Name: Minimalnie inwazyjny model iniekcji Cisterna Magna do badań przerzutów opon mózgowo-rdzeniowych u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T14:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Poznaj minimalnie inwazyjną metodę iniekcji do cisterna magna w myszach do badań przerzutów opon mózgowo-rdzeniowych. Technika zmniejsza uraz i obciążenie pozaczaszkowe, poprawiając dobrostan zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują członkom laboratorium Zhang za ich cenne dyskusje i pomoc podczas tego badania. WZ jest wspierany przez Fundusze Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Prowincji Zhejiang (2023QZJH60), Program Funduszu Naukowego dla Wybitnych Młodych Naukowców z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (588020-X42306/041) oraz fundusz startowy z Instytutu Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu Zhejiang.

Wszystkie procedury na zwierzętach w tym manuskrypcie zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komisję ds. Oceny Dobrostanu i Etyki Zwierząt Laboratoryjnych ZJU (ZJU20230155). Myszy C57BL/6J i NSG uzyskano i trzymano w warunkach wolnych od specyficznych patogenów w Centrum Zwierząt Laboratoryjnych ZJU. Protokół ten wykorzystuje mysią linię komórkową raka płuc, raka płuc Lewisa (LLC1) i linię komórkową ludzkiego raka płuc, A549, obie oznaczone GFP i lucyferazą świetlika. Obie linie komórkowe zostały dzięki uprzejmości dr Xiang H. F. Zhang (Baylor College of Medicine, USA)18. Tutaj jako przykładu używamy ogniw LLC1. Procedura wstrzykiwania komórek A549 jest prawie identyczna, z wyjątkiem tego, że myszom NSG wstrzyknięto 6 x 104 komórki A549.
1. Przygotowanie komórek rakowych do wstrzyknięcia
<ol>
	<li>Hodowla 1,0 x 106 komórek LLC1 w DMEM uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 0,1 mg / ml penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 . Gdy komórki osiągną zbieżność 70%-90%, trypsynizuj je przez 1 minutę, używając 2 ml 0,25% roztworu trypsyny/EDTA. Odwirować komórki przy 300 x g przez 3 minuty, umyć je 2x lodowatym PBS i ponownie zawiesić w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Oceń stężenie żywotnych komórek za pomocą roztworu błękitu trypanowego i hemocytometru19. Upewnij się, że żywotność komórek jest większa niż 90%, przy czym większość komórek jest pojedyncza. Dostosuj stężenie komórek do 2 x 106 komórek/ml w lodowatym PBS.</li>
	<li>Porcjować 50 μl zawiesiny komórek do oddzielnych probówek do mikrowirówek, aby uniknąć wielokrotnego pipetowania.</li>
	<li>Zawiesiny komórkowe należy przechowywać na lodzie do czasu, aż będą gotowe do wstrzyknięcia. Wstrzyknij 10 μl komórek LLC1 znakowanych GFP-lucyferazą na mysz w tym protokole, co odpowiada 2 x 104 komórkom na mysz. UWAGA: Dostosuj liczbę komórek w razie potrzeby w oparciu o kinetykę przerzutów wstrzykniętych linii komórkowych.</li>
</ol>
2. Przygotowanie myszy
UWAGA: W tym badaniu wykorzystano samce myszy C57BL / 6J w wieku 6-8 tygodni.
<ol>
	<li>Autoklaw wszystkie narzędzia chirurgiczne i rękawice wypełnione obłożeniami chirurgicznymi. Zdezynfekuj blat stołu i sprzęt niechirurgiczny za pomocą 75% etanolu, a następnie przykryj miejsce pracy wodoodpornymi zasłonami.</li>
	<li>Przygotuj czystą klatkę w pomieszczeniach dla zwierząt i podkładkę rozgrzewającą do rekonwalescencji po zabiegu.</li>
	<li>Znieczulić mysz poprzez podskórne wstrzyknięcie ketaminy (80-100 mg/kg) i ksylazyny (8-10 mg/kg). Przed kontynuowaniem sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą testu szczypania. Nałóż sterylną maść okulistyczną, aby chronić oczy przed uszkodzeniem rogówki po znieczuleniu myszy.</li>
	<li>Ogol sierść z tylnej części potylicznej za pomocą maszynki do strzyżenia, a następnie nałóż kremy do depilacji, aby całkowicie usunąć sierść w tym samym obszarze.</li>
	<li>Ustaw mysz na brzuchu z szyją umieszczoną nad probówką wirówkową o pojemności 15 ml. Zabezpiecz głowę i dolną część pleców taśmą i palcem wskazującym zbadaj palcem wskazującym przestrzeń między potylicą a kręgiem C1 (ryc. 1).</li>
	<li>Zdezynfekuj tylną część potyliczną przez trzy rundy przecierania sterylnymi wacikami nasączonymi etanolem 75%, a następnie peelingiem chirurgicznym betadyny. Przykryj niesterylne części zwierzęcia sterylnym obłożeniem.</li>
</ol>
3. Iniekcja Cisterna magna
UWAGA: Na kolejnych etapach wymagane są techniki aseptyki, w tym stosowanie środków ochrony osobistej i sterylnych rękawic.
<ol>
	<li>Delikatnie odpipetować zawiesinę komórkową i odessać 10 μl do wstrzykiwań za pomocą strzykawki insulinowej 31 g o średnicy 8 mm.</li>
	<li>Zbadaj palpacyjnie obszar między potylicą a C1 myszy palcem wskazującym, aby zlokalizować dokładne miejsce nakłucia na dolnym środkowym brzegu tylnej części czaszki potylicznej. W razie potrzeby oznacz tę stronę.</li>
	<li>Wbić igłę pod kątem 45°-50° do cisterna magna przez zidentyfikowane miejsce nakłucia, przesuwając się na głębokość 4 mm. Wyraźne odczucie przełomu wskazuje, że igła pomyślnie weszła w cisterna magna.<ol>
		<li>Jeśli miejsce nakłucia jest trudne do zlokalizowania, wykonaj małe nacięcie 3-5 mm na poziomie ucha, aby odsłonić tylną linię środkową. Jeśli wymagane jest nacięcie chirurgiczne, meloksykam (5 mg/kg mc./dobę) i buprenorfinę (0,1 mg/kg mc.) należy podać podskórnie na 1 godzinę przed zabiegiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powoli wstrzykiwać zawiesinę komórek, przesuwając tłok strzykawki, trzymając strzykawkę nieruchomo z ręką umieszczoną na stole.</li>
	<li>Po zaszczepieniu należy przytrzymać strzykawkę na miejscu przez dodatkowe 10 sekund, aby umożliwić wyrównanie ciśnienia wewnątrzczaszkowego. Następnie należy wyjąć igłę i dociskać miejsce nakłucia sterylnym wacikiem przez 1-2 minuty.</li>
</ol>
4. Opieka po iniekcji
<ol>
	<li>Przenieś zwierzęta do czystych klatek na poduszce grzewczej i uważnie je monitoruj, aż w pełni wyzdrowieją.<ol>
		<li>W przypadku wykonania nacięcia należy zamknąć ranę za pomocą kleju tkankowego i klipsów. Podawaj dodatkowe leki przeciwbólowe przez 2-3 dni po operacji, aby kontrolować ból i wspomóc powrót do zdrowia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Należy ściśle obserwować myszy przez 7 dni po zabiegu i codziennie sprawdzać aktywność fizyczną zwierząt oraz wygląd wokół miejsca wstrzyknięcia.</li>
</ol>
5. Ocena wzrostu guza opon mózgowo-rdzeniowych
<ol>
	<li>Obrazowanie bioluminescencyjne<ol>
		<li>Znieczulić mysz i podać D-lucyferynę (150 μg/g) w żyle zaoczodołowej. Umieść myszy w komorze obrazowania, umieszczając je w wyznaczonym stożku nosowym na kolektorze anestezjologicznym. Użyj przegród świetlnych między zwierzętami, aby zminimalizować zakłócenia sygnału.</li>
		<li>Zobrazuj zwierzęta natychmiast za pomocą systemu IVIS z czasem naświetlania od 0,5 s do 2 min6. Potwierdź udaną inokulację komórek nowotworowych w przestrzeni oponowo-rdzeniowej za pomocą dyspersyjnego sygnału bioluminescencyjnego przez głowę i rdzeń kręgowy (ryc. 2A).</li>
		<li>Monitoruj postęp LM za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego co 4 dni. Dostosuj interwały obrazowania w oparciu o kinetykę wzrostu guza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza histologiczna<ol>
		<li>Znieczulenie myszy, gdy były znacznie mniej aktywne lub straciły 20% masy ciała i przecięło skórę i żebra, aby odsłonić klatkę piersiową. Ostrożnie włóż kaniulę z końcówką do lewej komory i wsuń kaniulę do aorty wstępującej. Powoli przeprowadź perfuzję zwierzęcia z 20 ml PBS przez kaniulę.</li>
		<li>Użyj nożyczek, aby usunąć głowę i wykonaj nacięcie skóry głowy w linii środkowej, aby odsłonić czaszkę. Wyciąć otaczające tkanki miękkie. Przetnij wzdłuż grzbietu oczodołu, a następnie włóż nożyczki do otworu wielkiego i ostrożnie przesuwaj się wzdłuż wewnętrznej powierzchni czaszki z naciskiem w górę, aby uniknąć uszkodzenia tkanki.</li>
		<li>Usuń kości czaszki, a następnie delikatnie usuń mózg. Utrwalić mózg w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 °C przez 24 godziny, a następnie zrównoważyć go z 15% roztworem sacharozy PBS przez 24 godziny, a następnie 30% roztworem sacharozy PBS przez kolejne 24 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umieść chusteczkę w kriofordzie wypełnionym związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), a następnie przechowuj ją na suchym lodzie przez 30 minut20.</li>
		<li>Pokrój mózg osadzony w OCT na sekcje o grubości 10 μm za pomocą kriostatu. Przechowuj sekcje w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu dalszej aplikacji.</li>
		<li>Wykonaj barwienie hematoksyliny/eozyny (H&E) na szkiełkach mózgowych21. Obecność komórek nowotworowych na brzegu mózgu wskazuje, że przerzuty występują wyłącznie w przestrzeni oponowo-rdzeniowej (ryc. 3 i tabela 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikroskopia dwufotonowa<ol>
		<li>Znieczulij myszy LM. Usuń skórę głowy pokrywającą grzbietową powierzchnię czaszki za pomocą kleszczy i nożyczek. Użyj ostrza skalpela, aby usunąć cienką okostną z powierzchni czaszki.</li>
		<li>Rozcieńczyć czaszkę wiertłem ściernym, aż naczynia krwionośne będą widoczne przez przerzedzoną czaszkę. Ustabilizuj obszar obserwacji głowy myszy za pomocą trójkątnej głowicy zabezpieczonej klejem tkankowym22,23.</li>
		<li>Podaj 0,025 ml 5% (w/v) dekstranu TRITC do żyły podoczodołowej, aby oznaczyć naczynia krwionośne22.</li>
		<li>Wykonaj mikroskopię dwufotonową przez okienka obrazowania i zrekonstruuj przestrzeń opon mózgowo-rdzeniowych (ryc. 4). Wykryj kość za pomocą fluorescencji drugiej harmonicznej przy emisji 450 nm i wzbudzeniu 900 nm24. Wizualizacja komórek nowotworowych i naczyń znakowanych dekstranem GFP poprzez zbieranie sygnałów fluorescencyjnych przy emisji 507 nm i 572 nm ze wzbudzeniem odpowiednio 900 nm i 1000 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stereoskopowy mikroskop fluorescencyjny<ol>
		<li>Usuń mózg myszy i umieść go pod mikroskopem stereoskopowym. Wizualizacja komórek oznaczonych GFP przy użyciu zestawu filtrów specyficznych dla GFP (Rysunek 5).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wilcox, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptomeningeal+metastases+from+solid+tumors%3A+A+Society+for+Neuro-Oncology+and+American+Society+of+Clinical+Oncology+consensus+review+on+clinical+management+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Leptomeningeal metastases from solid tumors: A Society for Neuro-Oncology and American Society of Clinical Oncology consensus review on clinical management and future directions.</a> Neuro Oncol. 26 (10), 1781-1804 (2024).</li>
<li>Wasserstrom, W. R., Glass, J. P., Posner, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+leptomeningeal+metastases+from+solid+tumors%3A+experience+with+90+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of leptomeningeal metastases from solid tumors: experience with 90 patients.</a> Cancer. 49 (4), 759-772 (1982).</li>
<li>Remsik, J., Boire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+path+to+leptomeningeal+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The path to leptomeningeal metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 24 (7), 448-460 (2024).</li>
<li>Kokkoris, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptomeningeal+carcinomatosis.+How+does+cancer+reach+the+pia-arachnoid%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Leptomeningeal carcinomatosis. How does cancer reach the pia-arachnoid.</a> Cancer. 51 (1), 154-160 (1983).</li>
<li>Remsik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptomeningeal+metastatic+cells+adopt+two+phenotypic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Rep%22%5BJournal%5D)">Leptomeningeal metastatic cells adopt two phenotypic states.</a> Cancer Rep. 5 (4), e1236(2022).</li>
<li>Chi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+deploy+lipocalin-2+to+collect+limiting+iron+in+leptomeningeal+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer cells deploy lipocalin-2 to collect limiting iron in leptomeningeal metastasis.</a> Science. 369 (6501), 276-282 (2020).</li>
<li>Yin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+graded+prognostic+assessment+%28molGPA%29+model+specific+for+estimating+survival+in+lung+cancer+patients+with+leptomeningeal+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">A molecular graded prognostic assessment (molGPA) model specific for estimating survival in lung cancer patients with leptomeningeal metastases.</a> Lung Cancer. 131, 134-138 (2019).</li>
<li>Li, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptomeningeal+Metastases+in+Patients+with+NSCLC+with+EGFR+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Oncol%22%5BJournal%5D)">Leptomeningeal Metastases in Patients with NSCLC with EGFR Mutations.</a> J Thorac Oncol. 11 (11), 1962-1969 (2016).</li>
<li>Li, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+genetic+profiles+from+cerebrospinal+fluid+cell-free+DNA+in+leptomeningeal+metastases+of+EGFR-mutant+non-small-cell+lung+cancer%3A+a+new+medium+of+liquid+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Unique genetic profiles from cerebrospinal fluid cell-free DNA in leptomeningeal metastases of EGFR-mutant non-small-cell lung cancer: a new medium of liquid biopsy.</a> Ann Oncol. 29 (4), 945-952 (2018).</li>
<li>Posner, J. B., Chernik, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+metastases+from+systemic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Neurol%22%5BJournal%5D)">Intracranial metastases from systemic cancer.</a> Adv Neurol. 19, 579-592 (1978).</li>
<li>Kuiper, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+and+survival+of+patients+with+EGFR-mutated+non-small+cell+lung+cancer+and+leptomeningeal+metastasis%3A+A+retrospective+cohort+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Treatment and survival of patients with EGFR-mutated non-small cell lung cancer and leptomeningeal metastasis: A retrospective cohort analysis.</a> Lung Cancer. 89 (3), 255-261 (2015).</li>
<li>Tsukada, Y., Fouad, A., Pickren, J. W., Lane, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+metastasis+from+breast+carcinoma.+Autopsy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Central nervous system metastasis from breast carcinoma. Autopsy study.</a> Cancer. 52 (12), 2349-2354 (1983).</li>
<li>Singh, M., Bakhshinyan, D., Venugopal, C., Singh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Modeling+and+Therapeutic+Avenues+for+Cancer+Metastasis+to+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Preclinical Modeling and Therapeutic Avenues for Cancer Metastasis to the Central Nervous System.</a> Front Oncol. 7, 220(2017).</li>
<li>Shi, M. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PROTAC+EZH2+degrader-1+overcomes+the+resistance+of+podophyllotoxin+derivatives+in+refractory+small+cell+lung+cancer+with+leptomeningeal+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">PROTAC EZH2 degrader-1 overcomes the resistance of podophyllotoxin derivatives in refractory small cell lung cancer with leptomeningeal metastasis.</a> BMC Cancer. 24 (1), 504(2024).</li>
<li>Choi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+for+leptomeningeal+dissemination+of+medulloblastoma+in+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging for leptomeningeal dissemination of medulloblastoma in mouse models.</a> BMC Cancer. 16 (1), 723(2016).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dura+immunity+configures+leptomeningeal+metastasis+immunosuppression+for+cerebrospinal+fluid+barrier+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dura immunity configures leptomeningeal metastasis immunosuppression for cerebrospinal fluid barrier invasion.</a> Nat Cancer. 5 (12), 1940-1961 (2024).</li>
<li>Boire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+Component+3+Adapts+the+Cerebrospinal+Fluid+for+Leptomeningeal+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complement Component 3 Adapts the Cerebrospinal Fluid for Leptomeningeal Metastasis.</a> Cell. 168 (6), 1101-1113.e13 (2017).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+Initiation+Is+Coupled+with+Bone+Remodeling+through+Osteogenic+Differentiation+of+NG2%2B+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Metastasis Initiation Is Coupled with Bone Remodeling through Osteogenic Differentiation of NG2+ Cells.</a> Cancer Discov. 13 (2), 474-495 (2023).</li>
<li>Louis, K. S., Siegel, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+viability+analysis+using+trypan+blue%3A+manual+and+automated+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods.</a> Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).</li>
<li>Green, T. R. F., Ortiz, J. B., Harrison, J. L., Lifshitz, J., Rowe, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Cryosectioning+of+Multiple+Rodent+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains.</a> J Vis Exp. (139), e58513(2018).</li>
<li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Processing+and+Hematoxylin+and+Eosin+Staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue Processing and Hematoxylin and Eosin Staining.</a> Methods Mol Biol. 1180, 31-43 (2014).</li>
<li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J Vis Exp. (61), e3742(2012).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).</li>
<li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nat Methods. 7 (12), 981-984 (2010).</li>
<li>Wilcox, J. A., Li, M. J., Boire, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptomeningeal+Metastases%3A+New+Opportunities+in+the+Modern+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Leptomeningeal Metastases: New Opportunities in the Modern Era.</a> Neurotherapeutics. 19 (6), 1782-1798 (2022).</li>
<li>Zhang, C., Lowery, F. J., Yu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracarotid+Cancer+Cell+Injection+to+Produce+Mouse+Models+of+Brain+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis.</a> J Vis Exp. (120), e55085(2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

LM jest agresywnym i śmiertelnym stanem. Gdy komórki nowotworowe dają przerzuty do przestrzeni wypełnionej płynem mózgowo-rdzeniowym, szybko rozprzestrzeniają się po całym ośrodkowym układzie nerwowym25. Komórki te osiadają i atakują mózg, rdzeń kręgowy, czaszkę i nerwy rdzeniowe, ostatecznie prowadząc do szybkiego pogorszenia stanu neurologicznego i ostatecznej śmierci17. Aby lepiej zrozumieć leżące u podstaw mechanizmy patofizjologiczne i ocenić potencjalne strategie tera...

Największym wyzwaniem dla pacjentów z zaawansowanymi nowotworami pozostaje choroba przerzutowa. Przerzuty opon mózgowo-rdzeniowych (LM) odnoszą się do rozprzestrzeniania się komórek rakowych do błony pia mater, pajęczynówki i przestrzeni podpajęczynówkowej. LM z guzów litych staje się coraz bardziej powszechne w raku płuc (9%-25%), raku piersi (5%-20%) i czerniaku (6%-18%)1,2, głównie ze względu na dłuższe przeżycie i ulepszone techniki diagnostyczne. Komórki rakowe mogą atakować przestrzeń oponowo-rdzeniową na wiele sposobów, w tym 1) bezpośrednią inwazję przez struktury obwodowe, takie jak opona twarda, kości i nerwy; 2) krwiotwórcze rozprzestrzenianie się przez układ żylny; oraz 3) wejście przez krążenie tętnicze, gdzie komórki rakowe prześlizgują się przez naczynia z okienkami do splotu naczyniówkowego, a następnie do komór wypełnionych płynem mózgowo-rdzeniowym 3,4,5. Komórki nowotworowe wchodzące do przestrzeni oponowo-rdzeniowej napotykają wiele wyzwań, w tym pozbawienie czynników wzrostu, ograniczone produkty pośrednie metabolizmu i stanyniedotlenienia 6. Jednak ze względu na brak odpowiednich narzędzi i technik, sposób, w jaki komórki nowotworowe poruszają się po tych szlakach i pokonują niegościnne warunki, aby skolonizować przestrzeń opon mózgowo-rdzeniowych, jest słabo poznany. Pomimo postępów w terapiach multimodalnych, w tym radioterapii, leczeniu ogólnoustrojowym i terapii iniekcyjnej dooponowej, rokowanie dla pacjentów z LM pozostaje złe, a przeżycie zwykle wynosi od 2 do 4 miesięcy 3,7,8,9. W związku z tym istnieje pilna potrzeba głębszego zrozumienia biologii przerzutów opon mózgowo-rdzeniowych w celu ulepszenia obecnych metod leczenia i opracowania nowatorskich, celowanych terapii. Osiągnięcie tego celu wymaga opracowania modeli in vivo, które podsumowują złożone cechy LM.
W przeciwieństwie do przerzutów w narządach takich jak wątroba, kości i mózg, LM zwykle rozwija się wiele lat po rozpoznaniu guza pierwotnego 10,11,12. Podobnie w modelach mysich ze spontanicznymi przerzutami LM jest rzadki ze względu na niską częstość występowania i fakt, że myszy zazwyczaj ulegają przerzutom w innych miejscach. Eksperymentalne mysie modele LM można tworzyć różnymi metodami, w tym śródsercową, tętnicą szyjną lub, alternatywnie, bezpośrednim wstrzyknięciem do cisterna magna lub komór mózgowych. Chociaż dosercowe wstrzykiwanie komórek rakowych jest szeroko stosowane9, często powoduje znaczne obciążenie guzem zewnątrzczaszkowym, powodując śmiertelność niezwiązaną z LM. Alternatywne podejścia, takie jak wstrzykiwanie komórek nowotworowych przez tętnicę szyjną13,14, wymagają rozległych specjalistycznych zasobów i skutkują dużymi nacięciami chirurgicznymi, które są traumatyczne. Co więcej, metoda ta prowadzi przede wszystkim do przerzutów w obrębie samych tkanek mózgowych, a nie opon mózgowo-rdzeniowych, i jest czasochłonna i nieefektywna w tworzeniu modeli LM15. Iniekcja do cisterna magna umożliwia bezpośrednie dostarczenie komórek nowotworowych do przestrzeni oponowo-rdzeniowej. W kilku badaniach zastosowano to podejście do zbadania mechanizmów LM i oceny nowych metod leczenia 6,16,17.
W tym manuskrypcie przedstawiamy wygodny protokół wstrzyknięcia przezskórnego polegający na bezpośrednim przezskórnym nakłuciu w celu szybkiego i stabilnego wygenerowania większej liczby myszy z LM. Metoda ta omija barierę mózg-krew, a tym samym umożliwia skuteczny ksenoprzeszczep komórek nowotworowych w przestrzeni opon mózgowo-rdzeniowych. Znacznie skraca również czas urazu chirurgicznego i zabiegu, jednocześnie niezawodnie indukując LM u myszy. Potwierdziliśmy występowanie LM przy minimalnym naciekaniu do miąższu mózgu, co zostało zweryfikowane za pomocą mikroskopii dwufotonowej i analizy histologicznej. W związku z tym uzyskany model wiernie odwzorowuje złożone mikrośrodowisko LM, dostarczając cennego narzędzia do badania mechanizmów komórkowych i patologicznych związanych z chorobą oraz oceny potencjalnych terapii.

<table><tbody><tr><td>Probówki Eppendorf 1,5 ml</td><td>Ostrze biologiczne</td><td>Zobacz materiał BS-15-M-S</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówka wirówkowa</td><td>WYBIERZ LABSELECT</td><td>CT-002-15A</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa 31G x 8mm (0,3 ml)</td><td>Obiecane</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło ścierne</td><td>GLOBALEBIO</td><td>GEGZ-AM1</td><td></td></tr><tr><td>Mata grzewcza dla zwierząt</td><td>woggee powiedział:</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Firma Cryomold</td><td>Supin (w pozycji leżącej)</td><td>SP-AB-7 x 7 x 5</td><td></td></tr><tr><td>Kremy do depilacji</td><td>Nair</td><td>1.00023E+11</td><td></td></tr><tr><td>D-lucyferyna</td><td>Biologia złota</td><td>SZCZĘŚCIE-1G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (DMEM)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>C11995500CP</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Sieć Usługowa</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Widmo IVIS</td><td>Zacisk</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd.</td><td>H20193336</td><td></td></tr><tr><td>Optymalna temperatura cięcia</td><td>Sakura Sakura</td><td>4583-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>SCR</td><td>80096618</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Serwis bio</td><td>G4202-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Wstrzykiwacz/paciorkowiec Amfoterycyna B</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Golarka</td><td>Hipidog (Pies biodrowy)</td><td>2103CGMJ3373-GQ22N526</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskopowy mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze proste</td><td>Beyotime</td><td>FS019 powiedział:</td><td>Musi być sterylizowany w autoklawie</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Beyotime</td><td>FS001 powiedział:</td><td>Musi być sterylizowany w autoklawie</td></tr><tr><td>Trójkątna głowica mocująca mysz</td><td>Transcend vivoscope</td><td>TVS-FDM-027</td><td></td></tr><tr><td>TRITC-dektran, MW 70000</td><td>MedChemExpress (Ekspres Medyczny)</td><td>HY-158082C</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny/EDTA</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Dwufotonowa laserowa mikroskopia skaningowa</td><td>Olympus</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Kleje do tkanek Vetbond</td><td>3 mln</td><td>1469SB powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Sigma</td><td>Zobacz materiał X1126</td><td></td></tr></tbody></table>

minimalnie inwazyjny model iniekcji cisterna magna do badań przerzutów opon mózgowo-rdzeniowych u myszy

Minimally Invasive Cisterna Magna Injection Model for Leptomeningeal Metastasis Studies in Mice

Przerzuty do opon mózgowo-rdzeniowych (LM), rozprzestrzenianie się komórek rakowych do opon mózgowo-rdzeniowych wypełnionych płynem mózgowo-rdzeniowym (CSF), jest rzadkim, ale wyniszczającym powikłaniem zaawansowanych guzów litych. Pacjenci z LM często mają złe rokowanie, a przeżycie mierzy się w tygodniach lub miesiącach. Opracowanie modeli in vivo , które dokładnie odwzorowują złożoność LM, ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia jej mechanizmów komórkowych i patologicznych oraz oceny potencjalnych terapii. Mysie modele LM są zwykle tworzone poprzez wstrzyknięcie komórek nowotworowych do serca, tętnicy szyjnej lub cisterna magna. Jednak zastrzyki dosercowe lub szyjne często powodują znaczne obciążenie guza pozaczaszkowego i mózgu, komplikując obrazowanie bioluminescencyjne i prowadząc do śmiertelności niezwiązanej z LM. Tymczasem konwencjonalne wstrzyknięcie cisterna magna wymaga inwazyjnych procedur, takich jak nacięcie skóry i rozwarstwienie mięśni, co sprawia, że jest to zarówno traumatyczne, jak i wymagające dużych zasobów. W tym miejscu opisujemy minimalnie inwazyjną procedurę wstrzykiwania komórek nowotworowych do przestrzeni oponowo-rdzeniowej przez cisterna magna bez konieczności nacinania skóry. Takie podejście zmniejsza powstawanie guzów pozaczaszkowych, minimalizuje uraz chirurgiczny oraz skraca czas i wymaganą opiekę pooperacyjną w porównaniu z innymi metodami chirurgicznymi. Co ważne, konsekwentnie indukuje LM przy minimalnym nacieku miąższu mózgu, co potwierdza mikroskopia dwufotonowa i analiza histologiczna. To uproszczone podejście oferuje wydajny i wiarygodny model do badania LM w badaniach przedklinicznych.

Rysunek 1 przedstawia ułożenie myszy do iniekcji oraz miejsce nakłucia w widoku bocznym i przednim. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne in vivo obrazy bioluminescencyjne zwierząt badanych pod kątem powstawania przerzutów do płuc (LM) przy zastosowaniu różnych podejść. Komórki LLC1 znakowane GFP-lucyferazą wstrzyknięto zwierzętom różnymi drogami, po czym wykonano obrazowanie bioluminescencyjne. Jak pokazano w Rysun...

Protokół opisuje metodę wstrzykiwania komórek nowotworowych drogą przezskórnego nakłucia do cisterna magna, która silnie indukuje przerzuty opon mózgowo-rdzeniowych u myszy, zmniejszając uraz i obciążenie guzem pozaczaszkowym.

Minimalnie inwazyjny model iniekcji Cisterna Magna do badań przerzutów opon mózgowo-rdzeniowych u myszy

Leptomeningeal metastasis (LM), the spread of cancer cells into the cerebrospinal fluid (CSF)-filled leptomeninges, is a rare yet devastating complication ...

Przerzuty do opon mózgowo-rdzeniowych to bardzo ciężka i śmiertelna forma choroby przerzutowej. Jego środowisko prawdopodobnie zależy od interakcji między komórkami nowotworowymi a unikalnym mikrośrodowiskiem tkankowym. W przypadku modeli zwierzęcych bardzo ważne jest zbadanie mechanizmu leżącego u podstaw tego zjawiska.Aby zbadać przerzuty opon mózgowo-rdzeniowych in vivo, naukowcy często stosują techniki, takie jak tętnica śródsercowa, tętnica szyjna lub bezpośrednie wstrzyknięcie komórek rakowych do cisterna magna lub komór mózgowych. Podejścia te pomagają w generowaniu wiarygodnych modeli myszy do badań LM. Obecne próby mają znaczące ograniczenia. Na przykład zastrzyki dosercowe często powodują guzy poza przestrzenią oponowo-rdzeniową i mogą prowadzić do zgonów niezwiązanych z LM. Podczas gdy podejścia szyjne są bardzo inwazyjne i czasochłonne. Ten protokół może szybko generować modele LM. Omija barierę krew-mózg, precyzyjnie dostarcza komórki nowotworowe do przestrzeni oponowo-rdzeniowej i zmniejsza zarówno uraz chirurgiczny, jak i cenny czas.[Instruktor] Na początek weź 1 milion komórek raka płuc Lewisa lub LLC1 w DMEM, uzupełnionych 10% płodową surowicą bydlęcą i 0,1 miligra

minimally-invasive-cisterna-magna-injection-model-for-leptomeningeal

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Źródło: Joshi, K., et al. Stereotaktyczne podejście chirurgiczne do mikroiniekcji ogonowego pnia mózgu i górnego odcinka szyjnego rdzenia kręgowego za pośrednictwem Cisterna magna u myszy. J. Vis. Exp. (2022)Ten film demonstruje stereotaktyczne podejście cisterna magna do ukierunkowanego dostarczania do pnia mózgu i górnego rdzenia kręgowego. Dzięki dostępowi do cisterna magna wypełnionego płynem mózgowo-rdzeniowym, podejście to umożliwia precyzyjne wstrzykiwanie w miejsca, do których trudno...

Stereotaktyczne podejście Cisterna Magna do dostarczania terapeutycznego w modelu mysim

Źródło: Zamboni, M., et al., Indukcja modyfikacji komórek opon mózgowo-rdzeniowych poprzez wstrzyknięcie do wnętrzełka. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje procedurę dostarczania induktora leku do cisterna magna znieczulonej myszy. Wstrzyknięcie selektywnie indukuje ekspresję markerów fluorescencyjnych w komórkach powierzchni mózgu dostępnych za pośrednictwem płynu mózgowo-rdzeniowego, co potwierdza obrazowanie fluorescencyjne.

Celowane dostarczanie leków w modelu mysim za pomocą iniekcji Cisterna Magna

W tym filmie opisujemy procedurę dostarczania komórek nowotworowych pochodzenia ludzkiego do cisterna magna mózgu myszy. Ortotopowy model myszy może być wykorzystany do badania przerzutowego rozprzestrzeniania się raka do opon mózgowo-rdzeniowych.

Chirurgiczne wstrzyknięcie Cisterna Magna: metoda podawania komórek nowotworowych bezpośrednio do ośrodkowego układu nerwowego modelu mysiego

Tutaj opisujemy protokół wykonywania kaniulacji cisterna magna (CMc), minimalnie inwazyjnego sposobu dostarczania znaczników, substratów i cząsteczek sygnałowych do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF). W połączeniu z różnymi metodami obrazowania, CMc umożliwia ocenę dynamiki układu limfatycznego i płynu mózgowo-rdzeniowego, a także dostarczanie różnych związków do mózgu.

Implantacja kaniuli do Cisterna Magna gryzoni

Opisujemy iniekcję domostkową, która wykorzystuje igłę zgiętą na końcu, która może być stabilizowana do czaszki, eliminując w ten sposób ryzyko uszkodzenia leżącego pod spodem miąższu. Podejście to może być wykorzystane do genetycznego mapowania losów i manipulacji komórkami opon mózgowo-rdzeniowych oraz do śledzenia ruchów płynu mózgowo-rdzeniowego.

Indukcja modyfikacji komórek opon mózgowo-rdzeniowych poprzez wstrzyknięcie domostkowe

Modelowanie przerzutów wewnątrzczaszkowych do mózgu jest skomplikowane przez niemożność monitorowania wielkości guza i odpowiedzi na leczenie za pomocą precyzyjnych i szybkich metod. Przedstawiona metodologia łączy iniekcję guza śródczaszkowego z analizą rezonansu magnetycznego, która w połączeniu zapewnia precyzyjne i spójne iniekcje, ulepszone monitorowanie zwierząt i dokładne pomiary objętości guza.

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez iniekcję wewnątrzczaszkową i rezonans magnetyczny

Tutaj opisujemy model mysiego ksenoprzeszczepu, który funkcjonalnie przypomina rezerwuar Ommaya u pacjentów. Opracowaliśmy mysi Ommaya w celu zbadania nowych metod leczenia powszechnie śmiertelnej choroby opon mózgowo-rdzeniowych.

Mysi model ksenoprzeszczepu Ommaya do badania terapii ukierunkowanej na chorobę opon mózgowo-rdzeniowych

Opisujemy mysi model raka piersi z przerzutami do mózgu generowanymi przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej endogennej linii komórkowej zapalnego raka piersi z amplifikacją HER2.

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej komórek zapalnego raka piersi

Obecny protokół opisuje rozwój powtarzalnego mysiego modelu glejaka rdzenia kręgowego poprzez wstrzykiwanie komórek nowotworowych do przestrzeni międzykręgowej, oferując bardziej efektywne i mniej inwazyjne podejście do badań i rozwoju terapeutycznego.

Chirurgiczny przeszczep komórek nowotworowych do rdzenia kręgowego myszy

Przedstawiono tutaj protokół do oceny naczyń limfatycznych oponowych myszy (MLV), które odgrywają ważną rolę w wielu chorobach neurologicznych. Celem tego protokołu jest zapewnienie zintegrowanej metody, która umożliwia zarówno funkcjonalną ocenę drenażu znacznika, jak i szczegółową charakteryzację morfologiczną sieci grzbietowych MLV.

Zintegrowany Protokół Oceny Naczyń Chłonnych Opon Mózgowo-rdzeniowych: Wstrzyknięcie do Cisterny Magny, Wizualizowanie Węzłów Chłonnych, Sekcja Opon Mózgowo-rdzeniowych i Barwienie Całego Montażu

Poznaj minimalnie inwazyjną metodę iniekcji do cisterna magna w myszach do badań przerzutów opon mózgowo-rdzeniowych. Technika zmniejsza uraz i obciążenie pozaczaszkowe, poprawiając dobrostan zwierząt.

Minimalnie inwazyjny model iniekcji Cisterna Magna do badań przerzutów opon mózgowo-rdzeniowych u myszy

Przeglądaj więcej filmów