Mikrowzorowane elastomery magneto-reologiczne do wywoływania zmian w ustawieniu kardiomiocytów
10 czerwca 2025
Przedstawiamy dynamiczną i odwracalną platformę do testowania sztywności wykonaną z ultramiękkiego silikonowego elastomeru (polidimetylosiloksan, PDMS) z osadzonymi cząstkami żelaza. Ten nowatorski test nadaje się do badania pojawiających się czasowo zależnych zmian fizycznych w fenotypach komórek, w tym naprowadzania kontaktowego. Tutaj mierzymy wyrównanie kardiomiocytów noworodków szczurów po usztywnieniu macierzy za pomocą magnetyki.
Badamy, jak kardiomiocyty reagują na dynamiczne, odwracalne zmiany w swoim środowisku mechanicznym, naśladując wahania sztywności i struktury, które doświadczają in vivo. Od czasu wprowadzenia MRE opublikowaliśmy kilka ważnych badań z zakresu kardiologii. Korzystając z tych materiałów, odkryliśmy, że hipertrofia napędzana sztywnością w dorosłych kardiomiocytach zależy od sieci mikrotubul.
Ostatnio odkryliśmy więcej informacji o pamięci mechanicznej zarówno w fibroblastach sercowych, jak i kardiomiocytach pochodzących z iPSC. Najlepszą częścią stosowania elastomerów magnetoreologicznych jest ich prostota. Nasze protokoły są proste, jak się wydaje, to połączenie gotowych produktów, które współpracują, tworząc coś potężnego.
To łatwe w użyciu podejście, które sprawia, że nowoczesna nauka jest dostępna dla każdego. To utorowało drogę do bardziej realistycznych modeli chorób, zwłaszcza dla takich schorzeń jak niewydolność serca, gdzie mechanizmy tkanek stale się zmieniają. Pomaga także naukowcom projektować inteligentniejsze biomateriały, które są wysoce strojalne, dynamiczne i odwracalne.
Nasz zespół koncentrował się głównie na chorobach serca, ale ostatnio rozszerzyliśmy zakres dynamicznych, najsztywniejszych MRE z zaledwie 5 kilopaskali do nawet 400 kilopaskali. Ten przełom otwiera nam drzwi do rozszerzenia badań i współpracy nad innymi organami poza sercem. Na początek wymieszaj zasadę i środek utwardzający w proporcji 10 do 1, aby przygotować 10 gramów 184 polidimetylosiloksanu, czyli PDMS.
Wlej pięć gramów z 184 PDMS do 35-milimetrowej szalki Petriego. Następnie umieść naczynie w osuszacu i odgazuj na około pięć do dziesięciu minut, aż wszystkie bąbelki znikną. Pozwól 184 PDMS częściowo się utwardzić przez 30 minut w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza.
Gdy pozostanie pięć minut na utwardzanie, nałóż cienką warstwę dodatkowej 184 PDMS na powierzchnię siatki dyfrakcyjnej. Włóż go do suszarki, aby odgazowała na około pięć minut. Teraz wyjmij z piekarnika 35-milimetrową miskę Petriego zawierającą częściowo utwardzone 184 PDMS.
Przełóż siatkę dyfrakcyjną PDMS na częściowo utwardzone 184 PDMS w naczyniu. Delikatnie dociśnij siatkę dyfrakcyjną, aż otoczy ją niewielka ilość PDMS. Użyj pozostałych nieutwardzonych 184 PDMS, aby wypełnić naczynie otaczające rusztę, aby utrzymać się na miejscu podczas utwardzania.
Następnie włóż potrawę do piekarnika ustawionego na 60 stopni Celsjusza na 1,5 godziny. Po dojrzewaniu wyjmij naczynie z tartem z piekarnika. Użyj skalpela, aby naciąć wokół siatki dyfrakcyjnej.
Nałóż niewielką ilość alkoholu izopropylowego, aby przeniknąć pod kratę dyfrakcyjną. Zdejmij kratkę z PDMS w kierunku równoległym do wzorów. Usuń nadmiar PDMS, pozostawiając jedynie wzorzystą sekcję.
Następnie przytnij znaczek PDMS do pożądanego rozmiaru. Zaznacz kierunek wzoru na talerzu MRE. Aby pokryć pieczątkę silanem, umieść wyprodukowany znaczek 184 PDMS wewnątrz środka do czyszczenia plazmy tlenowej z powierzchnią wzorowaną do góry.
Traktuj powierzchnię 45 watami osocza tlenowego przez 30 sekund. Umieść impregnowane znaczki 184 PDMS w osuszaczce umieszczonej w okapu oparowym. Teraz zerwij pokrywkę z rurki mikrowirówki.
Umieść pokrywę rurki mikrowirówki obok stempelów PDMS wewnątrz suszarki. Podaj pipetę 20 mikrolitrów silanu do pokrywy rurki mikrowirówki. Zamknij osuszacz i podciśnij próżnię, aby zainicjować warstwę parową.
Do przygotowania MRE zmierz pożądaną ilość rozcieńczalnika silikonowego i części elastomera ECO. Wymieszaj je z prędkością 2 500 obrotów na minutę w mikserze szybkoszybkopędznym przez jedną minutę. Dodaj do mieszanki elastomer ECO i cząstki żelaza karbonylowego i mieszaj ponownie z prędkością 2 500 obrotów na minutę przez jedną minutę. Za pomocą pipety transferowej z odcięciem na końcówce należy podać pięć gramów mieszanki MRE do nowej 35-milimetrowej szalki Petriego.
Odgazuj w suszarce przez około pięć minut, a następnie częściowo utwardzaj przez 10 minut w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Gdy do utwardzenia pozostanie pięć minut, użyj pipety transferowej, aby dodać nieutwardzone MRE, aby pokryć tylko wzorzystą powierzchnię stempla PDMS. Włóż powlekany stempel do osuszacza, aby odgazował na pięć minut.
Wyjmij częściowo upieknioną miskę MRE z piekarnika. Za pomocą kleszczy odłóż powlekany stempel zakryty do dołu na powierzchnię MRE i lekko dociśnij. Zaznacz kierunek wzoru na talerzu MRE.
Włóż skład z powrotem do piekarnika w 60 stopniach Celsjusza na dodatkowe 25 minut. Gdy materiał jest całkowicie utwardzony, użyj skalpela, aby naciąć MRE na dolnej krawędzi znaczka w kierunku prostopadłym do linii wzoru. Nałóż niewielką ilość alkoholu izopropylowego na miejsce cięcia wokół stempelu.
Następnie użyj kleszczy, aby zdjąć stempel PDMS z MRE w kierunku równoległym do wzoru. Sterylizuj powierzchnię MRE, myjąc 3 razy 70% etanolem i pozwól trzeciemu myciu stać przez 20 minut. Następnie trzy razy myj powierzchnię MRE sterylnym PBS.
Powierzchnię MRE pokryj 10 mikrogramami na mililitr fibronektyny w PBS zawierającym magnez i wapń przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby wspomóc przyczepność komórek do urządzenia. Na koniec powierzchnię MRE umyj trzy razy PBS zawierającym magnez i wapń oraz zasiew noworodkowych kardiomiocytów szczurów o gęstości 20 000 komórek na centymetr kwadratowy. Wierność przenoszenia mikrowzorów z formy głównej do podłoża MRE jest przedstawiona na tym rysunku poprzez znormalizowane profile wysokości oraz ilościowe pomiary kąta i wysokości obiektów.
Porównanie profili X wykazało, że znormalizowany profil wysokości cech MRE był bardzo podobny do profilu formy głównej, choć z nieco zmniejszonymi szczytami i szerszymi kształtami cech. Średni skok podłoża MRE wynosił około 10 mikrometrów i nie różnił się istotnie od skoku formy głównej. Średnia wysokość obiektu na podłożu MRE była znacząco niższa niż w formie głównej, z wartościami średnimi odpowiednio 3,81 mikrometra i 5,49 mikrometra.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nowatorską platformę do analizy sztywności, wykorzystującą ultra miękki elastomer silikonowy z zatopionymi cząsteczkami żelaza. Platforma ta została zaprojektowana do badania zależnych od czasu zmian fizycznych w fenotypach komórek, ze szczególnym uwzględnieniem orientacji kardiomiocytów w odpowiedzi na usztywnianie macierzy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Kardiologia
- Biologia komórki
- Biomechanika
Wstęp
- Kardiomiocyty są wrażliwe na zmiany mechaniczne w swoim otoczeniu.
- Zrozumienie przerostu indukowanego sztywnością ma kluczowe znaczenie dla zdrowia serca.
- Elastomery magnetoreologiczne oferują unikalne podejście do badania właściwości mechanicznych.
- Poprzednie badania podkreśliły rolę sieci mikrotubul w odpowiedzi kardiomiocytów.
Cel badania
- Zbadanie, w jaki sposób kardiomiocyty szczura noworodka ustawiają się w odpowiedzi na dynamiczne zmiany sztywności.
- Odtworzenie in vivo fluktuacji mechanicznych w kontrolowanym środowisku.
- Pogłębienie zrozumienia pamięci mechanicznej w komórkach serca.
Zastosowane metody
- Wytwarzanie platformy do badań sztywności z wykorzystaniem PDMS i cząstek żelaza.
- Pomiar uporządkowania kardiomiocytów w odpowiedzi na usztywnienie macierzy.
- Wykorzystanie magnetyzmu do indukowania zmian sztywności.
- Analiza odpowiedzi komórkowych na zmienne środowiska mechaniczne.
Główne wyniki
- Kardiomiocyty wykazały uporządkowanie korelujące ze sztywnością macierzy.
- Dynamiczne zmiany sztywności wpływały na zachowanie fenotypowe komórek.
- Platforma testowa okazała się skuteczna w badaniu właściwości mechanicznych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia reakcji komórek serca na bodźce mechaniczne.
Wnioski
- Opracowana platforma stanowi cenne narzędzie do badania mechaniki kardiomiocytów.
- Wyniki wskazują na istotną rolę środowiska mechanicznego w zachowaniu komórek serca.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę platformę do analizy innych typów komórek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dynamiczna kontrola sztywności i topografii podłoża za pomocą mikrowzorowanych elastomerów magnetoreologicznych (MRE) umożliwia rygorystyczną analizę mechanobiologii kardiomiocytów w fizjologicznie istotnych, zmiennych w czasie warunkach. Platforma ta wypełnia krytyczną lukę w modelowaniu fluktuujących mikrośrodowisk mechanicznych obserwowanych w chorobach serca, zwiększając pewność predykcyjną we wczesnych fazach odkrywania leków i walidacji celów terapeutycznych. Podejście to ułatwia ciągłość translacyjną od wglądu w mechanizmy do modelowania systemów istotnych dla przebiegu choroby, co pozwala na podejmowanie decyzji portfelowych z uwzględnieniem ryzyka.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjne testowanie hipotez dotyczących mechanotransdukcji w kardiomiocytach w warunkach dynamicznego obciążenia.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez izolację efektów odwracalnej sztywności i wskazówek topograficznych.
- Ułatwia redukcję ryzyka mechanistycznego w modelach chorób serca poprzez naśladowanie biomechanicznych fluktuacji in vivo.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne podłoże do ilościowej oceny orientacji komórek oraz zmian fenotypowych.
- Dostarcza gotowe do analizy platformy z regulowanymi właściwościami mechanicznymi do oceny związków w kontekstach istotnych dla przebiegu chorób.
- Umożliwia skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy w wielu kampaniach badań z zakresu mechanobiologii i przesiewu kardiologicznego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje bodźce mechaniczne in vitro do klinicznie istotnej patofizjologii serca, takiej jak zawał mięśnia sercowego.
- Zapewnia ciągłość od mechanistycznych badań na etapie odkryć do przedklinicznej walidacji hipotez terapeutycznych.
- Zwiększa wartość prognostyczną w opracowywaniu translacyjnych biomarkerów w inżynierii tkankowej serca i modelowaniu chorób.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda oparta na MRE integruje się z kontinuum od odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając prowadzenie badań z zakresu mechanobiologii opartych na hipotezach, opracowywanie testów oraz modelowanie translacyjne chorób serca.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotezy zerowej dotyczącej wpływu obciążeń mechanicznych na orientację i fenotyp kardiomiocytów.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty orientacji komórek i wierności podłoża w celu standaryzacji testów.
- Analityka: Wspiera ilościowy pomiar skoku struktur, ich wysokości oraz odpowiedzi komórkowej na dynamiczne zmiany sztywności.
- Badania translacyjne: Łączy mechanistyczne wyniki uzyskane in vitro z istotnymi dla choroby modelami przedklinicznymi patologii serca.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje modularną, adaptowalną platformę do badań z zakresu mechanobiologii serca oraz innych układów organowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów kardiologicznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, skalowalne i reprodukowalne przepływy pracy dla badań nad mechanobiologią.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne kapitałowo rozwijanie programów odkryć w kardiologii.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów i modeli skorygowaną o ryzyko dla kardiologicznych i szerszych potoków badań mechanobiologicznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu mechanobiologii, wytwarzania podłoży oraz ilościowej analizy komórek.
- Wymaga dostępu do narzędzi do przygotowania PDMS/MRE, układów sterowania polem magnetycznym oraz infrastruktury obrazowania.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji mikrostrukturyzacji podłoży oraz charakteryzacji ich właściwości mechanicznych.
- Możliwość adaptacji do innych typów komórek i układów narządowych poprzez modyfikacje protokołu, w zależności od dostępnego zakresu podłoży.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wierność transferu mikrostruktur oraz osiągalne wymiary elementów.
