Name: Preparat mitochondrialny z mikrogleju do analizy glikanów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Poznaj metodę izolacji mitochondriów z komórek mikrogleju BV-2 i analizy glikanów N-glikanowych za pomocą spektrometrii masowej IR-MALDESI. Protokół umożliwia badanie roli glikanów w interakcjach neuroimmunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Sethowi Eisenbergowi, doktorantowi w Muddiman Lab na NCSU, za pomoc w nagraniu wideo protokołu spektrometrii mas. Badania te były częściowo wspierane przez School of Engineering Innovation Fellows Program na University of Alabama w Birmingham, AG068309 do D.J.T. i R01GM087964-12 do DCM. Schematy w tym rękopisie zostały narysowane przy użyciu BioRender.

1. BV2 Hodowla linii komórkowych mikrogleju
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki BV-2 (komórki mikrogleju pochodzące od myszy C57BL / 6) w pożywce DMEM o niskim poziomie glukozy uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% Penicillium-Streptomycyną (PenStrep) i 1% aminokwasami endogennymi (NEAA).</li>
	<li>Hoduj komórki w kolbach T-175 i pozwól im osiągnąć 70-80% konfluencji.</li>
	<li>Podzielić komórki przez inkubację z enzymami dysocjacji komórek przez 5 minut w temperaturze 37 °C w 5% CO2 , a następnie inaktywację enzymów z równą objętością pożywki komórkowej i odwirowanie komórek przez 5 minut w temperaturze 500 × g w temperaturze pokojowej (RT). 
	UWAGA: Zastosowane tutaj enzymy dysocjacji komórek są łagodniejsze dla komórek BV2 niż trypsyna i mogą być stosowane do ochrony ekspresji antygenu na powierzchni komórki.</li>
	<li>Odessać pożywkę, ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki wzrostowej i policzyć komórki za pomocą błękitu trypanowego (patrz Tabela Materiałów). 
	UWAGA: Na tym etapie użyliśmy automatycznego licznika komórek, aby zliczyć komórki.</li>
	<li>Aby przeprowadzić izolację mitochondriów, kontynuuj, jeśli osad komórkowy zawiera 2 × 107 (20 milionów komórek/osad).</li>
</ol>
2. Izolacja mitochondriów od komórek mikrogleju
UWAGA: Pracuj szybko, trzymając wszystko na lodzie przez cały czas trwania procedury. Zestaw do izolacji mitochondriów używany do izolacji mitochondriów składa się z trzech składników: odczynników A (bufor do lizy komórek), odczynnika B (bufor stabilizujący) i odczynnika C (bufor do płukania mitochondriów). Inhibitory proteazy należy dodać do odczynnika A i odczynnika C bezpośrednio przed użyciem.
<ol>
	<li>Osad 2 × 107 komórek, odwirowując zebrane komórki w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml w temperaturze 500 × g przez 5 minut. Ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 800 μl odczynnika do izolacji mitochondriów A (bufor do lizy komórek), wirować ze średnią prędkością przez 5 s i inkubować probówkę na lodzie dokładnie przez 2 minuty 
	UWAGA: Nie należy przekraczać 2 minut inkubacji.</li>
	<li>Dodać 10 μl odczynnika B do izolacji mitochondriów (bufor stabilizujący), wirować z maksymalną prędkością przez 5 s i inkubować probówkę na lodzie przez 5 minut, wirując z maksymalną prędkością co minutę.</li>
	<li>Dodać 800 μl odczynnika C do izolacji mitochondriów (bufor do przemywania mitochondriów), kilkakrotnie odwrócić probówkę w celu wymieszania i odwirować probówkę o stężeniu 700 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Nie wirować.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 2,0 ml i wirować z prędkością 3 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant (porcje cytozolowe) do nowej probówki. Osad zawiera izolowane mitochondria.</li>
	<li>Dodać 500 μl odczynnika C do izolacji mitochondriów do osadu i odwirować przy 12 000 × g przez 5 minut.</li>
	<li>Użyć osadu do ilościowego oznaczania i przetwarzania białka lub przechowywać go w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>
3. Szacowanie białka za pomocą testu mikroBCA
UWAGA: Oszacowanie białka dla tego protokołu może być przeprowadzone przy użyciu różnych odczynników i testów. Oznaczanie ilościowe białek cytozolowych lub mitochondrialnych można przeprowadzić poprzez normalizację w stosunku do całkowitego stężenia białka użytego w teście.
<ol>
	<li>Przygotować wzorce albuminy surowicy bydlęcej (BSA) między 0 μg/ml a 200 μg/ml (0 μg/mL, 0,5 μg/ml, 1 μg/mL, 2,5 μg/ml, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/ml, 40 μg/mL, 200 μg/ml) i ślepe próby tylko z buforem do lizy.</li>
	<li>Dodać 150 μl każdego wzorca do płaskodennej 96-dołkowej płytki zawierającej próbki.</li>
	<li>Wymieszaj 25 części odczynnika Micro BCA MA (roztwór kwasu bicinchoninowego (BCA)) i 24 części odczynnika MB (roztwór siarczanu miedzi) z 1 częścią odczynnika MC (bufor stabilizujący) (25:24:1, odczynniki MA:MB:MC), aby utworzyć działający odczynnik. Dodać 150 μl zmieszanego odczynnika BCA do każdej próbki i wzorca.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Za pomocą czytnika płytek zmierzyć absorbancję przy długości fali 562 nm i określić ilościowo stężenie białka za pomocą krzywej wzorcowej. Odjąć absorbancję wzorca ślepej próby od pomiaru absorbancji wszystkich innych indywidualnych wzorców i powtórzeń nieznanych próbek, aby uzyskać stężenia białka w próbce.</li>
</ol>
4. Kontrola jakości preparatu mitochondrialnego (western blot)
<ol>
	<li>Zawiesić osad mitochondrialny w buforze buforu do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) w celu przeprowadzenia kwantyfikacji białka. Określić stężenie białka dla każdej próbki za pomocą testu mikro BCA.</li>
	<li>Denaturacja próbek w buforze do próbek w temperaturze 94 oC przez 5 minut.</li>
	<li>Załadować równe ilości (20 μg) białka mitochondrialnego do prefabrykowanych żeli (patrz tabela materiałów) wraz ze znacznikiem masy cząsteczkowej.</li>
	<li>Uruchom żel na 50 minut przy 100 V. 
	UWAGA: Czas pracy może się różnić, dlatego należy przerwać podawanie żelu, gdy białka dotrą do końca żelu wskazanego przez barwnik w buforze próbki.</li>
	<li>Przenieść białka z żelu na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) przy użyciu protokołu suchego transferu w systemie transferu western blot przez 7 minut przy napięciu 20 V.</li>
	<li>Wyjąć membranę i zablokować za pomocą roztworu blokującego (tabela 1) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać odpowiednie rozcieńczenia pierwszorzędowego przeciwciała do błony w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 oC (COXIV = 1:3 000, GAPDH = 1:3 000). 
	UWAGA: Brak zanieczyszczenia jądrowego, retikulum endoplazmatycznego (ER) w preparacie mitochondrialnym można zbadać przy użyciu dodatkowych markerów, takich jak lamina (marker jądrowy) i ERp57 (marker ER) w zachodnich plamach.</li>
	<li>Płukać membranę przez 3 x 15 minut buforem do płukania (tabela 1).</li>
	<li>Inkubować błonę z odpowiednim rozcieńczeniem przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z HRP w buforze blokującym w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę</li>
	<li>Płukać membranę przez 3 x 15 min buforem do mycia.</li>
	<li>Do opracowania użyj zestawu substratów chemiluminescencyjnych</li>.
	<li>Zeskanuj membranę za pomocą imagera żelowego i membranowego.</li>
</ol>
5. Izolacja białek mitochondrialnych do ekstrakcji N-glikanów z mikrogleju
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić wyizolowane mitochondria w 50 μl buforu do izolacji białek (Tabela 1) i pozostawić na lodzie na 20 minut.</li>
	<li>Zassać i dozować trzy razy i pozostawić na 20 minut na lodzie (przed użyciem odwirować). Jeśli osad mitochondrialny nie jest w pełni rozpuszczony, dodaj kolejne 50 μl buforu izolacyjnego i puli do tej samej probówki.</li>
	<li>Wirować przy 13 000 × g przez 10 min.</li>
	<li>Odzyskać supernatant, zamrażać w temperaturze -80 oC przez co najmniej 1 godzinę i wysuszyć w miarę możliwości w koncentratorze próżniowym.</li>
	<li>Zawiesić przed izolacją glikanów przy użyciu buforu trawienia PNGazy (Tabela 1) dla IR-MALDESI.</li>
</ol>
6. Mitochondrialny preparat N -glikanów dla IR-MALDESI
<ol>
	<li>Załaduj 25-250 μg białka (w maksymalnej objętości 250 μl) wyizolowanych białek mitochondrialnych do filtra o masie cząsteczkowej 10 kDa (MWCO).</li>
	<li>Zredukować próbki białka, aby odsłonić ugrupowania glikanów, dodając 2 μl 1 M ditiotreitolu (DTT) do każdej próbki w filtrze.</li>
	<li>Rozcieńczyć próbkę 200 μl buforu trawiącego PNGazę i lekko przemieszać, aby uniknąć zakłócenia pracy filtra.</li>
	<li>Denaturację białek mitochondrialnych poprzez inkubację próbki w temperaturze 56 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Użyj 50 μl 1 M jodoacetamidu do alkilowania mitochondriów, aby uzyskać końcowe stężenie ~200 mM i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 60 minut.</li>
	<li>Aby dalej zagęścić zdenaturowane metody mitochondrialne, należy odwirować próbki o masie 14 000 × g przez 40 minut. Odrzucić przepływ.</li>
	<li>Przepłukać próbkę 100 μl buforu do trawienia PNGazy.</li>
	<li>Skoncentrować glikoproteinę na filtrze na 14 000 × g przez 20 minut i odrzucić przepływ. Powtórz etap mycia i koncentratu 2 razy, w sumie 3 razy, uzyskując koncentrat w martwej objętości filtra (~5 μL). Odrzuć cały przepływ.</li>
	<li>Wyrzuć fiolkę do pobierania po zakończeniu mycia. Użyj nowej fiolki do pobierania wszystkich przyszłych eluentów i płukania.</li>
	<li>Aby rozszczepić glikany ze zdenaturowanych glikowzorców mitochondrialnych, przenieś je do świeżej fiolki zbiorczej i dodaj 2 μl PNGazy wolnej od glicerolu (75 000 jednostek/ml) do filtra. Dodać 98 μl buforu mineralizującego PNGazy, zwiększając całkowitą objętość do 100 μl i mieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół na filtrze.</li>
	<li>Próbki inkubować w temperaturze 37 °C przez 18 godzin w celu enzymatycznego rozszczepienia wszystkich N-glikanów z białek mitochondrialnych.</li>
	<li>Eluować uwolnione mitochondrialne N-glikany, odwirowując próbkę o sile 14 000 × g przez 20 minut w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Przemyć glikany mitochondrialne, dodając 100 μl buforu trawiącego PNGazę do filtra i odwirować w temperaturze 14 000 × g przez 20 minut w temperaturze 20 °C. Zebrać płuczkę zawierającą pozostałe N-glikany w tej samej fiolce zbiorczej co eluent. Powtórzyć czynność 2 razy i wyjąć filtr z fiolki zbiorczej.</li>
	<li>Próbki glikanów mitochondrialnych inkubować w zamrażarce o temperaturze -80 °C do momentu zamrożenia (30-60 min) i wysuszyć do końca w temperaturze pokojowej w koncentratorze próżniowym (4-6 godzin dla 400 μl). 
	UWAGA: N-glikany mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy przed analizą. </li>
	<li>Wysuszone glikany sprzężone z azotem należy zawiesić w 50 μl wody klasy LC/MS bezpośrednio przed analizą IR-MALDESI.</li>
</ol>
7. Wykrywanie uwolnionych glikanów za pomocą spektrometrii mas IR-MALDESI
<ol>
	<li>Kalibrację masy należy wykonywać każdego dnia eksperymentu. Załadować roztwór kalibracyjny do pompy strzykawkowej i przecisnąć z szybkością 1,2 μl/min. Zastosuj napięcie 3,5 kV, aby uzyskać stabilny pióropusz elektrorozpylania do kalibracji masy zarówno w trybie dodatnim, jak i ujemnym.</li>
	<li>Odpipetować 5 μl zawieszonych glikanów mitochondrialnych na miejsce próbki na szkiełku teflonowym do mikrodołka.</li>
	<li>Do ablacji należy użyć lasera średniej podczerwieni działającego na długości fali 2,97 μm o energii 1,8 mJ na impuls.</li>
	<li>Jonizuj i wykrywaj N-glikany w trybie jonizacji ujemnej. Użyj rozpuszczalnika do elektrorozpylania składającego się z 60% acetonitrylu i 1 mM kwasu octowego, aby wytworzyć stabilny pióropusz elektrorozpylania o natężeniu przepływu 2 μl/min przy napięciu 3,2 kV.</li>
	<li>Aby przeprowadzić analizę, należy połączyć IR-MALDESI ze spektrometrem masowym HRAM ustawionym na zdolność rozdzielczą masy 240 000FWHM przy m/z 200, analizując od 500 do 2 000 m/z w trybie jonizacji ujemnej.</li>
	<li>Wyłącz automatyczną kontrolę wzmocnienia (AGC) i ustaw stały czas wtrysku na 90 ms. Użyj źródła EasyIC do wewnętrznej kalibracji każdego widma w czasie rzeczywistym, aby osiągnąć wysoką dokładność pomiaru masy (MMA).</li>
</ol>
8. Analiza danych mitochondrialnej N-glikanów 
<ol>
	<li>Ręczna identyfikacja glikanów sprzężonych z N poprzez wyszukiwanie mas monoizotopowych i potwierdzanie rozkładów izotopowych przy użyciu odstępów m/z w celu wyznaczenia podwójnie i potrójnie naładowanych jonów, które mają minimalny próg strumienia jonów wynoszący 1,000 jonów / s.</li>
	<li>Przelicz widma mas surowych ze stosunków m/z na neutralne masy monoizotopowe.</li>
	<li>Prześlij masy monoizotopowe do internetowego narzędzia do przewidywania struktury oligosacharydów, aby określić potencjalny skład glikanów. Potwierdzanie adnotacji za pomocą eksperymentalnie wyselekcjonowanej bazy danych glikomicznej20; upewnij się, że każda identyfikacja mieści się w marginesie 2,5 ppm MMA, zawiera rdzeń struktury glikanu sprzężonego z N (Hex3HexNAc2) i wyklucza monosacharydy pentozy, KDN lub HexA.</li>
	<li>Narysuj potwierdzone struktury glikanów za pomocą nomenklatury SNFG21.</li>
	<li>Uzyskaj względną obfitość glikanów z widm surowej masy i znormalizuj z ilością białka mitochondrialnego w μg, aby uzyskać jony/s/μg.</li>
	<li>Użyj analizy chi-kwadrat, aby przetestować dobroć dopasowania między teoretycznymi i eksperymentalnymi rozkładami glikanów sprzężonych z N w celu określenia liczby adduktów chloru. Pozwala to na bezpośrednie określenie liczby kwasów sjalowych19.</li>
</ol>

<ol><li>Dos Santos, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+microglial+cell+densities+across+brain+structures+and+mammalian+species%3A+Implications+for+brain+tissue+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Similar microglial cell densities across brain structures and mammalian species: Implications for brain tissue function.</a> J Neurosci. 40 (24), 4622-4643 (2020).</li>
<li>Shao, F., Wang, X., Wu, H., Wu, Q., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+neuroinflammation%3A+Crucial+pathological+mechanisms+in+traumatic+brain+injury-induced+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia and neuroinflammation: Crucial pathological mechanisms in traumatic brain injury-induced neurodegeneration.</a> Front Aging Neurosci. 14, 825086(2022).</li>
<li>Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiological+role+of+microglia+in+dynamic+surveillance%2C+phagocytosis+and+structural+remodeling+of+the+developing+cns%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The pathophysiological role of microglia in dynamic surveillance, phagocytosis and structural remodeling of the developing cns.</a> Front Mol Neurosci. 10, 191(2017).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+glycolytic+reprogramming+controls+microglial+inflammatory+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Early glycolytic reprogramming controls microglial inflammatory activation.</a> J Neuroinflammation. 18 (1), 129(2021).</li>
<li>Cătălin, B., Cupido, A., Iancău, M., Albu, C. V., Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+First+responders+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Rom+J+Morphol+Embryol%22%5BJournal%5D)">Microglia: First responders in the central nervous system.</a> Rom J Morphol Embryol. 54 (3), 467-472 (2013).</li>
<li>Cai, Y., Liu, J., Wang, B., Sun, M., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+neuroinflammatory+pathogenesis+of+alzheimer%27s+disease+and+related+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia in the neuroinflammatory pathogenesis of alzheimer's disease and related therapeutic targets.</a> Front Immunol. 13, 856376(2022).</li>
<li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia in neurodegeneration.</a> Nat Neurosci. 21 (10), 1359-1369 (2018).</li>
<li>Norat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+neurological+disorders%3A+Exploring+mitochondrial+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in neurological disorders: Exploring mitochondrial transplantation.</a> NPJ Regen Med. 5 (1), 22(2020).</li>
<li>Picca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+glia+remodeling+and+mitochondrial+dysfunction+in+neurodegeneration%3A+Antioxidant+supplementation+as+a+possible+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Age-associated glia remodeling and mitochondrial dysfunction in neurodegeneration: Antioxidant supplementation as a possible intervention.</a> Nutrients. 14 (12), 2406(2022).</li>
<li>Mcavoy, K., Kawamata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+mitochondrial+function+and+dysfunction+in+health+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial mitochondrial function and dysfunction in health and neurodegeneration.</a> Mol Cell Neurosci. 101, 103417(2019).</li>
<li>Fairley, L. H., Wong, J. H., Barron, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+microglial+immunometabolism+in+alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of microglial immunometabolism in alzheimer's disease.</a> Front Immunol. 12, 624538(2021).</li>
<li>Starossom, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-1+deactivates+classically+activated+microglia+and+protects+from+inflammation-induced+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Galectin-1 deactivates classically activated microglia and protects from inflammation-induced neurodegeneration.</a> Immunity. 37 (2), 249-263 (2012).</li>
<li>Puigdellívol, M., Allendorf, D. H., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialylation+and+galectin-3+in+microglia-mediated+neuroinflammation+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sialylation and galectin-3 in microglia-mediated neuroinflammation and neurodegeneration.</a> Front Cell Neurosci. 14, 162(2020).</li>
<li>Gerlach, J. Q., Kilcoyne, M., Eaton, S., Bhavanandan, V., Joshi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-carbohydrate-mediated+interaction+of+lectins+with+plant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-carbohydrate-mediated interaction of lectins with plant proteins.</a> Adv Exp Med Biol. 705, 257-269 (2011).</li>
<li>Cummings, R. D., Pierce, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+and+promise+of+glycomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">The challenge and promise of glycomics.</a> Chem Biol. 21 (1), 1-15 (2014).</li>
<li>Robichaud, G., Barry, J. A., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IR-MALDESI+mass+spectrometry+imaging+of+biological+tissue+sections+using+ice+as+a+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">IR-MALDESI mass spectrometry imaging of biological tissue sections using ice as a matrix.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 25 (3), 319-328 (2014).</li>
<li>Barry, J. A., Groseclose, M. R., Robichaud, G., Castellino, S., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+drug+and+metabolite+detection+in+liver+tissue+by+uv-maldi+and+ir-maldesi+mass+spectrometry+imaging+coupled+to+ft-icr+ms%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Assessing drug and metabolite detection in liver tissue by uv-maldi and ir-maldesi mass spectrometry imaging coupled to ft-icr ms.</a> Int J Mass Spectrom. 377, 448-155 (2015).</li>
<li>Pace, C. L., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+analysis+of+native+N-linked+glycans+by+IR-MALDESI%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Direct analysis of native N-linked glycans by IR-MALDESI.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 31 (8), 1759-1762 (2020).</li>
<li>Palomino, T. V., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+sialic+acid+content+of+N-linked+glycans+using+the+isotopic+pattern+of+chlorine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Predicting sialic acid content of N-linked glycans using the isotopic pattern of chlorine.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 34 (7), 1392-1399 (2023).</li>
<li>Mariethoz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomics%40expasy%3A+Bridging+the+gap%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Glycomics@expasy: Bridging the gap.</a> Mol Cell Proteomics. 17 (11), 2164-2176 (2018).</li>
<li>Varki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbol+nomenclature+for+graphical+representations+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Symbol nomenclature for graphical representations of glycans.</a> Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+glycopattern+alterations+of+mitochondrial+proteins+in+cerebral+cortex+between+rat+alzheimer%27s+disease+and+the+cerebral+ischemia+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparison of the glycopattern alterations of mitochondrial proteins in cerebral cortex between rat alzheimer's disease and the cerebral ischemia model.</a> Sci Rep. 7 (1), 39948(2017).</li>
<li>Dixit, B., Vanhoozer, S., Anti, N. A., O'Connor, M. S., Boominathan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enrichment+of+mitochondria+from+mammalian+cell+cultures+using+digitonin%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Rapid enrichment of mitochondria from mammalian cell cultures using digitonin.</a> MethodsX. 8, 101197(2021).</li>
<li>Kalathil, A. A., et al. New pathway for cisplatin prodrug to utilize metabolic substrate to overcome cancer intrinsic resistance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKalathil%2C+AA+%22central+science%22">central science</a>. 9, 1297-1312 (2023).</li>
<li>Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+screening+design+optimization+of+mass+spectrometry+parameters+for+sensitive+comparison+of+filter+and+solid+phase+extraction+purified%2C+inlight+plasma+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, inlight plasma N-glycans.</a> Anal Chem. 87 (14), 7305-7312 (2015).</li>
<li>Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+glycomics+and+proteomics+combined+purification+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A quantitative glycomics and proteomics combined purification strategy.</a> J Vis Exp. (109), e53735(2016).</li>
<li>Fischler, D. A., Orlando, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycan+release+efficiency%3A+A+quantitative+comparison+between+NaOCl+and+PNGase+F+release+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Tech%22%5BJournal%5D)">N-linked glycan release efficiency: A quantitative comparison between NaOCl and PNGase F release protocols.</a> J Biomol Tech. 30 (4), 58-63 (2019).</li>
<li>Tu, A., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+energy+deposition+in+infrared+matrix-assisted+laser+desorption+electrospray+ionization+with+and+without+the+use+of+ice+as+a+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Internal energy deposition in infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization with and without the use of ice as a matrix.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 30 (11), 2380-2391 (2019).</li>
<li>Barry, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+antiretroviral+drugs+in+tissue+by+IR-MALDESI+MSI+coupled+to+the+Q+exactive+and+comparison+with+LC-MS%2FMS+SRM+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Mapping antiretroviral drugs in tissue by IR-MALDESI MSI coupled to the Q exactive and comparison with LC-MS/MS SRM assay.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 25 (12), 2038-2047 (2014).</li>
<li>Samal, J., Palomino, T. V., Chen, J., Muddiman, D. C., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+of+charged+N-glycans+in+the+brain+by+infrared+matrix-assisted+laser+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection of charged N-glycans in the brain by infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization mass spectrometric imaging.</a> Anal Chem. 95 (29), 10913-10920 (2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Mikroglej jest rezydującymi komórkami odpornościowymi mózgu, a modyfikacje glikanów modulują immunofenotyp i funkcję mikrogleju. Te funkcje odpornościowe wymagają znacznej ilości energii komórkowej, która jest dostarczana głównie przez mitochondria. Warto zauważyć, że białka mitochondrialne również wykazują modyfikacje glikanów, które pozostały znacznie niedostatecznie zbadane ze względu na wyzwania technologiczne związane z badaniem subkomórkowej glikozylacji. Większość badań nad glikozylacją mitochondrialną opiera się ...

Mikroglej jest dominującym wrodzonym komórkiem odpornościowym w mózgu i stanowi 10-15% komórek w dorosłym mózgu1,2. Wykorzystują swój repertuar receptorów do dynamicznego monitorowania mikrośrodowiska mózgu i regulowania prawidłowego funkcjonowania mózgu w celu utrzymania homeostazy mózgu3. Mikroglej jest bardzo wrażliwy na zmiany w swoim mikrośrodowisku i ulega zmianom w morfologii komórek, immunofenotypie i funkcji w stanach patologicznych lub różnych stymulacjach. Stany aktywacji mikrogleju zależą od zapotrzebowania na energię komórkową wymaganą do ich funkcjonowania, takiego jak fagocytoza, produkcja cytokin lub naprawa tkanek. Dlatego metabolizm energii komórkowej odgrywa kluczową rolę w regulacji zmian w funkcjonowaniu mikrogleju4. Rozregulowanie mikrogleju prowadzi do nadmiernego uwalniania cytokin prozapalnych (np. IL-1β, TNF-α) i reaktywnych form tlenu (ROS), predysponując mózg do zapalenia nerwów5,6. Przewlekła dysregulacja mikrogleju i wynikające z niej środowisko neurozapalne stanowią podstawę dla neurodegeneracji7.
Mózg odpowiada tylko za 2% masy ciała, ale za to 20% całkowitego zużycia energii przez ciało. Mitochondria są głównym źródłem energii w komórkach mózgowych i odgrywają kluczową rolę w patogenezie zarówno ostrych, jak i przewlekłych zaburzeń mózgu8. Wcześniejsze badania wykazały silną korelację między aktywacją mikrogleju a dysfunkcją metaboliczną w starzeniu się9 oraz zaburzeniach związanych z wiekiem, takich jak choroba Alzheimera10,11, podkreślając kluczową rolę mitochondriów w starzeniu się komórek i neurodegeneracji. Upośledzona funkcja mitochondriów prowadzi do zmniejszonej produkcji energii, podwyższonego stresu oksydacyjnego i zwiększonego zapalenia nerwów podczas starzenia się i chorób związanych z wiekiem.
Podczas gdy obszerne badania wyjaśniły rolę mitochondriów w metabolizmie energetycznym, starzeniu się i zaburzeniach mózgu, rola powszechnych modyfikacji potranslacyjnych, takich jak glikozylacja, w biologii i funkcji mitochondriów pozostaje niewystarczająco zbadana. Glikozylacja, enzymatyczne dodawanie ugrupowań cukrowych zwanych glikanami do białek przez enzymy glikozylacji, jest najczęstszą modyfikacją potranslacyjną w większości komórek mózgowych, w tym mikrogleju. Aktywowany mikroglej moduluje swoją funkcję immunologiczną pod wpływem bodźców zapalnych poprzez regulację wewnątrzkomórkowej lub powierzchniowej ekspresji glikanów na powierzchni komórki12. Reakcje pro- i przeciwzapalne wykazywane przez mikroglej po stymulacji są również regulowane przez glikany13. Białka mitochondrialne mają również te modyfikacje glikanów, które regulują ich funkcję i lokalizację. Brakuje jednak szczegółowej analizy specyficznych dla komórki wzorców glikozylacji mitochondrialnej w mikrogleju ze względu na wyzwania techniczne związane z badaniem glikozylacji subkomórkowej. Pomimo dobrze scharakteryzowanej roli glikozylacji w modulowaniu fenotypu mikrogleju, rola glikanów w modulowaniu funkcji mitochondriów, a następnie immunofenotypu komórkowego w mikrogleju pozostaje słabo poznana.
Ograniczone badania nad glikozylacją białek mitochondrialnych skupiały się głównie na identyfikacji wzorców glikozylacji na podstawie lektyny. Lektyny to białka wiążące glikany, które wiążą biomolekularne ugrupowania glikanów14,15, którym brakuje specyficzności i zdolności do dostarczania szczegółowych informacji o składzie glikanów. Metody spektrometrii mas oferują szczegółową identyfikację składu glikanów w celu przezwyciężenia wyzwań analitycznych związanych z analizą lektyn. Jedna z takich metod, jonizacja elektronrozpylania z desorpcją laserową wspomaganą matrycą w podczerwieni (IR-MALDESI), wykorzystuje hybrydową strategię jonizacji, wykorzystując laser średniej podczerwieni do rezonansowego wzbudzania wody znajdującej się w próbkach biologicznych16 w celu desorpcji neutralnych gatunków i poddania ich ortogonalnemu pióropuszowi elektrorozpylania, a następnie analizie przy użyciu precyzyjnego spektrometru masowego Orbitrap o wysokiej rozdzielczości. IR-MALDESI został wcześniej zademonstrowany do bezpośredniej analizy metabolitów tkankowych17, z wyraźnymi zaletami szybkiej analizy18, metoda miękkiej jonizacji i przewidywalność zawartości kwasu sjalowego w glikanach związanych z N w oparciu o wzorce dystrybucji izotopowej adduktów chlorowanych glikanów19. Nie wykazano jednak adaptacji tej platformy do bezpośredniej analizy glikanów subkomórkowych.
Tutaj opisujemy protokół o wysokiej przepustowości do izolacji mitochondriów z komórek mikrogleju, izolacji mitochondrialnych N-glikanów oraz wykrywania i analizy mitochondrialnej N-glikanów za pomocą spektrometrii mas IR-MALDESI. Protokół ten będzie miał fundamentalne znaczenie dla odkrycia nowych spostrzeżeń na temat roli glikozylacji w funkcjonowaniu mitochondriów, potencjalnie identyfikując nowe cele terapeutyczne dla zaburzeń neurozapalnych i neurodegeneracyjnych.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amersham 600 imager</td><td>Cytvia&nbsp;</td><td>29194217</td><td>Imager żelowo-membranowy</td></tr><tr><td>Countess 3 automatyczny licznik komórek</td><td>Fisher Scientific</td><td>X003SZ1LY9</td><td></td></tr><tr><td>Sucha kąpiel Stdrd 4 blck 100-120V</td><td>Thermofisher scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>88870003</tr><tr><td>i-Blot2 Gel Transfer Device</td><td>Invitrogen</td><td>IB21001</td><td>System przenoszenia Western blot</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Cell Treat</td><td>04355223EA</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik</td><td></td> mikropłytek <td>82050-760</td><td></td></tr><tr><td>Mini zbiornik na żel</td><td>Invitrogen</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Open Air Rocker</td><td>Fisher Marka</td><td>88861025</td><td></td></tr><tr><td>Chłopiec z pipetą&nbsp;</td>Mieszalnik wirowy <td>BioTek</td><td>229310</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Integra- Odczynniki</td> do izolacji mitochondriów VWR<td></td><td></td></tr><<tr><td>strong> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji mitochondriów</td><td>Thermofisher scientific&nbsp;</td><td>89874</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor fosfotazy</td><td>Thermofisher naukowy&nbsp;</td><td></td><td></td>1861274</tr><tr><td>Inhibitor proteazy</td><td>Thermofisher naukowy&nbsp;</td><td>Izolacja 1861281</td><td></td></tr><tr><td>N-glikanu i odczynniki IR-MALDESI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11350</td><td>50% w rozpuszczalniku ESI</td></tr><tr><td>Acetonitryl&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34851-4L</td><td>1 mM w rozpuszczalniku ESI</td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A643500</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Roztwór kalibracyjny</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A39239</td><td>Pierce FlexMix</td></tr><tr><td>Ditiothreitol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AC426380100</td><td>1 M</td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A322-10VL</td><td></td></tr><tr><td>LC/MS klasa wody</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>047146.M6</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>Bulldog Bio</td><td>NZPP010</td><td>75000 U/mL, enzym do uwalniania N-glikanów&nbsp;</td></tr><tr><td>Izolacja N-glikanów i materiały eksploatacyjne IR-MALDESI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Filtry odśrodkowe</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>UFC501024</td> Spektrometr masowy <td>MWCO 10 kDa</td></tr><tr><td></td><td>Orbitrap Exploris 240</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mid-IR Laser</td><td>JGM Associates, Burlington, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teflonowy szkiełko mikrostudzienne</td><td>Prosolia, Indianapolis, IN, USA</td><td></td><td></td><</tr><tr><td>strong>N-glikanów oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlycoMod&nbsp;</td><td>Ekspasy&nbsp;</td><td></td><td>https://web.expasy.org/glycomod/</td></tr> <tr><td>GlyConnect</td><td>Expasy&nbsp;</td><td></td><td>https://glyconnect.expasy.org/</td></tr><tr><td>Izolacja białek i materiały eksploatacyjne western blot&nbsp; Końcówki ładujące żel </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Basix (10 &mikro; L)&nbsp;</td><td>Basix</td><td>13-611-102</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki ładujące żel Basix ( 200 &mikro; L)&nbsp;</td><td>Basix</td><td>13-611-116</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>VWR labs</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td>Regularne stosy Blot NC</td><td>Invitrogen</td><td>IB23001</td><td></td></tr><tr><td>Blot2 PVDF Regularne stosy</td><td>Invitrogen</td><td>IB24001</td><td></td></tr><tr><td>10&nbsp; &mikro; L mikropipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBE00010</td><td></td></tr><tr><td>20 & mikro; L</td><td>mikropipeta Invitrogen</td><td>FBE00020</td><td></td></tr><tr><td>200&nbsp; &mikro; L mikropipeta&nbsp;</td><td>Marka Fisher</td><td>FBE00200</td><td></td></tr><tr><td>1000 & L mikropipeta</td><td>marki Fisher</td><td>FBE01000</td><td></td></tr><tr><td>10&nbsp; &mikro; Końcówki do pipet L&nbsp;</td><td>Laboratoria VWR</td><td>76322-528</td><td></td></tr><tr><td>20&nbsp; &mikro; L końcówki do pipet</td><td>VWR labs</td><td>76322-134</td><td></td></tr><tr><td>200&nbsp; &micro; Końcówki do pipet L&nbsp;</td><td>VWR labs</td><td>76322-150</td><td></td></tr><tr><td>1000&nbsp; &mikro; Końcówki do pipet L</td><td>VWR labs</td><td>76322-154</td><td></td></tr><tr><td>Płytka studzienna&nbsp;</td><td>Marka Fisher</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td>Izolacja białek i odczynniki western blot&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Actin przeciwciało ( Gospodarz: Królik )</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>8457T</td><td></td></tr><tr><td>Anty-królicze IgG HRP Powiązane&nbsp;</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>Bolt 4-12% Bis-tris Plus</td><td>Invitrogen</td><td>NW04120BOX</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Odczynniki Fishera</td><td>BP9700-100</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało COXIV (gospodarz: królik)</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>4844S Przeciwciało</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (gospodarz: królik)</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek MicroBCA</td><td>Thermofisher naukowy&nbsp;</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do biegania Nupage MOPS SDS [20x]</td><td>Thermofisher naukowy&nbsp;</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>STRONA Linijka wstępnie barwiona drabinka białkowa</td><td>Thermofisher naukowy&nbsp;</td><td>815-968-0747</td><td>Rozcieńczenie= Stosować 7&nbsp; &mikro; L do załadowania do pierwszej studzienki</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami&nbsp;</td><td>Aniara Diagnostics</td><td>A12-9423-5</td><td>Przygotuj 1x PBS z 10x proszku&nbsp;</td></tr><tr><td>Pierce ECL Western Blotting Substrate</td><td>Thermofisher naukowy&nbsp;</td><td>32106</td><td>Zestaw substratów chemiluminescencyjnych</td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Thermofisher naukowy&nbsp;</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do próbek</td><td>Novex</td><td>B0007</td><td>Bufor do próbek śrubowy LDS jest przygotowywany w stosunku 3:1 próbki do próbki Bufor</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>MP Biomedicals</td><td>TWEEN201</td><td></td></tr><tr><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli tkankowych&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess Slides</td><td>Avantor</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>probówki Eppendorf</td><td>Cell Treat</td><td>414004-265612-5884</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta aspiracyjna 2 ml</td><td>Vista lab</td><td>5090-0010E</td><td></td></tr><tr><td>Pipipeta serologiczna 5 mL&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipeta serologiczna&nbsp;</td><td>Basix</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 25 ml</td><td>Vista lab</td><td>FB012937</td><td></td></tr><tr><td>50 ml pipeta serologiczna</td><td>Vista lab</td><td>14955233</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Rurka stożkowa</td><td>Avantor</td><td>229225A</td> 50 ml rurka <td></td></tr><tr><td>stożkowa</td><td>Leczenie komórkowe</td><td>4190-0050</td><td></td></tr><tr><td>T-75 cm2 Kolba do hodowli tkankowych</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>FB012937</tr><tr><td>T-180 cm2 Kolba do hodowli tkankowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012939</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki do hodowli tkankowych&nbsp; Linia komórek mikrogleju </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV2&nbsp;</td><td>Kreatywna bioarray&nbsp;</td><td>CSC-I2227Z</td><td>Nieśmiertelny mikroglej myszy (BV2) pochodzący z mikrogleju noworodków C57/BL6&nbsp;</td></tr><tr><td>Enzymy dysocjacji komórek&nbsp;</td><td>Thermofisher naukowy&nbsp;</td><td>12563029</td><td>TrypLE&nbsp;</td></tr><tr><td>Pożywka o niskiej zawartości glukozy Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10567014</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Cytiva</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Minimalne niezbędne podłoże (MEM) Aminokwasy endogenne</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillium Streptomycyna</td> Bufor fosforanowy <td>Cytivia</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue barin 0,4%</td><td>Invitrogen</td><td>Zobacz materiał T10282</td><td></td></tr></tbody></table>

preparat mitochondrialny z mikrogleju do analizy glikanów

Mitochondrial Preparation from Microglia for Glycan Analysis

Zrozumienie wzorców glikozylacji białek mitochondrialnych w mikrogleju jest kluczowe dla określenia ich roli w chorobach neurodegeneracyjnych. W tym miejscu przedstawiamy nowatorską i wysokoprzepustową metodologię analizy glikomicznej białek mitochondrialnych wyizolowanych z hodowanego mikrogleju. Metoda ta obejmuje izolację mitochondriów z kultur mikrogleju, ocenę jakości próbek mitochondrialnych, a następnie zoptymalizowaną ekstrakcję białek w celu maksymalizacji wykrywania glikanów oraz spektrometrię mas o wysokiej rozdzielczości (HRAM) wspomaganą desorpcją laserową w podczerwieni z desorpcją laserową i jonizacją (IR-MALDESI) w celu uzyskania szczegółowych profili glikozylacji mitochondrialnej.
Ten protokół podkreśla znaczenie utrzymania integralności mitochondriów podczas izolacji i stosuje rygorystyczną kontrolę jakości w celu zapewnienia odtwarzalności, w tym pomiar czystości mitochondriów po ekstrakcji. Podejście to pozwala na kompleksowe profilowanie zmian glikozylacji w mitochondriach mikrogleju w różnych warunkach eksperymentalnych in vitro, co daje wgląd w zmiany mitochondrialne związane z chorobami neurodegeneracyjnymi. Podejście to można zastosować do innych metod leczenia in vitro, innych typów komórek hodowlanych lub komórek pierwotnych. Dzięki temu ustandaryzowanemu podejściu dążymy do pogłębienia wiedzy na temat mitochondrialnych glikanów mikrogleju, przyczyniając się do szerszego obszaru badań neurodegeneracyjnych.

Rysunek 1 przedstawia schematyczny przebieg etapów izolacji mitochondriów z linii komórkowej mikrogleju BV2 w celu analizy glikanów metodą spektrometrii mas. Powtarzalność izolacji białek mitochondrialnych pomiędzy różnymi preparatami mitochondriów otrzymanymi z tej samej gęstości wyjściowej komórek mikrogleju przedstawiono na Rysunku 2, który nie wykazuje istotnych różnic w stężeniu białek mitochondrialnych oszacowanym za pomocą testu mikro BCA.
<p class="j...

Protokół został opracowany do przygotowania oczyszczonych mitochondriów z komórek mikrogleju, izolacji białek mitochondrialnych do uwalniania N-glikanów oraz szybkiego wykrywania subkomórkowych, mitochondrialnych glikanów za pomocą desorpcji laserowej wspomaganej matrycą w podczerwieni, jonizacji elektrorozpylanej w połączeniu z precyzyjnym analizatorem mas o wysokiej rozdzielczości.

Preparat mitochondrialny z mikrogleju do analizy glikanów

Understanding the glycosylation patterns of mitochondrial proteins in microglia is critical for determining their role in neurodegenerative diseases. ...

Ogólnie rzecz biorąc, nasze badania koncentrują się na określeniu mechanistycznej roli cukrów lub glikanów oraz na tym, jak możemy wykorzystać te komórkowe i subkomórkowe szlaki glikozylacji w starzeniu się, a także w zaburzeniach mózgu. Obecnie istnieje luka w wiedzy na temat roli, a także modulacji glikanów subkomórkowych w różnych patofizjologiach chorób, w tym w ostrych i przewlekłych zaburzeniach mózgu, takich jak udar mózgu i choroba Alzheimera. Ten protokół i nasze badania mają na celu pogłębienie wiedzy na temat roli glikanów w interakcjach neuroimmunologicznych oraz tego, jak można wykorzystać te informacje do projektowania lepszych i skuteczniejszych terapii ośrodkowego układu nerwowego.[Narrator] Na początek uzyskaj komórki mikrogleju BV-2 pochodzące od myszy C57BL/6. Utrzymuj je w pożywce DMEM o niskiej zawartości glukozy uzupełnionej o 10% FBS, 1% penicyliny, streptomycyny i 1% aminokwasów endogennych. Hoduj komórki w kolbach T175, aż osiągną zbieżność od 70 do 80%. Odessać pożywkę z kolby. Ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze pożywki wzrostowej. Używając błękitu trypanowego, policz komórki. Odwirować komórki w dwumililitrowej probówce mikrowirówkowej o stężeniu 500 G przez pięć minut. Ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant. Dodaj 800 mikrolitrów odczynnika do izolacji mitochondriów A i wiruj ze średnią prędkością przez pięć sekund. Następnie inkubuj probówkę na lodzie dokładnie przez dwie minuty. Dodaj 10 mikrolitrów odczynnika B do izolacji mitochondriów i wiruj z maksymalną prędkością przez pięć sekund. Inkubuj na lodzie przez pięć minut, wirując z maksymalną prędkością co minutę. Teraz dodaj 800 mikrolitrów odczynnika do izolacji mitochondriów C i odwróć probówkę do wymieszania. I wirować przy 700 G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. Przenieść supernatant do nowej dwumililitrowej probówki i odwirować przy 3000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant zawierający część cytozolową do nowej probówki. Osad zawiera izolowane mitochondria. Dodaj 500 mikrolitrów odczynnika do izolacji mitochondriów C do osadu i odwiruj przy 12 000 G przez pięć minut. Ponownie zawiesić izolowane mitochondria w 50 mikrolitrach buforu do izolacji białek. Pozostawić zawiesinę na lodzie na 20 minut. Zassać i dozować trzy razy, a następnie pozostawić na lodzie na 20 minut, wirując przed użyciem. Jeśli nie jest w pełni rozpuszczony, dodaj kolejne 50 mikrolitrów buforu i puli w tej samej probówce. Wirować przy 13 000 G przez 10 minut. Po odzyskaniu i zamrożeniu supernatantu wysuszyć za pomocą koncentratora próżniowego. W celu wykrycia uwolnionych glikanów należy ponownie zawiesić wysuszone i połączone glikany w 50 mikrolitrach wody klasy LCMS. Odpipetować pięć mikrolitrów zawieszonych glikanów mitochondrialnych na miejsce próbki na szkiełku teflonowym z mikrostudzienką. Jonizuj i wykrywaj N-glikany w trybie jonizacji ujemnej za pomocą rozpuszczalnika do elektrorozpylania składającego się z 60% acetonitrylu i jednego milimolowego kwasu octowego przy natężeniu przepływu dwóch mikrolitrów na minutę i napięciu 3,2 kilowolta. Połącz IR-MALDESI ze spektrometrem masowym HRAM ustawionym na zdolność rozdzielczą 240 000 pełnej szerokości przy połowie maksimum przy stosunku masy do ładunku 200, aby przeanalizować stosunek masy do ładunku wynoszący 502 000 w trybie jonizacji ujemnej. Ręcznie zidentyfikuj glikany sprzężone z N, wyszukując masy monoizotopowe. Potwierdź rozkłady izotopowe za pomocą odstępów między masą a ładunkiem, aby określić podwójnie i potrójnie naładowane jony o minimalnym progu strumienia jonów wynoszącym 1,000 jonów na sekundę. Przelicz widma mas surowych dla stosunku masy do ładunku na neutralne masy monoizotopowe. Następnie prześlij masy monoizotopowe do internetowego narzędzia do przewidywania struktury oligosacharydów, aby określić potencjalny skład glikanów. Potwierdź adnotacje, korzystając z eksperymentalnie dobranej bazy danych glikosteroidy. Upewnij się, że każda identyfikacja mieści się w marginesie dokładności pomiaru masy 2,5 części na milion, zawiera rdzeń i połączoną strukturę glikanu i wyklucza pentozę, kwas 3-deoksy-d-manno-okt-2-ulozon lub monosacharydy kwasu uronowego. Stężenia białek mitochondrialnych uzyskane z sześciu niezależnych preparatów nie wykazały istotnej zmienności, co potwierdza wysoką odtwarzalność. Zachodnia analiza krwi wykazała ekspresję CoxIV tylko we frakcjach mitochondrialnych, a GAPDH tylko we frakcjach cytoplazmatycznych, potwierdzając czystość izolacji mitochondrialnych i brak zanieczyszczenia niemitochondrialnego. Wyraźne sjalylowane, fosforylowane i siarczanowane struktury N-glikanów wykryto w ekstraktach mitochondrialnych przy użyciu IR-MALDESI. Wysokie kwadraty testujące dobroć dopasowania potwierdziły wykrycie glikanów sprzężonych z N z jednym i dwoma adduktami chloru, potwierdzając wykrycie tych kompozycji glikanowych za pomocą IR-MALDESI.

mitochondrial-preparation-from-microglia-for-glycan-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Izolowanie pierwotnych mikroglejów z heterogenicznej populacji komórek mózgu jest niezbędne do zbadania ich roli w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Niniejszy protokół opisuje technikę mechanicznej izolacji i mieszanej hodowli komórkowej, która zapewnia wysoką wydajność oraz wysoką czystość żywych, pierwotnych komórek mikrogleju do badań in vitro i dalszych zastosowań.

Izolacja pierwotnych mikroglejów z mieszanych kultur komórek glejowych tkanki mózgu noworodka szczura

Mikroglią są rezydentne makrofagi, które stanowią pierwszą linię obrony i nadzoru immunologicznego ośrodkowego układu nerwowego. MikroRNA to cząsteczki regulacyjne, które odgrywają istotną rolę w wielu procesach fizjologicznych, w tym w aktywacji i różnicowaniu makrofagów. W niniejszym artykule opisujemy metodę pomiaru mikroRNA w mikroglii.

Wykrywanie mikroRNA w mikrogleju za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w prawidłowym OUN oraz podczas neurostanu zapalnego

Film demonstruje technikę izolowania mikrogleju z kory mózgowej dorosłej myszy. Po pierwsze, kora przechodzi segmentację i homogenizację w celu usunięcia neuronów i innych komórek glejowych, zachowując mikroglej. Następnie zawiesina komórkowa jest poddawana działaniu mikrokulek magnetycznych antymieliny i pola magnetycznego, skutecznie oddzielając komórki mikrogleju i szpiku od resztek mieliny i komórek zawierających mielinę.

Izolacja mikrogleju z kory mózgowej dorosłej myszy

Ta procedura ilustruje, jak wyizolować z mózgu dorosłej myszy błony ER związane z mitochondriami lub MAM oraz frakcje mikrodomen wzbogacone glikosfingolipidami z MAM i preparatów mitochondrialnych.

Błony ER związane z mitochondriami (MAM) i mikrodomeny wzbogacone w glikosfingolipidy (GEM): izolacja od mózgu myszy

Przedstawiamy metody efektywnej i szybkiej izolacji/hodowli żywotnego mikrogleju z kory mózgowej noworodka i dorosłego rdzenia kręgowego.  Sekcja i posiew mikrogleju korowego może być przeprowadzona w ciągu 90 minut, a późniejsze zbieranie mikrogleju odbywa się ~ 10 dni po początkowym rozbiorze.

Hodowla mikrogleju z ośrodkowego układu nerwowego noworodków i dorosłych

Jednym z kluczy do udanego badania biologii mikrogleju jest zachowanie funkcji immunologicznej mikrogleju ex vivo podczas izolacji z tkanki OUN. Wyizolowanie mikrogleju za pomocą wytrząsania obrotowego daje wysoce czyste i immunofunkcjonalne hodowle komórek, oceniane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, immunocytochemii i ELISA po aktywacji mikrogleju za pomocą bodźców prozapalnych lipopolisacharydu (LPS) i Pam3CSK4 (Pam).

Izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków

Tutaj przedstawiono protokół (MitoCeption) do transferu mitochondriów, wyizolowanych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), do komórek macierzystych glejaka (GSC), w celu zbadania ich biologicznego wpływu na metabolizm i funkcje GSC. Podobny protokół można dostosować do przenoszenia mitochondriów między innymi typami komórek.

MitoCeption: Przenoszenie izolowanych ludzkich mitochondriów MSC do komórek macierzystych glejaka

Dostępny jest tutaj protokół do badania interakcji między natywnymi formami, prefibrylarnymi i dojrzałymi fibrylami amyloidowymi różnych peptydów i białek z mitochondriami izolowanymi z różnych tkanek i różnych obszarów mózgu.

Interakcje i przenikanie błony mitochondriów mózgowych przez fibryle amyloidowe

Dostarczamy protokół izolacji mikrogleju z różnych wypreparowanych obszarów półkuli mózgu dorosłej myszy, a następnie półautomatyczne przygotowanie biblioteki do głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki transkryptomów pełnej długości. Metoda ta pomoże wyjaśnić funkcjonalną heterogeniczność mikrogleju w zdrowiu i chorobie.

Izolacja specyficznego dla regionu mikrogleju z jednej dorosłej półkuli mózgu myszy w celu głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

To badanie przedstawia metodę analizy morfologii mitochondriów na podstawie barwienia immunologicznego i analizy obrazu w tkance mózgowej myszy in situ. Opisano również, w jaki sposób pozwala to na wykrycie zmian w morfologii mitochondriów wywołanych przez agregację białek w modelach choroby Parkinsona.

Badanie histologiczne morfologii mitochondriów w modelu choroby Parkinsona

Protokół ten opisuje opłacalny sposób przeprowadzenia testu stresowego glikolizy w celu ilościowego przeprogramowania metabolizmu w pierwotnym mikrogleju myszy. Po izolacji i stymulacji zapalnej mierzy się tempo zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) przy użyciu świeżo przygotowanych, pH-skorygowanych odczynników, a następnie następuje normalizacja białek, umożliwiająca dokładną i powtarzalną ocenę zmian glikolitycznych.

Badanie glikolizy w mikrogleju pierwotnym za pomocą testu strumienia zewnętrznego

Poznaj metodę izolacji mitochondriów z komórek mikrogleju BV-2 i analizy glikanów N-glikanowych za pomocą spektrometrii masowej IR-MALDESI. Protokół umożliwia badanie roli glikanów w interakcjach neuroimmunologicznych.

Preparat mitochondrialny z mikrogleju do analizy glikanów

Przeglądaj więcej filmów