Optymalizacja izolacji i oczyszczania mysich komórek mezangialnych kłębuszków nerkowych
7 marca 2025
To badanie opracowało zoptymalizowany protokół izolacji mysich komórek mezangialnych (MC) i ich hodowli komórkowej ex vivo. Komórki te mogą być wielokrotnie pasażowane, zamrażane, ożywiane i hodowane bez uszczerbku dla wzrostu komórek lub ekspresji białek.
Jedno z naszych badań koncentruje się na zaburzeniach czynności nerek związanych ze szpiczakiem mnogim. Aby wesprzeć nasze badania, opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy protokoły pierwotnej hodowli mysich komórek mezangialnych. Sprzęt niezbędny do przeprowadzenia zabiegów jest łatwo dostępny, a poszczególne etapy procedury są proste.
Pozyskanie komórek docelowych trwa tylko od dwóch do trzech tygodni. Technika ta ułatwia badania nad nerkami i wspiera badania nad funkcją komórek mezangialnych w modelach chorób, rozwojem terapeutycznym lub badaniami nad transdukcją sygnału. Aby rozpocząć izolację mysich komórek mezangialnych lub MC od prawidłowo uśpionego zwierzęcia, za pomocą nożyczek i pęsety należy aseptycznie usunąć nerki myszy i umieścić je na szalce Petriego.
Przepłucz nerki zrównoważonym roztworem soli Earle'a, a następnie użyj pęsety, aby ostrożnie usunąć tkankę łączną i torebkę nerkową. Zmniejsz nerkę w pionie o połowę za pomocą skalpela. Dodaj trzy do czterech mililitrów roztworu kolagenazy I na szalkę Petriego i dokładnie zmiel tkankę plastikowym tłuczkiem do komórek.
Odpipetować całą tkankę i roztwór z szalki Petriego do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Opłucz szalkę Petriego jednym do dwóch mililitrów roztworu kolagenazy I, aby zapewnić całkowity transfer tkanki. Umieść probówkę w wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 120 obrotów na minutę przez 30 minut.
Następnie dodać równą objętość roztworu zatrzymującego lub pożywki hodowlanej do mieszaniny. Odpipetować roztwór z probówki wirówkowej i przepuścić go przez sitko o średnicy 100 mikronów. Zebrać filtrat w 50-mililitrowej probówce wirówkowej.
Przepuścić filtrat przez sitko o średnicy 40 mikronów, zatrzymując tylko komórki na sitku. Kilkakrotnie przepłucz sitko pożywką hodowlaną, aby zmaksymalizować zbieranie komórek. Przenieś zebrane komórki z sitka do nowej 50-mililitrowej probówki wirówkowej.
Odwirować zawiesinę o masie 600 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu ponownie zawieś komórki w naczyniu do hodowli komórkowych zgodnie z pożądaną gęstością komórek. Umieść naczynia w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 95% powietrzem i 5% dwutlenkiem węgla.
Dodaj jeden do dwóch mililitrów PBS wzdłuż wewnętrznej krawędzi naczynia hodowlanego, aby przepłukać komórki. Użyj pipety, aby usunąć cały PBS z dna naczynia, a następnie dodaj 10 mililitrów pożywki hodowlanej wzdłuż wewnętrznej krawędzi naczynia. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, zwykle w ciągu siedmiu do 10 dni, umyj komórki dwukrotnie sterylnym PBS.
Dodaj 0,25% roztworu trypsyny do naczynia, aby trypsynizować komórki. Umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy większość komórek wykazuje zaokrągloną morfologię i odrywa się od powierzchni, zakończ trypsynizację, dodając równą objętość pożywki dwa.
Odwirować komórki o masie 600 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie zawiesić je w pożywce drugiej. MC wyizolowane w tym badaniu wykazywały znacznie wysoką ekspresję alfa-SMA, fibronektyny i wimentyny. Barwienie immunofluorescencyjne oczyszczonych i hodowanych MC przeprowadzone po 10 dniach hodowli w pożywce drugiej wykazało, że ponad 95% komórek wyrażało zarówno alfa-SMA, jak i wimentynę.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na opracowaniu zoptymalizowanego protokołu izolacji i hodowli mysich komórek kłębuszkowych (MCs), które mają kluczowe znaczenie dla badań nad nerkami. Metoda ta umożliwia przeprowadzanie wielu pasażowań, zamrażanie i rozmrażanie z jednoczesnym zachowaniem wzrostu komórek oraz ekspresji białek.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Niewydolność nerek związana z szpiczakiem mnogim
- Funkcja komórek kłębuszkowych w modelach chorób nerek
- Rozwój terapeutyczny i badania nad transdukcją sygnału
Wstęp
- Znaczenie komórek kłębuszkowych dla zdrowia nerek
- Wyzwania związane z izolacją i hodowlą tych komórek
- Potrzeba opracowania wiarygodnych protokołów eksperymentalnych
Zastosowane metody
- Techniki izolacji z wykorzystaniem trawienia kolagenazą
- Mysi model systemowy
- Kultura komórek w kontrolowanych warunkach
Główne wyniki
- Wysoka ekspresja alpha-SMA, fibronektyny i wimentyny w hodowlach MC
- Potwierdzona skuteczna izolacja i optymalne warunki wzrostu
- Metoda stanowi niezawodne narzędzie do dalszych badań nad nerkami
Wnioski
- Badanie wykazuje skuteczną metodę hodowli mysich komórek kłębuszkowych (MCs), dostarczając cennych metod dla badań nad nerkami.
- Pozwala ono na lepsze zrozumienie roli komórek mezangialnych w patologiach nerek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Efektywna izolacja i oczyszczanie mysich komórek mezanialnych kłębuszków nerkowych (MCs) stanowi bezpośrednie wsparcie dla wczesnych etapów badań nefrologicznych oraz modelowania chorób. Ten zoptymalizowany protokół przyspiesza uzyskiwanie MCs o wysokiej czystości, umożliwiając rzetelną walidację celów oraz badania mechanistyczne w patobiologii nerek. Zastosowane podejście skraca czas cyklu i zwiększa powtarzalność, wzmacniając pewność prognostyczną w późniejszym procesie odkrywania terapeutyków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia szybkie generowanie pierwotnych kultur MC do badania szlaków nerkowych w oparciu o postawione hipotezy.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów istotnych dla chorób w biologii kłębuszków nerkowych.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez zapewnienie spójnego materiału komórkowego do analizy szlaków.
- Zwiększa pewność prognostyczną w modelach wczesnych stadiów chorób nerek.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowane, wysokiej czystości MC do opracowywania testów i screeningu związków.
- Gwarantuje powtarzalny fenotyp komórek z wysoką ekspresją alpha-SMA i wimentyny.
- Umożliwia skalowalność i spójność między partiami w procesach screeningu.
- Ogranicza zmienność w ilościowych odczytach, co pozwala na wiarygodną ocenę związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie in vitro modeli MC do patologii nerkowych istotnych dla danej choroby w badaniach translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkryć po walidację przedkliniczną w ramach projektów nefrologicznych.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektów w oparciu o analizę ryzyka i rzetelne dane komórkowe.
- Stanowi platformę do poszukiwania biomarkerów w kontekście chorób kłębuszkowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół sytuuje izolację MC na styku wczesnej fazy odkrywania i badań przedklinicznych, umożliwiając płynne przejście od walidacji celu do identyfikacji związku wiodącego w programach badawczych nad chorobami nerek.
- Biologia odkrywcza: Przyspiesza testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w badaniach kłębuszków nerkowych.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalne, gotowe do analizy MC dla ilościowych platform przesiewowych.
- Analityka: Wspiera pomiar ekspresji białek (alpha-SMA, vimentin) w celu porównania stanów badawczych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z przedklinicznymi modelami nerkowymi w celu dopasowania biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Ustanawia powtarzalny schemat izolacji MC dla projektów nefrologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad celami nerkowymi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację MC, umożliwiając powtarzalność i skalowalność w procesach badawczo-rozwojowych (R&D).
- Wartość strategiczna: Przyspiesza podejmowanie decyzji go/no-go i poprawia efektywność kapitałową w portfolio nefrologicznym.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów dotyczących chorób nerek.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga doświadczenia w izolacji pierwotnych komórek oraz w technice aseptycznej.
- Wymaga dostępu do standardowej aparatury do hodowli komórkowych i analizy.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu uzyskania powtarzalnego fenotypu komórek i ekspresji białek.
- Metoda jest możliwa do zaadaptowania do różnych modeli mysich, lecz może wymagać optymalizacji dla innych gatunków.
- Wynik zależy od konsekwentnego przeprowadzenia etapów trawienia enzymatycznego i oczyszczania.
