Identyfikacja gatunków prątków za pomocą metody mikromacierzy DNA

[Narrator] Badania koncentrują się na diagnostyce molekularnej w mikrobiologii klinicznej. W porównaniu z tradycyjnymi metodami wykrywania, metoda mikromacierzy DNA do identyfikacji gatunków prątków jest bardzo czuła, specyficzna i szybka, co może stanowić ważną pomoc we wczesnej diagnozie pacjentów klinicznych. Obecnie metody szybkiej identyfikacji prątków niegruźliczych są ograniczone w wielu oddolnych laboratoriach, co ma bezpośredni wpływ na diagnostykę kliniczną i leczenie pacjentów. Na początek ustaw temperaturę łaźni wodnej o stałej temperaturze na 50 stopni Celsjusza i podgrzej ją. Aby przygotować chipy, dodaj 200 mikrolitrów wody destylowanej na dno pudełka do hybrydyzacji chipów z mikromacierzą genów. Umieść wspornik między dwiema kolumnami pozycjonującymi wewnątrz pudełka. Ostrożnie umieść chip przednią stroną do góry na wsporniku i przykryj go szkiełkiem nakrywkowym tak, aby cztery występy były skierowane w dół, upewniając się, że koniec szkiełka nakrywkowego jest wyrównany z etykietą na końcu chipa. Następnie przygotuj probówki wirówkowe o pojemności 200 mikrolitrów lub osiem pasków dołkowych w zależności od liczby próbek i odpowiednio je oznacz. Podgrzej bufor hybrydyzacyjny z zestawu w temperaturze 50 stopni Celsjusza, aż całkowicie się rozpuści. Po dokładnym wymieszaniu szybko odwiruj go w mikrowirówce. Podwielokrotność dziewięciu mikrolitrów buforu hybrydyzacyjnego do każdej przygotowanej probówki lub paska. Dodaj sześć mikrolitrów odpowiedniego produktu PCR do każdej probówki, uzyskując końcową objętość 15 mikrolitrów na mieszaninę reakcyjną. Podgrzej mieszaninę reakcji hybrydyzacji do 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby ją denaturować za pomocą przyrządu do PCR lub łaźni wodnej. Po zabiegu denaturacji natychmiast zanurzyć mieszaninę w mieszaninie lodowatej wody i inkubować przez trzy minuty. Wyjąć mieszaninę z reakcji hybrydyzacji z łaźni lodowej i wymieszać ją, pipetując dwukrotnie w górę i w dół. Gdy nie pozostanie żaden biały kłaczkowaty osad, dodać 13,5 mikrolitra mieszaniny reakcyjnej przez otwór załadowczy szkiełka nakrywkowego. Szybko przykryj i uszczelnij pudełko hybrydyzacyjne i zapisz numer chipa, pozycję mikromacierzy i numer próbki. Teraz umieść szczelne pudełka hybrydyzacyjne poziomo w łaźni wodnej o stałej temperaturze, która została wstępnie podgrzana do 50 stopni Celsjusza. Po umieszczeniu wszystkich pudełek w środku uruchom minutnik na 120 minut. Po zakończeniu reakcji hybrydyzacji wyjmij pudełka hybrydyzacyjne poziomo, zdemontuj je i odzyskaj chipy. Natychmiast umieść frytki na ruszcie do szkiełka w pojemniku wypełnionym roztworem do mycia wiórów I, który został zrównoważony do temperatury pokojowej i umyj je z prędkością od 80 do 100 obr./min na wytrząsarce o stałej temperaturze przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Ponownie umyj frytki roztworem do mycia wiórów II na wytrząsarce ustawionej na 80 do 100 obr./min przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Teraz umieść frytki w wirówce i wiruj z prędkością 100 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Włącz skaner. A następnie otwórz odpowiednie oprogramowanie. Kliknij przycisk Sterowanie laserem, aby umożliwić jego wstępne rozgrzanie przez 10 minut. Wprowadź do oprogramowania informacje związane z próbką. Gdy skaner zakończy wstępne nagrzewanie, kliknij przycisk Wysuń. Umieść wysuszony wiór równomiernie na małym wsporniku. Delikatnie i poziomo wepchnij chip do komory skanera i kliknij przycisk Załaduj. Teraz wprowadź numer chipa do oprogramowania i kliknij, aby wybrać obszar wykrywania mikromacierzy od 1 do 4. Kliknij przycisk Wybierz próbkę, aby wybrać odpowiednie próbki dla każdej mikromacierzy. Następnie kliknij Rozpocznij wykrywanie, aby rozpocząć skanowanie chipów. Wyniki skanowania zostaną wyświetlone na ekranie i automatycznie zapisane. Strona zapytania o dane służy do wykonywania zapytań o dane i operacji drukowania. Po wykonaniu wszystkich operacji wyłącz laser, wyjdź z oprogramowania, a na koniec wyłącz skaner. Ważność wyników doświadczalnych potwierdza się w drodze kontroli jakości, przy czym kontrola pozytywna daje wynik wykrycia kompleksu Mycobacterium tuberculosis, a kontrola ujemna nie daje żadnych prątków. Interpretacja próbek testowych rozpoczyna się od przypadków, w których wszystkie sondy, w tym ta o najwyższej wartości sygnału, są ujemne, co skutkuje raportem o braku prątków. W próbkach, w których tylko sonda kompleksu Mycobacterium tuberculosis wykazuje silny sygnał, wynik jest identyfikowany jako pozytywny dla tej grupy gatunków. Jeśli sonda odpowiadająca Mycobacterium avium jest jedyną z silnym sygnałem, próbka jest identyfikowana jako dodatnia na obecność Mycobacterium avium. Jeżeli tylko sonda kontroli wewnętrznej jest dodatnia, a wszystkie inne są ujemne, wynik jest podawany jako nieokreślony, co wskazuje na obecność gatunku prątków nieobjętych zestawem do wykrywania.