Name: Kompleksowa analiza płytek krwi prokoagulantów wykazujących cechy martwicy, apoptozy i aktywacji płytek krwi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: Poznaj metodę analizy prokoagulantnych płytek krwi wykazujących cechy martwicy i apoptozy. Ta technika umożliwia identyfikację biomarkerów zakrzepicy oraz ocenę ryzyka trombotycznego w stanach prozakrzepowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Paresh P. Kulkarni i Keith R. McCrae, odpowiednio, dziękują za stypendium i pilota ufundowane przez VeloSano, Cleveland Clinic Foundation.

Ludzcy uczestnicy zostali zrekrutowani do badania w celu pobrania krwi z żył obwodowych po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody, ściśle przestrzegając zaleceń i zgody Institutional Review Board of Cleveland Clinic Lerner Research Institute, przy czym wszystkie metodologie badań były zgodne ze standardami określonymi w Deklaracji Helsińskiej. Uwzględniono zdrowych dorosłych uczestników w wieku powyżej 18 lat, podczas gdy osoby poniżej 18 roku życia, osoby z niedawną historią zdarzeń zakrzepowych w ciągu ostatnich sześciu miesięcy, osoby z historią alkoholizmu lub nadużywania narkotyków oraz uczestnicy, którzy stosowali leki przeciwpłytkowe lub przeciwzakrzepowe w ciągu ostatnich czterech tygodni, zostali wykluczeni. Szczegółowy opis materiałów i odczynników użytych w protokołach znajduje się w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie płytek krwi
<ol>
	<li>Pobrać próbki krwi z żył obwodowych do antykoagulantu ACD (1:9 v/v) od ludzi po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody, ściśle przestrzegając zaleceń zatwierdzonych przez Institutional Review Board.</li>
	<li>Odwirować krew zebraną w ACD w stężeniu 100 x g przez 20 minut w temperaturze 22 °C w celu uzyskania osocza bogatopłytkowego (PRP) jako supernatantu.</li>
	<li>Odwirować PRP przy 800 x g przez 7 minut w temperaturze 22 °C po dodaniu 3 μM PGE1 i 2 mM EDTA.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad płytek krwi w buforze A (patrz tabela materiałów) przez delikatne pipetowanie.</li>
	<li>Odwirować płytki krwi zawieszone w buforze A o stężeniu 800 x g przez 7 minut w temperaturze 22 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad płytek krwi w buforze B (patrz tabela materiałów) przez delikatne pipetowanie.</li>
	<li>Dostosuj końcową liczbę płytek krwi do 1 × 107/ml za pomocą automatycznego licznika komórek. 
	UWAGA: Wszystkie czynności należy wykonywać w sterylnych warunkach i należy podjąć środki ostrożności w celu utrzymania płytek krwi w stanie spoczynku, unikając narażenia na nadmierne ścinanie podczas pipetowania.</li>
</ol>
2. Analiza prokoagulantów płytek krwi za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Uzupełnij umyte ludzkie płytki krwi 2,5 mM wapnia (0,5 μl podstawowego roztworu CaCl2 0,5 M w 100 μl zawiesiny płytek krwi).</li>
	<li>Utrzymuj jedną frakcję płytek krwi niestymulowaną, a pozostałe frakcje stymuluj trombiną (0,1 U/ml, 0,25 U/ml, 0,5 U/ml), kondroksyną (20 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/ml) lub ich kombinacją przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po stymulacji dodać po 1 μl PE-aneksyny V, FITC-PAC1 i APC-przeciwciała anty-ludzkiego CD62P do 100 μl stymulowanych zawiesin płytkowych.</li>
	<li>Płytki krwi inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Utrwalić płytki krwi, dodając równą objętość (1:1) 2% formaliny.</li>
	<li>Przeanalizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej, aby określić ilościowo płytki krwi prokoagulantu15,16.</li>
	<li>Narysuj amorficzną bramę, która obejmie płytki krwi, oddzielając je od szumu i cząstek wielopłytkowych.</li>
	<li>Zbierz wszystkie dane dotyczące fluorescencji za pomocą czterokwadrantowej amplifikacji logarytmicznej dla 10 000 zdarzeń w bramce płytek krwi z każdej próbki.</li>
	<li>Zdefiniuj regiony dla płytek krwi na podstawie dodatniej lub ujemnej fluorescencji dla ekspozycji na fosfatydyloserynę (PS) (wiązanie Aneksyny V), ekspresji selektyny P (CD62P) i aktywacji integryny αIIbβ3 (wiązanie PAC1).</li>
	<li>Rozważ płytki krwi dodatnie zarówno dla ekspozycji PS (wiązanie aneksyny V), jak i ekspresji selektyny P (CD62P), ale ujemne dla aktywacji integryny αIIbβ3 (wiązanie PAC1) jako prokoagulantów płytek krwi (<silna klasa = "xfig">Figura 1) (Tabela 1).</li>
	<li>Podobnie, rozważ płytki krwi dodatnie zarówno dla aktywacji integryny αIIbβ3 (wiązanie PAC1) i ekspresji selektyny P (CD62P), ale ujemne dla ekspozycji na PS (wiązanie Aneksyny V) jako proagregacyjne płytki krwi. 
	UWAGA: Płytki krwi ujemne zarówno dla aktywacji integryny αIIbβ3 (wiązanie PAC1), jak i ekspresji selektyny P (CD62P), ale dodatnie dla ekspozycji PS (wiązanie Aneksyny V) to prawdopodobnie apoptotyczne płytki krwi15,16.</li>
</ol>
3. Analiza mitochondrialnego wapnia metodą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Rozcieńczyć przemyte ludzkie płytki krwi do 1 × 106/ml i uzupełnić 2,5 mM wapnia (0,5 μl podstawowego roztworu CaCl2 0,5 M w 100 μl zawiesiny płytek krwi).</li>
	<li>Oznacz płytki krwi 5 μM Rhod-2 AM (dla mitochondrialnego wapnia) przez 30 minut w ciemności.</li>
	<li>Odpowiednio dobierać płytki krwi, jak opisano w kroku 2.</li>
	<li>Analizuj zdarzenia w bramce płytek krwi pod kątem zależnych od czasu zmian średniej fluorescencji nabytych zdarzeń w ciągu 5 minut, używając wykresu rozproszenia gęstości fluorescencji PE (dla Rhod-2 AM) w funkcji czasu.</li>
	<li>Zapisuj wyjściowy poziom wapnia przez pierwsze 1 minutę.</li>
	<li>Dodaj trombinę (0,1 U/ml, 0,25 U/ml lub 0,5 U/ml), kondroksynę (20 ng/mL, 50 ng/ml lub 100 ng/ml) lub ich kombinację i kontynuuj zbieranie danych dla kolejnych 4 min17.</li>
</ol>
4. Analiza potencjału błony mitochondrialnej metodą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Uzupełnij umyte ludzkie płytki krwi 2,5 mM wapnia (0,5 μl podstawowego roztworu CaCl2 0,5 M w 100 μl zawiesiny płytek krwi).</li>
	<li>Utrzymuj jedną frakcję płytek krwi niestymulowaną, a pozostałe frakcje stymuluj trombiną (0,1 U/ml, 0,25 U/ml lub 0,5 U/ml), kondroksyną (20 ng/mL, 50 ng/ml lub 100 ng/ml) lub ich kombinacją przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po stymulacji do stymulowanych zawiesin płytek krwi dodać barwnik znakujący mitochondria (patrz tabela materiałów) o końcowym stężeniu 500 nM.</li>
	<li>Inkubuj płytki krwi przez 30 minut w ciemności.</li>
	<li>Utrwal płytki krwi, dodając równą objętość 2% formaliny.</li>
	<li>Analizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej17.</li>
	<li>Odpowiednio dobierać płytki krwi zgodnie z opisem w kroku 2.</li>
	<li>Analizuj zdarzenia w bramce płytek krwi pod kątem spadku fluorescencji w kanale PE (dla barwnika znakującego mitochondria) cytometru przepływowego.</li>
</ol>
5. Analiza aktywności kaspazy 3 i kaspazy 8 za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Uzupełnij umyte ludzkie płytki krwi 2,5 mM wapnia (0,5 μl podstawowego roztworu CaCl2 0,5 M w 100 μl zawiesiny płytek krwi).</li>
	<li>Utrzymuj jedną frakcję płytek krwi niestymulowaną, a pozostałe frakcje stymuluj trombiną (0,1 U/ml, 0,25 U/ml lub 0,5 U/ml), kondroksyną (20 ng/mL, 50 ng/ml lub 100 ng/ml) lub ich kombinacją przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po stymulacji dodać odczynnik do wykrywania apoptozy w proporcji 1:1000 (v/v) (patrz tabela materiałów) (zarówno dla wewnętrznych, jak i zewnętrznych szlaków apoptozy) lub 1:300 (v/v) FITC-IETD-FMK (dla kaspazy 8 zewnętrznego szlaku apoptozy) do stymulowanych zawiesin płytek krwi.</li>
	<li>Inkubuj płytki krwi przez 30 minut w ciemności.</li>
	<li>Utrwal płytki krwi, dodając równą objętość 2% formaliny.</li>
	<li>Analizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej17.</li>
	<li>Odpowiednio dobierać płytki krwi, jak opisano w kroku 2.</li>
	<li>Analizuj zdarzenia w bramce płytek krwi pod kątem fluorescencji w kanale FITC (dla kaspazy 3/7 lub kaspazy 8) cytometru przepływowego.</li>
</ol>
6. Analiza wiązania protrombiny za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Sprzęż bydlęcą protrombinę z barwnikiem Alexa Fluor 488 za pomocą zestawu do znakowania białek (patrz tabela materiałów), postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Uzupełnić umyte płytki krwi ludzkiej 2,5 mM wapnia (0,5 μL podstawowego roztworu CaCl2 0,5 M w 100 μl zawiesiny płytek krwi).</li>
	<li>Utrzymuj jedną frakcję płytek krwi niestymulowaną, a pozostałe frakcje stymuluj trombiną (0,1 U/ml, 0,25 U/ml lub 0,5 U/ml), kondroksyną (20 ng/mL, 50 ng/ml lub 100 ng/ml) lub ich kombinacją przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po stymulacji dodać sprzężoną z AF488 bydlęcą protrombinę (100 μg/ml) i po 1 μl przeciwciała anty-ludzkiego CD62P PE-aneksyny V i APC do 100 μl stymulowanych zawiesin płytek krwi.</li>
	<li>Utrwal płytki krwi, dodając równą objętość 2% formaliny.</li>
	<li>Analizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej17 w celu ilościowego określenia wiązania protrombiny z płytkami krwi</li>.
	<li>Narysuj bramę amorficzną, która obejmie płytki krwi oddzielone od szumu i cząstek wielopłytkowych.</li>
	<li>Zbierz wszystkie dane dotyczące fluorescencji za pomocą czterokwadrantowej amplifikacji logarytmicznej dla 10 000 zdarzeń w bramce płytek krwi z każdej próbki.</li>
	<li>Narysuj obszary dla płytek krwi z fluorescencją dodatnią lub ujemną dla ekspozycji na PS (wiązanie Aneksyny V), ekspresji selektyny P (CD62P) i protrombiny AF488 (wiązanie protrombiny).</li>
	<li>Określ proporcję wszystkich zdarzeń związanych z płytkami krwi, a także odsetek płytek krwi dodatnich zarówno dla ekspozycji PS (wiązanie aneksyny V), jak i ekspresji selektyny P (CD62P) (płytki prokoagulacji), które są dodatnie dla wiązania protrombiny.</li>
</ol>
7. Analiza wiązania protrombiny za pomocą mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Sprzęż bydlęcą protrombinę z barwnikiem Alexa Fluor 488 za pomocą zestawu do znakowania białek (patrz tabela materiałów), postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Uzupełnić umyte płytki krwi ludzkiej 2,5 mM wapnia (0,5 μL podstawowego roztworu CaCl2 0,5 M w 100 μl zawiesiny płytek krwi).</li>
	<li>Utrzymuj jedną frakcję płytek krwi niestymulowaną, a pozostałe frakcje stymuluj trombiną (0,1 U/ml, 0,25 U/ml lub 0,5 U/ml), kondroksyną (20 ng/mL, 50 ng/ml lub 100 ng/ml) lub ich kombinacją przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po stymulacji dodać sprzężoną z AF488 bydlęcą protrombinę (100 μg/ml) i po 1 μl przeciwciała anty-ludzkiego CD62P PE-aneksyny V i APC do 100 μl stymulowanych zawiesin płytek krwi.</li>
	<li>Utrwal płytki krwi, dodając równą objętość 2% formaliny.</li>
	<li>Utrwalone płytki krwi umieścić na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych za pomocą roztworu zapobiegającego blaknięciu.</li>
	<li>Alternatywnie, powlekaj szkiełka nakrywkowe kolagenem (100 μg/ml) przez 1 godzinę w wilgotnej komorze.</li>
	<li>Zablokować powlekane szkiełka nakrywkowe 0,5% BSA w PBS na 1 godzinę.</li>
	<li>Oznaczyć płytki krwi protrombiną bydlęcą sprzężoną z AF488 (100 μg/ml) i po 1 μl PE-aneksyny V i przeciwciała anty-ludzkiego CD62P APC.</li>
	<li>Pozostaw oznakowane płytki krwi do przylegania przez 20 minut do szkiełek nakrywkowych pokrytych kolagenem.</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe z przylegającymi płytkami krwi przemyć trzykrotnie PBS.</li>
	<li>Utrwal szkiełka nakrywkowe 2% paraformaldehydem przez 1 godzinę.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych za pomocą roztworu zapobiegającego blaknięciu.</li>
	<li>Obserwuj szkiełka pod mikroskopem konfokalnym przy powiększeniu obiektywu 63×.</li>
	<li>Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania Fiji do ilościowego oznaczania fluorescencji.</li>
</ol>
8. Test wytwarzania trombiny zależny od fosfolipidów płytek krwi na podstawie skrzepów
<ol>
	<li>Uzupełnij umyte ludzkie płytki krwi 2,5 mM wapnia (0,5 μl podstawowego roztworu CaCl2 0,5 M w 100 μl zawiesiny płytek krwi).</li>
	<li>Utrzymuj jedną frakcję płytek krwi niestymulowaną, a pozostałe frakcje stymuluj trombiną (0,1 U/ml, 0,25 U/ml lub 0,5 U/ml), kondroksyną (20 ng/mL, 50 ng/ml lub 100 ng/ml) lub ich kombinacją przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 100 μl poddanych działaniu substancji płytek krwi do mieszaniny 50 μl zebranego normalnego osocza i 50 μl roztworu kaolinu o niskim zmętnieniu (20 mg/ml), wstępnie inkubowanego w temperaturze 37 °C przez 5 min.</li>
	<li>Dodać 5 mM CaCl2 do mieszaniny.</li>
	<li>Monitorować tworzenie się skrzepów za pomocą zmętnienia na czytniku mikropłytek, mierząc absorbancję przy 660 nm co 60 s przez 1 godzinę.</li>
</ol>

<ol><li>Munnix, I., Cosemans, J., Auger, J., Heemskerk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+response+heterogeneity+in+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Platelet response heterogeneity in thrombus formation.</a> Thromb Haemost. 102 (12), 1149-1156 (2009).</li>
<li>Heemskerk, J. W. M., Mattheij, N. J. A., Cosemans, J. M. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-based+coagulation%3A+Different+populations%2C+different+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Platelet-based coagulation: Different populations, different functions.</a> J Thromb Haemost. 11 (1), 2-16 (2013).</li>
<li>Podoplelova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+factors+bound+to+procoagulant+platelets+concentrate+in+cap+structures+to+promote+clotting%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Coagulation factors bound to procoagulant platelets concentrate in cap structures to promote clotting.</a> Blood. 128 (13), 1745-1755 (2016).</li>
<li>Mann, K. G., Butenas, S., Brummel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+thrombin+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamics of thrombin formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (1), 17-25 (2003).</li>
<li>Jackson, S. P., Schoenwaelder, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procoagulant+platelets%3A+Are+they+necrotic%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Procoagulant platelets: Are they necrotic.</a> Blood. 116 (12), 2011-2018 (2010).</li>
<li>Hua Vivien Mun Yee, V. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procoagulant+platelets+and+the+pathways+leading+to+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">Procoagulant platelets and the pathways leading to cell death.</a> Semin Thromb Hemost. 41 (04), 405-412 (2015).</li>
<li>Dale, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coated-platelets%3A+An+emerging+component+of+the+procoagulant+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Coated-platelets: An emerging component of the procoagulant response.</a> J Thromb Haemost. 3 (10), 2185-2192 (2005).</li>
<li>Vulliamy, P., Armstrong, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+in+hemostasis%2C+thrombosis%2C+and+inflammation+after+major+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Platelets in hemostasis, thrombosis, and inflammation after major trauma.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (3), 545-557 (2024).</li>
<li>Vulliamy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H4+induces+platelet+ballooning+and+microparticle+release+during+trauma+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Histone H4 induces platelet ballooning and microparticle release during trauma hemorrhage.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (35), 17444-17449 (2019).</li>
<li>Aliotta, A., Bertaggia Calderara, D., Zermatten, M. G., Marchetti, M., Alberio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombocytopathies%3A+Not+just+aggregation+defects-the+clinical+relevance+of+procoagulant+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Thrombocytopathies: Not just aggregation defects-the clinical relevance of procoagulant platelets.</a> J Clin Med. 10 (5), 894(2021).</li>
<li>Kirkpatrick, A. C., Vincent, A. S., Dale, G. L., Prodan, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coated+platelets+predict+stroke+at+30+days+following+TIA%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Coated platelets predict stroke at 30 days following TIA.</a> Neurology. 89 (2), 125-128 (2017).</li>
<li>Kirkpatrick, A. C., Tafur, A. J., Vincent, A. S., Dale, G. L., Prodan, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coated+platelets+improve+prediction+of+stroke+and+transient+ischemic+attack+in+asymptomatic+internal+carotid+artery+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Coated platelets improve prediction of stroke and transient ischemic attack in asymptomatic internal carotid artery stenosis.</a> Stroke. 45 (10), 2995-3001 (2014).</li>
<li>Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+phospholipid+scrambling+by+TMEM16F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F.</a> Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).</li>
<li>Prodan, C. I., Vincent, A. S., Dale, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coated+platelet+levels+correlate+with+bleed+volume+in+patients+with+spontaneous+intracerebral+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Coated platelet levels correlate with bleed volume in patients with spontaneous intracerebral hemorrhage.</a> Stroke. 41 (6), 1301-1303 (2010).</li>
<li>Josefsson, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+report+on+markers+to+distinguish+procoagulant+platelets+from+apoptotic+platelets%3A+Communication+from+the+Scientific+and+Standardization+Committee+of+the+ISTH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Consensus report on markers to distinguish procoagulant platelets from apoptotic platelets: Communication from the Scientific and Standardization Committee of the ISTH.</a> J Thromb Haemost. 21 (8), 2291-2299 (2023).</li>
<li>Kulkarni, P. P., Sonkar, V. K., Gautam, D., Dash, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK+inhibition+protects+against+arterial+thrombosis+while+sparing+hemostasis+through+differential+modulation+of+platelet+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">AMPK inhibition protects against arterial thrombosis while sparing hemostasis through differential modulation of platelet responses.</a> Thromb Res. 196, 175-185 (2020).</li>
<li>Ekhlak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+executioner+MLKL+plays+pivotal+roles+in+agonist-induced+platelet+prothrombotic+responses+and+lytic+cell+death+in+a+temporal+order%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Necroptosis executioner MLKL plays pivotal roles in agonist-induced platelet prothrombotic responses and lytic cell death in a temporal order.</a> Cell Death Differ. 30 (8), 1886-1899 (2023).</li>
<li>Kholmukhamedov, A., Janecke, R., Choo, H. -J., Jobe, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+calcium+uniporter+regulates+procoagulant+platelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial calcium uniporter regulates procoagulant platelet formation.</a> J Thromb Haemost. 16 (11), 2315-2321 (2018).</li>
<li>Choo, H. -J., Saafir, T. B., Mkumba, L., Wagner, M. B., Jobe, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+and+reactive+oxygen+species+regulate+agonist-initiated+platelet+phosphatidylserine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium and reactive oxygen species regulate agonist-initiated platelet phosphatidylserine exposure.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (12), 2946-2955 (2012).</li>
<li>Jobe, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+and+cyclophilin+D+in+platelet+activation+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Critical role for the mitochondrial permeability transition pore and cyclophilin D in platelet activation and thrombosis.</a> Blood. 111 (3), 1257-1265 (2008).</li>
<li>Leytin, V., Allen, D. J., Mykhaylov, S., Lyubimov, E., Freedman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin-triggered+platelet+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Thrombin-triggered platelet apoptosis.</a> J Thromb Haemost. 4 (12), 2656-2663 (2006).</li>
<li>Lopez, J. J., Salido, G. M., Pariente, J. A., Rosado, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin+induces+activation+and+translocation+of+Bid%2C+Bax+and+Bak+to+the+mitochondria+in+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Thrombin induces activation and translocation of Bid, Bax and Bak to the mitochondria in human platelets.</a> J Thromb Haemost. 6 (10), 1780-1788 (2008).</li>
<li>Wolf, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain+functions+in+a+caspase-independent+manner+to+promote+apoptosis-like+events+during+platelet+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Calpain functions in a caspase-independent manner to promote apoptosis-like events during platelet activation.</a> Blood. 94 (5), 1683-1692 (1999).</li>
<li>Kim, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatal+dysfunction+and+disintegration+of+thrombin-stimulated+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Fatal dysfunction and disintegration of thrombin-stimulated platelets.</a> Haematologica. 104 (9), 1866-1878 (2019).</li>
<li>Schoenwaelder, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+pathways+regulate+platelet+phosphatidylserine+exposure+and+procoagulant+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Two distinct pathways regulate platelet phosphatidylserine exposure and procoagulant function.</a> Blood. 114 (3), 663-666 (2009).</li>
<li>Abbasian, N., Millington-Burgess, S. L., Chabra, S., Malcor, J. -D., Harper, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramaximal+calcium+signaling+triggers+procoagulant+platelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">Supramaximal calcium signaling triggers procoagulant platelet formation.</a> Blood Adv. 4 (1), 154-164 (2020).</li>
<li>Le, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inner+activation+gate+controls+TMEM16F+phospholipid+scrambling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">An inner activation gate controls TMEM16F phospholipid scrambling.</a> Nat Commun. 10 (1), 1846(2019).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMEM16F+forms+a+Ca2%2B-activated+cation+channel+required+for+lipid+scrambling+in+platelets+during+blood+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TMEM16F forms a Ca2+-activated cation channel required for lipid scrambling in platelets during blood coagulation.</a> Cell. 151 (1), 111-122 (2012).</li>
<li>Mattheij, N. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+mechanism+of+integrin+closure+in+procoagulant+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dual mechanism of integrin closure in procoagulant platelets.</a> J Biol Chem. 288 (19), 13325-13336 (2013).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrially+mediated+integrin+%CE%B1iIb%CE%B23+protein+inactivation+limits+thrombus+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrially mediated integrin αiIbβ3 protein inactivation limits thrombus growth.</a> J Biol Chem. 288 (42), 30672-30681 (2013).</li>
<li>van Kruchten, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+TMEM16F-dependent+and+TMEM16F-independent+pathways+contribute+to+phosphatidylserine+exposure+in+platelet+apoptosis+and+platelet+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Both TMEM16F-dependent and TMEM16F-independent pathways contribute to phosphatidylserine exposure in platelet apoptosis and platelet activation.</a> Blood. 121 (10), 1850-1857 (2013).</li>
<li>Goelz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+express+adaptor+proteins+of+the+extrinsic+apoptosis+pathway+and+can+activate+caspase-8%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Platelets express adaptor proteins of the extrinsic apoptosis pathway and can activate caspase-8.</a> PLOS ONE. 16 (1), e0244848(2021).</li>
<li>Shlomovitz, I., Speir, M., Gerlic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flipping+the+dogma+-+phosphatidylserine+in+non-apoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Flipping the dogma - phosphatidylserine in non-apoptotic cell death.</a> Cell Commun Signal. 17 (1), 139(2019).</li>
<li>Nadine, J. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coated+platelets+function+in+platelet-dependent+fibrin+formation+via+integrin+%CE%B1IIb%CE%B23+and+transglutaminase+factor+XIII%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Coated platelets function in platelet-dependent fibrin formation via integrin αIIbβ3 and transglutaminase factor XIII.</a> Haematologica. 101 (4), 427-436 (2016).</li>
<li>Michelson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+activation+by+thrombin+can+be+directly+measured+in+whole+blood+through+the+use+of+the+peptide+GPRP+and+flow+cytometry%3A+Methods+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Coagul+Fibrinolysis%22%5BJournal%5D)">Platelet activation by thrombin can be directly measured in whole blood through the use of the peptide GPRP and flow cytometry: Methods and clinical applications.</a> Blood Coagul Fibrinolysis. 5 (1), 121-131 (1994).</li>
<li>Taylor, M. R., Couto, J. R., Scallan, C. D., Ceriani, R. L., Peterson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactadherin+%28formerly+BA46%29%2C+a+membrane-associated+glycoprotein+expressed+in+human+milk+and+breast+carcinomas%2C+promotes+Arg-Gly-Asp+%28RGD%29-dependent+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lactadherin (formerly BA46), a membrane-associated glycoprotein expressed in human milk and breast carcinomas, promotes Arg-Gly-Asp (RGD)-dependent cell adhesion.</a> DNA Cell Biol. 16 (7), 861-869 (1997).</li>
<li>Andersen, M. H., Graversen, H., Fedosov, S. N., Petersen, T. E., Rasmussen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analyses+of+two+cellular+binding+domains+of+bovine+lactadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Functional analyses of two cellular binding domains of bovine lactadherin.</a> Biochemistry. 39 (20), 6200-6206 (2000).</li>
<li>Tan, C. W., Bourcy, M., Pasalic, L., Chen, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+assessment+of+procoagulant+platelets+using+a+dithiol-reactive+probe+functional+disulfide+bonds%3A+Methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry assessment of procoagulant platelets using a dithiol-reactive probe functional disulfide bonds: Methods and protocols.</a> Methods Mol Biol. 1967, 305-321 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów do ujawnienia.

Prokoagulanty płytek krwi wykazują wyraźny i trwały wzrost wewnątrzkomórkowego wapnia po stymulacji26, ale mogą być uzyskiwane przez różne mechanizmy. Są one generowane w wyniku silnej stymulacji agonistycznej kolagenem i trombiną przez odrębne mediatory, w tym przede wszystkim mitochondrialny napływ wapnia18,19 wzdłuż gradientu elektrochemicznego przez wewnętrzną błonę mitochondrialną po indukowanym przez agonistów cytozolowym wzroście wa...

Istnieją co najmniej dwie odrębne populacje aktywowanych płytek krwi1,2. Proagregacyjne płytki krwi charakteryzują się wysoką aktywacją integryn i niską, jeśli w ogóle, ekspozycją na PS. Z drugiej strony, płytki krwi prokoagulacyjne charakteryzują się niską aktywnością integryny i wysoką ekspozycją na PS1,2, zapewniając powierzchnię do składania kompleksów tenazy i protrombinazy3, która jest odpowiednio 105-10 6-krotnie i 300000-krotnie bardziej aktywna niż indywidualny rozpuszczalny czynnik fazowy IXa i Xa4. W ten sposób prokoagulanty znacznie przyspieszają krzepliwość. Interesującym aspektem prokoagulacyjnych płytek krwi jest to, że ich morfologia przypomina pewne cechy "martwicy", takie jak mikropęcherzyki, balonowanie komórki z rozerwaniem cytoszkieletu i utrata integralności błony, a także cechy "apoptozy", takie jak utrata asymetrii fosfolipidów błonowych z ekspozycją na fosfatydyloserynę w ulotce zewnętrznej5, 6. Innymi słowy, prokoagulacyjne tworzenie się płytek krwi może reprezentować formę śmierci komórki w płytkach krwi, aczkolwiek z ważną funkcją fizjologiczną w hemostazie.
Płytki krwi prokoagulacyjne są znacząco związane z zaburzeniami zakrzepowymi. Podczas gdy większość zdrowych osób nie ma krążących prokoagulacyjnych płytek krwi, ~ 30% normalnych płytek krwi dawcy przyjmuje fenotyp prokoagulacyjny ex vivo po ekspozycji na silnych agonistów, takich jak trombina i kolagen7. Krążące prokoagulacyjne płytki krwi były zgłaszane w urazach, gdzie ich tworzenie może odzwierciedlać aktywację przez histon H48,9. Jednak w większości zaburzeń prozakrzepowych zwiększone poziomy prokoagulacyjnych płytek krwi są wykrywane dopiero po stymulacji ex vivo10. Na przykład pacjenci z ostrym udarem mózgu, u których >51,1% płytek krwi zostało przekształconych w płytki krwi proagulacyjne (znane również jako płytki krwi COATed) przez kolagen i trombinę, mieli współczynnik ryzyka nawrotu udaru wynoszący 10,72 w ciągu 30 dni w porównaniu z pacjentami z mniejszym tworzeniem się płytek krwi prokoagulant11. Podobne wyniki uzyskano u pacjentów z przemijającymi atakami niedokrwiennymi i miażdżycą tętnic szyjnych12. Natomiast zaburzenie krzepnięcia Zespół Scotta wynika z mutacji ANO6, która koduje scramblazę fosfolipidową TMEM-16F, prowadząc do niedostatecznej ekspozycji na PS płytek krwi13. Idiopatyczne zaburzenia krzepnięcia krwi i krwawienia wewnątrzczaszkowe mogą być związane ze zmniejszoną zdolnością do wytwarzania proagulacyjnych płytek krwi14.
Stąd, ocena prokoagulacyjnych płytek krwi jest częścią analizy funkcji płytek krwi nie tylko podczas podstawowych badań nad mechanizmami aktywacji płytek krwi i w konsekwencji zakrzepicy i hemostazy, ale także podczas analizy klinicznej ryzyka zakrzepicy lub krwawienia u pacjentów w różnych stanach patologicznych. Panel Międzynarodowego Towarzystwa Zakrzepicy i Hemostazy (ISTH) zalecił stosowanie wiązania aneksyny V i ekspresji selektyny P za pomocą cytometrii przepływowej w celu odróżnienia prokoagulantów od innych subpopulacji płytek krwi15. W artykule omówiono również różne metody, które można wykorzystać do analizy płytek krwi prokoagulujących i apoptotycznych, ale nie opisano ich szczegółowo. Metody te obejmują wykrywanie (1) aktywacji płytek krwi przez PAC1/JonA lub wiązanie fibrynogenu (cytometria przepływowa); (2) wydzielanie alfa-granulek przez ekspresję selektyny P (cytometria przepływowa); (3) Narażenie na PS przez wiązanie aneksyny V z laktadheryną (cytometria przepływowa); (4) utrata integralności błony w wyniku znakowania GSAO (cytometria przepływowa); (5) zmiany morfologiczne, takie jak balonowanie (mikroskopia); (6) wykrywanie aktywacji kaspazy za pomocą testu kaspazy (immunoblotting/luminometria/cytometria przepływowa) lub degradacji substratu cytoszkieletu żelsoliny (immunoblotting); (7) utrata potencjału błony mitochondrialnej przez barwniki wrażliwe na potencjał mitochondriów, takie jak JC-1/Mitotracker (cytometria przepływowa); (8) mitochondrialne wewnętrzne markery apoptozy Bax, Bak i uwalnianie cytochromu c (immunoblotting); (9) funkcja prokoagulacji za pomocą testu wytwarzania trombiny i wiązania czynnika krzepnięcia Xa/Va (cytometria przepływowa, mikroskopia); (10) Cytozolowy i mitochondrialny wzrost wapnia za pomocą fluorescencyjnych barwników wrażliwych na wapń (cytometria przepływowa, fluorometria, mikroskopia).
Niniejsze badanie zagłębia się w kompleksowe protokoły analizy płytek krwi proagulant, jak również odróżnia je od płytek proagregacyjnych i apoptotycznych. Większość opisanych procedur opiera się na cytometrii przepływowej, która ma zalety (1) jest łatwo dostępna i łatwa w użyciu, (2) wymaga małej objętości próbki oraz (3) umożliwia jednoczesne wykrywanie wielu subpopulacji płytek krwi (proagregacyjnych, prokoagulacyjnych i apoptotycznych)15. Te protokoły oparte na cytometrii przepływowej są uzupełnione funkcjonalnymi testami aktywności prokoagulacyjnej opartymi na testach wiązania czynnika krzepnięcia i testach wytwarzania trombiny na podstawie skrzepów.

<table><tbody><tr><td>Roztwór kwaśnego cytrynianu dekstrozy (ACD) (na 1000 ml)</td><td></td><td></td><td>Cytrynian tri-sodu- &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 22 g Kwas cytrynowy-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 8 g Dekstroza-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 24,5 g Woda-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Uzupełnić objętość do 1000 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania białek Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A10235</td><td></td></tr><tr><td>APC Mysz Anti-Human CD62P</td><td>BD Pharmingen</td><td>550888</td><td></td></tr><tr><td>Bydlęca protrombina</td><td>Prolytix</td><td>BCP-1010</td><td></td></tr><tr><td>Bufor A (preparat płytek krwi)</td><td></td><td></td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; M.W&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Połączenie w 1X&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Na 100 ml roztworu 10X HEPES&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 238.30&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 20 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 4.766 g NaCl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 58.44&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 134 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 7.83 g KCl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 74.55&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 2,9 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 216,19 mg MgCl2&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 203.30&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 203,30 mg NaH2PO4&nbsp; &nbsp; &nbsp; 156.01&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 0,34 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 53,04 mg NaHCO3&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 84 01&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 12 mM &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1,01 g Woda do 100 ml po dostosowaniu pH do 6,2 Rozcieńczyć roztwór 10X w stosunku 1:10 (v/v) wodą Milli Q tuż przed przygotowaniem płytek krwi, aby uzyskać roztwór 1X, który należy uzupełnić następującymi &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Połączenie w 1X&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Na 1 ml 1X roztwór EGTA &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1 mM &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Dodaj 10 &mu; L (1:100 v/v) 100 mM EGTA&nbsp; Glukoza &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 5 mM &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Dodaj 5 &mu; L (1:200 v/v) 1 M glukoza PGE1 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 3 &mu; M &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Dodaj 3 &mu; L (1:333 v/v) 1 mM PGE1</td></tr><tr><td>roztwór Bufor B (preparat płytek krwi)</td><td></td><td></td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; M.W&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Połączenie w 1X&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Na 100 ml roztworu 10X HEPES&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 238.30&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 20 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 4.766 g NaCl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 58.44&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 134 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 7.83 g KCl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 74.55&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 2,9 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 216,19 mg MgCl2&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 203.30&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 203,30 mg NaH2PO4&nbsp; &nbsp; &nbsp; 156.01&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 0,34 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 53,04 mg NaHCO3&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 84 01&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 12 mM &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1,01 g Woda do 100 ml po dostosowaniu pH do 7,4 Rozcieńczyć roztwór 10X w stosunku 1:10 (v/v) wodą Milli Q tuż przed przygotowaniem płytek krwi, aby uzyskać roztwór 1X, który należy uzupełnić następującymi &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Połączenie w 1X&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Na 1 ml 1X roztwór Glukoza &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 5 mM &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Dodaj 5 &mu; L (1:200 v/v) 1 M glukozy&nbsp;</td></tr><tr><td>CaCl2 (0,5 M) (na 50 ml)</td><td></td><td></td><td>Masa cząsteczkowa CaCl2,2H2O = 147,02 Rozpuść 3,675 g CaCl2,2H2O w 50 ml Odczynniki do wykrywania kaspazy Milli Q</td></tr><tr><td>CellEvent CellEvent-3/7</td> Green <td>Invitrogen</td><td>C10423</td><td>Odczynnik do wykrywania apoptozy</td></tr><tr><td>Convulxin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-350-100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M; pH 8) (Na 100 ml)</td><td></td><td></td><td>Masa cząsteczkowa EDTA Na2.2H2 O: 372,24 g Zważyć 18,612 g i zawiesić w 50 ml wody Milli Q i sprawdzić pH (pH ~ 4) Powoli dodawać 10 N NaOH mieszając i monitorować pH. EDTA zaczyna rozpuszczać się przy pH około 7 i jest całkowicie rozpuszczalny przy pH 8, Uzupełnić objętość do 100 ml wodą Milli Q.</td></tr><tr><td>EGTA (100 mM; pH 7,4) (dla 100 ml)</td><td></td><td></td><td>Masa cząsteczkowa: 380,4 Dodaj 3,804 g EGTA do 50 ml wody Milli Q i sprawdź pH (pH~3) Mieszając kroplami dodawać 10 N NaOH i monitorować pH EGTA staje się rozpuszczalna przy pH 7,0 (w przybliżeniu) Dostosuj pH do 7,4 Uzupełnij objętość do 100 ml wodą</td></tr> <tr><td>Milli QFITC Mysz Anti-Human PAC-1</td><td>BD</td><td>340507</td><td></td></tr><tr><td>FITC-IETD-FMK Zestaw do barwienia kaspazy 8 (aktywny)</td><td>Abcam</td><td>ab65614</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos (barwnik do etykietowania mitochindria)</td><td>Invitrogen</td><td>M7512</td><td>Stock= 1 mM (50 &mikro; g rozpuszczony w 90 &mikro; l DMSO) Zapas podrzędny = 100 &mikro; M (10 &mikro; l Zapas + 90 i mikro; l DMSO) Stężenie robocze = 500nM (0,5 &mikro; l w 100 i mikro; l)</td></tr> <tr><td>PE Aneksyna V</td><td>BD Pharmingen</td><td>560930</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandyna E1</td><td>Sigma</td><td>P5515</td><td>Stock = 20 mM (1 mg rozpuszczony w 141 &mikro; L DMSO) Zapas podrzędny = 1 mM (10 &mikro; l Zapas + 190 i mikro; L DMSO) Stężenie robocze = 3 &mikro; M (3 i mikro; L w 1 ml)</td></tr><tr><td>Rhod-2 AM</td><td>Invitrogen</td><td>R1244</td><td>Stock= 5 mM (1 mg rozpuszczony w 178 &mikro; L DMSO) Zapas podrzędny = 100 &mikro; M (10 &mikro; L Zapas + 90 &mikro; L DMSO) Stężenie robocze = 500 nM (0,5 &mikro; L w 100 i mikro; L)</td></tr> <tr><td>Trombina z ludzkiego osocza</td><td>Sigma</td><td>T7572</td><td></td></tr></tbody></table>

kompleksowa analiza płytek krwi prokoagulantów wykazujących cechy martwicy, apoptozy i aktywacji płytek krwi

Comprehensive Analysis of Procoagulant Platelets Exhibiting Features of Necrosis, Apoptosis and Platelet Activation

Płytki krwi krążące w krwiobiegu są względnie spokojne, ale stają się "aktywowane" po napotkaniu stymulantów lub "agonistów" w miejscu uszkodzenia naczynia krwionośnego. Proagregacyjne i prokoagulacyjne płytki krwi reprezentują dwie odrębne populacje aktywowanych płytek krwi. Podczas gdy proagregacyjne płytki krwi ułatwiają zatrzymanie krwawienia lub "hemostazy", tworząc czop płytek krwi zlepionych ze sobą za pomocą mostków fibrynogenu, płytki krwi prokoagulacyjne dramatycznie przyspieszają kaskadę krzepnięcia, której kulminacją jest tworzenie się skrzepów fibryny. Interesującym aspektem prokoagulacyjnych płytek krwi jest to, że ich morfologia wykazuje pewne cechy "martwicy" i "apoptozy". Mogą zatem stanowić formę śmierci komórek w płytkach krwi, aczkolwiek odgrywają ważną rolę w zakrzepicy i hemostazie. W artykule przedstawiono pojęcie prokoagulacyjnych płytek krwi, ich znaczenie dla zdrowia i choroby oraz porównanie istniejących metod ich analizy. Następnie dostarcza kompleksowych protokołów do analizy prokoagulacyjnych płytek krwi, badania mechanizmów ich powstawania i oceny ich prozakrzepowej roli w ułatwianiu krzepnięcia. Artykuł kończy się omówieniem kluczowych kroków, ograniczeń i zasad rozwiązywania problemów dla opisanych metod.

Część aktywowanych płytek krwi staje się „prokoagulacyjna”, co objawia się charakterystycznym wzrostem ekspresji powierzchniowej fosfatydyloseryny (PS) oraz P-selektyny; odróżnia to te płytki od płytek „apoptotycznych”, które wykazują jedynie ekspozycję PS, a także od płytek „proagregacyjnych”, które są dodatnie pod kątem ekspresji P-selektyny. Stwierdzono, że trombina indukuje zależny od dawki wzrost proporcji płytek prokoagulacyjnych wykazujących ekspresję zarówno P-selektyny, jak i PS, co wykryto odpowiednio poprzez w...

Obecny protokół dostarcza obszerny zestaw procedur niezbędnych do analizy prokoagulacyjnych płytek krwi, które wykazują nakładające się cechy martwicy, apoptozy i aktywacji płytek krwi.

Kompleksowa analiza płytek krwi prokoagulantów wykazujących cechy martwicy, apoptozy i aktywacji płytek krwi

Platelets circulating in the bloodstream are relatively quiescent but become "activated" upon encountering stimulants or "agonists" at the site of blood ...

Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu metabolizmu płytek krwi i sygnalizacji w stanach prozakrzepowych, takich jak zespół antyfosfolipidowy i rak, z zamiarem zidentyfikowania nowych biomarkerów i celów terapeutycznych. Nasza grupa była w czołówce niedawnego wzrostu zainteresowania tym, w jaki sposób metabolizm płytek krwi przyczynia się do aktywacji płytek krwi i zakrzepicy. Istotnym wyzwaniem pozostaje dokładna charakterystyka stanu aktywacji płytek krwi w krążeniu pacjentów w celu określenia ryzyka zakrzepicy, a także skuteczności terapeutycznej leków przeciwpłytkowych.Glikoliza tlenowa, szlak pentozofosforanowy i beta-utlenianie kwasów tłuszczowych zostały odkryte jako charakterystyczne szlaki metabolizmu energetycznego w płytkach krwi, a ich potencjał został ustalony dla celów terapeutycznych. Protokół ten służy do pomocy w identyfikacji i dokładnej charakterystyce funkcjonalnej płytek krwi prokoagulacyjnych, różniących się od płytek krwi proagregacyjnych, a także płytek krwi ulegających śmierci komórkowej w wyniku apoptozy lub martwicy. Na początek uzupełnij umyte ludzkie płytki krwi 2,5 milimolowym wapniem, dodając 0,5 mikrolitra 0,5 molowego roztworu chlorku wapnia do 100 mikrolitrów zawiesiny płytek krwi.Utrzymuj jedną frakcję płytek krwi w stanie niestymulowanym, a pozostałą frakcję stymuluj kombinacją trombiny i leku drgawkowego przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po stymulacji dodać po jednym mikrolitrze aneksyny V, opakowanie po jednym i przeciwciałie anty-CD62P do 100 mikrolitrów stymulowanych zawiesin płytek krwi. Inkubuj płytki krwi w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Po 30 minutach utrwalić płytki krwi, dodając równą objętość 2% formaliny, a następnie przeanalizować próbki za pomocą cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia płytek krwi prokoagulantów. W celu przygotowania płytek krwi rozcieńczyć umyte ludzkie płytki krwi do stężenia miliona płytek krwi na mililitr i uzupełnić 2,5 milimolowym wapniem. Oznacz płytki krwi pięcioma mikromolowymi ROD2 w celu wykrycia mitochondrialnego wapnia i inkubuj przez 30 minut w ciemności.W celu przygotowania płytek krwi do testu aktywacji kaspazy, po uzupełnieniu płytek krwi wapniem i stymulacji frakcji, do stymulowanych zawiesin płytek krwi dodać matrycę znakującą aktywną kaspazę. Inkubuj płytki krwi przez 30 minut w ciemności. Po 30 minutach utrwalić płytki krwi, dodając równą objętość 2% formaliny, a następnie przeanalizować płytki krwi za pomocą cytometrii przepływowej.Wyniki pokazują, że trombina indukowała zależny od dawki wzrost odsetka płytek krwi wyrażających zarówno fosfatydyloserynę, jak i P-selektynę. Stymulacja trombiną spowodowała również zależny od czasu wzrost poziomu wapnia w mitochondriach w płytkach krwi. Jednak stymulacja trombiną spowodowała zmniejszenie potencjału błony mitochondrialnej w płytkach krwi.Stymulacja trombiną aktywowała kaspazę-8, ale nie kaspazę-3 lub 7 w płytkach krwi.

comprehensive-analysis-procoagulant-platelets-exhibiting-features

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Tutaj przedstawiamy eksperymentalną technikę fluorescencji pod mikroskopem przyżyciowym do wizualizacji heterotypowych interakcji płytkowo-neutrofilowych na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy. Ta mikroskopowa technologia będzie cenna w badaniu molekularnego mechanizmu chorób naczyniowych i testowaniu środków farmakologicznych w warunkach patofizjologicznych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

Ta praca opisuje metodę opartą na mikroskopii fluorescencyjnej do badania adhezji, rozprzestrzeniania się i wydzielania płytek krwi pod przepływem. Ta wszechstronna platforma umożliwia badanie funkcji płytek krwi w badaniach mechanistycznych nad zakrzepicą i hemostazą.

Obrazowanie żywych komórek degranulacji i wydzielania płytek krwi pod wpływem przepływu

Tworzenie się płytek krwi z prokoagulantem jest skorelowane ze zwiększonym ryzykiem zakrzepicy. Przedstawiono dokładny protokół izolacji przemytych płytek krwi od krwi ludzkiej, mający na celu ilościowe określenie ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalnianie mikropęcherzyków, które są charakterystycznymi cechami płytek krwi prokoagulantu.

Charakterystyka płytek krwi prokoagulantu poprzez pomiar ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków z oczyszczonych płytek krwi u ludzi

Funkcja płytek krwi pod przepływem może być oceniona, a symulowana resuscytacja hemostatyczna może być modelowana za pomocą urządzenia mikroprzepływowego, które ma zastosowanie w medycynie urazowej i transfuzjologicznej.

Mikrofluidyka w ocenie funkcji płytek krwi

Wielokolorowa cytometria przepływowa dla płytek krwi może zidentyfikować nowe podtypy płytek krwi w klasycznych subpopulacjach płytek krwi, takie jak płytki spoczynku, agregacyjne, prokoagulacyjne i apoptotyczne. Pozwala to na porównanie różnych wzorców subpopulacji indukowanych przez różnych agonistów płytek krwi. Tutaj szczegółowo opisano procedurę tworzenia wielokolorowego panelu cytometrii przepływowej.

Analiza subpopulacji płytek krwi za pomocą wielobarwnej cytometrii przepływowej

Praca ta opisuje test mikrofluidyczny, który wykorzystuje naprężenie ścinające do wywołania powstawania zakrzepów we krwi i charakteryzuje zakrzep za pomocą wielu wymiarów odczytu. Test pozwala mierzyć tendencję protrombotyczną próbek krwi, dzięki czemu jest przydatny w diagnozowaniu chorób, odkrywaniu leków oraz podstawowych badaniach mechanistycznych związanych z zakrzepicą.

Testy profilowania zakrzepów: platforma oparta na mikrofluidyce do kompleksowej charakterystyki trombogenezy biomechanicznej

Opracowano bazę danych onkologii klatki piersiowej, która ma służyć jako kompleksowe repozytorium danych klinicznych i laboratoryjnych na potrzeby badań translacyjnych. Baza danych będzie służyć badaczom nowotworów w ramach Programu Badań nad Onkologią Klatki Piersiowej. Niniejsza baza danych jest możliwa do dostosowania do innych modeli nowotworowych, jak również do innych chorób ludzkich.

Tworzenie kompleksowej bazy danych onkologii klatki piersiowej – narzędzie do badań translacyjnych

Obiektywne oceny mechanizmów fizjologicznych wspierających mowę są niezbędne do monitorowania początku i postępu choroby u osób z ALS oraz do ilościowego określenia efektów leczenia w badaniach klinicznych. W niniejszym filmie przedstawiamy kompleksowy protokół oparty na instrumentacji, służący do ilościowej oceny sprawności motorycznej mowy w populacjach klinicznych.

Protokół kompleksowej oceny dysfunkcji opuszkowej w stwardnieniu bocznym zanikowym (SLA)

Niniejszy artykuł opisuje technikę in vitro służącą do monitorowania naciekania komórek nowotworowych przez monowarstwę komórek śródbłonka. Dane są pozyskiwane w czasie rzeczywistym jako funkcja zmian impedancji na powierzchni elektrod znajdujących się na dnie studzienki.

Technika oparta na pomiarze impedancji elektrycznej w czasie rzeczywistym do pomiaru inwazji monowarstwy komórek śródbłonka przez komórki nowotworowe

Interferencja RNA (RNAi) posiada wiele zalet w porównaniu z nokautem genów i jest szeroko stosowana jako narzędzie w badaniach nad funkcjami genów. Wynalezienie technologii RNAi opartej na wektorach DNA umożliwiło długotrwałe i indukowalne wyciszanie genów, a także zwiększyło wykonalność wyciszania genów in vivo.

Interferencja RNA oparta na wektorach DNA w badaniu funkcji genów w nowotworach

Poznaj metodę analizy prokoagulantnych płytek krwi wykazujących cechy martwicy i apoptozy. Ta technika umożliwia identyfikację biomarkerów zakrzepicy oraz ocenę ryzyka trombotycznego w stanach prozakrzepowych.

Kompleksowa analiza płytek krwi prokoagulantów wykazujących cechy martwicy, apoptozy i aktywacji płytek krwi

Przeglądaj więcej filmów