Name: In vivo (in vivo) Zastosowanie znakowania zbliżeniowego opartego na TurboID u Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Poznaj znakowanie zbliżeniowe TurboID do badania interakcji białek zucchini w komórkach linii zarodowej Drosophila melanogaster. Metoda umożliwia identyfikację nowych interaktorów i zrozumienie mechanizmów molekularnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium za ich dyskusje i pomoc. Praca ta była wspierana przez Narodową Fundację Badawczą (NRF) finansowaną przez rząd koreański (MSIT) (RS-2024-00345327 do ML; RS-2023-00219563 do ML).

<ol><li>Kim, D. I., Roux, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filling+the+void%3A+Proximity-based+labeling+of+proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Filling the void: Proximity-based labeling of proteins in living cells.</a> Trend Cell Biol. 26 (11), 804-817 (2016).</li>
<li>Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+labeling+of+protein+complexes+and+cell-type-specific+organellar+proteomes+in+Arabidopsis+enabled+by+turboid%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by turboid.</a> eLife. 8, e47864(2019).</li>
<li>Qi, Y., Katagiri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+low-abundance+Arabidopsis+plasma-membrane+protein+complexes+and+identification+of+candidate+components%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Purification of low-abundance Arabidopsis plasma-membrane protein complexes and identification of candidate components.</a> Plant J. 57 (5), 932-944 (2009).</li>
<li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+turboid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with turboid.</a> Nat Biotechnol. 36 (9), 880-887 (2018).</li>
<li>Rhee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+mapping+of+mitochondria+in+living+cells+via+spatially+restricted+enzymatic+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging.</a> Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).</li>
<li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).</li>
<li>Quantitative Proteomics. , 
 <a target="_blank" href="https://case.edu/medicine/nutrition/centers-and-collaborations/case-center-proteomics-and-bioinformatics/proteomics-and-small-molecule-mass-spectrometry-core/quantitative-proteomics">https://case.edu/medicine/nutrition/centers-and-collaborations/case-center-proteomics-and-bioinformatics/proteomics-and-small-molecule-mass-spectrometry-core/quantitative-proteomics</a> (2025).</li>
<li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+biotin+enable+large-scale+detection+of+biotinylation+sites+on+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins.</a> Nat Meth. 14 (12), 1167-1170 (2017).</li>
<li>Ummethum, H., Hamperl, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+labeling+techniques+to+study+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Proximity labeling techniques to study chromatin.</a> Front Genet. 11, 450(2020).</li>
<li>Han, S., Li, J., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+labeling%3A+Spatially+resolved+proteomic+mapping+for+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Proximity labeling: Spatially resolved proteomic mapping for neurobiology.</a> Curr Opin Neurobiol. 50, 17-23 (2018).</li>
<li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+zucchini+endoribonuclease+in+pirna+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure and function of zucchini endoribonuclease in pirna biogenesis.</a> Nature. 491 (7423), 284-287 (2012).</li>
<li>Zamudio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+restrains+transposons+from+adopting+a+chromatin+signature+permissive+for+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">DNA methylation restrains transposons from adopting a chromatin signature permissive for meiotic recombination.</a> Genes Dev. 29 (12), 1256-1270 (2015).</li>
<li>Cha, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+modulation+of+gsto+activity+rescues+fus-associated+neurotoxicity+via+deglutathionylation+in+als+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Therapeutic modulation of gsto activity rescues fus-associated neurotoxicity via deglutathionylation in als disease models.</a> Dev Cell. 57 (6), 783-798.e8 (2022).</li>
<li>Pulver, S. R., Berni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamentals+of+flying%3A+Simple+and+inexpensive+strategies+for+employing+Drosophila+genetics+in+neuroscience+teaching+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22J+Undergrad+Neurosci+Educ%22%5BJournal%5D)">The fundamentals of flying: Simple and inexpensive strategies for employing Drosophila genetics in neuroscience teaching laboratories.</a> J Undergrad Neurosci Educ. 11 (1), A139-A148 (2012).</li>
<li>Feizy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+Drosophila+rhodopsin+interaction+partners+by+biotin+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of Drosophila rhodopsin interaction partners by biotin proximity labeling.</a> Sci Rep. 14 (1), 1986(1986).</li>
<li>Zhang, B., Zhang, Y., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+effective+proximate+labeling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Highly effective proximate labeling in Drosophila.</a> G3. 11 (5), jkab077(2021).</li>
<li>Hudson, A. M., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying oogenesis.</a> Methods. 68 (1), 207-217 (2014).</li>
<li>Waring, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+eggshells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the eggshells in Drosophila.</a> Int Rev Cytol. 198, 67-108 (2000).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparing individual drosophila egg chambers for live imaging.</a> J Vis Exp. (60), e3679(2012).</li>
<li>Nguyen, T. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+profiling+of+the+zucchini+proximal+proteome+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">In vivo profiling of the zucchini proximal proteome in the Drosophila ovary.</a> Development. 150 (4), dev201220(2023).</li>
<li>Ahmadi, S., Winter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+poly%28ethylene+glycol%29+and+poly%28ethylene+glycol%29-based+detergents+using+peptide+search+engines%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of poly(ethylene glycol) and poly(ethylene glycol)-based detergents using peptide search engines.</a> Anal Chem. 90 (11), 6594-6600 (2018).</li>
<li>Zada, A., Khan, I., Zhang, M., Cheng, Y., Hu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airid-based+proximity+labeling+for+protein-protein+interaction+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Airid-based proximity labeling for protein-protein interaction in plants.</a> J Vis Exp. (187), e64428(2022).</li>
<li>Fang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lowering+sample+requirements+to+study+tyrosine+kinase+signaling+using+phosphoproteomics+with+the+tmt+calibrator+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Lowering sample requirements to study tyrosine kinase signaling using phosphoproteomics with the tmt calibrator approach.</a> Proteomics. 20 (24), 2000116(2020).</li>
<li>Park, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-stage+tip+method+for+tmt-based+proteomic+analysis+of+a+minimal+amount+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">One-stage tip method for tmt-based proteomic analysis of a minimal amount of cells.</a> ACS Omega. 8 (22), 19741-19751 (2023).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turboid-based+proximity+labeling+for+in+planta+identification+of+protein-protein+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks.</a> J Vis Exp. (159), e60728(2020).</li>
<li>Trinkle-Mulcahy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+proximity-based+labeling+methods+for+interactome+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances in proximity-based labeling methods for interactome mapping.</a> F1000Res. 8, Faculty Rev-135 F1000(2019).</li>
<li>Wei, X. F., Li, S., Hu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+turboid-based+proximity+labelling+approach+for+identifying+the+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">A turboid-based proximity labelling approach for identifying the DNA-binding proteins.</a> STAR Protoc. 4 (1), 102139(2023).</li>
<li>Bosch, J. A., Chen, C. L., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity-dependent+labeling+methods+for+proteomic+profiling+in+living+cells%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximity-dependent labeling methods for proteomic profiling in living cells: An update.</a> WIREs Dev Biol. 10 (1), e392(2021).</li>
<li>Rayaprolu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+biotin+labeling+in+vivo+resolves+regional+neuronal+and+astrocyte+proteomic+differences+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific biotin labeling in vivo resolves regional neuronal and astrocyte proteomic differences in mouse brain.</a> Nat Commun. 13, 2927(2022).</li>
<li>Uckun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+profiling+of+the+alk+proximitome+in+the+developing+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo profiling of the alk proximitome in the developing Drosophila brain.</a> J Mol Biol. 433 (23), 167282(2021).</li>
<li>Xiong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+proteomic+mapping+through+gfp-directed+proximity-dependent+biotin+labelling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">In vivo proteomic mapping through gfp-directed proximity-dependent biotin labelling in zebrafish.</a> Elife. 10, e64631(2021).</li>
<li>Holzer, E., Rumpf-Kienzl, C., Falk, S., Dammermann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+turboid+approach+identifies+tissue-specific+centriolar+components+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A modified turboid approach identifies tissue-specific centriolar components in C. elegans.</a> PLoS Genet. 18 (4), e1010150(2022).</li>
<li>Artan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactome+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+synapses+by+turboid-based+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interactome analysis of Caenorhabditis elegans synapses by turboid-based proximity labeling.</a> J Biol Chem. 297 (3), 101094(2021).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turboid-based+proximity+labeling+reveals+that+ubr7+is+a+regulator+of+n+nlr+immune+receptor-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Turboid-based proximity labeling reveals that ubr7 is a regulator of n nlr immune receptor-mediated immunity.</a> Nat Comm. 10 (1), 3252(2019).</li>
<li>Baumgartner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+zad+zinc+finger+protein+kipferl+guides+rhino+to+pirna+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The Drosophila zad zinc finger protein kipferl guides rhino to pirna clusters.</a> eLife. 11, e80067(2022).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W tym miejscu przedstawiamy kompleksową procedurę znakowania zbliżeniowego (PL) w jajniku Drosophila opartą na TurboID, opracowaną w wyniku szeroko zakrojonego rozwiązywania problemów w celu pokonania różnych wyzwań. Jedna z kluczowych kwestii dotyczyła konstruktów genetycznych, ponieważ różne układy fuzji znacząco wpływały na ekspresję białek i wydajność biotynylacji. Na przykład NES-V5-TurboID wykazywał słabszą ekspresję i biotynylację w porównaniu z innymi transgenami, co czasami komplikowało interpretację da...

Konwencjonalne metody mapowania interakcji białko-białko (PPI), takie jak oczyszczanie powinowactwa i spektrometria mas (AP-MS) oraz systemy hybrydowe drożdży-2 (Y2H), często nie są w stanie uchwycić białek o niskiej obfitości, przejściowo eksprymowanych lub związanych z błoną. To ograniczenie wynika z ich niezdolności do odtworzenia natywnych warunków fizjologicznych żywej komórki1,2,3. Aby sprostać tym wyzwaniom, PL stała się potężną techniką mapowania proteomu w wysokiej rozdzielczości na poziomie suborganelli in vivo. PL wykorzystuje fuzję promiskuitycznego enzymu z białkiem przynęty, umożliwiając enzymowi katalizowanie powstawania krótkożyciowych reaktywnych cząsteczek1. Te reaktywne cząsteczki, takie jak biotyna, kowalencyjnie znakują białka w promieniu kilku nanometrów od białka fuzyjnego4. Następnie biotynylowane białka są izolowane i analizowane za pomocą spektrometrii mas, aby ułatwić identyfikację białek na dużą skalę5,6.
W ciągu ostatnich lat rozwinięto różne enzymy rozwiązłe, które rozwijają techniki PL. Dwa szeroko stosowane enzymy to zmutowana ligaza biotyny R118G pochodząca z Escherichia coli (BioID) i enzym peroksydazy askorbinianowej 2 pochodzący z grochu (APEX2). BioID przekształca biotynę i ATP w biotynylo-5'-adenylan (bioAMP)1. Ta reaktywna cząsteczka kowalencyjnie wiąże się z resztami lizyny pobliskich białek w promieniu ± 10 nm. Kluczową zaletą PL opartej na BioID jest zastosowanie biotyny. Jest to naturalnie występująca i nietoksyczna biomolekuła w organizmach żywych, co pozwala na bezpieczne etykietowanie in vivo6. BioID ma jednak ograniczenia, w tym powolną kinetykę znakowania (18-24 h) i wymóg wysokiej temperatury (37 °C) dla optymalnej aktywności katalitycznej4. Cechy te mogą utrudniać jego zastosowanie w badaniu dynamicznych procesów biologicznych. Tymczasem APEX2 katalizuje powstawanie rodników biotynowo-fenoksylowych w obecności biotyny-fenolu i nadtlenku wodoru (H2O2)<sup class="xref">7. Rodniki te reagują głównie z łańcuchem bocznym aminokwasów bogatych w elektrony, takich jak tyrozyna, a także mogą wiązać cysteinę, histydynę i tryptofan8. Zdolność enzymu peroksydazy do szybkiego znakowania (< 1 min) jest odpowiednia do wychwytywania dynamicznych i przejściowych IPP9. Ponadto ma szerszy zakres wykrywania (do 20 nm) niż ligaza biotyny. Jednak PL na bazie APEX2 ma swoje wady, w tym wymóg toksycznego środka utleniającego,H2O2, oraz niską przepuszczalność biotyny-fenolu, co ogranicza możliwość zastosowania in vivo10.
W 2018 roku Branon i in. opracowali nową ligazę biotyny o nazwie TurboID, zmutowaną wersję BirA (ligazy biotyny występującej w E. coli) o sile 35 kD)4. Enzym ten zawiera mutację w pozycji R118 (R118S) wraz z 15 innymi mutacjami w stosunku do BirA. Wykazuje dwukrotnie wyższą aktywność katalityczną niż BioID. Biotynylacja indukowana przez TurboID w ciągu 10 minut generuje dane proteomiczne o wielkości i swoistości porównywalnej z 18 godzinami znakowania przez BioID. Ponadto wykazuje doskonałą aktywność etykietowania w temperaturze 30 °C4. Dlatego TurboID jest bardziej odpowiedni do stosowania w organizmach takich jak Drosophila lub Caenorhabditis elegans, które są zwykle hodowane w temperaturze odpowiednio 25 °C i 20 °C.
W tym badaniu zamierzamy wykorzystać PL oparte na TurboID do badania interaktomu w jajniku Drosophila. Opisane tutaj protokoły są stosowane do mapowania interaktomu Zuc w komórkach linii rozrodczej. Zuc to endonukleaza zlokalizowana na zewnętrznej błonie mitochondrialnej (OMM), która pośredniczy w biogenezie piRNA, małych niekodujących RNA krytycznych dla utrzymania integralności genomu11,12,13. Porównując biotynylowane białka zidentyfikowane na podstawie analizy Zuc-TurboID z białkami z dwóch dodatkowych kontroli, NES-TurboID i Tom20-TurboID, zdefiniowaliśmy odrębnych kandydatów na oddziałujące z Zuc.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciała</td>Goat anty-mysie przeciwciało drugorzędowe IgG (H+L), HRP Invitrogen 31430 Klasa analityczna, światłoczułe kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) wysoce adsorbowane krzyżowo, <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>alexa fluor plus 488</td><td>Invitrogen</td><td>A32731</td><td>Klasa analityczna, światłoczułe, światłoczułe</td></tr><tr><td>kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L), HRP</td><td>Invitrogen</td><td>31460</td><td>Klasa analityczna, światłoczułe</td></tr><tr><td>przeciwciało HSP90 (królik)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>4874</td><td>Przeciwciało poliklonalne</td></tr><tr><td>Pierce Streptawidyna, HRP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21126</td><td>Klasa analityczna</td></tr><tr><td>Streptawidyna, Alexa Fluor 594 koniugat</td><td>Invitrogen</td><td>S11227</td><td>Światłoczuły, klasa</td></tr> <tr><td>analitycznaPrzeciwciało V5-tag (mysz)</td><td>Invitrogen</td><td>R960-25</td><td>Przeciwciało monoklonalne</td></tr><tr><td>V5-tag przeciwciało (królik) (D3H8Q)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>13202</td><td>Przeciwciało monoklonalne</td></tr><tr><td>Fly Lines</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze/Opis</td></tr><tr><td>pUASp Tom20 V5-TurboID/ TM3</td><td>Korea Drosophila Stock Center</td><td>2373-2</td><td>Fly stock</td></tr><tr><td>pUASp Zucchini V5-TurboID/Cyo</td><td>Korea Drosophila Stock Center</td><td>2188</td><td>Fly stock</td></tr> Center <tr><td>pUASP_attB_V5-TurboID-NES/Cyo</td><td>Korea Drosophila Stock Center</td><td>2635-4</td><td>Fly stock</td></tr><tr><td>stock w[*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2H</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>7062</td><td>Fly stock</td></tr><tr><td>Equipments and Consumables</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze/Opis</td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>ME204</td><td>Odczyt</td></tr> <tr><td>0,1 mgMembrany Western Blot Amersham Protran 0,45 NC nitrocelulozowe (300 mm i razy 4 m)</td><td>Cytiva</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>10600002-Axygen 1,7 mL MaxyClear Snaplock Probówka mikrowirówkowa</td><td>Corning</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Kopolimer MARKA&nbsp; Szkło pokrywowe (22 mm x 22 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR470055</td><td>szkło borokrzemianowe</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet luzem (10 &mikro; L)</td> <td>Vertex</td><td>4110N00</td><td>Końcówki</td></tr><tr><td>do pipet luzem propylenowym (1000 &mikro; L)</td> <td>Vertex</td><td>4330N00</td><td>Końcówki</td></tr><tr><td>do pipet propylenowych (200 &mikro; L)</td> <td>Vertex</td><td>4230N00</td><td>Płytka do hodowli komórek propylenowych</td></tr><tr><td>(96-dołkowa)</td><td>SPL</td><td>300096</td><td>Polistyren, płaska</td></tr><tr><td>wirówka denna (z rotorem o pojemności 1,5-2 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>5424 R</td><td>Wirówka z chłodzeniem o stałym kącie</td></tr><tr><td>nachylenia (z wirnikiem o pojemności 5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>5425 R</td> Łyżka chemiczna o <td>stałym kącie, z chłodzeniem</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td>- </td><td>System</td></tr><tr><td>obrazowania ChemiDoc</td> ze stali nierdzewnej System <td>obrazowania Western blot</td><td>Biorad</td><td>12003153</td></tr><tr><td>Podkładka muchowa CO2</td><td></td> - <td></td><td>Tablica anestezjologiczna</td></tr><tr><td>CO2 zbiornik i regulator</td><td></td> - <td></td><td>Uwaga przed gazem pod wysokim ciśnieniem i zawrotami głowy</td></tr><tr><td>Kompaktowy inkubator</td><td>JSR</td><td>JSGI-10T</td><td>Uwaga na wysoką jakość temperatura</td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710</td><td>Uwaga przed intensywną wiązką laserową</td></tr><tr><td>Rurka stożkowa (15 mL)</td><td>SPL</td><td>50015</td><td>Polipropylen / polietylen o wysokiej gęstości&nbsp;</td></tr><tr><td>Rurka stożkowa (50 mL)</td><td>SPL</td><td>50050</td><td>Polipropylen / Polietylen o wysokiej gęstości&nbsp;</td></tr><tr><td>Równowaga cyfrowa</td> <td>-</td><td>--</td><td></td></tr> <tr><td>Zegar cyfrowy</td> <td>-</td><td>--</td><td></td></tr> <tr><td>Miska preparacyjna</td><td>-</td><td>-</td><td>Silikonowe</td></tr><tr><td>kleszcze Dumont #5SF&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Super cienkie końcówki, uwaga na ostre przedmioty</td></tr><tr><td>Magnes DynaMag-2</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Do probówek mikrowirówek o wielkości 1,5-2 ml</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus (25 mm x 75 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Uwaga na ostre przedmioty</td></tr><tr><td>Butelki na żywność na muchy (z papierową zatyczką)</td><td>Hansol Tech</td><td>FFB-21010-Fiolki</td><td></td></tr> z <tr><td>pokarmem dla much (z bawełnianą nakrętką)</td><td>Hansol Tech</td><td>FFV-11010-Skoncentrowany-ultradźwiękowiec</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Covaris</td><td>M220</td><td>Ostrzeżenie przed falą ultradźwiękową</td></tr><tr><td>Nóż żelowy</td><td>Invitrogen</td><td>EI9010</td><td>Stal nierdzewna z plastikowym uchwytem</td></tr><tr><td>Klasa 3MM Bibuła Chr (46 cm i czasy; 57 cm)</td><td>Cytiva</td><td>3030-917</td><td>Papier Whatmann</td></tr><tr><td>Ręczny homogenizator i plastikowy tłuczek</td><td>Kimble</td><td>749540-0000</td><td>Silnik akumulatorowy</td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>Drobny ALB6400 PCR</td><td></td><td>Uwaga przed wysoką temperaturą</td></tr><tr><td>Niestrzępiąca się chusteczka</td><td>Yuhan-Kimberly</td><td>41112</td><td>- </td></tr><tr><td>Ciekły azot</td> <td>-</td><td></td> <td>Uwaga przed odmrożeniami i oparzeniami</td></tr><tr><td>Spektrofotometr mikropłytkowy</td><td>Agilent Technologies</td><td>Epoka</td><td>Optyka oparta na monochromatorze</td></tr><tr><td>Mikrofale</td> <td>-</td><td></td> <td>Uwaga przed wysoką</td></tr><tr><td>temperaturą milliTUBE 1 mL włókno AFA</td><td>Covaris</td><td>PN 520135</td><td>Szkło</td></tr><tr><td>Mini zbiornik żelowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25977</td><td>Uwaga przed wysokotemperaturowymi</td></tr><tr><td>mini żelami białkowymi NuPAGE Bis-tris, 4&ndash; 12%, 1.0&ndash; 1,5 mm, 10-dołkowy</td><td>Invitrogen</td><td>NP0323BOX</td><td>Zawierają poliakrylamid, ostrzeżenie o toksyczności</td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-tris mini żele białkowe, 4&ndash; 12%, 1.0&ndash; 1,5 mm, 15-dołkowy</td><td>Invitrogen</td><td>NP0321BOX</td><td>Zawierają poliakrylamid, ostrzeżenie o toksyczności</td></tr><tr><td>Pędzel malarski (&Oslash; 1,8 mm)</td><td>Hwa hong</td><td>791240-Pipetman</td><td></td></tr> <tr><td>L (P1000L)</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td>Mikropipeta jednokanałowa z metalowym wyrzutnikiem</td></tr><tr><td>Pipetman L (P200L)</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td>Mikropipeta jednokanałowa z metalowym wyrzutnikiem</td></tr><tr><td>Pipetman L ( P20L)</td><td>Gilson</td><td>FA10003M</td><td>Mikropipeta jednokanałowa z metalowym wyrzutnikiem</td></tr><tr><td>Pipetman L (P2L)</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td>Mikropipeta jednokanałowa z metalowym eżektorem</td></tr><tr><td>Zasilanie Nauka</td><td>Major</td><td>MP-310</td><td>Uwaga przed elektrycznością wysokonapięciową</td></tr><tr><td>Programowalny rotator</td><td>Biosan</td><td>RS-24-Protein</td><td></td></tr> <tr><td>LoBind&nbsp; </td><td>rurki Eppendorf</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>30108302-Żyletka</td><td>Dorco</td><td>304020</td><td>Stal nierdzewna, uwaga na ostre przedmioty</td></tr><tr><td>Wałek</td> <td>-</td><td>--</td><td></td></tr> <tr><td>Pipeta serologiczna (10 ml)</td><td>SPL</td><td>91010</td><td>Polistyren</td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna (25 ml)</td><td>SPL</td><td>91025</td><td>Polistyren</td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna (5 ml)</td><td>SPL</td><td>91005</td><td>Polistyrenowa</td></tr><tr><td>pipeta serologiczna (50 ml)</td><td>SPL</td><td>91050</td><td>Polistyrenowe</td></tr><tr><td>probówki mikrowirówkowe o niskiej retencji z zatrzaskiem (1,5 ml)</td><td>Thermo Scientific</td><td>3451PK</td><td>Polipropylenowa</td></tr><tr><td>podkładka z gąbki</td><td>Invitrogen</td><td>EI9052-Mikroskop</td><td></td></tr> <tr><td>stereoskopowy</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508-Stereoskop</td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>Termomikser Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Z blokami o wielkości 1,5 i 5 ml</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Aven Tools</td><td>18526</td><td>Plastikowa, płaska końcówka</td></tr><tr><td>Mieszalnik Vortex</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236-XCell</td><td></td></tr> <tr><td>II Moduł Blot</td><td>Invitrogen</td><td>EI9051</td><td>Ostrzeżenie przed wysoką temperaturą</td></tr><tr><td>XCell&nbsp; Mini-komórka SureLock</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td>Ostrzeżenie przed wysoką temperaturą</td></tr><tr><td><silny>Chemikalia</silny><</td><td>silny>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze/Opis</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td><td>Klasa analityczna</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Supelco</td><td>1.00029.1000</td><td>Stopień LC-MS, ostrożność przed toksycznością inhalacyjną i łatwopalnymi</td></tr><tr><td>ampułkami wzorcowymi albuminy (zawierające albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniu 2 mg/ml w 0,9% soli fizjologicznej i 0,05% azydku sodu)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23209</td><td>Część zestawów do oznaczania białek Pierce BCA (Thermo Scientific, 23225)</td></tr><tr><td>Albumina, surowica bydlęca</td><td>Bioshop</td><td>ALB001</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td> klasy analitycznej <td>Sigma-Aldrich</td><td>09830</td><td>Biotyna klasy analitycznej</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td>Klasa do hodowli komórkowych i tkankowych</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>Klasa hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Klarowność zachodniego substratu ECL</td><td>Biorad</td><td>1705060</td><td>Klasa analityczna</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MBD0015</td><td>Światłoczuły, analityczny</td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td>Klasa analityczna</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Corning</td><td>35-015-CV</td><td>Klasa hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507</td><td>Klasa odczynnika, uwaga na toksyczność inhalacyjną</td></tr><tr><td>Pożywka dla owadów Grace</td><td>Gibco</td><td>11595030</td><td>Klasa hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Błyskawiczne suche drożdże</td><td>Brak marki</td><td>N1019</td><td>-</td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td>Światłoczuły, analityczny</td></tr><tr><td>metanol</td><td>Carlo Erba</td><td>41484</td><td>Klasa analityczna</td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td> <td>-</td><td></td> <td>bezbarwny</td></tr><tr><td>bufor do próbek Novex Tris-glycine SDS (2X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC2676</td><td>Klasa analityczna</td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td>Klasa analityczna</td></tr><tr><td>PageRuler Prestained protein ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td>Klasa analityczna</td></tr><tr><td>Fluorek fenylometanosulfonylu&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>36978</td><td>Klasa analityczna</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Klasa analityczna</td></tr><tr><td>Pierce 16% Formaldehyd (w/v)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Klasy analitycznej, światłoczułe</td></tr><tr><td>zestawy do oznaczania białek Pierce BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Klasa</td></tr> <tr><td>analitycznaOdczynnik A Pierce BCA (zawierający węglan sodu, wodorowęglan sodu, kwas bicynchoninowy i winian sodu w 0,1 M wodorotlenku sodu)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23228</td><td>Część zestawów do oznaczania białek Pierce BCA (Thermo Scientific, 23225)</td></tr><tr><td>Odczynnik Pierce BCA B (zawierający 4% siarczanu miedzi)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1859078</td><td>Część zestawów do oznaczania białek Pierce BCA (Thermo Scientific, 23225)</td></tr><tr><td>Kwas propionowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402907</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw koktajli inhibitorów proteazy</td> klasy <td>ACS Klasa 539134 Calbiochem</td><td></td><td>Klasa kultur komórkowych i tkankowych</td></tr><tr><td>SlowFade Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>S36936</td><td>Światłoczuły</td></tr><tr><td>chlorek sodu (NaCl)</td><td>Bioneer</td><td>C-9025</td><td>Klasa analityczna</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>Klasa analityczna</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>Klasa cząsteczkowa</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Biosesang</td><td>SR2018-100-00</td><td>Klasa analityczna</td></tr><tr><td>Potrójnie destylowana woda</td> - <td></td><td></td><td>ultraczysta (typ 1)</td></tr> <tr><td>sól fizjologiczna buforowana trisem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94158</td><td>Klasa analityczna</td></tr><tr><td>Bufor transferowy Tris-glicyny</td><td>Koma Biotech</td><td>K0341001</td><td>Klasa analityczna</td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 8</td><td>Bioneer</td><td>C-9006</td><td>Klasa analityczna</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td>Klasa molekularna</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20233</td><td>Klasa hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td> klasy cząsteczkowej <td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378</td><td>Molekularne i Klasa hodowli komórkowej</td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) zastosowanie znakowania zbliżeniowego opartego na turboid u drosophila melanogaster

In Vivo Application of TurboID-based Proximity Labeling in Drosophila melanogaster

Etykietowanie zbliżeniowe (PL) to skuteczna metoda mapowania sieci interakcji białko-białko. Postępy w znakowaniu enzymów, zwłaszcza TurboID, poszerzyły jego zastosowanie w systemach biologicznych. TurboID jest szczególnie korzystny do zastosowań in vivo ze względu na swoją wytrzymałość, nietoksyczność i łatwość użycia. Enzym ten rozwiązłe biotynyluje pobliskie biomolekuły, w tym białka i kwasy nukleinowe, w zakresie około 10 nm w obecności biotyny. Zastosowaliśmy tę metodę do zbadania interakcji cukinii (Zuc), kluczowego czynnika w biogenezie RNA oddziałującego z piwi (piRNA) na zewnętrznej błonie mitochondrialnej (OMM) w komórkach linii rozrodczej jajnika Drosophila melanogaster. Poprzez ekspresję Zuc-TurboID w komórkach rozrodczych i suplementację biotyną, indukowaliśmy biotynylację białek proksymalnych Zuc. Analiza spektrometrii mas po wzbogaceniu biotynylowanych peptydów pozwoliła zidentyfikować białka znajdujące się w bliskim sąsiedztwie Zuc, w tym dobrze znane interakcje w biogenezie piRNA. Co ciekawe, odkryliśmy nowe interakcje Zuc zaangażowane w fałdowanie białek, organizację błony i transport pęcherzyków.

Przykładowe wyniki przedstawiono na Rysunku 1, Rysunku 2, Rysunku 3 oraz Rysunku 4, które zostały wcześniej opublikowane przez zespół Nguyen i wsp.20. Rysunek 1 ilustruje procedurę eksperymentalną PL opartej na TurboID w jajniku Drosophila. Najpierw wygenerowano konstrukt łączący Zuc i TurboID (Zuc-V5-TurboID...

W tym badaniu ustalamy szczegółowy protokół znakowania zbliżeniowego (PL) opartego na TurboID w jajniku D. melanogaster, obejmujący etapy od suplementacji biotyną i rozwarstwienia jajników do walidacji ekspresji transgenu i wzbogacenia biotynylowanych peptydów do spektrometrii mas.

In vivo (in vivo) Zastosowanie znakowania zbliżeniowego opartego na TurboID u Drosophila melanogaster

Proximity labeling (PL) is a powerful method for mapping protein-protein interaction networks. Advances in labeling enzymes, especially TurboID, have ...

W tym badaniu znakowanie zbliżeniowe oparte na TurboID służy do mapowania interakcji białek cukinii w komórkach linii rozrodczej jajnika drosophila. Zidentyfikowano zarówno dobrze znane, jak i nowatorskie interakcje cukinii. W szczególności odkryto, że kilka nowych interakcji jest zaangażowanych w fałdowanie białek, organizację błon i transport fizyczny. W tym badaniu TurboID jest używany do skutecznego znakowania w tkance zwierzęcej przy jednoczesnej kontroli biotynylacji tła. Specyficzność znakowania i pokrycie białkami są zwiększane przez optymalizację kontroli i wzbogacanie biotynylowanych peptydów po trypsynizacji. Podejście to umożliwia systemowe badania przesiewowe interakcji białkowych w celu odkrycia funkcji i mechanizmów molekularnych białek będących przedmiotem zainteresowania.[Narrator] Na początek nałóż łyżkę laboratoryjną gładkiej pasty drożdżowej przygotowanej przez rozpuszczenie proszku drożdżowego w potrójnie destylowanej wodzie na ściankę fiolki. Weź kolejną fiolkę zawierającą nowo wyklute muchy i delikatnie postukaj w nią, aby zebrać muchy na dnie. Odwrócić tę fiolkę na fiolkę zawierającą pastę drożdżową i wyrównać brzegi, aby zapobiec ucieczce much. Postukać o siebie obie fiolki, aby przenieść muchy do dolnej części fiolki zawierającej pastę. Po zakończeniu transferu należy bezpiecznie umieścić bawełniane nakrętki na obu fiolkach i odczekać trzy dni. Trzeciego dnia przygotuj 100 mikromolowy roztwór roboczy biotyny, rozcieńczając jeden molowy zapas biotyny w potrójnie destylowanej wodzie. Do roztworu dodać 500 mikrolitrów 0,5% kwasu proponowego. Wymieszaj roztwór biotyny z suchymi drożdżami w proszku i wymieszaj z pastą. Dodaj łyżkę laboratoryjną pasty drożdżowej z biotyną do ścianki fiolki z biotyną. Podziel muchy na dwie grupy. Przenieść jedną grupę do fiolki zawierającej normalny pokarm jako kontrolę. Przenieś drugą grupę do fiolki z biotyną uzupełnioną pastą z drożdży biotyny, aby rozpocząć uniesienie biotyną. Po 16 godzinach przenieść muchy do nowej fiolki zawierającej normalny pokarm. W celu pobrania jajników Drosophila odpipetuj jeden mililitr zimnego podłoża owadzi Grace's na naczynie separacyjne. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką umieść samicę muchy w naczyniu preparacyjnym i zanurz ją w pożywce. Przytrzymaj klatkę piersiową jedną parą kleszczy, nie miażdżąc ciała. Użyj innych kleszczy, aby delikatnie usunąć czubek tylnej części brzucha, w której znajdują się genitalia. Powoli wyciśnij jajniki za pomocą kleszczy, zaczynając od górnej części brzucha i przesuwając się w dół. Usuń siatki mięśniowe i otaczające tkanki bez uszkadzania jajników. Przenieś czyste jajniki do rurki o pojemności 1,7 mililitra za pomocą kleszczy i trzymaj rurkę na lodzie. W celu lizy tkanek dodaj 500 mikrolitrów 2% dodecylosiarczanu sodu w buforowanym roztworze soli fizjologicznej uzupełnionym koktajlem inhibitorów proteazy do probówki zawierającej jajniki. Poczekaj, aż komórki zostaną poddane lizie, a roztwór stanie się lepki. Wykonaj sonikację, korzystając z warunków pokazanych na ekranie. Następnie, w celu wytrącenia acetonu, przenieś lizat do pięciomililitrowej probówki o niskim poziomie wiązania. Dodać zimny aceton do probówki o objętości sześciokrotności objętości próbki. Krótko zawiruj probówkę, a następnie załaduj ją do wielorotatora i inkubuj przez noc przez około 16 godzin w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Wytrącone białka osadzać przez odwirowywanie w temperaturze 15 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Teraz dodaj dwa mililitry roztworu mieszaniny składającego się z 90% zimnego acetonu i 10% próby buforowanej soli fizjologicznej. Wymieszać osad i roztwór, pipetując w górę i w dół. Krótko wymieszaj probówkę przed ponownym załadowaniem jej do multirotatora i inkubacją przez dwie godziny w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Wytrącone białka osadzać przez odwirowywanie w temperaturze 15 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu wykonaj wirowanie w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie otwórz probówkę i pozostaw granulat do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut. Ponownie zawiesić osad białkowy w 500 mikrolitrach ośmiomolowego mocznika. Przenieś roztwór do mililitrowej rurki mili o wielkości jednego mililitra zawierającej adaptacyjną akustykę skupioną lub włókno AFA. Sonikuj probówkę przy użyciu tych samych parametrów, które pokazano wcześniej, przed wykonaniem kwasu bicinchoninowego lub BCASA, w celu określenia stężenia białka. Denaturacja białek za pomocą bloku termicznego ustawionego na 450 obr./min przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodać do probówki pięć mikrolitrów jednego molowego ditiotreitolu rozpuszczonego w potrójnie destylowanej wodzie, aby uzyskać końcowe stężenie 10 milimolów. Umieść probówkę ponownie na bloku termicznym na godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zredukować białka. Teraz dodaj 55 mikrolitrów 400-milimolowego roztworu jodoacetamidu do probówki z próbką, aby osiągnąć końcowe stężenie 40 milimoli przed umieszczeniem probówki z powrotem w bloku termicznym w celu alkilowania. Rozcieńczyć próbkę, dodając 50 milimolowy roztwór wodorowęglanu amonu, aż całkowita objętość osiągnie cztery mililitry. Dodać cztery mikrolitry jednego molowego roztworu podstawowego chlorku wapnia do probówki, aby osiągnąć końcowe stężenie jednego milimola. Pipetować w górę i w dół, aby homogenizować roztwór. Następnie dodaj 150 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr roztworu podstawowego trypsyny do probówki, utrzymując stosunek trypsyny do próbki od jednego do 20. Trawić białko za pomocą bloku termicznego ustawionego na 450 obr./min przez 16 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przemyć 150 mikrolitrów sprzężonych ze streptawidyną kulek magnetycznych na trzy miligramy próbki jednym mililitrem dwóch molowych mocznika w buforowanym roztworze soli fizjologicznej. Odpipetować jeden mililitr strawionych peptydów do probówki zawierającej kulki i delikatnie wymieszać. Połącz mieszaninę z pozostałą próbką peptydu w pięciomililitrowej probówce o niskim poziomie wiązania. Po inkubacji przez godzinę przenieś jeden mililitr mieszaniny do 1,5 mililitrowej probówki i umieść ją na stojaku magnetycznym na jedną minutę. Umyj kulki dwukrotnie jednym mililitrem dwóch molowych mocznika w 50-milimolowym wodorowęglanie amonu i raz jednym mililitrem potrójnie destylowanej wody przed umieszczeniem probówki z powrotem na stojaku magnetycznym na jeszcze jedną minutę i wyrzuceniem buforu. Następnie odpipetuj 100 mikrolitrów buforu wyjaśniającego do probówki zawierającej kulki, delikatnie wymieszaj i wymyj peptydy za pomocą bloku termicznego ustawionego na 300 obr./min przez pięć minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza przed ponownym umieszczeniem probówki na stojaku magnetycznym. Teraz przenieś elucję do nowej 1,5 mililitrowej probówki, unikając wszelkich kulek. Wymyta próbka jest teraz gotowa do wysuszenia i wykorzystania do analizy spektrometrii mas. Rysunek ten przedstawia obrazowanie konfokalne i analizę interakcji proteomicznej cukinii V5 TurboID w celu identyfikacji białek proksymalnych i oddziałujących. Obrazy konfokalne wykazały silną nakładającą się ekspresję między transgenami i białkami proksymalnymi po leczeniu biotyną, wychwyconą odpowiednio przez przeciwciało V5 i streptawidynę sprzężoną z Alexa Fluer 594. Analiza ontologii genowej proteomu V5 TurboID cukinii ujawniła wzbogacone biotynylowane białka zaangażowane w fałdowanie białek za pośrednictwem białek opiekuńczych, organizację układu endomembranowego i regulację transportu z retikulum endoplazmatycznego do aparatu GGI.

in-vivo-application-turboid-based-proximity-labeling-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie mikroiniekcji i obrazowania o wysokiej rozdzielczości w zarodku syncytialnym Drosophila melanogaster w celu badania mitozy.

Techniki mikroiniekcji do badania mitozy w embrionie syncytialnym Drosophila melanogaster

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna działa poza limitami penetracji charakterystycznymi dla fluorescencyjnej mikroskopii sekcji tkanek. Technika ta opiera się na oświetleniu wieloprojekcyjnym oraz opisie transportu fotonów. Demonstrujemy wizualizację 3D całego organizmu in-vivo podczas morfogenezy wyobraźników skrzydeł wykazujących ekspresję GFP u Drosophila melanogaster.

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna do obrazowania in-vivo rozwijających się Drosophila

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Niniejszy protokół opisuje niezawodną metodę znieczulania i obrazowania nienaruszonych larw Drosophila melanogaster. Wykorzystaliśmy lotny anestetyk desfluran, aby umożliwić powtarzalne obrazowanie z rozdzielczością podkomórkową oraz ponowną identyfikację struktur przez okres do kilku dni1.

Obrazowanie in vivo nienaruszonych larw Drosophila z rozdzielczością podkomórkową

Prezentujemy technikę oznaczania pojedynczych neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) zarodków Drosophila, która pozwala na analizę morfologii neuronów za pomocą światła przechodzącego lub mikroskopii konfokalnej.

Znakowanie pojedynczych komórek w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila melanogaster

Ten artykuł demonstruje użycie szybkiego skaningowego mikroskopu konfokalnego do obrazowania zachowania komórek bezpośrednio przez poczwarkę. Pozostawiając nienaruszoną obudowę poczwarki, metoda ta umożliwia obserwację i pomiar dynamicznych procesów komórkowych na etapie rozwoju Drosophila, który jest trudny do bezpośredniego zbadania.

Obrazowanie przez poczwarkę Drosophila melanogaster

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Opisany protokół hybrydyzacji RNA in situ pozwala na wykrycie RNA w całych zarodkach Drosophila lub wypreparowanych tkankach. Korzystając z 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych i wzmocnienia sygnału tyramidu, transkrypty mogą być wykrywane z wysoką rozdzielczością, czułością i przepustowością oraz przy stosunkowo niskich kosztach.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach Drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji, wykrywania, analizy i śledzenia endogennego transportu mRNA w żywej komorze jajowej Drosophila melanogaster za pomocą latarni molekularnych, mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem i oprogramowania do analizy open-source.

Wizualizacja i śledzenie endogennych mRNA w żywych komorach jajowych Drosophila melanogaster

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Poznaj znakowanie zbliżeniowe TurboID do badania interakcji białek zucchini w komórkach linii zarodowej Drosophila melanogaster. Metoda umożliwia identyfikację nowych interaktorów i zrozumienie mechanizmów molekularnych.

In vivo (in vivo) Zastosowanie znakowania zbliżeniowego opartego na TurboID u Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów