Wewnątrzkomórkowa cytometria fosfoflowa ostrej białaczki szpikowej Ksenotransplantacje pochodzące od pacjentów

Nasze badania mają na celu zrozumienie, w jaki sposób ostra białaczka szpikowa rozwija oporność na zatwierdzone terapie. Opiera się na hipotezie, że metaboliczne odgrywają kluczową rolę. Ostatecznym celem jest zidentyfikowanie strategii, która może skutecznie przezwyciężyć ten opór. Cytometria przepływowa, szeroko stosowana w badaniach nad białaczką, jest idealna do analizy komórek zawiesinowych, takich jak komórki białaczkowe. Jego zdolność adaptacji sprawia, że jest to potężne narzędzie do badania mechanizmów molekularnych danych. Głównym wyzwaniem eksperymentalnym w badaniach nad AML jest opracowanie optymalnego protokołu in vivo do reanimacji molekularnej, czyli komórki do dokładnego modelowania, zrozumienia mechanizmu leżącego u podstaw oporności terapeutycznej.

[Narrator] Na początek zegnij kolano myszy i użyj ręki niedominującej, aby unieruchomić nogę w celu odsłonięcia powierzchni stawowej kości udowej, w której znajduje się strona nakłucia. Umieść kciuk na kości piszczelowej, palec wskazujący na kości udowej, a środkowy na zewnętrznej stronie kości, aby je ustabilizować. Zachowując unieruchomienie, należy zdezynfekować okolice kolana alkoholem izopropylowym, aby odsunąć na bok pozostałe włoski i poprawić wizualizację struktury kości. Używając pierwszej suchej strzykawki o rozmiarze 25, umieść igłę na środku stawu udowego i delikatnie ją obróć, aby utworzyć otwór w powierzchni stawowej kości udowej bez użycia siły. Gdy igła dostanie się do szpiku, należy stopniowo wyjmować strzykawkę, jednocześnie ją obracając. Włożyć drugą przepłukaną strzykawkę do otworu utworzonego przez pierwszą igłę. Przycisnąć podciśnienie do drugiej strzykawki włożonej do kości udowej, delikatnie ją obracając i stopniowo wycofując. Przenieść wyekstrahowany szpik kostny, przepłukując zawartość strzykawki do schłodzonej mikroprobówki wirówkowej zawierającej 500 mikrolitrów PBS. Próbkę należy przechowywać na lodzie. Delikatnie uciskaj miejsce wkłucia za pomocą wacika izopropanolowego przez 30 sekund, aby zatrzymać krwawienie. Odwiruj komórki w temperaturze 500G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Za pomocą systemu zasysania próżniowego delikatnie odessać i wyrzucić supernatant. Dodaj 200 mikrolitrów na próbkę roztworu do barwienia komórek fluorescencyjnych. Rozcieńczyć od jednego do 100 w PBS w celu oznaczenia martwych komórek. Delikatnie ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety. Następnie inkubuj komórki na lodzie przez 10 minut, chroniąc przed światłem. Po 10 minutach odwiruj komórki w temperaturze 500G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Odessać i wyrzucić supernatant za pomocą systemu próżniowego, dodać 100 mikrolitrów na próbkę HCD 45 Brilliant ultraviolet 395 przeciwciała rozcieńczonego do 1 do 100 w PBS zawierającym 2% płodowej surowicy bydlęcej w celu oznaczenia ludzkich komórek krwiotwórczych. Inkubuj komórki na lodzie przez 15 minut, upewniając się, że są chronione przed światłem. Odwiruj komórki w temperaturze 500G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Odessać i wyrzucić supernatant za pomocą systemu próżniowego. Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze 1,6% formaldehydu w roztworze PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, chroniąc przed światłem. Po 10 minutach odwiruj komórki w temperaturze 500G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Odessać i wyrzucić supernatant za pomocą systemu próżniowego. Teraz dodaj jeden mililitr 100% metanolu, wstępnie schłodzonego w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza bezpośrednio do dwóch. Próbki należy inkubować w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 30 minut, chroniąc przed światłem. Odwiruj komórki w temperaturze 500G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Za pomocą systemu próżniowego odessać i wyrzucić supernatant. Do każdej próbki dodać 50 mikrolitrów mieszanego roztworu przeciwciał lub mieszanego roztworu kontrolnego izotypu. Delikatnie ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety, inkubować wszystkie próbki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, upewniając się, że są chronione przed światłem. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 500G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu przemyć komórki 1000 mikrolitrami PBS, delikatnie zawieszając je ponownie pipetą. Ponownie odwirować komórki w temperaturze 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu należy przeprowadzić drugie płukanie przy użyciu 1000 mikrolitrów PBS i delikatnie ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety, a następnie ponownie odwirować komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zasysaniu supernatantu należy ponownie zawiesić próbki końcowe w 200 mikrolitrach PBS. Rysunek ten ilustruje przebieg pracy, strategię bramkowania i normalizację wewnątrzkomórkowych sygnałów fosfoproteinowych w komórkach szpiku kostnego od pacjentów z ostrą białaczką szpikową myszy ksenoprzeszczepowych leczonych terapią opartą na wenetoklaksie przez 15 dni. Strategia bramkowania z powodzeniem zidentyfikowała żywotne ludzkie komórki ostrej białaczki szpikowej lub AML na podstawie profili rozproszenia do przodu i bocznego oraz dodatniego wyniku CD45, umożliwiając spójną analizę we wszystkich grupach leczenia. Leczenie wenetoklaksem 5-azacytydyną i urydyną CDZ prowadziło do zwiększonej fosforylacji STAT5 i RPS6 w komórkach AML, co sugeruje aktywację szlaków przeżycia związanych z opornością. Co ciekawe, gdy myszy były leczone gilterytynibem, leczenie nie zmniejszyło znacząco fosforylacji białek szlaku FLT3, co wskazuje, że sygnalizacja utrzymywała się pomimo terapii celowanej. Fosforylowany STAT5 i fosforylowany RPS6 wykazały najsilniejszy wzrost korelacji poziomów ekspresji po terapii opartej na wenetoklaksie, co wskazuje na jednoczesną aktywację tych szlaków.