Preparat mitochondrialny z mikrogleju do analizy glikanów

Ogólnie rzecz biorąc, nasze badania koncentrują się na określeniu mechanistycznej roli cukrów lub glikanów oraz na tym, jak możemy wykorzystać te komórkowe i subkomórkowe szlaki glikozylacji w starzeniu się, a także w zaburzeniach mózgu. Obecnie istnieje luka w wiedzy na temat roli, a także modulacji glikanów subkomórkowych w różnych patofizjologiach chorób, w tym w ostrych i przewlekłych zaburzeniach mózgu, takich jak udar mózgu i choroba Alzheimera. Ten protokół i nasze badania mają na celu pogłębienie wiedzy na temat roli glikanów w interakcjach neuroimmunologicznych oraz tego, jak można wykorzystać te informacje do projektowania lepszych i skuteczniejszych terapii ośrodkowego układu nerwowego.

[Narrator] Na początek uzyskaj komórki mikrogleju BV-2 pochodzące od myszy C57BL/6. Utrzymuj je w pożywce DMEM o niskiej zawartości glukozy uzupełnionej o 10% FBS, 1% penicyliny, streptomycyny i 1% aminokwasów endogennych. Hoduj komórki w kolbach T175, aż osiągną zbieżność od 70 do 80%. Odessać pożywkę z kolby. Ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze pożywki wzrostowej. Używając błękitu trypanowego, policz komórki. Odwirować komórki w dwumililitrowej probówce mikrowirówkowej o stężeniu 500 G przez pięć minut. Ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant. Dodaj 800 mikrolitrów odczynnika do izolacji mitochondriów A i wiruj ze średnią prędkością przez pięć sekund. Następnie inkubuj probówkę na lodzie dokładnie przez dwie minuty. Dodaj 10 mikrolitrów odczynnika B do izolacji mitochondriów i wiruj z maksymalną prędkością przez pięć sekund. Inkubuj na lodzie przez pięć minut, wirując z maksymalną prędkością co minutę. Teraz dodaj 800 mikrolitrów odczynnika do izolacji mitochondriów C i odwróć probówkę do wymieszania. I wirować przy 700 G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. Przenieść supernatant do nowej dwumililitrowej probówki i odwirować przy 3000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant zawierający część cytozolową do nowej probówki. Osad zawiera izolowane mitochondria. Dodaj 500 mikrolitrów odczynnika do izolacji mitochondriów C do osadu i odwiruj przy 12 000 G przez pięć minut. Ponownie zawiesić izolowane mitochondria w 50 mikrolitrach buforu do izolacji białek. Pozostawić zawiesinę na lodzie na 20 minut. Zassać i dozować trzy razy, a następnie pozostawić na lodzie na 20 minut, wirując przed użyciem. Jeśli nie jest w pełni rozpuszczony, dodaj kolejne 50 mikrolitrów buforu i puli w tej samej probówce. Wirować przy 13 000 G przez 10 minut. Po odzyskaniu i zamrożeniu supernatantu wysuszyć za pomocą koncentratora próżniowego. W celu wykrycia uwolnionych glikanów należy ponownie zawiesić wysuszone i połączone glikany w 50 mikrolitrach wody klasy LCMS. Odpipetować pięć mikrolitrów zawieszonych glikanów mitochondrialnych na miejsce próbki na szkiełku teflonowym z mikrostudzienką. Jonizuj i wykrywaj N-glikany w trybie jonizacji ujemnej za pomocą rozpuszczalnika do elektrorozpylania składającego się z 60% acetonitrylu i jednego milimolowego kwasu octowego przy natężeniu przepływu dwóch mikrolitrów na minutę i napięciu 3,2 kilowolta. Połącz IR-MALDESI ze spektrometrem masowym HRAM ustawionym na zdolność rozdzielczą 240 000 pełnej szerokości przy połowie maksimum przy stosunku masy do ładunku 200, aby przeanalizować stosunek masy do ładunku wynoszący 502 000 w trybie jonizacji ujemnej. Ręcznie zidentyfikuj glikany sprzężone z N, wyszukując masy monoizotopowe. Potwierdź rozkłady izotopowe za pomocą odstępów między masą a ładunkiem, aby określić podwójnie i potrójnie naładowane jony o minimalnym progu strumienia jonów wynoszącym 1,000 jonów na sekundę. Przelicz widma mas surowych dla stosunku masy do ładunku na neutralne masy monoizotopowe. Następnie prześlij masy monoizotopowe do internetowego narzędzia do przewidywania struktury oligosacharydów, aby określić potencjalny skład glikanów. Potwierdź adnotacje, korzystając z eksperymentalnie dobranej bazy danych glikosteroidy. Upewnij się, że każda identyfikacja mieści się w marginesie dokładności pomiaru masy 2,5 części na milion, zawiera rdzeń i połączoną strukturę glikanu i wyklucza pentozę, kwas 3-deoksy-d-manno-okt-2-ulozon lub monosacharydy kwasu uronowego. Stężenia białek mitochondrialnych uzyskane z sześciu niezależnych preparatów nie wykazały istotnej zmienności, co potwierdza wysoką odtwarzalność. Zachodnia analiza krwi wykazała ekspresję CoxIV tylko we frakcjach mitochondrialnych, a GAPDH tylko we frakcjach cytoplazmatycznych, potwierdzając czystość izolacji mitochondrialnych i brak zanieczyszczenia niemitochondrialnego. Wyraźne sjalylowane, fosforylowane i siarczanowane struktury N-glikanów wykryto w ekstraktach mitochondrialnych przy użyciu IR-MALDESI. Wysokie kwadraty testujące dobroć dopasowania potwierdziły wykrycie glikanów sprzężonych z N z jednym i dwoma adduktami chloru, potwierdzając wykrycie tych kompozycji glikanowych za pomocą IR-MALDESI.