Name: Optymalizacja izolacji i oczyszczania mysich komórek mezangialnych kłębuszków nerkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 46 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę izolacji i hodowli mysich komórek mezangialnych kłębuszków nerkowych przy użyciu trawienia kolagenazą. Technika ta umożliwia wielokrotne podziały i zamrażanie komórek z zachowaniem ich właściwości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty dla Y.Z. z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 82470196, nr 82070219 i nr 81870157) oraz Funduszu Startowego Uniwersytetu Sichuan.

Eksperymenty na zwierzętach były zgodne z wytycznymi ARRIVE, a wszystkie procedury na zwierzętach były przeprowadzane zgodnie z ustawodawstwem krajowym i Dyrektywą Komisji Europejskiej (2010/63/UE). Myszy były trzymane i utrzymywane w warunkach wolnych od patogenów, zgodnie z wymaganiami Komitetów ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szpitala Zachodniochińskiego Uniwersytetu Syczuańskiego. Wszystkie badania eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szpitala Zachodniochińskiego Uniwersytetu Sichuan. Ośmiotygodniowe samce myszy C57BL / 6JGpt użyto do izolacji komórek mezangialnych w tym teście. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów. Rysunek 1 ilustruje procedury izolowania i oczyszczania mysich komórek kłębuszków nerkowych.
1. Przygotowanie odczynników do izolacji mysich MC
UWAGA: Upewnij się, że wszystkie odczynniki i sprzęt są sterylne.
<ol>
	<li>Kolagenaza typu I (750 U/ml): Zważyć proszek i rozpuścić na krótko przed użyciem w RPMI 1640.</li>
	<li>Pożywka do hodowli komórek mezangialnych 1: Wymieszaj RPMI 1640 z 2 mM glutaminy, 17% FBS, antybiotykami (100 jednostek/ml penicyliny plus 10 000 μg/ml streptomycyny) i 0,1 U/ml insuliny.</li>
	<li>Pożywka do hodowli komórek mezangialnych 2: Połącz RPMI 1640 (D-walina) z 2 mM glutaminy, 10% FBS, antybiotykami (100 jednostek/ml penicyliny plus 10 000 μg/ml streptomycyny), ITS-G (insulina, transferyna, roztwór selenu 100x) i 0,1 U/ml insuliny. Pożywkę do hodowli komórek mezangialnych przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 1 miesiąca po przygotowaniu.</li>
	<li>Pożywki do krioprezerwacji komórek: Przygotuj mieszaninę pożywki RPMI 1640, surowicy i DMSO w stosunku 7:2:1.</li>
</ol>
2. Izolacja mysich MC
<ol>
	<li>Humanitarne uśmiercanie myszy poprzez uduszenie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Zanurz tusze w zlewce zawierającej 75% alkoholu w celu sterylizacji, a następnie przenieś zwierzę na aseptyczną powierzchnię roboczą. 
	UWAGA: Po zakończeniu uduszenia CO2 obserwuje się u myszy brak bicia serca i oddychania. Następnie wykonuje się zwichnięcie szyjki macicy w celu zapewnienia eutanazji.</li>
	<li>Aseptycznie usuń nerki myszy za pomocą nożyczek i pęsety, umieść je na szalce Petriego, spłucz EBSS (Earle's Balanced Salt Solution), a następnie ostrożnie usuń tkankę łączną i torebkę nerkową za pomocą pęsety.</li>
	<li>Przekrój nerkę na pół pionowo, dodaj 3-4 ml roztworu kolagenazy I i zmiel plastikowym tłuczkiem do komórek.</li>
	<li>Odpipetować wszystkie tkanki i roztwór z płytki Petriego do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Opłucz szalkę Petriego 1-2 ml roztworu kolagenazy I, aby upewnić się, że cała tkanka została przeniesiona. Umieścić roztwór w wytrząsarce w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 120 obr./min przez 30 minut. Następnie dodać równą objętość roztworu zatrzymującego (pożywka hodowlana 1).</li>
	<li>Odpipetować roztwór z probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, przepuścić go przez sitko o pojemności 100 μm i zebrać filtrat do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Przepuścić płyn z etapu 2.5 przez sitko o średnicy 40 μm, zachowując tylko komórki znajdujące się na sitku o średnicy 40 μm. Kilkakrotnie przepłukać sitko pożywką hodowlaną 1, aby zapewnić zebranie jak największej liczby komórek na sitku. Przenieść zebrane komórki z sitka do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę o sile 600 x g przez 5 minut (w temperaturze pokojowej), a następnie ponownie zawiesić komórki w naczyniu do hodowli komórkowych zgodnie z gęstością komórek. Ogólnie rzecz biorąc, należy ponownie zawiesić komórki z dwóch nerek w dwóch lub trzech 100-milimetrowych szalkach hodowlanych (10 ml pożywki hodowlanej 1/100 mm). Umieścić naczynia w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 °C z 95% powietrzem/5% CO2 .</li>
	<li>Zbadaj morfologię i adhezję komórek pod mikroskopem (40×) następnego dnia. Jeśli w pożywce hodowlanej znajdują się pływające martwe komórki, użyj pipety, aby usunąć pożywkę z dna naczynia hodowlanego, uważając, aby nie naruszyć przyczepionych komórek.</li>
	<li>Dodaj 1-2 ml PBS wzdłuż wewnętrznej krawędzi naczynia hodowlanego, aby przepłukać komórki. Użyj pipety, aby usunąć cały PBS z dna szalki hodowlanej, a na koniec dodaj 10 ml pożywki hodowlanej 1 wzdłuż wewnętrznej krawędzi szalki hodowlanej.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie mysich MC
<ol>
	<li>Jednego dnia po rozdzieleniu należy usunąć nieprzylegające komórki, delikatnie myjąc i zastępując pożywkę hodowlaną świeżą pożywką hodowlaną 1, jak opisano w kroku 2.8. Obserwować komórki kłębuszków nerkowych pod mikroskopem z kontrastem fazowym (40×). 
	UWAGA: Jasne kuliste kształty reprezentują kłębuszki nerkowe, podczas gdy otaczające je komórki wykazują cechy przypominające kostkę brukową, charakterystyczne dla komórek nabłonkowych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Obserwuj morfologię komórki po 1-3 dniach (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B-C). Komórki w kształcie gwiaździsty i wrzecionowatego pojawią się wokół komórek brukowych, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 2D.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną 80% zbieżności (zwykle w ciągu 7-10 dni), umyj komórki dwukrotnie sterylnym PBS, a następnie trypsynizuj komórki 0,25% roztworem trypsyny (2 ml 0,25% roztworu trypsyny na 100 mm naczynie).</li>
	<li>Początkowy proces trypsynizacji komórek może trwać około 20 minut. Po dodaniu trypsyny umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Obserwuj proces w czasie rzeczywistym pod mikroskopem kontrastu fazowego (40×), aby ocenić trypsynizację komórek.</li>
	<li>Zakończ proces trypsynizacji, dodając równą objętość pożywki 2, gdy większość komórek wykazuje zaokrągloną morfologię i odrywa się od powierzchni naczynia.</li>
	<li>Odwirować komórki o masie 600 × g przez 5 minut (w temperaturze pokojowej), a następnie ponownie zawiesić je w pożywce 2. Ogólnie rzecz biorąc, ponownie zawiesić komórki z jednej szalki o średnicy 100 mm w dwóch szalkach hodowlanych o średnicy 100 mm (10 ml pożywki hodowlanej 2/100 mm).</li>
	<li>Zmień pożywkę hodowlaną 2 następnego dnia. Obserwuj liczne zawieszone komórki i fragmenty komórek pod mikroskopem (40×), ponieważ tylko MC mogą przetrwać i namnażać się w pożywce D-waliny16. Zmieniaj pożywkę co 1-2 dni, aby usunąć martwe komórki. Komórkami przylegającymi w kulturze są MC (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A-D). Określ tempo wzrostu izolowanych MC (<silna klasa="xfig">Rysunek 3E).</li>
	<li>Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, trypsynizuj je i przechodź. MC zwykle potrzebują około 5-10 minut na trypsynizację.</li>
</ol>
4. Długoterminowe zachowanie mysich MC
UWAGA: Ponieważ komórki pierwotne mogą różnicować się i mutować wraz z upływem czasu i wielokrotnymi przejściami, zamrażaj i przechowuj MC po oczyszczeniu komórek dla długoterminowego zachowania.
<ol>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant wzdłuż dolnej krawędzi naczynia za pomocą pipety, umyć komórki dwukrotnie sterylnym PBS, a następnie trypsynizować 0,25% roztworem trypsyny (2 ml 0,25% roztworu trypsyny na 100 mm naczynia). Postępuj zgodnie z krokami trypsynizacji zgodnie z opisem w krokach 3.3-3.8.</li>
	<li>Po trypsynizacji dodaj równą objętość pożywki 2, aby zakończyć proces i przenieś cały płyn do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować komórki w stężeniu 600 × g przez 5 minut (w temperaturze pokojowej), odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS w celu policzenia komórek.</li>
	<li>Użyj automatycznego licznika komórek, aby policzyć komórki. Pobrać 20 μl z 1 ml zawieszonego roztworu komórek i dodać je do dedykowanej płytki do zliczania komórek, aby określić całkowitą liczbę komórek. Na podstawie liczby komórek ponownie zawieś je w pożywce do kriokonserwacji komórek (1 ml pożywki do kriokonserwacji komórek na 106 komórek).</li>
	<li>Przenieść roztwór komórkowy do probówek do kriokonserwacji (1 ml pożywki do krioprezerwacji komórek na 2 ml probówki do krioprezerwacji) i przeprowadzić powolne zamrażanie do temperatury -80 °C przed przeniesieniem do ciekłego azotu w celu konserwacji. 
	UWAGA: W razie potrzeby ponownie zawiesić i wysadzić komórki w szalkach do hodowli komórkowych w celu amplifikacji. Komórki powinny być używane między fragmentami 3 i 8 po ich pełnym scharakteryzowaniu17.</li>
</ol>
5. Identyfikacja mysich MC
UWAGA: Po dwukrotnym przejściu komórek, zidentyfikuj mysie MC za pomocą następujących technik.
<ol>
	<li>Western blot mysich MCs 
	UWAGA: Odczynniki potrzebne do przeprowadzenia zabiegu podano w Tabeli Uzupełniającej 1.
	<ol>
		<li>Trypsynizuj komórki, wykonując te same czynności, co w 3.3-3.8 i kroku 4.1.</li>
		<li>Po zebraniu komórek poddaj je lizie w celu ekstrakcji białek i zmierz stężenie białka.</li>
		<li>Pobrać odpowiednią ilość próbki (zwykle 20 ng), dodać bufor ładujący i dokonać denaturacji w temperaturze 100 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Rozpuść białko (20 ng) za pomocą 10% żelu SDS-PAGE lub 7,5% żelu SDS-PAGE, a następnie przenieś je do membrany celulozowej pod stałym napięciem.</li>
		<li>Zatkać błonę 5% mlekiem beztłuszczowym, a następnie inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w temperaturze 4 °C na wytrząsarce przez noc.</li>
		<li>Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę po trzykrotnym przemyciu TBST (Tris Buffered Saline with Tween 20).</li>
		<li>Wykrywanie sygnałów za pomocą systemu obrazowania. 
		UWAGA: Podstawowe przeciwciała użyte w tym badaniu obejmowały mysi anty-αSMA (1:500), króliczą anty-wimentynę (1:2000), króliczą antyfibronektynę (1:2000) i mysi anty-GAPDH (1:50000). Przeciwciała drugorzędowe użyte w tym badaniu obejmowały kozie przeciwciała anty-królicze IgG (H + L) (1:5000) sprzężone z peroksydazą i kozie anty-mysie IgG (H + L) sprzężone z peroksydazą (1:5000).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunofluorescencyjne mysich MCs 
	UWAGA: Odczynniki potrzebne do przeprowadzenia zabiegu podano w Tabeli Uzupełniającej 2.
	<ol>
		<li>Trypsynizuj komórki, wykonując te same czynności, co w krokach 3.3-3.8 i 4.1.</li>
		<li>Zawieś ponownie komórki i policz je. Weź 1 x 105 komórek i dodaj je do naczynia do hodowli komórek ze szklanym dnem o średnicy 15 mm (1 ml pożywki hodowlanej, 2 na szklane dno o średnicy 15 mm).</li>
		<li>Utrwal MC 4% paraformaldehydem przez 15 minut (1 ml 4% paraformaldehydu na 15 mm szklane dno), a następnie przemyj trzy razy PBS.</li>
		<li>Potraktuj MC 0,1% Triton X-100 przez 10 minut, aby przeniknąć przez błony komórkowe.</li>
		<li>Po trzech kolejnych płukaniach PBS zablokuj komórki w temperaturze pokojowej 3% roztworem BSA PBS na 30 minut.</li>
		<li>Umyć komórki i inkubować je z pierwszorzędowymi przeciwciałami anty-mysimi αSMA i anty-króliczymi przeciwciałami wimentyny w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Inkubować przez 1 godzinę z wtórną anty-mysią IgG osła skoniugowaną z czerwoną Alexa 594 i anty-króliczą IgG osła skoniugowaną z zielonym FITC w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Użyj DAPI do barwienia jądrowego przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodaj nośnik fluoromount i przykryj szklanym szkiełkiem. Analizuj komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego. 
		UWAGA: Podstawowe przeciwciała użyte w tym badaniu obejmowały mysi anty-αSMA (1:200) i króliczą anty-wimentynę (1:200). Przeciwciała drugorzędowe użyte w tym badaniu obejmowały przeciwciała anty-mysie IgG skoniugowane z czerwoną Alexą 594 (1:400), przeciwciała anty-królicze osła skoniugowane z zielonym FITC (1:400) i DAPI (1:1000).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cytometria przepływowa mysich MC
	<ol>
		<li>Trypsynizuj komórki, wykonując te same czynności, co w krokach 3.3-3.8 i 4.1.</li>
		<li>Zawieś ponownie komórki i policz je. Weź 5 x 105 komórek i umyj je raz 3 ml PBS.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki ze 100 μl PBS w probówce przepływowej, a następnie dodać 1-2 μl przeciwciała anty-mysiego PDGFRB (CD140b).</li>
		<li>Inkubować komórki na lodzie przez 30 minut w ciemności, a następnie analizować za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Pollak, M. R., Quaggin, S. E., Hoenig, M. P., Dworkin, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glomerulus%3A+The+sphere+of+influence%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">The glomerulus: The sphere of influence.</a> Clin J Am Soc Nephrol. 9 (8), 1461-1469 (2014).</li>
<li>Mené, P., Simonson, M. S., Dunn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+the+mesangial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Physiology of the mesangial cell.</a> Physiol Rev. 69 (4), 1347-1424 (1989).</li>
<li>Avraham, S., Korin, B., Chung, J. J., Oxburgh, L., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mesangial+cell+-+the+glomerular+stromal+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">The mesangial cell - the glomerular stromal cell.</a> Nat Rev Nephrol. 17 (12), 855-864 (2021).</li>
<li>Chadban, S. J., Atkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Glomerulonephritis.</a> Lancet. 365 (9473), 1797-1806 (2005).</li>
<li>Qian, Y., Feldman, E., Pennathur, S., Kretzler, M., Brosius, F. C. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+fibrosis+to+sclerosis%3A+Mechanisms+of+glomerulosclerosis+in+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">From fibrosis to sclerosis: Mechanisms of glomerulosclerosis in diabetic nephropathy.</a> Diabetes. 57 (6), 1439-1445 (2008).</li>
<li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iga+Gut+microbiome+regulates+the+production+of+hypoglycosilated+iga1+via+the+tlr4+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol+Dial+Transplant%22%5BJournal%5D)">Iga Gut microbiome regulates the production of hypoglycosilated iga1 via the tlr4 signaling pathway.</a> Nephrol Dial Transplant. 39 (10), 1624-1641 (2024).</li>
<li>Kong, L. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+murine+models+of+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in murine models of diabetic nephropathy.</a> J Diabetes Res. 2013, 797548(2013).</li>
<li>Schiffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+smads+and+tgf-beta+signaling+in+glomerular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory smads and tgf-beta signaling in glomerular cells.</a> J Am Soc Nephrol. 13 (11), 2657-2666 (2002).</li>
<li>Gyarmati, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sparsentan+improves+glomerular+hemodynamics%2C+cell+functions%2C+and+tissue+repair+in+a+mouse+model+of+FSGS%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Sparsentan improves glomerular hemodynamics, cell functions, and tissue repair in a mouse model of FSGS.</a> JCI Insight. 9 (19), e177775(2024).</li>
<li>Chafin, C. B., Regna, N. L., Hammond, S. E., Reilly, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+urinary+microRNA+alterations+in+NZB%2FW+mice+with+hydroxychloroquine+or+prednisone+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Cellular and urinary microRNA alterations in NZB/W mice with hydroxychloroquine or prednisone treatment.</a> Int Immunopharmacol. 17 (3), 894-906 (2013).</li>
<li>Lucero, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tnf-%CE%B1+plus+il-1%CE%B2+induces+opposite+regulation+of+cx43+hemichannels+and+gap+junctions+in+mesangial+cells+through+a+rhoa%2Frock-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Tnf-α plus il-1β induces opposite regulation of cx43 hemichannels and gap junctions in mesangial cells through a rhoa/rock-dependent pathway.</a> Int J Mol Sci. 23 (17), (2022).</li>
<li>Schnaper, H. W., Hayashida, T., Hubchak, S. C., Poncelet, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tgf-beta+signal+transduction+and+mesangial+cell+fibrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tgf-beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 284 (2), F243-F252 (2003).</li>
<li>Mackay, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+epithelial%2C+mesangial%2C+and+endothelial+cell+lines+from+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Glomerular epithelial, mesangial, and endothelial cell lines from transgenic mice.</a> Kidney Int. 33 (3), 677-684 (1988).</li>
<li>Wilson, H. M., Stewart, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+epithelial+and+mesangial+cell+culture+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Glomerular epithelial and mesangial cell culture and characterization.</a> Methods Mol Med. 107, 269-282 (2005).</li>
<li>Menè, P., Stoppacciaro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+propagation+of+glomerular+mesangial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and propagation of glomerular mesangial cells.</a> Methods Mol Biol. 466, 3-17 (2009).</li>
<li>Gilbert, S. F., Migeon, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D-valine+as+a+selective+agent+for+normal+human+and+rodent+epithelial+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">D-valine as a selective agent for normal human and rodent epithelial cells in culture.</a> Cell. 5 (1), 11-17 (1975).</li>
<li>Kreisberg, J. I., Venkatachalam, M., Troyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+cultured+glomerular+mesangial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of cultured glomerular mesangial cells.</a> Am J Physiol. 249 (4 Pt 2), F457-F463 (1985).</li>
<li>Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychrophilic+proteases+dramatically+reduce+single-cell+rna-seq+artifacts%3A+A+molecular+atlas+of+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell rna-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development.</a> Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).</li>
<li>Sadovnic, M. J., Brand-Elnaggar, J., Bolton, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+chicken+mesangial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of chicken mesangial cells.</a> Nephron. 58 (1), 75-84 (1991).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktów interesów, finansowych lub innych.

Choroby związane z nerkami są bardzo rozpowszechnione, a myszy są szeroko stosowane jako główny model zwierzęcy do badania tych schorzeń ze względu na ich genetyczne podobieństwo do ludzi i dostępność dobrze ugruntowanych modeli chorób. Komórki mezangialne odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu prawidłowej struktury i funkcji kłębuszków nerkowych, zapewniając wsparcie strukturalne, regulując filtrację kłębuszkową i uczestnicząc w odpowiedziach immunologicznych. Chociaż istnieją różne techniki eksperymentalne izolowania kom...

Kłębuszek nerkowy to sieć naczyń włosowatych, która spełnia podstawowe zadanie filtrowania krwi do tworzenia moczu1. Komórki mezangialne (MC) są osadzone w macierzy mezangialnej, znajdującej się między naczyniami włosowatymi kłębuszków nerkowych i są wyjątkowo rozmieszczone, aby wpływać na dynamikę kłębuszków nerkowych poprzez swoje różnorodne funkcje2. MC odgrywają kluczową rolę w kłębuszkach nerkowych, w tym w rozwoju kłębuszków nerkowych, strukturalnym wsparciu naczyń włosowatych kłębuszków nerkowych, fagocytozie i wytwarzaniu macierzy błony podstawnej kłębuszków nerkowych3. Badanie komórek mezangialnych ma kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszej wiedzy na temat fizjologii i patologii nerek.
Udział komórek mezangialnych w stanach patologicznych jest również godny uwagi. W odpowiedzi na uszkodzenie lub chorobę kłębuszków nerkowych, taką jak nefropatia cukrzycowa lub kłębuszkowe zapalenie nerek, komórki mezangialne mogą się namnażać i wydzielać nadmiar składników macierzy zewnątrzkomórkowej, co prowadzi do stwardnienia kłębuszków nerkowych i upośledzenia funkcji nerek4,5. Zrozumienie funkcji i mechanizmów regulacyjnych komórek mezangialnych jest zatem niezbędne do opracowania strategii terapeutycznych w chorobach nerek.
Mysie komórki mezangialne umożliwiają badaczom modelowanie i badanie procesów molekularnych i komórkowych związanych z takimi stanami jak nefropatia IgA6, nefropatia cukrzycowa7, oraz ogniskowe segmentalne stwardnienie kłębuszków nerkowych (FSGS)8,9. Biorąc pod uwagę ich rolę w zwłóknieniu nerek i zapaleniu, mysie kłębuszkowe MC są często stosowane w badaniach klinicznych do oceny skuteczności związków terapeutycznych9,10. Ponadto mysie komórki mezangialne są ważnym narzędziem do badania wpływu różnych szlaków sygnałowych na czynność nerek, w tym szlaku RhoA/ROCK11 i szlaku transformującego czynnika wzrostu-beta (TGF-β)12. Badania te pomagają wyjaśnić, w jaki sposób te cząsteczki sygnałowe przyczyniają się do postępu choroby nerek. Niezależnie od tego, czy są wykorzystywane do modelowania chorób, opracowywania terapii czy badań nad transdukcją sygnału, mysie MC nadal służą jako kluczowe źródło wiedzy na temat zdrowia i chorób nerek.
Mackay et al. ustalili metodę pozyskiwania ex vivo linii komórkowych komórek nabłonka kłębuszkowego, mezangialnego i śródbłonka od myszy transgenicznych w 1988 roku13. Wilson i Stewart opracowali metodę izolowania i oczyszczania pierwotnych MC z tkanki nerkowej pacjenta, która obejmuje trzy rundy przesiewania i intensywne mycie mediami14. Menè i Stoppacciaro zaproponowali również metodę izolowania pierwotnych MC z tkanki nerkowej pacjenta lub szczura. Technika ta obejmuje dwie rundy przesiewania, dwa pchnięcia igłą i trawienie kolagenazą. Komórki uzyskane z 4-8 nerek szczurów są siane na płytce sześciodołkowej, chociaż wydajność jest stosunkowo niska15. Metody te wymagają rozbioru nerek na małe kawałki przed przetworzeniem. Dodatkowo, te podejścia potrzebują około 3-4 tygodni, aby uzyskać oczyszczone MC.
Myszy są najczęściej wykorzystywanymi eksperymentalnymi modelami zwierzęcymi w badaniach nad chorobami nerek. Jednak nadal brakuje systematycznej metody izolowania mysich MC. W tym badaniu opracowaliśmy zoptymalizowany protokół izolacji mysich MC i hodowli komórek ex vivo. Metoda ta może być stosowana w przypadku użycia pierwotnych mysich MC nerek do badań eksperymentalnych. W porównaniu z poprzednimi metodami, takie podejście eliminuje potrzebę cięcia tkanek i przesiewania przed trawieniem. Zamiast tego cała nerka myszy jest mielona za pomocą młynka do komórek i bezpośrednio trawiona kolagenazą. Roztwór wytrawiający jest następnie dwukrotnie przesiewany, przy czym wszystkie komórki są zbierane na drugim sicie i ponownie zawieszane. Ta metoda pozwala dwóm nerkom myszy wyprodukować wystarczającą ilość komórek, aby w ciągu 10 dni wysiać od dwóch do trzech 100-milimetrowych szalek hodowlanych. Oczyszczone MC są następnie otrzymywane poprzez hodowlę i oczyszczanie przy użyciu specjalistycznej pożywki zawierającej D-walinę. Komórki te mogą być wielokrotnie pasażowane, zamrażane, ożywiane i hodowane bez uszczerbku dla wzrostu komórek lub ekspresji białek. Sprzęt niezbędny do tych zabiegów jest łatwo dostępny dla podstawowych laboratoriów biomedycznych, a cały proces trwa zaledwie 2-3 tygodnie w celu uzyskania komórek docelowych. Metoda ta nadaje się do badań z udziałem mysich MC w celu zbadania chorób lub mechanizmów związanych z nerkami, ponieważ jest skuteczna i oszczędza czas.

<table><tbody><tr><td>100 &mikro; m Sitko do komórek</td><td>Biosharp</td><td>BS-100-CS</td><td></td></tr><tr><td>100 mm szalka Petriego</td><td>Sorfa</td><td>230301</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Probówka wirówkowa</td><td>Sorfa</td><td>411000</td><td></td></tr><tr><td>15 mm szklane naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Sorfa</td><td>201200</td><td></td></tr><tr><td>180 kDa Plus Marker białkowy</td><td>Vazyme</td><td>MP201-01</td><td></td></tr><tr><td>2 mM L-glutamina</td><td>BasalMedia</td><td>S210JV</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>Biosharp</td><td>BL539A</td><td></td></tr><tr><td>40 &mikro; m Sitko do komórek</td><td>Biosharp</td><td>BS-40-XBS</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówka wirówkowa</td><td>Sorfa</td><td>41000</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Szalka Petriego</td><td>Sorfa</td><td>230201</td><td></td></tr><tr><td>75% Alkohol</td><td>Knowles</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>96 dołkowe płytki do hodowli komórkowych, antybiotyki</td><td>Servicebio</td><td>CCP-96H</td><td></td>poddane działaniu TC</tr><tr><td>(10 &mu; g/ml ceftriaksonu plus 100 &mu; g / ml gentamycyny)</td><td>NCM</td><td>C100C5</td><td></td></tr><tr><td>BCA (kwas bicunchoninowy) Zestaw do oznaczania białek</td><td>CWBIO</td><td>CW0014S</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do liczenia komórek-8</td><td>Oriscience</td><td>CB101</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>FV-3000</td><td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DMSO Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Earle's Zrównoważony roztwór soli (1x EBSS)&nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>&nbsp; C0213</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Excell</td><td>FSP500</td><td></td></tr><tr><td>Analizator komórek fluorescencyjnych</td><td>Mira FL&nbsp;</td><td>Countstar</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount media</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Insulina, transferyna, roztwór selenu 100x (ITS -G)</td><td>Gibco</td><td>41400045</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwróconej fluorescencji</td><td>Bufor</td> do lizy Olympus <td>IX83</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Adilab</td><td>PP1101</td><td></td></tr><tr><td>Jednoetapowy zestaw do przygotowania PAGE (10%)</td><td>Oriscience</td><td>PB102</td><td></td></tr><tr><td>Jednoetapowy zestaw do przygotowania strony (7,5%)</td><td>Oriscience</td><td>PB101</td><td></td></tr> PE przeciwciało <tr><td>anty-mysie CD140b</td><td>Biolegend</td><td>323605</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Tłuczek do komórek plastikowych</td><td>Biofil</td><td>&nbsp; CC-4090</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteinaz</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Vazyme</td><td>E802-01</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana insulina ludzka</td><td>Solarbio</td><td>11061-68-0</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Bufor do ładowania próbek (5x)</td><td>Servicebio</td><td>G2013</td><td></td></tr><tr><td>Specjalnie dostosowany Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium (D-walina zamiast L-waliny)</td><td>Procell</td><td>WH3923U222</td><td></td></tr><tr><td>TBS (Tris Buffered Saline)&nbsp;</td><td>Servicebio</td><td>G0001-2L</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Biosharp</td><td>BS084</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Biosharp</td><td>BS100</td><td></td></tr><tr><td>Typ I Kolagenaza</td><td>Solarbio</td><td>&nbsp; Zobacz materiał CB140</td><td></td></tr></tbody></table>

optymalizacja izolacji i oczyszczania mysich komórek mezangialnych kłębuszków nerkowych

Optimizing Isolation and Purification of Murine Glomerular Mesangial Cells

Komórki mezangialne (MCs) to komórki zrębu znajdujące się w środkowej przestrzeni kłębuszków nerkowych, pełniące kluczowe funkcje w homeostazie kłębuszków nerkowych. Metody izolacji, oczyszczania i hodowli kłębuszkowych MC są opracowywane i optymalizowane od 1980 roku do stosowania w badaniach biomedycznych, szczególnie w dziedzinie nefrologii. Myszy są najczęściej wykorzystywanymi eksperymentalnymi modelami zwierzęcymi w badaniach nad chorobami nerek. W tym badaniu opracowaliśmy zoptymalizowany protokół izolacji mysich MC i hodowli komórek ex vivo. Komórki te mogą być wielokrotnie pasażowane, zamrażane, ożywiane i hodowane bez uszczerbku dla wzrostu komórek lub ekspresji białek. To zoptymalizowane podejście znacznie skraca czas trwania badania dla badaczy i umożliwia długoterminową ochronę komórek. Niezbędny sprzęt do zabiegów jest łatwo dostępny w podstawowym laboratorium biomedycznym, a etapy procedury są proste. Pozyskanie komórek docelowych wymaga tylko 2-3 tygodni, co stanowi skrócenie o co najmniej 1 tydzień w porównaniu z istniejącymi metodami.

W niniejszym badaniu opracowano zoptymalizowany protokół izolacji mysich komórek mięśni gładkich (MCs) oraz ich hodowli ex vivo. Z tego co nam wiadomo, nie istnieje standardowa metoda walidacji pierwotnych MCs ex vivo. Zgodnie z wcześniejszymi publikacjami, MCs charakteryzują się ekspresją αSMA, wimentyny i fibronektyny3,14,15. Do wykrycia poziomów ekspresji MCs wykorzystano analizę Western blot. MCs izolowane ...

To badanie opracowało zoptymalizowany protokół izolacji mysich komórek mezangialnych (MC) i ich hodowli komórkowej ex vivo. Komórki te mogą być wielokrotnie pasażowane, zamrażane, ożywiane i hodowane bez uszczerbku dla wzrostu komórek lub ekspresji białek.

Optymalizacja izolacji i oczyszczania mysich komórek mezangialnych kłębuszków nerkowych

Mesangial cells (MCs) are stromal cells located in the middle space of the glomerulus, with pivotal functions in glomerular homeostasis. Methods for ...

Jedno z naszych badań koncentruje się na zaburzeniach czynności nerek związanych ze szpiczakiem mnogim. Aby wesprzeć nasze badania, opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy protokoły pierwotnej hodowli mysich komórek mezangialnych. Sprzęt niezbędny do przeprowadzenia zabiegów jest łatwo dostępny, a poszczególne etapy procedury są proste.Pozyskanie komórek docelowych trwa tylko od dwóch do trzech tygodni. Technika ta ułatwia badania nad nerkami i wspiera badania nad funkcją komórek mezangialnych w modelach chorób, rozwojem terapeutycznym lub badaniami nad transdukcją sygnału. Aby rozpocząć izolację mysich komórek mezangialnych lub MC od prawidłowo uśpionego zwierzęcia, za pomocą nożyczek i pęsety należy aseptycznie usunąć nerki myszy i umieścić je na szalce Petriego.Przepłucz nerki zrównoważonym roztworem soli Earle'a, a następnie użyj pęsety, aby ostrożnie usunąć tkankę łączną i torebkę nerkową. Zmniejsz nerkę w pionie o połowę za pomocą skalpela. Dodaj trzy do czterech mililitrów roztworu kolagenazy I na szalkę Petriego i dokładnie zmiel tkankę plastikowym tłuczkiem do komórek.Odpipetować całą tkankę i roztwór z szalki Petriego do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Opłucz szalkę Petriego jednym do dwóch mililitrów roztworu kolagenazy I, aby zapewnić całkowity transfer tkanki. Umieść probówkę w wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 120 obrotów na minutę przez 30 minut.Następnie dodać równą objętość roztworu zatrzymującego lub pożywki hodowlanej do mieszaniny. Odpipetować roztwór z probówki wirówkowej i przepuścić go przez sitko o średnicy 100 mikronów. Zebrać filtrat w 50-mililitrowej probówce wirówkowej.Przepuścić filtrat przez sitko o średnicy 40 mikronów, zatrzymując tylko komórki na sitku. Kilkakrotnie przepłucz sitko pożywką hodowlaną, aby zmaksymalizować zbieranie komórek. Przenieś zebrane komórki z sitka do nowej 50-mililitrowej probówki wirówkowej.Odwirować zawiesinę o masie 600 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu ponownie zawieś komórki w naczyniu do hodowli komórkowych zgodnie z pożądaną gęstością komórek. Umieść naczynia w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 95% powietrzem i 5% dwutlenkiem węgla.Dodaj jeden do dwóch mililitrów PBS wzdłuż wewnętrznej krawędzi naczynia hodowlanego, aby przepłukać komórki. Użyj pipety, aby usunąć cały PBS z dna naczynia, a następnie dodaj 10 mililitrów pożywki hodowlanej wzdłuż wewnętrznej krawędzi naczynia. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, zwykle w ciągu siedmiu do 10 dni, umyj komórki dwukrotnie sterylnym PBS.Dodaj 0,25% roztworu trypsyny do naczynia, aby trypsynizować komórki. Umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy większość komórek wykazuje zaokrągloną morfologię i odrywa się od powierzchni, zakończ trypsynizację, dodając równą objętość pożywki dwa.Odwirować komórki o masie 600 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie zawiesić je w pożywce drugiej. MC wyizolowane w tym badaniu wykazywały znacznie wysoką ekspresję alfa-SMA, fibronektyny i wimentyny. Barwienie immunofluorescencyjne oczyszczonych i hodowanych MC przeprowadzone po 10 dniach hodowli w pożywce drugiej wykazało, że ponad 95% komórek wyrażało zarówno alfa-SMA, jak i wimentynę.

optimizing-isolation-purification-murine-glomerular-mesangial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym raporcie opisujemy metodę izolacji i hodowli niszy komórek progenitorowych z embrionalnej nerki myszy, która może być wykorzystana do badania szlaków sygnalizacyjnych regulujących komórki macierzyste/progenitorowe rozwijającej się nerki. Hodowane komórki są bardzo podatne na traktowanie małymi cząsteczkami i białkami rekombinowanymi, a co istotne, również na transdukcję wirusową, co umożliwia efektywną manipulację badanymi szlakami.

Izolacja i hodowla komórek ze strefy nefrogennej embrionalnej nerki myszy

Ten film opisuje metodę izolowania nienaruszonych kłębuszków nerkowych od nerek myszy. Otrzymane w ten sposób kapsułkowane i zdecapsulowane kłębuszki nerkowe mogą być dalej wykorzystywane do hodowli komórek nabłonka ciemieniowego z mysiej nerki.

Izolacja kłębuszków nerkowych: technika uzyskiwania nienaruszonych kłębuszków nerkowych z mysiej nerki

W tym filmie pokazujemy kroki izolacji i oczyszczania komórek nabłonka kanalików nerkowych dla szerokiego zakresu badań biologii molekularnej i hodowli komórkowych.

Izolacja mysich komórek nerkowych: technika izolowania i generowania pierwotnej kultury komórek nabłonka kanalików nerkowych

Techniki, które są niezawodne i skuteczne w izolacji komórek odpornościowych nerek, są potrzebne do dalszych zastosowań. Wymaga to znakowania powierzchniowego przeciwciałami niewielkiej liczby komórek odpornościowych nerek. W niniejszym artykule opisujemy zwięzłą metodę izolacji komórek odpornościowych nerek, która pozornie osiąga ten cel.

Niezawodna i wysokowydajna izolacja komórek odpornościowych nerek

Przedstawiono protokół izolacji pierwotnego mikrogleju z mysich mózgów. Technika ta pomaga w pogłębieniu obecnego zrozumienia schorzeń neurologicznych. Wirowanie w gradiencie gęstości i separacja magnetyczna są połączone w celu uzyskania wystarczającej wydajności próbki o wysokiej czystości. Ponadto przedstawiamy etapy charakterystyki mikrogleju.

Charakterystyka i izolacja pierwotnego mikrogleju myszy za pomocą wirowania w gradifikacji gęstości

Głównym celem tego protokołu jest efektywne izolowanie żywotnych pierwotnych kultur kłębuszków nerkowych z minimalnymi zanieczyszczeniami do wykorzystania w różnych dalszych zastosowaniach. Wyizolowane kłębuszki nerkowe zachowują relacje strukturalne między typami komórek składowych i mogą być hodowane ex vivo przez krótki czas.

Skuteczna metoda przesiewania w celu odizolowania nienaruszonych kłębuszków nerkowych z nerki dorosłego szczura

Tutaj prezentujemy protokół do mysiego znakowania in vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszkowych za pomocą biotyny. Protokół ten zawiera informacje o tym, jak perfuzja nerek myszy, izolowanie kłębuszków nerkowych i przeprowadzanie endogennej immunoprecypitacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Izolacja kłębuszków nerkowych i znakowanie in vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszków nerkowych

Zoptymalizowaliśmy protokół izolacji i oczyszczania mysich perycytów serca do podstawowych badań i badania ich potencjału biologicznego i terapeutycznego.

Izolacja i oczyszczanie perycytów serca myszy

Ten artykuł opisuje metodę hodowli i analizy wyrostków komórek kłębuszkowych nabłonków ciemieniowych zamkniętych kłębuszków wyizolowanych z nerki myszy. Metoda ta może być stosowana do badania szlaków zaangażowanych w proliferację i migrację komórek nabłonka okładzinowego.

Rozrost kłębuszków nerkowych jako test ex vivo do analizy szlaków zaangażowanych w aktywację komórek nabłonka ciemieniowego

Artykuł opisuje metodę izolowania warunkowo unieśmiertelnionych komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych z nerek transgenicznych myszy wykazujących ekspresję termolabilnego wirusa małp 40 i fotoaktywowalnych mitochondriów,PhAM wyciętych. Opisujemy procedurę izolacji kłębuszków nerkowych z całych nerek za pomocą kulek, etapów trawienia, wysiewu i hodowli GECs-CD31 dodatnich.

Izolacja warunkowo unieśmiertelnionych komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych myszy z fluorescencyjnymi mitochondriami

Poznaj zoptymalizowaną metodę izolacji i hodowli mysich komórek mezangialnych kłębuszków nerkowych przy użyciu trawienia kolagenazą. Technika ta umożliwia wielokrotne podziały i zamrażanie komórek z zachowaniem ich właściwości.

Optymalizacja izolacji i oczyszczania mysich komórek mezangialnych kłębuszków nerkowych

Przeglądaj więcej filmów