1, 1-22 (2024).</li>
<li>Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+cloning+system+for+standardized+assembly+of+multigene+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs.</a> PLoS One. 6 (2), e16765(2011).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), e3647(2008).</li>
<li>Pingoud, A., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+type+II+restriction+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structure and function of type II restriction endonucleases.</a> Nucleic Acids Res. 29 (18), 3705-3727 (2001).</li>
<li>Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golden+Gate+shuffling%3A+A+one-pot+DNA+shuffling+method+based+on+type+IIs+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Golden Gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes.</a> PLoS One. 4 (5), e5553(2009).</li>
<li>de Vries, S. T., Kley, L., Schindler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+Golden+Gate+plasmid+set+enabling+scarless+MoClo-compatible+transcription+unit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Golden+Gate+Cloning%3A+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Use of a Golden Gate plasmid set enabling scarless MoClo-compatible transcription unit assembly.</a> Golden Gate Cloning: Methods Protoc. 2850, 105-132 (2024).</li>
<li>de Vries, S. T., Köbel, T. S., Sanal, A., Schindler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-%26+Out-Cloning%3A+Plasmid+toolboxes+for+scarless+transcription+unit+and+modular+Golden+Gate+acceptor+plasmid+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">In-& Out-Cloning: Plasmid toolboxes for scarless transcription unit and modular Golden Gate acceptor plasmid assembly.</a> Synth Biol. 9 (1), ysae016(2024).</li>
<li>Schindler, D., Milbredt, S., Sperlea, T., Waldminghaus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+assembly+of+DNA+sequence+libraries+for+chromosomal+insertion+in+bacteria+based+on+a+set+of+modified+MoClo+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Design and assembly of DNA sequence libraries for chromosomal insertion in bacteria based on a set of modified MoClo vectors.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1362-1368 (2016).</li>
<li>Zumkeller, C., Schindler, D., Felder, J., Waldminghaus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+assembly+of+synthetic+secondary+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Bacterial+Chromatin%3A+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Modular assembly of synthetic secondary chromosomes.</a> Bacterial Chromatin: Methods Protoc. 2819, 157-187 (2024).</li>
<li>Hoffmann, S. A. YeastFab cloning of toxic genes and protein expression optimization in yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoffmann%2C+SA+%22Golden+Gate+Cloning%3A+Methods+and+Protocols%22">Golden Gate Cloning: Methods and Protocols</a>. , Springer, New York. (2025).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-evaluation+of+E.+coli%27s+operon+structures+via+a+whole-cell+model+suggests+alternative+cellular+benefits+for+low-+versus+high-expressing+operons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Cross-evaluation of E. coli's operon structures via a whole-cell model suggests alternative cellular benefits for low- versus high-expressing operons.</a> Cell Syst. 15 (3), 227-245.e7 (2024).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+stoichiometry+control+of+bacterial+operons+revealed+by+deep+proteome+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Multifaceted stoichiometry control of bacterial operons revealed by deep proteome quantification.</a> Front Genet. 10, 1-12 (2019).</li>
<li>Müntjes, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+polycistronic+expression+in+the+model+microorganism+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Establishing polycistronic expression in the model microorganism Ustilago maydis.</a> Front Microbiol. 11, 1-10 (2020).</li>
<li>Behrendt, G., Frohwitter, J., Vlachonikolou, M., Klamt, S., Bettenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymo-Parts%3A+A+Golden+Gate+modular+cloning+toolbox+for+heterologous+gene+expression+in+Zymomonas+mobilis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Zymo-Parts: A Golden Gate modular cloning toolbox for heterologous gene expression in Zymomonas mobilis.</a> ACS Synth Biol. 11 (11), 3855-3864 (2022).</li>
<li>Green, R., Rogers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+transformation+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chemical transformation of E. coli.</a> Methods Enzymol. 529, 329-336 (2013).</li>
<li>Köbel, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy-to-use+plasmid+toolset+for+efficient+generation+and+benchmarking+of+synthetic+small+RNAs+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">An easy-to-use plasmid toolset for efficient generation and benchmarking of synthetic small RNAs in bacteria.</a> ACS Synth Biol. 11 (9), 2989-3003 (2022).</li>
<li>Meyer, A. J., Segall-Shapiro, T. H., Glassey, E., Zhang, J., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+%26%2334%3BMarionette%26%2334%3B+strains+with+12+highly+optimized+small-molecule+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli &#34;Marionette&#34; strains with 12 highly optimized small-molecule sensors.</a> Nat Chem Biol. 15 (2), 196-204 (2019).</li>
<li>Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+design+of+synthetic+ribosome+binding+sites+to+control+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression.</a> Nat Biotechnol. 27 (10), 946-950 (2009).</li>
<li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+582+natural+and+synthetic+terminators+and+quantification+of+their+design+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints.</a> Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).</li>
<li>Togna, A. P., Shuler, M. L., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+plasmid+copy+number+and+runaway+plasmid+replication+on+overproduction+and+excretion+of+beta-lactamase+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Effects of plasmid copy number and runaway plasmid replication on overproduction and excretion of beta-lactamase from Escherichia coli.</a> Biotechnol Prog. 9 (1), 31-39 (1993).</li>
<li>Messerschmidt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+characterization+of+the+synthetic+secondary+chromosome+synVicII+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optimization and characterization of the synthetic secondary chromosome synVicII in Escherichia coli.</a> Front Bioeng Biotechnol. 4, 1-9 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Klonowanie molekularne może być czasochłonne i uciążliwe, zwłaszcza przy strategiach ad hoc klonowania. Zestawy narzędzi MoClo mogą poprawić klonowanie molekularne dzięki swojej modułowości, hierarchicznemu montażowi oraz wysoce wydajnym reakcjom w jednym garnku. Polegają na montażu DNA poprzez reakcje Golden Gate. Dzięki standaryzowanym zwisom biblioteki części molekularnych mogą być ponownie wykorzystywane i udostępniane innym 3,6. Wielokrotne używanie...

Klonowanie molekularne, czyli wprowadzenie rekombinowanego DNA do replikonu, takiego jak plazmid, jest podstawową metodologią w biologii molekularnej. Metody konstrukcyjne i montażowe DNA stały się w ostatnich dekadach coraz bardziej zaawansowane. Obecnie naukowcy potrafią zbudować całe syntetyczne chromosomy, a nawet genomy z syntetyzowanego DNA1. Tradycyjne klonowanie molekularne często opiera się na strategiach ad hoc klonowania i może być żmudne oraz kosztowne dla dużych, wielogenowych konstrukcji2. W ostatnich latach klonowanie Golden Gate (GG) oraz wyprowadzone hierarchiczne zestawy klonowania modułowego (MoClo) 2,3 stały się popularnymi rozwiązaniami umożliwiającymi efektywne i czasowo oszczędne składanie DNA.
Enzymy restrykcyjne typu IIS to endonukleazy, które rozpoznają sekwencję kierunkową (niepalindromiczną) i rozcinają ją poza sekwencją rozpoznawczą4. W rezultacie sekwencje przesahu utworzone przez rozszczepienie nie zależą od miejsca rozpoznania, ale mogą być wybrane4. Ponadto funkcjonalne fragmenty DNA, tutaj nazywane "częściami", mogą być zaprojektowane tak, aby cięcie usuwało miejsce rozpoznania z końców częścido łączenia 2. Strategie klonowania GG wykorzystują to, umożliwiając efektywne wieloczęściowe zespoły DNA w reakcjach jednogarniczkowych5. Zestawy narzędzi MoClo opierają się na klonowaniu GG i mają na celu zapewnienie modułowego i hierarchicznego sposobu składania wielogenowych konstrukcji. Nawisy używane do montażu części są standaryzowane, co pozwala na tworzenie bibliotek wielokrotnego użytku i wymiennych części. Zestawy narzędzi MoClo opierają się na plazmidach akceptorowych, które są zaprojektowane tak, aby przyjmować wiele sekwencji DNA i uwalniać złożony produkt. Każdy plazmid akceptorowy zawiera dwa miejsca rozpoznania dwóch różnych enzymów typu IIS, z których jedno służy do przyjmowania ładunku DNA, a drugie do uwalniania złożonego DNA 3,6. Ilustrację tej zasady pokazano na Rysunku 1 dla klonowania pojedynczej części, terminatora, do plazmidu akceptora MoClo (poziom 0). Zarówno plazmid akceptorowy, jak i wkładka są przecięte przez enzym restrykcyjny BbsI, w taki sposób, że pozostawia kompatybilne zwisy i usuwa miejsca rozpoznawcze BbsI. Prawidłowo ligowane plazmidy nie są już przecięte przez BbsI. Przecięcie powstałego plazmidu enzymem typu IIS SapI uwalnia wcześniej włożony fragment w kolejnym etapie montażu (poziom 1).
W tym protokole używany jest zestaw narzędzi MoClo do klonowania i wejścia 7. Tutaj plazmidy poziomu 0 zawierają zdefiniowane fundamentalne części genetyczne, takie jak promotory z 5' nieprzetłumaczonymi regionami (UTR), sekwencje kodujące oraz terminatory z 3' UTR. Rysunek 1 przedstawia schematyczny przegląd poziomu 0. Na poziomie 1 wiele części jest składanych w jednostkę transkrypcyjną (TU), a Rysunek 2 przedstawia schemat części poziomu 1 oraz klonowania. Klonowanie wewnętrzne i zewnętrzne MoClo został zaprojektowany do bezbliznowatego montażu jednostek transkrypcji na poziomie 1 poprzez wykorzystość enzymu typu IIS, który tworzy przewisy 3-nukleotydowe. Pozwala to na pełne umieszczenie przepustów w rasterze kodon sekwencji kodującej, wykorzystując startowe kodony ATG i TGA stop do montażu. Poziomy M i P służą do składania wielu jednostek transkrypcyjnych uwalnianych z plazmidów poziomu 1 3,8. Rysunek 3 przedstawia schematyczny przegląd części przeznaczonych do klonowania na poziom M i P oraz montaż operonu bizystronicznego na poziomie M (operon bizystronizowy to jednostka transkrypcyjna, która wyraża wiele sekwencji kodujących (CDS)). Poziom P i M zostały zaprojektowane tak, aby umożliwiać iteracyjne przechodzenie od jednego do drugiego, tak że nie ma teoretycznego ograniczenia liczby części, które można złożyć, jednak nie jest to opisane w tym protokole, ponieważ głównym celem protokołu jest pokazanie montażu operonu bizystronicznego. Chociaż nie ma ograniczenia liczby części, które można złożyć, istnieje ograniczenie rozmiaru konstrukcji, którą można złożyć; do 100 000 bp zostało zmontowanych przy użyciu zestawuMoClo 9. Ponadto duże konstrukty lub konstrukcje zawierające toksyczne geny mogą stanowić obciążenie dla komórki; dla tych przypadków opublikowano zmodyfikowane protokoły10.
In- and Out-Cloning początkowo nie opisywał schematu składania jednostek transkrypcji policistronnych. Operony policystroniczne są bardzo powszechnym trybem organizacji genów ubakterii 11,12,13, dlatego budzi duże zainteresowanie ich modułowym układem oddolnym14. Tutaj opisano strukturalny schemat składania operonów policistronnych z użyciem klonowania wejścia i wyjścia. Przedstawiony schemat umożliwia łatwą zamianę pozycji sekwencji kodujących w jednostkach transkrypcji policistronnej, a także zespołów składających się zarówno z transkrypcji mono- jak i policistronnej.
Poniższy protokół krok po kroku pokazuje projektowanie i klonowanie operonu policistronnego za pomocą klonowania wejścia i wyjścia. Przedstawioną strategię klonowania jednostek transkrypcji policistronnych można łatwo dostosować do innych zestawów narzędzi MoClo.

<table><tbody><tr><td>Ampicylina</td><td>Merck Life Science</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Agar bakteryjny</td><td>Fisher Scientific &nbsp;</td><td>P0011B</td><td></td></tr><tr><td>BbsI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3539</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF V2</td><td>New England Biolabs</td><td>R3733</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5&alpha; Komórki kompetentne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Mastercycler&nbsp; Nexus Thermal Cyclers</td><td>Eppendorf</td><td>6333000014</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr mikroobjętościowy EzDrop 1000</td><td>Blue-Ray Biotech</td><td>BRED-1000</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep GeneJET Plazmid Miniprep</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>In- & Out- Zestaw narzędzi do klonowania</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor ligazowy</td><td>New England Biolabs</td><td>B0216</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific &nbsp;</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova&reg; &nbsp; 42/42R - Układany inkubator shaker</td><td>Eppendorf</td><td>M1335-0080</td><td></td></tr><tr><td>PhenoBooth+</td><td>Instrumenty śpiewane</td><td>PHB-007</td><td></td></tr><tr><td>SapI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0569</td><td></td></tr><tr><td>Spektromycyna</td><td>Merck Life Science</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe naczynia laboratoryjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Thermomix MM</td><td>B. Braun Biotech International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Fisher Scientific &nbsp;</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Fisher Scientific &nbsp;</td><td>LP0021B</td><td></td></tr></tbody></table>

standaryzowany modułowy montaż operonów policistronnych z klonowaniem modularnym (moclo) z wykorzystaniem zestawu narzędzi in-cloning

Standardized Modular Assembly of Polycistronic Operons with Modular Cloning (MoClo) using the In-Cloning toolkit

Zestawy narzędzi klonowania modularnego (MoClo) umożliwiają szybkie składanie konstrukcji wielogenowych. Opierają się na klonowaniu Golden Gate, które wykorzystuje enzymy restrykcyjne typu IIS, które wykraczają poza miejsce rozpoznania. Ponieważ rozpoznawanie i sekwencja cięcia są rozdzielone, można celowo wybierać zwisy utworzone przez enzymy restrykcyjne typu IIS, a strategie klonowania zazwyczaj uniemożliwiają cięcie prawidłowo połączonych fragmentów DNA. Pozwala to na bardzo efektywne złożenie wielu fragmentów DNA w jednej reakcji. W MoClo indywidualne funkcjonalne części DNA, takie jak promotory, miejsca wiązania rybosomów, sekwencje kodujące i terminatory, a także zespoły wyższego rzędu, otrzymują standaryzowane zwisy, dzięki czemu można tworzyć wielokrotnego użytku biblioteki części. Większość bakteryjnych zestawów narzędzi MoClo jest zaprojektowana do klonowania monocistronnych jednostek transkrypcyjnych i nie zapewnia uporządkowanej ścieżki do składania operonów policistronnych. Protokół ten demonstruje montaż jednostek transkrypcji policistronnych za pomocą zestawu narzędzi In- & Out-Cloning . To samo podejście można przenieść na inne zestawy narzędzi MoClo.

Tutaj przedstawiono wyniki oddolnego zespołu operonu policistronnego od poziomu 0 do poziomu M (rysunek S1). Operon inicjuje się od promotoraP-LuxB, który może być aktywowany przez białko LuxR w obecności związku induktorowego N-(β-ketokaproyl)-L-homoserynowego laktonu (OC6)17. GFP jest pierwszym CDS operonu, jego RBS to iGEM BBa_B0064. GFP następuje łącznik nieterminalny, zwany "mostkiem terminatora". Drugi RBS jest zaprojektowany przez kalkulator RBS...

Niniejszy artykuł przedstawia krok po kroku protokół demonstrujący, jak klonowanie modułowe (MoClo) można dostosować do klonowania operonów policistronnych.

Standaryzowany modułowy montaż operonów policistronnych z klonowaniem modularnym (MoClo) z wykorzystaniem zestawu narzędzi In-Cloning

Modular Cloning (MoClo) toolkits enable the rapid assembly of multigene constructs. They are based on Golden Gate cloning, which uses Type IIS restriction ...

Opracowałem metody pozwalające na modułowe składanie DNA od małych, pojedynczych części molekularnych aż po konstrukcje o rozmiarze chromosomów oraz na przeprogramowanie komórek za pomocą tych sztucznych chromosomów. Jedną z ważnych innowacji w tej dziedzinie jest opracowanie modułowych zestawów narzędzi klonowania, które umożliwiają modułowe składanie wielogenowych konstrukcji z biblioteki standaryzowanych części molekularnych. Modułowe zestawy narzędzi klonowania są zazwyczaj projektowane do klonowania monocistronnych jednostek transkrypcyjnych.Protokół ten demonstruje uogólniony sposób składania jednostek transkrypcji policistronnych za pomocą zestawu narzędzi do klonowania w środku. Ta strategia klonowania jednostki transkrypcji policistronnej pozwala na elastyczne wykorzystanie sekwencji kodujących zarówno w pojedynczej jednostce transkrypcji, jak i w układach policistronnych. Aby zacząć, wybierz części poziomu 0, które zostaną złożone w jednostkę transkrypcyjną.Muszą one obejmować co najmniej RBS, sekwencję kodującą oraz terminator. Wybierz pozycję, w której jednostka transkrypcji zostanie złożona w operonie. Na podstawie wybranej pozycji wybierz odpowiedni plazmid akceptorow

standardized-modular-assembly-polycistronic-operons-with-modular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film opisuje BiFC-PALM ― połączenie fotoaktywowanej mikroskopii lokalizacyjnej i dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji ― do oceny interakcji białko-białko. BiFC polega na fuzji dwóch fluorescencyjnych fragmentów białek z dwoma oddziałującymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Kiedy te dwa białka wchodzą w interakcję, fragmenty są zbliżane do siebie, co pozwala obu częściom połączyć się i odtworzyć funkcjonalne białko fluorescencyjne. Fluorescencja pojedynczego fluoroforu...

Mikroskopia lokalizacji fotoaktywowanej sprzężona z fluorescencją fluorescencji bimolekularnej

Kompleksy białkowe katalizują kluczowe funkcje komórkowe. Szczegółowa charakterystyka funkcjonalna i strukturalna wielu istotnych kompleksów wymaga produkcji rekombinowanej. MultiBac to system komórkowy bakulowirusa/owadów specjalnie przystosowany do ekspresji białek eukariotycznych i ich kompleksów. MultiBac został wdrożony jako platforma o otwartym dostępie, a standardowe procedury operacyjne zostały opracowane w celu maksymalizacji jego użyteczności.

Platforma do produkcji kompleksu białkowego MultiBac w EMBL

Synteza niestandardowych plazmidów jest pracochłonna i czasochłonna. Protokół ten opisuje zastosowanie klonowania zespołu Gibsona w celu zmniejszenia pracy i czasu trwania niestandardowej procedury klonowania DNA. Opisany protokół pozwala również na uzyskanie wiarygodnych znakowanych konstruktów białkowych do ekspresji ssaków przy podobnych kosztach jak w przypadku tradycyjnego klonowania DNA metodą "wytnij i wklej".

Generowanie wektorów plazmidowych eksprymujących białka znakowane FLAG pod regulacją promotora ludzkiego czynnika wydłużenia-1α przy użyciu zespołu Gibsona

Interakcje białko-białko są wizualizowane w komórkach z nanometrową rozdzielczością przestrzenną poprzez połączenie dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji (BiFC) z fotoaktywowaną mikroskopią lokalizacyjną (PALM). Opisano tutaj zastosowanie BiFC-PALM do obrazowania oddziaływań Ras-Raf w komórkach U2OS do wizualizacji klastrowania i dyfuzji w nanoskali poszczególnych kompleksów Ras-Raf.

Fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna z dwucząsteczkową komplementacją fluorescencji (BiFC-PALM)

Opisujemy system oocytów i czapeczek zwierzęcych Xenopus do klonowania ekspresji genów zdolnych do wywołania odpowiedzi w kompetentnej ektodermie i omawiamy techniki późniejszej analizy takich genów. System ten jest przydatny w funkcjonalnej identyfikacji szerokiej gamy produktów genowych.

Klonowanie funkcjonalne przy użyciu systemu ekspresji oocytów Xenopus

Tutaj prezentowany jest zautomatyzowany przepływ pracy do wykonywania modułowego montażu "urządzenia" DNA przy użyciu modułowej metody klonowania DNA na robotach obsługujących ciecze. Protokół wykorzystuje intuicyjne narzędzie programowe do generowania list wyboru osób zajmujących się cieczami do kombinatorycznego generowania biblioteki urządzeń DNA, które demonstrujemy za pomocą dwóch platform do obsługi cieczy.

Zautomatyzowany zrobotyzowany montaż modułowych urządzeń DNA do obsługi cieczy

Tutaj prezentujemy protokół opisujący, jak i) złożyć samoreplikujący się wektor za pomocą modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate, ii) wprowadzić wektor do sinicowego gospodarza przez koniugację, oraz iii) scharakteryzować transgeniczne szczepy sinic za pomocą czytnika płytek lub cytometrii przepływowej.

Modyfikacja genetyczna cyjanobakterii przez koniugację przy użyciu modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowego, krok po kroku przewodnika do tworzenia konstruktów wielogenowych za pomocą modułowego systemu klonowania opartego na klonowaniu Golden Gate. Zawiera również zalecenia dotyczące krytycznych kroków, aby zapewnić optymalny montaż w oparciu o nasze doświadczenia.

Szybkie składanie konstruktów wielogenowych przy użyciu modułowego klonowania Golden Gate

Badanie opisuje protokół tworzenia dużych (μg-mg) ilości DNA do kampanii przesiewowych białek z syntetycznych fragmentów genów bez klonowania lub używania żywych komórek. Minimalny szablon jest trawiony enzymatycznie i okrężny, a następnie amplifikowany za pomocą izotermicznego amplifikacji tocznego koła. Bezkomórkowe reakcje ekspresji można przeprowadzić z nieoczyszczonym produktem.

Szybkie, enzymatyczne metody amplifikacji minimalnych, liniowych matryc do prototypowania białek przy użyciu systemów bezkomórkowych

Adaptowalny moduł klonowania molekularnego Gibson Assembly został wykorzystany w formacie kursu opartego na kursie licencjackim (CURE) dla studentów kursów laboratoryjnych biologii molekularnej. Ocena efektów uczenia się studentów wykazała lepsze zrozumienie i pewność siebie w klonowaniu molekularnym po ukończeniu CURE, a nowe plazmidy sklonowano do badań nad biosyntezą produktów naturalnych.

Poprawa wyników studentów dzięki adaptacyjnemu doświadczeniu badawczemu na studiach licencjackich opartym na kursie klonowania molekularnego

Poznaj metodę montażu operonów policistronowych za pomocą klonowania modularnego MoClo z zestawem narzędzi In-Cloning. Ten protokół umożliwia elastyczne łączenie sekwencji kodujących w wielogenowych konstruktach.

Standaryzowany modułowy montaż operonów policistronnych z klonowaniem modularnym (MoClo) z wykorzystaniem zestawu narzędzi In-Cloning (Wideo) | JoVE Journal

Standaryzowany modułowy montaż operonów policistronnych z klonowaniem modularnym (MoClo) z wykorzystaniem zestawu narzędzi In-Cloning

Przeglądaj więcej filmów