Optymalizacja izolacji i oczyszczania mysich komórek mezangialnych kłębuszków nerkowych
March 7th, 2025
To badanie opracowało zoptymalizowany protokół izolacji mysich komórek mezangialnych (MC) i ich hodowli komórkowej ex vivo. Komórki te mogą być wielokrotnie pasażowane, zamrażane, ożywiane i hodowane bez uszczerbku dla wzrostu komórek lub ekspresji białek.
Jedno z naszych badań koncentruje się na zaburzeniach czynności nerek związanych ze szpiczakiem mnogim. Aby wesprzeć nasze badania, opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy protokoły pierwotnej hodowli mysich komórek mezangialnych. Sprzęt niezbędny do przeprowadzenia zabiegów jest łatwo dostępny, a poszczególne etapy procedury są proste.
Pozyskanie komórek docelowych trwa tylko od dwóch do trzech tygodni. Technika ta ułatwia badania nad nerkami i wspiera badania nad funkcją komórek mezangialnych w modelach chorób, rozwojem terapeutycznym lub badaniami nad transdukcją sygnału. Aby rozpocząć izolację mysich komórek mezangialnych lub MC od prawidłowo uśpionego zwierzęcia, za pomocą nożyczek i pęsety należy aseptycznie usunąć nerki myszy i umieścić je na szalce Petriego.
Przepłucz nerki zrównoważonym roztworem soli Earle'a, a następnie użyj pęsety, aby ostrożnie usunąć tkankę łączną i torebkę nerkową. Zmniejsz nerkę w pionie o połowę za pomocą skalpela. Dodaj trzy do czterech mililitrów roztworu kolagenazy I na szalkę Petriego i dokładnie zmiel tkankę plastikowym tłuczkiem do komórek.
Odpipetować całą tkankę i roztwór z szalki Petriego do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Opłucz szalkę Petriego jednym do dwóch mililitrów roztworu kolagenazy I, aby zapewnić całkowity transfer tkanki. Umieść probówkę w wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 120 obrotów na minutę przez 30 minut.
Następnie dodać równą objętość roztworu zatrzymującego lub pożywki hodowlanej do mieszaniny. Odpipetować roztwór z probówki wirówkowej i przepuścić go przez sitko o średnicy 100 mikronów. Zebrać filtrat w 50-mililitrowej probówce wirówkowej.
Przepuścić filtrat przez sitko o średnicy 40 mikronów, zatrzymując tylko komórki na sitku. Kilkakrotnie przepłucz sitko pożywką hodowlaną, aby zmaksymalizować zbieranie komórek. Przenieś zebrane komórki z sitka do nowej 50-mililitrowej probówki wirówkowej.
Odwirować zawiesinę o masie 600 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu ponownie zawieś komórki w naczyniu do hodowli komórkowych zgodnie z pożądaną gęstością komórek. Umieść naczynia w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 95% powietrzem i 5% dwutlenkiem węgla.
Dodaj jeden do dwóch mililitrów PBS wzdłuż wewnętrznej krawędzi naczynia hodowlanego, aby przepłukać komórki. Użyj pipety, aby usunąć cały PBS z dna naczynia, a następnie dodaj 10 mililitrów pożywki hodowlanej wzdłuż wewnętrznej krawędzi naczynia. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, zwykle w ciągu siedmiu do 10 dni, umyj komórki dwukrotnie sterylnym PBS.
Dodaj 0,25% roztworu trypsyny do naczynia, aby trypsynizować komórki. Umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy większość komórek wykazuje zaokrągloną morfologię i odrywa się od powierzchni, zakończ trypsynizację, dodając równą objętość pożywki dwa.
Odwirować komórki o masie 600 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie zawiesić je w pożywce drugiej. MC wyizolowane w tym badaniu wykazywały znacznie wysoką ekspresję alfa-SMA, fibronektyny i wimentyny. Barwienie immunofluorescencyjne oczyszczonych i hodowanych MC przeprowadzone po 10 dniach hodowli w pożywce drugiej wykazało, że ponad 95% komórek wyrażało zarówno alfa-SMA, jak i wimentynę.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie koncentruje się na opracowaniu zoptymalizowanego protokołu izolacji i hodowli komórek mezangialnych mysich (MCs), które są kluczowe dla badań nad nerkami. Metoda ta umożliwia wielokrotne przeszczepy, zamrażanie i przywracanie do życia, zachowując wzrost komórek i ekspresję białek.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Upośledzenie czynności nerek związane z mnogim szpiczakiem
- Funkcja komórek mezangialnych w modelach chorób nerek
- Rozwój terapii i badania przekaźnictwa sygnałowego
Tło
- Znaczenie komórek mezangialnych dla zdrowia nerek
- Wyzwania związane z izolacją i hodowlą tych komórek
- Potrzeba niezawodnych protokołów eksperymentalnych
Zastosowanie metod
- Techniki izolacji z wykorzystaniem trawienia kolagenazą
- System modelu mysiego
- Hodowla komórek w kontrolowanych warunkach
Główne wyniki
- Wysoka ekspresja alfa-SMA, fibronektyny i wimentyny w hodowalnych MCs
- Udana izolacja i zweryfikowane optymalne warunki wzrostu
- Metoda zapewnia narzędzie do dalszych badań nad nerkami
Wnioski
- Badanie wykazuje skuteczny sposób hodowli mysich MCs, wnosząc cenne metody do badań nad nerkami.
- Poprawia zrozumienie roli komórek mezangialnych w patologiach nerek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Efficient isolation and purification of murine glomerular mesangial cells (MCs) directly supports early-stage nephrology research and disease modeling. This optimized protocol accelerates access to high-purity MCs, enabling robust target validation and mechanistic studies in renal pathobiology. The approach reduces cycle time and enhances reproducibility, strengthening predictive confidence for downstream therapeutic discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid generation of primary MC cultures for hypothesis-driven interrogation of renal pathways.
- Supports functional validation of disease-relevant targets in glomerular biology.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing consistent cellular material for pathway analysis.
- Improves predictive confidence in early-stage renal disease models.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, high-purity MCs for assay development and compound screening.
- Ensures reproducible cell phenotype with high expression of alpha-SMA and vimentin.
- Enables scalability and batch-to-batch consistency for screening workflows.
- Reduces variability in quantitative readouts for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro MC models with disease-relevant renal pathologies for translational studies.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in nephrology pipelines.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust cellular data.
- Provides a platform for biomarker exploration in glomerular disease contexts.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol positions MC isolation at the interface of early discovery and preclinical research, enabling seamless progression from target validation to lead identification in renal disease programs.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway clarification in glomerular research.
- Screening: Delivers reproducible, assay-ready MCs for quantitative screening platforms.
- Analytics: Supports measurement of protein expression (alpha-SMA, vimentin) for condition comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical renal models for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for MC isolation across nephrology projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in renal target studies.
- Operational Value: Standardizes MC isolation, enabling reproducibility and scalability in R&D workflows.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and improves capital efficiency in nephrology portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of renal disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and aseptic technique.
- Needs access to standard cell culture and analytical instrumentation.
- Demands cross-team standardization for reproducible cell phenotype and protein expression.
- Adaptable to various murine models but may require optimization for other species.
- Dependent on consistent execution of enzymatic digestion and purification steps.
