Name: Szpatułka Montevideo Urządzenie do witryfikacji zarodków ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T15:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Poznaj metodę witryfikacji zarodków ssaków za pomocą szpatułki Montevideo. Protokół umożliwia szybkie zamrażanie mysich i owczych zarodków przed implantacją z wysoką przeżywalnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Alejo Menchaca za jego wkład w rozwój Spatula MVD. GS otrzymał dofinansowanie z Biotechnology Postgraduate Program - Facultad de Ciencias - Universidad de la República (https://webmasterbiotecnol.wixsite.com/biotec1) (numer grantu: GS 2437 347). GS, MNM i MC otrzymały dofinansowanie od FOCEM - Fondo para la Convergencia Estructural del Mercosur (https://focem.mercosur.int/es/) (numer grantu: COF 03/11). GS i MC są stypendystami Sistema Nacional de Investigadores, Agencia Nacional de Investigación e Innovación w Urugwaju. (https://www.anii.org.uy/). Fundatorzy (Podyplomowy Program Biotechnologii - Facultad de Ciencias -Universidad de la República; FOCEM - Fondo para la Convergencia Estructural del Mercosur; Sistema Nacional de Investigadores, Agencia Nacional de Investigación e Innovación, Urugwaj) nie odgrywała żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Zwierzęta wykorzystane do pozyskania embrionów myszy były utrzymywane i traktowane zgodnie z prawem krajowym 18.611 oraz międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami11. Protokół eksperymentalny (numer zezwolenia #007-18) został odpowiednio zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Institut Pasteur de Montevideo (wyrażono pisemną zgodę). Protokoły eksperymentalne dla oocytów/embrionów owiec zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Fundación IRAUy (protokół #001-2017), zgodnie z wytycznymi ARRIVE12, i były realizowane zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami11.
1. Witryfikacja (Rysunek 2)
<ol>
	<li>Przygotowanie szpatułek MVD
	<ol>
		<li>Skróć końcówkę do nakładania żelu (patrz Tabela materiałów), odcinając pierwsze 10 mm oraz stożek końcowy. 
		UWAGA: Pozwala to uzyskać krótszą, prostą końcówkę, co ułatwia końcowe uszczelnienie za pomocą słomki 0,5 mL (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Chwyć koniec końcówki do nakładania żelu pęsetą zegarmistrzowską nr 5 (patrz Tabela materiałów) w odległości około 1,0 cm od wierzchołka. Ostrożnie umieść końcówkę w płomieniu palnika Bunsena (patrz Tabela materiałów) i przytrzymaj przez 8-10 s, aby uformować platformę w kształcie płatka o powierzchni około 1 mm2.</li>
		<li>Wyjmij z płomienia i mocno przytrzymaj pęsetą przez 5 s.</li>
		<li>Za pomocą stereomikroskopu (patrz Tabela materiałów) sprawdź, czy uformowała się platforma w kształcie płatka (~ 1 mm2) i czy krawędź dystalna jest szczelna. 
		UWAGA: Platforma musi być zamknięta na końcu dystalnym, aby zapobiec infiltracji LN2 podczas witryfikacji. Upewnij się, że platforma jest czysta i wolna od plastikowych nitek. Jeśli jest zbyt mała lub posiada nitki, przytnij końcówkę i powtórz procedurę.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.1.1-1.1.4, aby przygotować wymaganą liczbę szpatułek (1 szpatułka = do 40 embrionów myszy).</li>
		<li>Zesterylizuj szpatułki za pomocą promieniowania ultrafioletowego (UV) lub tlenku etylenu i przechowuj je w sterylnej probówce lub pudełku.</li>
		<li>W dniu witryfikacji wyjmij szpatułki, trzymając je za koniec przeciwległy do platformy. Włóż pręt identyfikacyjny (patrz Tabela materiałów) do każdej szpatułki i umieść je na podstawie stereomikroskopu. Oznacz pręt markerem permanentnym lub etykietą odporną na ciekły azot. 
		UWAGA: Podczas manipulowania szpatułkami zawsze unikaj dotykania platformy. Całkowita długość kompletnego urządzenia (szpatułka + słomka 0,5 mL + pręt identyfikacyjny) nie powinna przekraczać długości kielicha o więcej niż 1 cm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworów do witryfikacji
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór FS: Rozpuść 1,5 g medium do gradientu gęstości (patrz Tabela materiałów) i 0,85 g sacharozy (patrz Tabela materiałów) w 5 mL fosforanowego roztworu soli buforowanej (PBS; patrz Tabela materiałów). Podgrzewaj w łaźni wodnej w temperaturze wrzenia do całkowitego rozpuszczenia, a następnie wysterylizuj za pomocą filtra 0,22 µm (patrz Tabela materiałów). 
		UWAGA: Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.</li>
		<li>Przygotuj roztwór przedwitryfikacyjny (PV): W dniu witryfikacji wymieszaj 10% glikolu etylenowego (patrz Tabela materiałów), 10% dimsylu (patrz Tabela materiałów) i 80% medium M2 (patrz Tabela materiałów). Do 5 szpatułek potrzebna jest całkowita objętość 100 µL.</li>
		<li>Przygotuj roztwór witryfikacyjny (V): W dniu witryfikacji połącz 15% glikolu etylenowego, 15% dimsylu, 10% medium M2 i 60% roztworu FS. Do 5 szpatułek wymagana jest całkowita objętość 100 µL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Proces odwodnienia i witryfikacji embrionów
	<ol>
		<li>Przygotuj LN2: Wlej LN2 do odpowiedniego pojemnika (np. izolowanego pojemnika polistyrenowego o wymiarach 10 cm x 30 cm x 20 cm) i umieść w nim tyle słomek 0,5 mL, ile szpatułek zostanie użytych. 
		UWAGA: Aby ułatwić wizualizację platformy szpatułki podczas manipulacji w LN2, sugeruje się użycie kolorowego izolowanego pojemnika polistyrenowego z dnem, aby uzyskać efekt kontrastu. 
		OSTROŻNIE: Podczas pracy z LN2 należy nosić odpowiednie okulary ochronne i rękawice (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Przygotuj roztwory: Na plastikowej szalce Petriego o średnicy 100 mm (patrz Tabela materiałów) umieść następujące krople: 100 µL M2, 20 µL roztworu PV i 20 µL roztworu V dla każdej szpatułki.</li>
		<li>Witryfikuj embriony: Umieść embriony przeznaczone do witryfikacji w kropli M2. Przenoś po 30-40 embrionów jednocześnie, inkubując je w kropli roztworu PV przez 30 s, a następnie w kropli roztworu V przez kolejne 30 s w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Użyj wyciągniętej kapilary szklanej (patrz Tabela materiałów) z zestawem rurki aspiracyjnej (patrz Tabela materiałów). Przed pobraniem embrionów napełnij kapilarę co najmniej 1 µL odpowiedniego roztworu. 
		UWAGA: Embriony będą znajdować się na różnych wysokościach w kroplach, dlatego należy dostosować mikrometr stereomikroskopu, aby je zlokalizować. Pobierz embriony z każdej kropli, gdy pozostanie 10 s. Wszystkie manipulacje z embrionami muszą być przeprowadzane pod stereomikroskopem.</li>
		<li>Załaduj embriony: Aspiruj embriony przy użyciu minimalnej ilości roztworu V (np. ~ 0,1 µL) i szybko umieść je na platformie szpatułki.</li>
		<li>Zanurzenie w LN2: Po załadowaniu embrionów natychmiast zanurz platformę szpatułki w LN2 na 5 s (trzymając szpatułkę ręką za jej pręt). Następnie, utrzymując szpatułkę w oparach LN2, uszczelnij ją słomką 0,5 mL za pomocą długiej pęsety ze stali nierdzewnej (patrz Tabela materiałów). 
		UWAGA: Przed uszczelnieniem usuń LN2 ze słomki, aby zapobiec rozszerzalności podczas ogrzewania. Upewnij się, że szpatułka i słomka są prawidłowo wyrównane, aby uniknąć kontaktu kropli z embrionami ze ścianką słomki. Dla wygody uszczelnione szpatułki mogą pozostać w pojemniku z LN2 aż do załadowania wszystkich szpatułek embrionami, uzupełniając LN2 w razie potrzeby.</li>
		<li>Powtórz procedurę: Powtórz kroki od 1.3.3 do 1.3.7 dla każdej grupy embrionów, używając nowej pary kropli PV i V.</li>
		<li>Przechowywanie: Przenieś szpatułki do kielichów (patrz Tabela materiałów), a następnie do naczynia storage dewar z LN2 (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat procesu witryfikacji z użyciem LN2 obejmujący manipulację zarodkami, roztwory M2, PV i V oraz Spatula MVD." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68176/68176fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat procesu witryfikacji z użyciem Spatula MVD. Więcej szczegółów znajduje się w tekście. Utworzono w BioRender. Meikle, M. (2025) https://BioRender.com/x96y902. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68176/68176fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
2. Ogrzewanie (Rysunek 3)
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów
	<ol>
		<li>Przygotować 1 M roztwór sacharozy, rozpuszczając 0,85 g sacharozy w 2,5 mL pożywki M2. Roztwór wysterylizować za pomocą filtra 0,22 µm. 
		UWAGA: Roztwór ten można przygotować i przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.</li>
		<li>Przygotować roztwory sacharozy o stężeniach 0,5 M i 0,25 M poprzez rozcieńczenie 1 M roztworu sacharozy odpowiednią objętością pożywki M2.</li>
		<li>Utrzymywać roztwory sacharozy w temperaturze 37 °C na płycie grzejnej (patrz Tabele materiałów) do momentu rozpoczęcia procesu ogrzewania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie płyty do ogrzewania
	<ol>
		<li>Na plastikowej szalce Petri o średnicy 100 mm nanieść następujące krople roztworów: kroplę 500 µL sacharozy 0,5 M, kroplę 50 µL sacharozy 0,5 M oraz kroplę 50 µL sacharozy 0,25 M dla każdej szpatułki przeznaczonej do ogrzania. Nanieść trzy krople pożywki M2 (po 100 µL każda) do płukania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Proces ogrzewania 
	UWAGA: Proces ogrzewania odbywa się w temperaturze pokojowej (RT), np. 20-22 °C, na podstawie stereomikroskopu.
	<ol>
		<li>Wyjąć szczelnie zamknięte szpatułki z naczynia Dewara. Umieścić je w odpowiednim pojemniku z LN2. Patrz Rysunek 3.</li>
		<li>Umieścić płytę do ogrzewania na stereomikroskopie. Trzymając podstawę szpatułki pęsetą ze stali nierdzewnej, wyciągnąć ręką w rękawiczce najpierw pręt identyfikacyjny, a następnie słomkę. Szybko zanurzyć platformę zawierającą embriony w kropli 500 µL sacharozy 0,5 M.</li>
		<li>Upewnić się, że wszystkie embriony wpadły do kropli; w razie potrzeby delikatnie poruszyć szpatułką, aby ułatwić ich uwolnienie. Przenieść embriony do wyciągniętej kapilary szklanej, umieścić je w kropli 50 µL roztworu sacharozy 0,5 M i inkubować przez 2 min.</li>
		<li>Przenieść embriony do kropli 50 µL roztworu sacharozy 0,25 M i inkubować przez kolejne 2 min. 
		UWAGA: Przed umieszczeniem embrionów w każdym roztworze, należy uprzednio napełnić kapilarę roztworem, który będzie użyty.</li>
		<li>Na koniec przemyć embriony trzy razy w oddzielnych kroplach pożywki M2, aby usunąć sacharozę.</li>
		<li>Inkubować embriony w warunkach odpowiednich dla każdego gatunku przez co najmniej 1 h przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat procesu ogrzewania; rehydratacja embrionów w malejącym stężeniu sacharozy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68176/68176fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Schemat procesu ogrzewania metodą Spatula MVD. Szczegóły opisano w tekście. Utworzono w BioRender. Meikle, M. (2025) https://BioRender.com/k91k191. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68176/68176fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<ol><li>Crispo, M., Meikle, M. N., Rülicke, T. Cryopreservation of Valuable Mouse and Rat Lines. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrispo%2C+M+%22Rodent+Quality+Control%3A+Genes+and+Bugs.+Laboratory+Animal+Science+and+Medicine%22">Rodent Quality Control: Genes and Bugs. Laboratory Animal Science and Medicine</a>. , Springer. Cham. (2024).</li>
<li>Lloyd, K., Franklin, C., Lutz, C., Magnuson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility%3A+use+mouse+biobanks+or+lose+them%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reproducibility: use mouse biobanks or lose them.</a> Nature. 522 (7555), 151-153 (2015).</li>
<li>Hart-Johnson, S., Mankelow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archiving+genetically+altered+animals%3A+a+review+of+cryopreservation+and+recovery+methods+for+genome-edited+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Archiving genetically altered animals: a review of cryopreservation and recovery methods for genome-edited animals.</a> Lab Anim. 56 (1), 26-34 (2022).</li>
<li>Shaw, J. M., Jones, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminology+associated+with+vitrification+and+other+cryopreservation+procedures+for+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Terminology associated with vitrification and other cryopreservation procedures for oocytes and embryos.</a> Hum Reprod Update. 9 (6), 583-605 (2003).</li>
<li>Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of oocytes and embryos.</a> Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).</li>
<li>dos Santos Neto, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryotolerance+of+Day+2+or+Day+6+in+vitro+produced+ovine+embryos+after+vitrification+by+Cryotop+or+Spatula+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Cryotolerance of Day 2 or Day 6 in vitro produced ovine embryos after vitrification by Cryotop or Spatula methods.</a> Cryobiology. 70 (1), 17-22 (2015).</li>
<li>Renard, J. P., Babinet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+survival+of+mouse+embryos+after+rapid+freezing+and+thawing+inside+plastic+straws+with+1-2+propanediol+as+cryoprotectant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">High survival of mouse embryos after rapid freezing and thawing inside plastic straws with 1-2 propanediol as cryoprotectant.</a> J Exp Zool. 230 (3), 443-448 (1984).</li>
<li>Tsang, W. H., Chow, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryo+cryopreservation+utilizing+a+novel+high-capacity+vitrification+spatula%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mouse embryo cryopreservation utilizing a novel high-capacity vitrification spatula.</a> Biotechniques. 46 (7), 550-552 (2009).</li>
<li>Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+vitrification+for+cryopreservation+of+human+oocytes+and+embryos%3A+the+Cryotop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method.</a> Theriogenology. 67 (1), 73-80 (2007).</li>
<li>Nakao, K., Nakagata, N., Katsuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+vitrification+procedure+for+cryopreservation+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Anim%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient vitrification procedure for cryopreservation of mouse embryos.</a> Exp Anim. 46 (3), 231-234 (1997).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%22">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals</a>. , National Academies Press. Washington, DC. (1996).</li>
<li>du Sert, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ARRIVE+guidelines+2.0%3A+Updated+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biol. 18 (7), e3000410(2020).</li>
<li>Meikle, M. N., Schlapp, G., Menchaca, A., Crispo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+volume+Spatula+MVD+vitrification+method+improves+embryo+survival+compared+to+traditional+slow+freezing%2C+both+for+in+vivo+and+in+vitro+produced+mice+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Minimum volume Spatula MVD vitrification method improves embryo survival compared to traditional slow freezing, both for in vivo and in vitro produced mice embryos.</a> Cryobiology. 84, 77-81 (2018).</li>
<li>Momozawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+vitrification+of+mouse+embryos+using+the+Kitasato+Vitrification+System+as+a+novel+vitrification+device%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Efficient vitrification of mouse embryos using the Kitasato Vitrification System as a novel vitrification device.</a> Reprod Biol Endocrinol. 15 (1), 29(2017).</li>
<li>Stringfellow, D. A., Givens, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStringfellow%2C+DA+%22Manual+of+the+International+Embryo+Transfer+Society%3A+A+Procedural+Guide+and+General+Information+for+the+use+of+Embryo+Transfer+Technology+Emphasizing+Sanitary+Procedures%22">Manual of the International Embryo Transfer Society: A Procedural Guide and General Information for the use of Embryo Transfer Technology Emphasizing Sanitary Procedures</a>. , International Embryo Transfer Society. (2010).</li>
<li>Dos Santos-Neto, P. C., Cuadro, F., Barrera, N., Crispo, M., Menchaca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+survival+and+birth+rate+after+minimum+volume+vitrification+or+slow+freezing+of+in+vivo+and+in+vitro+produced+ovine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Embryo survival and birth rate after minimum volume vitrification or slow freezing of in vivo and in vitro produced ovine embryos.</a> Cryobiology. 78, 8-14 (2017).</li>
<li>Schlapp, G., Meikle, M. N., Pórfido, J. L., Menchaca, A., Crispo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zygote+cryobanking+applied+to+CRISPR%2FCas9+microinjection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zygote cryobanking applied to CRISPR/Cas9 microinjection in mice.</a> PLoS One. 19 (7), e0306617(2024).</li>
<li>Kamoshita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+of+oocyte%2Fembryo+vitrification+in+mammals+from+rodents+and+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Sci+J%22%5BJournal%5D)">Recent advances of oocyte/embryo vitrification in mammals from rodents and large animals.</a> Anim Sci J. 95 (1), e13931(2024).</li>
<li>Qiu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos+using+low+concentrations+of+cryoprotectants%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Equilibrium vitrification of mouse embryos using low concentrations of cryoprotectants.</a> Cryobiology. 98, 127-133 (2021).</li>
<li>Tsang, W. H., Chow, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mammalian+embryos%3A+Advancement+of+putting+life+on+hold%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mammalian embryos: Advancement of putting life on hold.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 163-175 (2010).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Szpatułka MVD to łatwe w montażu, niedrogie urządzenie do witryfikacji o minimalnej objętości o wysokiej zdolności zatrzymywania zarodków i optymalnym wykorzystaniu ciekłego azotu dewara. Ta metoda okazała się prosta, szybka i solidna. Średnio osiągnęliśmy nie tylko wysokie wskaźniki odzysku zarodków i przeżywalności zarodków zeszklonych (~90%), ale także dobre wyniki reprodukcyjne podczas wykonywania transferu zarodków u myszy (~80% wskaźnik ciąż i ~30% wskaźnik urodzeń), które są porównywalne z innymi metodami witryfik...

Wydajność generowania zwierząt modyfikowanych genetycznie (GM) znacząco wzrosła dzięki opracowaniu metod opartych na endonukleazach, w szczególności CRISPR/Cas9. Wiele laboratoriów na całym świecie wytwarza różne linie myszy i szczurów GM, które powinny być krio konserwowane, aby zapobiec dryfowi genetycznemu i zachować integralność oryginalnego fenotypu1. Ponadto archiwizacja eliminuje konieczność ciągłego rozrodu, co często prowadzi do nadmiernej liczby zwierząt. Niektóre laboratoria przesyłają linie myszy GM w formie krio konserwowanych embrionów lub plemników do międzynarodowych repozytoriów, co ułatwia wymianę tych modeli, unikając jednocześnie transportu żywych zwierząt. Zapewnia to dostęp do linii bez konieczności powtarzającego się generowania identycznych modeli zwierząt GM2. Z tych powodów krio konserwacja embrionów i plemników ma kluczowe znaczenie w każdej jednostce zajmującej się zwierzętami GM. Zazwyczaj do przechowywania linii GM preferowana jest krio konserwacja embrionów, ponieważ zawierają one kompletny genom diploidalny z modyfikacjami i mogą być łatwo odzyskiwane poprzez transfer embrionów.
Witryfikacja jest procesem nierównowagowym, który charakteryzuje się brakiem równowagi między wodą wnikającą do komórki a wodą tworzącą kryształy pozakomórkowe wokół niej. Metoda ta zapobiega tworzeniu się wewnątrzkomórkowych kryształów lodu, co odróżnia ją od metody powolnego zamrażania (SLF)3 (patrz Rycina 1). Wysokie stężenie krioprotektantów oraz bezpośredni kontakt z ciekłym azotem (LN2) umożliwiają ultraszybkie chłodzenie (~40 °C/s), co pozwala na osiągnięcie stanu szklistego próbek w ciągu kilku sekund. Co więcej, witryfikacja jest szybsza, łatwiejsza i tańsza niż powolne zamrażanie4. Wymaga minimalnej ilości LN2 i zazwyczaj wykorzystuje prosty sprzęt, który można nabyć komercyjnie lub wykonać samodzielnie5 (patrz Rycina 1).
Dodatkowo, proces rozmrażania jest zazwyczaj szybki i powtarzalny. Powinien być on przeprowadzany sprawnie, aby uniknąć toksyczności krioprotektantów i zachować stan szklisty3. Podczas zamrażania embrionów wiele laboratoriów bierze pod uwagę wygodę użytkowania urządzenia nośnego, jego niezawodność, wytrzymałość, pojemność oraz koszty.
W rutynowej kriokonserwacji embrionów owiec i myszy preferujemy metodę witryfikacji z użyciem szpatułki o minimalnej objętości, wykorzystując urządzenie Spatula Montevideo (MVD)6. Początkowo stosowaliśmy metodę powolnego zamrażania7, lecz szybko przeszliśmy na witryfikację. Aby stworzyć prostsze i bardziej kompaktowe urządzenie do naczynia Dewar z LN2, zmodyfikowaliśmy domowej roboty szpatułkę według Tsang i Chow (2009)8, która jest wkładana do krioprobówki, w celu opracowania Spatula MVD, która jest uszczelniona słomką 0,5 mL (patrz Tabela materiałów). Szpatułka posiada końcówkę do nakładania żelu (patrz Tabela materiałów), w której poprzez delikatne stopienie końcówki precyzyjną pęsetą formuje się platformę o powierzchni około 1 mm², tworząc płytkę w kształcie płatka do nakładania embrionów. Platforma ta może pomieścić do 40 embrionów myszy w małej kropli do witryfikacji. Do otwartego końca końcówki do nakładania żelu wkłada się pręt identyfikacyjny (patrz Tabela materiałów).
Celem niniejszej metody jest witryfikacja zarodków w prosty, szybki i niedrogi sposób, który dodatkowo pozwala oszczędzić miejsce w naczyniu Dewara z azotem. System ten jest z sukcesem stosowany od wielu lat, zapewniając doskonałe wskaźniki przeżywalności zarodków (~97%) oraz wyniki reprodukcyjne, szczególnie w przypadku zarodków mysich. Ponieważ Spatula MVD jest przygotowywana w laboratorium, jest to metoda niskokosztowa w porównaniu z urządzeniami komercyjnymi9. Co więcej, w porównaniu z zastosowaniem kriop probówek, pozwala ona zaoszczędzić miejsce w naczyniu Dewara z azotem8,10.
<img alt="Schemat procesu kriokonserwacji; powolne zamrażanie a witryfikacja, przechowywanie w ciekłym azocie, zachowanie komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68176/68176fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Porównanie dwóch głównych technik stosowanych w kriokonserwacji embrionów. Rycina została zmodyfikowana za zgodą Crispo i wsp.1. Utworzona w BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68176/68176fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; Filtr M&nbsp;</td><td>Sartorius Sartorius (Wyspa Sar</td><td>16534</td><td>Filtr strzykawkowy Minisart 0,2 i mikro; L</td></tr><tr><td>0,5 ml słomki&nbsp;</td><td>Minitube</td><td>13408/0044</td><td>Paillette średnia typu francuskiego</td></tr><tr><td>Zespół rurki aspiratora&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Nr kat. A5177</td><td></td></tr><tr><td>Palnik Bunsena&nbsp;</td><td>Indulab</td><td>7000134</td><td></td></tr><tr><td>Sulcotlenek dimetylu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Zobacz materiał D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>102466</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll PM70&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F2878 (angielski)</td><td>Gradient gęstości średni</td></tr><tr><td>Końcówka ładowarki żelu</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>10411193</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara szklana&nbsp;</td><td>Lotnisko Marienfeld</td><td>2900000</td><td>Rurka kapilarna z mikrohematokrytem</td></tr><tr><td>Rękawice do obsługi LN2&nbsp;</td><td>Osłona tymczasowa</td><td>CE0338 powiedział:</td><td>Rękawice kriogeniczne</td></tr><tr><td>Puchary</td><td>Minitube</td><td>16913/1133</td><td></td></tr><tr><td>Gogle do obsługi LN2&nbsp; &nbsp;</td><td>3 mln</td><td>&nbsp; 40661-00000-10</td><td>Powłoka przeciwmgielna i zapobiegająca zarysowaniom</td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>Labec powiedział:</td><td>LA-SH-II-5B</td><td>Model cyfrowy</td></tr><tr><td>Pręt identyfikacyjny&nbsp;</td><td>Technologie IMV</td><td>6326</td><td>Niesterylny LG48 mm</td></tr><tr><td>Izolowany pojemnik styropianowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magazyn LN2 dewar</td><td>Taylora-Whartona</td><td>XT21-AI</td><td>Krionauka</td></tr><tr><td>Długie pęsety ze stali nierdzewnej</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>11000-25</td><td></td></tr><tr><td>M2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Zobacz materiał M7167</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Domowej roboty</td><td></td><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami. Zwykle przygotowuje się 1 l stężonego buforu 5x, a następnie rozcieńcza się do 1x. Przepis: 40 g chlorku sodu, 1 g chlorku potasu, 7,2 g bezwodnego fosforanu disodowego, 1,2 g fosforanu monopotasowego. Dodaj wodę destylowaną i sterylizuj w autoklawie.</td></tr><tr><td>Plastikowa szalka Petriego&nbsp;</td><td>Sokół</td><td>&nbsp; &nbsp; 351029</td><td>Bakteriologiczna szalka Petriego bez TC</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>SZ2-LGB</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Zobacz materiał S1888</td><td></td></tr><tr><td>Zegarmistrz" S #5 Kleszcze&nbsp;</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>11254-20</td><td></td></tr></tbody></table>

szpatułka montevideo urządzenie do witryfikacji zarodków ssaków

Spatula Montevideo Device for the Vitrification of Mammalian Embryos

W badaniu tym opisano wydajną i opłacalną metodę witryfikacji kriokonserwacji zarodków myszy i owiec, znaną jako Spatula Montevideo (MVD). Protokół ten wykorzystuje domowej roboty szpatułkę jako urządzenie nośne, które jest przygotowywane z końcówką do ładowania żelu. Zarodki są szybko równoważone w dwóch domowych roztworach krioprotekcyjnych o rosnącym stężeniu, ładowane do szpatułki, a następnie bezpośrednio zanurzane w ciekłym azocie. Około 30-40 zarodków myszy w fazie przedimplantacyjnej można załadować na szpatułkę, która jest następnie zamykana słomką o pojemności 0,5 ml. Użycie szpatułek zamiast krioprobówek, które są często używane do przechowywania zeszklonych zarodków, optymalizuje przestrzeń w ciekłym azocie Dewara. Dodatkowo proces ocieplania wymaga jedynie domowego roztworu sacharozy o malejącym stężeniu, aby nawodnić zarodki i przywrócić ich morfologię. Nasze laboratorium od ponad 10 lat z powodzeniem stosuje Spatula Montevideo do zarodków przedimplantacyjnych myszy i owiec. Szpatułka Montevideo wykazała średni wskaźnik wyzdrowienia (zarodki odzyskane/zszklone) wynoszący 84% i wskaźnik przeżywalności (zarodki zdolne do życia/ozdrowieńców) wynoszący 97% w zarodkach myszy. Witryfikacja mysich zarodków przyniosła lepsze wyniki niż powolne zamrażanie, chociaż nie zaobserwowano żadnych różnic w wynikach reprodukcyjnych (ciąża, poród i wskaźniki urodzeń). W przypadku zarodków owiec za pomocą Spatula Montevideo osiągnięto podobne wskaźniki przeżywalności i rozwoju zarodków w porównaniu z urządzeniem komercyjnym. Chociaż odsetek ciąż był wyższy w przypadku urządzenia komercyjnego, wskaźnik przeżywalności jagniąt nie różnił się znacząco między urządzeniami. Metoda witryfikacji Spatula Montevideo jest prostą techniką kriokonserwacji, która może być stosowana do przechowywania nadwyżek zarodków, tworzenia kopii zapasowych genetycznie zmodyfikowanych linii myszy i modeli owiec oraz ułatwiania ich wymiany między naukowcami na całym świecie.

Początkowo stosowaliśmy tradycyjną metodę powolnego zamrażania opartą na roztworach glikolu propylenowego, słomkach i urządzeniach do zamrażania z kontrolowaną szybkością7. Jednak po rozważeniu metody witryfikacji jako potencjalnie łatwiejszej i bardziej opłacalnej opcji, przeprowadziliśmy badanie w celu porównania wyników tradycyjnego powolnego zamrażania (SLF) i Spatula MVD w 8-komórkowych zarodkach myszy pochodzących z in vivo i 2-komórkowych in vitro 13</sup...

W tym miejscu przedstawiamy protokół Spatula Montevideo do witryfikacji zarodków przedimplantacyjnych myszy i owiec, składający się z domowej szpatułki i wykorzystujący domowe roztwory. Zarodki są szybko równoważone w dwóch roztworach krioprotekcyjnych o rosnącym stężeniu, ładowane na szpatułkę, zanurzane w ciekłym azocie, a na koniec zamykane słomką o pojemności 0,5 ml.

Szpatułka Montevideo Urządzenie do witryfikacji zarodków ssaków

This study describes an efficient and cost-effective vitrification method for mouse and sheep embryo cryopreservation known as the Spatula Montevideo ...

Wygenerowanie genetycznie zmodyfikowanych modeli myszy, a następnie kriokonserwacja linii jako kopii zapasowej. W tym celu potrzebujemy łatwej, taniej, wydajnej i powtarzalnej metody witryfikacji zarodków. Mikroiniekcja lub elektroporacja CRISPR-Cas9 może być wykonana w zeszklonych, rozgrzewających zygotach myszy i zwierząt gospodarskich, co skutkuje bardziej elastycznym harmonogramem i zmniejszeniem liczby używanych zwierząt.Witryfikacja zarodków wykorzystuje ultraszybkie chłodzenie, aby zapobiec tworzeniu się kryształków lodu, zachowując integralność komórkową. Technika ta naprzód badania kriobiologiczne, umożliwiając badania nad żywotnością zarodków, stabilnością genetyczną i wynikami długoterminowego przechowywania. Zarówno szpatułka MVD, jak i roztwory są domowej roboty. Szpatułka jest uszczelniona słomką o pojemności 0,5 mililitra, zajmującą minimalną ilość miejsca w ciekłym azocie Dewara.[Instruktor] Aby rozpocząć, odetnij pierwsze 10 milimetrów i stożek końcówki ładowarki do żelu. Używając szczypiec zegarmistrzowskich numer pięć, przytrzymaj koniec końcówki ładowarki żelu około jednego centymetra od końcówki i delikatnie umieść ją w płomieniu palnika Bunsena na 8 do 10 seku

spatula-montevideo-device-for-the-vitrification-of-mammalian-embryos

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Błona chorioallantoiczna (CAM) zarodka kurczaka stanowi unikalne, naturalnie immunodeficyjne środowisko hodowlane do badania angiogenezy i tumorigenzy. Niniejszy artykuł wideo prezentuje poszczególne etapy hodowli kurczaka ex ovo, aplikację substancji potencjalnie angiogennych oraz skuteczną inokulację komórek i tkanek nowotworowych na powierzchni CAM.

Hodowla kurcząt ex ovo oraz test CAM ex ovo: jak to naprawdę działa

Ten film opisuje wstrzyknięcie projądrkowe wektorów lentiwirusowych do przestrzeni okołokomórkowej zapłodnionego zarodka myszy. Lentiwirus zawiera transgen, który jest włączany do genomu zapłodnionego zarodka, ostatecznie dając początek transgenicznym myszom.

Wstrzyknięcie periviteliny opartej na wektorze lentiwirusowym: metoda transdukcji interesującego genu do zapłodnionych jednokomórkowych oocytów myszy

Transfer zarodków macicowo-jajowodowych wykorzystuje połączenie macicowo-jajowodowe jako barierę zapobiegającą odpływowi zarodka, który może wystąpić podczas transferu macicy. Mężczyźni poddani wazektomii są zobowiązani do pozyskania biorców pseudociężarnych do transferu zarodków. Omówiono obie techniki.

Transfer zarodka macicowo-jajowodowego i wazektomia w modelu mysim

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

MicroSecure Vitrification został opracowany jako niekomercyjny, aseptyczny system zamkniętych urządzeń do witryfikacji, który jest zgodny z dobrymi praktykami FDA w zakresie produkcji i obchodzenia się z tkankami. Ze względu na wycofanie z przemysłu hydrofobowych słomek zarodkowych, procedura witryfikacji została zmodyfikowana tak, aby obejmowała wewnętrzną uszczelkę przed standardową wewnętrzną zatyczką bawełnianą.

Zmodyfikowana witryfikacja MicroSecure: bezpieczna, prosta i wysoce skuteczna procedura kriokonserwacji ludzkich blastocyst

Techniki wspomaganego rozrodu (ARTs) są w ciągłym emulucie ocenianym w celu poprawy wyników i zmniejszenia związanego z tym ryzyka. Manuskrypt ten opisuje minimalnie inwazyjną procedurę transferu zarodków z skutecznym protokołem kriokonserwacji, który pozwala na wykorzystanie królików jako idealnego zwierzęcego modelu rozrodu człowieka.

Małoinwazyjny transfer zarodków i witryfikacja zarodków w optymalnym stadium zarodka w modelu królika

Tutaj prezentujemy poklatkowy protokół morfometryczny, aby śledzić intensywność kurczenia się i ponownego rozszerzania blastocyst podczas interwencji prewitryfikacyjnych i regeneracji po ociepleniu. Zastosowanie protokołu jest możliwe w laboratoriach zapłodnienia pozaustrojowego wyposażonych w mikroskopy poklatkowe i jest zalecane w opracowaniu optymalnej metody witryfikacji blastocyst.

Protokół morfometryczny do obiektywnej oceny zachowania blastocyst podczas etapów witryfikacji i ocieplania

Biopsja blastocysty i witryfikacja są niezbędne do skutecznego przeprowadzenia preimplantacyjnych badań genetycznych. Podejście polegające na sekwencyjnym otwieraniu osłonki przejrzystej i pobieraniu 7-8 komórek trofektodermy w 5-7 dniu po inseminacji ogranicza zarówno liczbę wymaganych manipulacji, jak i narażenie zarodka na nieoptymalne warunki środowiskowe.

Biopsja ludzkiej blastocysty i witryfikacja

Tutaj opisujemy metodę ogrzewania zeszklonych ludzkich blastocyst, hodowli ich przez okres implantacji in vitro, trawienia ich do pojedynczych komórek i zbierania wczesnych komórek trofoblastu do dalszych badań.

Jednokomórkowy zbiór komórek trofoblastu w zarodkach ludzkich w okresie okołoimplantacyjnym

Tutaj prezentujemy zoptymalizowaną metodę natychmiastowego usuwania części kompleksów cumulus-oocyt po pobraniu komórek jajowych, aby przyspieszyć proces obserwacji IVF, skracając czas potrzebny na usunięcie komórek ziarnistych, minimalizując narażenie oocytów na czynniki zewnętrzne i nie utrudniając rozwoju zarodka, ostatecznie poprawiając efektywność procedur laboratoryjnych IVF.

Natychmiastowe częściowe usunięcie kompleksów cumulus-oocyty: wyrafinowane podejście do szybkiej obserwacji zapłodnienia in vitro

Poznaj metodę witryfikacji zarodków ssaków za pomocą szpatułki Montevideo. Protokół umożliwia szybkie zamrażanie mysich i owczych zarodków przed implantacją z wysoką przeżywalnością.

Szpatułka Montevideo Urządzenie do witryfikacji zarodków ssaków

Przeglądaj więcej filmów