Name: In vivo (in vivo ) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach nerwu trójdzielnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Poznaj obrazowanie wapniowe GCaMP in vivo neuronów zwoju nerwu trójdzielnego u myszy. Ta metoda umożliwia badanie aktywności neuronalnej w odpowiedzi na bodźce mechaniczne i termiczne w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania te były wspierane przez National Institutes of Health Grants R01NS0128574 i R01DE031477 (dla Y.S.K.) oraz nagrodę Rising STAR Award przyznawaną przez University of Texas (Y.S.K.).

Wszystkie procedury opisane w niniejszym dokumencie są wykonywane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania. Operacja nie daje szans na przeżycie. Sekcje 1 i 2 tej procedury należy wykonać natychmiast po jej rozpoczęciu. Sekcja 3 może zostać wykonana w późniejszym terminie.
1. Zabezpieczenie i operacja myszy do obrazowania TG po prawej stronie
UWAGA: Myszy Pirt-GCaMP3 C57BL/6J18 muszą mieć dorosły rozmiar ciała (zwykle 8 tygodni lub więcej), niezależnie od płci. Możliwe jest obustronne obrazowanie TG. Podane tutaj czasy są szacunkowe przez doświadczonego technika. Jeśli krwawienie jest większe niż normalnie, może trwać kilka minut dłużej za każdym razem.
<ol>
	<li>Przygotować sterylny roztwór soli fizjologicznej z 40 mg/ml ketaminy i 6 mg/ml ksylazyny. Przygotuj wystarczającą objętość do operacji i eutanazji po obrazowaniu (minimum 9 μl na gram masy ciała myszy). UWAGA: Podczas obrazowania in vivo stosuje się wiele rodzajów znieczulenia. Uwaga: Ketamina jest szkodliwa w przypadku wstrzyknięcia, połknięcia lub kontaktu z oczami. Obchodź się ostrożnie.</li>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w sterylizatorze koralików. Umyj narzędzia 70% etanolem. UWAGA: Alternatywnie, należy wcześniej autoklawować instrumenty.</li>
	<li>Wstrzyknąć 2,25 μl ketaminy/ksylazyny na gram masy ciała (odpowiednio 90 mg/kg i 13,5 mg/kg ketaminy i ksylazyny) i.p. myszom Pirt-GCaMP3 15-25 minut przed zabiegiem. Nie przekraczać dawki 120 mg/kg ketaminy.</li>
	<li>Po 15-25 minutach wstrzyknięcia środka znieczulającego (krok 1.3) uszczypnij tylną łapę kleszczami, aby upewnić się, że mysz znajduje się na płaszczyźnie znieczulenia chirurgicznego. UWAGA: Szczypanie powinno być wystarczająco intensywne, aby wywołać wokalizację u przytomnej myszy, ale nie na tyle intensywne, aby spowodować obrażenia. Ważne jest, aby nie zostawiać myszy na tym etapie dłużej niż to konieczne, aby uniknąć spadku temperatury ciała. Utrzymywanie klatki w cieple jest pomocne, jeśli to możliwe.</li>
	<li>Umieść mysz na poduszce grzewczej, aby upewnić się, że temperatura ciała jest utrzymywana na poziomie 37 °C i umieść głowę myszy w masce stereotaktycznej (Rysunek 1A,B), z głową pochyloną około 15° w lewo (Rysunek 1B). UWAGA: Maska stereotaktyczna, która zarówno stabilizuje głowę, jak i zapewnia drogę do podania izofluranu, jest opisana tutaj. Jeśli w zabiegu nie stosuje się izofluranu lub nie stosuje się maski stereotaktycznej, należy zastosować inną metodę stabilizacji głowy, aby zapobiec ruchomości.</li>
	<li>Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu i podrażnieniu, ponieważ podrażnienie wywołuje aktywność nerwu trójdzielnego.</li>
	<li>Ogol prawą stronę głowy myszy. UWAGA: Ten krok trwa 90 sekund. Badacz może na krótko usunąć zwierzę z poduszki grzewczej w celu ogolenia.</li>
	<li>Wykonaj prostokątne nacięcie o wymiarach 9 mm x 5 mm między prawym uchem a prawym okiem (ryc. 2A). Zatamuj krwawienie za pomocą wacika hemostatycznego lub chusteczki laboratoryjnej. UWAGA: Ten krok trwa 2 minuty. Badacz może użyć kleszczy hemostatycznych lub retraktora, aby utrzymać nacięcie otwarte. Jest to procedura nieprzeżyciowa, co oznacza, że dodatkowe czyszczenie nie jest konieczne. Badacz może jednak pobrać wymaz z miejsca operowanego z jodowidonem. Podany jest największy dopuszczalny rozmiar nacięcia. Jeśli chirurg jest wystarczająco wykwalifikowany, mniejsze nacięcie jest lepsze niż większe nacięcie, aby zminimalizować uszkodzenie tkanki. TG unerwia tę tkankę i może zostać uszkodzony.</li>
	<li>Przeciąć tkankę (okostną) na powierzchni czaszki tuż brzusznie do oka (ryc. 2B).</li>
	<li>Za pomocą wiertła dentystycznego i szczeliny stożkowej TNT BUR 31p wywierć otwór o wymiarach około 9 mm x 5 mm w czaszce grzbietowej wyśrodkowany w miejscu nacięcia (ryc. 2C). Przyłóż wiertło tak lekko, jak to możliwe do powierzchni czaszki. UWAGA: Ten krok zajmuje około 2 minut. Jeśli chirurg jest wystarczająco wykwalifikowany, mniejszy otwór jest lepszy niż większy.</li>
	<li>Przechyl głowę, aż TG będzie wyraźnie widoczny (Rysunek 2C). Jeśli występuje krwawienie do TG, odessać krew lub usunąć krew, odprowadzając wilgoć za pomocą wacika hemostatycznego lub chusteczki laboratoryjnej. Upewnij się, że TG jest wyraźnie widoczny bez usuwania tkanki korowej (ryc. 2C). UWAGA: Rutynowo obrazujemy TG przez 3-6 godzin lub dłużej bez oznak niepokoju w neuronach, ale badacz może zdecydować się na umieszczenie szkiełka nakrywkowego lub innego pokrycia, aby zapobiec wysychaniu TG.</li>
	<li>Przenieś zwierzę i poduszkę grzewczą do stolika mikroskopowego i umieść nos myszy w stereotaktycznym stożku nosowym. Podłącz przewody tlenu/izofluranu tak, aby mysz otrzymywała ciągłe znieczulenie izofluranem (ryc. 3A). UWAGA: Ten krok trwa 3 minuty. Ciągły izofluran wymaga butli z tlenem, rurek doprowadzających gaz i parownika anestezjologicznego. Możliwe jest również utrzymanie znieczulenia przez cały czas trwania zabiegu poprzez okresowe iniekcje środka znieczulającego.</li>
	<li>Ustawić ramę stereotaktyczną tak, aby obiektyw mikroskopu znajdował się 9 mm bezpośrednio nad otworem czaszki (ryc. 3B). UWAGA: Dokładna odległość zależy od obiektywu, mikroskopu i myszy.</li>
	<li>Włóż termometr doodbytniczy. Podłącz przewód zasilający do termometru doodbytniczego i poduszki grzewczej. Połączyć maskę anestezjologiczną z izofluranem w przewodzie tlenowym z 1% izofluranem.</li>
</ol>
2. Obrazowanie TG
UWAGA: Użyj ustawienia zielonego (FITC) 495 nm, emisja 519 nm, długość fali detekcji 500-580 nm, urządzenie do obrazowania GaAsP-Pmt1, detektor GaAsP-PMT lub użyj zalecanych ustawień dla mikroskopu. Tabela 1 zawiera podsumowanie ustawień oprogramowania.
<ol>
	<li>Użyj obiektywu 5x/0,25 M27, oprogramowania producenta mikroskopu i pionowego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. Zlokalizuj powierzchnię TG za pomocą mikroskopu. UWAGA: Wybór obiektywu zależy od mikroskopu i preferencji badacza.</li>
	<li>Wyreguluj obiektyw i stożek nosowy tak, aby powierzchnia TG była jak najbardziej płaska i miała jak największą powierzchnię w płaszczyźnie ogniskowej. UWAGA: Bardziej płaska TG zapewnia ostrzejszy obraz, powoduje, że oprogramowanie komponuje ostrzejsze filmy, obrazuje więcej neuronów oraz upraszcza i poprawia dokładność analizy w porównaniu z bardziej nachylonym TG.</li>
	<li>Utrzymuj mysz w znieczuleniu, aplikując 1-1,5% izofluranu na przepływ tlenu przez maskę anestezjologiczną. UWAGA: Zwierzę musi być ściśle monitorowane przez cały czas trwania zabiegu, szczypiąc tylną łapę co 20-30 minut, aby upewnić się, że zwierzę pozostaje pod narkozą. Procentowa zawartość izofluranu wymagana do utrzymania znieczulenia zależy od konkretnej myszy. Jeżeli zwierzę porusza się podczas próbnego uszczypnięcia, należy zwiększyć stężenie izofluranu. Jeśli oddech staje się płytki, izofluran musi być zmniejszony. UWAGA: Izofluran jest szkodliwy w przypadku wdychania i może powodować zawroty głowy lub senność. Unikaj wdychania i upewnij się, że miejsce pracy ma odpowiednią wentylację.</li>
	<li>Załaduj protokół szybkiego skanowania mikroskopu: rozmiar woksela 4,160 μm x 4,160 μm x 14 μm, 512 x 512 pikseli, 10 warstw optycznych Z-stack, 1,02 jednostki przewiewne (AU)/33 μm, 15% moc lasera 488 nm/75 mW, czas piksela 1,52 μs, czas linii 0,91 ms, czas klatki 465 ms, prędkość skanowania LSM 8, skanowanie dwukierunkowe, wzmocnienie detektora GaAsP-PMT 550 V, wzmocnienie cyfrowe 1. UWAGA: Optymalne ustawienia mogą się różnić w zależności od mikroskopu i zwierząt.</li>
	<li>Skanuj TG w krótkich seriach po 6-8 cykli. Utwórz ortogonalne rzuty skanów (jeden skan tworzy jedną klatkę filmu), aby utworzyć film i sprawdzić klarowność i spójność obrazu między klatkami. W razie potrzeby dostosuj pozycję klatki stereoskopowej i grubość sekcji optycznej, a następnie powtarzaj ten krok, aż powstanie wyraźny, spójny film. UWAGA: Ten krok należy powtórzyć, jeśli głowa myszy porusza się lub badacz zmienia położenie myszy lub dostosowuje płaszczyznę ogniskowej.</li>
	<li>Załaduj protokół skanowania mikroskopu w wysokiej rozdzielczości: rozmiar woksela 0,520 μm x 0,520 μm x 14 μm, 4096 x 4096 pikseli, 6 warstw optycznych Z-stack, 1,02 jednostki przewiewnej (AU)/33 μm, 20% mocy lasera 488 nm/100 mW, czas piksela 0,52 μs, czas linii 4,95 ms, czas klatki 20,26 s, prędkość skanowania LSM 6, skanowanie dwukierunkowe, wzmocnienie detektora GaAsP-PMT 550 V, wzmocnienie cyfrowe 1. UWAGA: Optymalne ustawienia zależą od mikroskopu i zwierzęcia. Jeśli komórki są oznaczone td-Tomato, ustaw mikroskop tak, aby skanował czerwony kanał 592 nm wzbudzenie / emisja 614 nm, długość fali wykrywania 600-700 nm oprócz zielonego kanału.</li>
	<li>Utwórz obraz TG w wysokiej rozdzielczości. UWAGA: Ten obraz może być przydatny do liczenia neuronów, mierzenia średnicy przyciemnionych neuronów lub dostarczania szczegółowego obrazu w celu odróżnienia, czy ten sam neuron zareagował na dwa różne bodźce, czy odpowiedziały dwa różne neurony.</li>
	<li>Załaduj protokół szybkiego skanowania mikroskopu (patrz krok 2.4).</li>
	<li>Rejestruj spontaniczną aktywność przez 80 cykli (około 10 minut). Utwórz film z projekcją ortogonalną i sprawdź, czy obrazy są wystarczająco wyraźne i spójne, aby można je było przeanalizować. UWAGA: Spowoduje to wygenerowanie wystarczającej liczby klatek, aby przeanalizować spontaniczną aktywność. Liczba ta może być zmniejszana lub zwiększana w zależności od tego, jak ważna jest spontaniczna aktywność w danym eksperymencie.</li>
	<li>Aby zastosować stymulację, ustaw mikroskop na skanowanie 15-20 cykli. UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas stosowania bodźców, aby nie poruszać głową myszy. Przesunięcie TG nawet o mikrony podczas bodźca może zakłócić obrazowanie. Skanowanie pozwala cyklom ustalić linię bazową, bodziec i obserwować neurony po usunięciu bodźca.</li>
	<li>Poczekaj, aż cykle 1-5 zostaną zakończone, aby wygenerować linię bazową. Zastosuj stymulację podczas skanów 6-10. Odczekaj co najmniej 5 minut po każdym bodźcu, aby uniknąć znieczulenia neuronów. UWAGA: Każdy bodziec wymaga osobnego skanowania w ciągu 15-20 cykli. Najpierw zastosuj stymulację mechaniczną, a następnie stymulację zimnem, ciepłem i chemiczną. Zastosuj stymulację o niskiej częstotliwości (np. mała siła mechaniczna, temperatura zbliżona do temperatury pokojowej) przed stymulacją o wysokiej częstotliwości (duża siła mechaniczna, temperatura daleka od temperatury pokojowej). Uważaj, aby nie poruszać TG podczas stosowania stymulacji. Jeśli skany są wyraźnie słyszalne, stymulację można zastosować natychmiast po skanowaniu 5. Jednak każda metoda, która zapewnia stały czas stymulacji, będzie działać. Zobacz dyskusję na temat kolejności bodźców.</li>
	<li>W przypadku von Freya w obszarze unerwionym przez część V2 TG, przytrzymaj filament i nakładaj go wielokrotnie na obszar ipsilateralny poniżej oka i powyżej ust od bezpośrednio po skanie 5 do bezpośrednio po skanie 10.</li>
	<li>W przypadku von Freya w obszarze unerwionym przez część V3 TG, przytrzymaj filament i kilkakrotnie nakładaj na obszar ipsilateralny tuż pod uchem od razu po zakończeniu skanowania 5 do bezpośrednio po zakończeniu skanowania 10.</li>
	<li>W przypadku bodźców zimnych i cieplnych ostudź lub podgrzej zlewkę z wodą do temperatury nieco poniżej (w przypadku zimna) lub powyżej (w przypadku ciepła), a następnie rozpocznij skanowanie za pomocą plastikowej pipety transferowej. Zastosuj bodziec za pomocą pipety transferowej natychmiast po skanie 5 do obszaru ipsilateralnego tuż pod okiem, nad ustami (dla V2) lub tuż pod uchem (dla V3). UWAGA: Upewnij się, że temperatura mieści się w zakresie 1 °C od żądanej temperatury dla skanowania 5. Aby uniknąć odczulania neuronów, nie stosuj bodźca, jeśli temperatura zlewki nie jest prawidłowa. Zamiast tego ponownie ostudź lub podgrzej wodę i spróbuj ponownie.</li>
	<li>Pod koniec eksperymentów wstrzyknij podskórnie 50 mM chlorku potasu w obszary V2 lub V3, zaczynając od cyklu 6, aby aktywować i zidentyfikować wszystkie reagujące neurony.</li>
	<li>Po podaniu i zarejestrowaniu wszystkich bodźców, należy poddać zwierzę eutanazji przez przedawkowanie ketaminy/ksylazyny (300 mg na kg ketaminy, 30 mg na kg ksylazyny lub 5 μl na g roztworu przygotowanego w kroku 1.1), a następnie odciąć głowę.</li>
</ol>
3. Protokół analizy
<ol>
	<li>Otwórz plik rzutowania ortogonalnego, korzystając z opcji przeciągnij i upuść . Wybierz typ obrazu z menu Obraz | Rodzaj | Kolor RGB. Opcjonalnie: Użyj wtyczki StackReg31 w sekcji Wtyczki | słoiki | StackReg do korygowania artefaktów ruchu i wyrównywania. UWAGA: Badacz może wybrać typ obrazu w oparciu o preferencje. RGB upraszcza tworzenie kolorowych obrazów do publikacji.</li>
	<li>Otwórz Menedżera zwrotu z inwestycji za pomocą opcji Analizuj | Narzędzia | Menedżer zwrotu z inwestycji.</li>
	<li>Wybierz aktywne neurony, rysując ROI za pomocą narzędzia Elipsa lub Prostokąt na pasku narzędzi, a następnie umieść go w pliku ROI, klikając przycisk Dodaj w oknie Menedżera ROI lub naciskając "t". UWAGA: Często zapisuj pliki ROI. Zwrot z inwestycji można przywrócić, przeciągając i upuszczając plik ROI do ImageJ i klikając pole Pokaż wszystko u dołu okna Menedżera ROI. Zapisanie pliku .zip ROI upraszcza analizę w porównaniu z zapisywaniem ROI jako nakładki. Neuron, który ulega wahaniom w okresie wyjściowym, powinien być wykluczony jako spontanicznie aktywny, a nie reagujący na bodziec.</li>
	<li>W Analiza | Ustawienia pomiaru, zaznacz opcję Średnia wartość szarości (opcjonalnie, ale zalecane: odznacz wszystkie inne pola w sekcji Ustawienia pomiaru).</li>
	<li>Korzystanie z okna ROI w obszarze Więcej | Multi-Measure do pomiaru intensywności. UWAGA: Czasami sąsiednie neurony są zbyt blisko, aby narysować oddzielny ROI. Neurony te mogą być uwzględnione w liczbie aktywnych neuronów, ale nie mogą być uwzględnione w pomiarach intensywności przejściowej.</li>
	<li>Funkcja Multi-Measure generuje plik CSV w nowym oknie o nazwie "Wyniki". Zapisz plik CSV, klikając Plik | Zapisz jako. Otwórz plik .csv za pomocą oprogramowania do obsługi arkuszy kalkulacyjnych i zapisz plik jako arkusz kalkulacyjny. UWAGA: Zobacz Plik uzupełniający 1 , aby zapoznać się z szablonem analizy.</li>
	<li>Oblicz intensywność przejściową Ca2+ jako ΔF/F0 = (Ft- F0)/F0, gdzie Ft to intensywność pikseli w ROI w punkcie zainteresowania, a F0 to intensywność wyjściowa określona przez średnią intensywność 2-4 klatek poprzedzających stan przejściowy Ca2+ dla spontanicznej aktywności lub pierwsze 1-5 klatek dla stanów przejściowych Ca2+ wywołanych bodźcem. Wyklucz wszystkie neurony, które generują piki Ca2+ przed stymulacją i nie analizuj aktywności po stymulacji.</li>
	<li>W przypadku analizy intensywności przejściowej Ca2+ losowo pobieraj próbki mniej więcej takiej samej liczby neuronów z każdego zwoju, aby zapobiec zdominowaniu analizy przez zwoje, które generują największą liczbę odpowiadających neuronów. Wykluczyć piki z ΔF/F0 < 0,15. UWAGA: Istnieją alternatywne opublikowane metody analizowania oraz uwzględniania i wykluczania neuronów 15,16,19,22,32,33,34,35.</li>
	<li>Zmierz średnicę neuronu, obliczając średnią długość linii narysowanej w ImageJ wzdłuż najdłuższej i najkrótszej średnicy za pomocą narzędzia Linia na pasku narzędzi. UWAGA: Badacz może również zmierzyć obszar i eliptyczne parametry ROI, aby oszacować średnicę.</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Zaburzenia bólowe stawu skroniowo-żuchwowego i zapalenie przyzębia wierzchołkowego dotykają odpowiednio około 5%36 i 30-70%37,38 populacji ogólnej. Pierwotne neurony czuciowe wykrywają szkodliwe bodźce w skórze, błonie śluzowej jamy ustnej, zębach i obszarach okołooczodołowych, a ich plastyczność przyczynia się do uporczywego bólu. Hodowle komórkowe i eksplantaty mogą być wykorzystywane do badania neuronów, ale są usuwane z ich normalnego ...

Pierwotne neurony czuciowe bezpośrednio unerwiają tkanki, w tym skórę, i przekazują sygnały czuciowe do ośrodkowego układu nerwowego (rdzenia kręgowego lub pnia mózgu). Neurony zwoju nerwu trójdzielnego (TG) unerwiają głowę i reagują na bodźce czuciowe, w tym ból zębów, okolice okołooczodołowe, ustno-twarzowe i twarzoczaszkowe, staw skroniowo-żuchwowy 1,2 i opony mózgowo-rdzeniowe 3,4,5. Neurony TG różnią się wielkością, poziomem mielinizacji i profilami ekspresji genów 6,7,8,9. Mniejsze neurony są nocyceptywne, podczas gdy większe neurony na ogół reagują na niebolesne bodźce mechaniczne10,11. Dysfunkcja neuronów zwojowych nerwu trójdzielnego może uwrażliwiać zarówno same neurony, jak i neurony czuciowe ośrodkowego układu nerwowego (OUN)11,12.
W normalnym kontekście fizjologicznym w warunkach niepatologicznych, neurony odpalające się in vivo są niezbędne do odczuwania bólu, ale do ostatnich dwóch dekad narzędzia do badania nienaruszonych zwojów czuciowych in vivo ograniczały się do monitorowania stosunkowo niewielu neuronów jednocześnie. Ze względu na normalnie niskie stężenia wapnia w cytoplazmie, napływ wapnia podczas potencjałów czynnościowych i wykorzystanie wapnia jako sygnału cytoplazmatycznego, dynamika wapnia jest potężnym substytutem monitorowania potencjałów czynnościowych lub aktywności komórkowej in vivo przy użyciu wrażliwych na wapń wskaźników fluorescencyjnych. Uzasadnieniem tej metody jest to, że mikroskopia fluorescencyjna może jednocześnie monitorować te wskaźniki w setkach do tysięcy neuronów jednocześnie w obwodowych zwojach czuciowych myszy 13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 i szczury 25,26. Jest to potężna przewaga nad metodami, które mogą monitorować bardziej ograniczoną liczbę neuronów in vivo.
Celem tej metody jest bezpośrednia obserwacja cytoplazmatycznej dynamikiCa2+ in vivo w TG w odpowiedzi na bodźce mechaniczne, temperaturowe, chemiczne i hormonalne w modelach bólu głowy 19,23,24. Metoda ta może być stosowana jako uzupełnienie badań bólowych lub innych badań somatosensorycznych w okolicy ustno-twarzowej. Obrazowanie Ca2+ in vivo trójdzielne zostało wykorzystane do scharakteryzowania kodowania termicznego i sensorycznego19,22, zbadania klas mechanoreceptorów27, odkrycia nowej klasy neuronów mechanowrażliwych28, monitorowania odpowiedzi nerwu trójdzielnego na normalne naprężenia mechaniczne na oponach mózgowych29, badania wpływu hormonów na wrażliwość na ból24, scharakteryzowania modeli bólu ustno-twarzowego30oraz badania przyczyniające się do bólu wywołanego odstawieniem alkoholu23.
Myszy Pirt-GCaMP3 umożliwiają monitorowanie aktywności neuronalnej in vivo, ponieważ mają czujnik Ca2 + GCaMP3 wstawiony do regionu promotorowego genu Pirt, który ulega silnej ekspresji we wszystkich (>95%) pierwotnych neuronach czuciowych12,18. W artykule przedstawiono technikę wykonywania chirurgicznej ekspozycji na TG in vivo oraz gromadzenie i analizę danych z mikroskopii wskaźnikowej wapnia dla prawej strony TG myszy Pirt-GCaMP3 przy użyciu konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

<table><tbody><tr><td>Wstrzyknięcie w zniekojeniu (ksylazyna)</td><td>Covetrus, Akorn</td><td>33197</td><td></td></tr><tr><td>Flurar 5x/0.25 M27 obejctive</td><td>Cal Zeiss</td><td>420130-9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>McKesson powiedział:</td><td>24-106-1S</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywiony hemostat</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>13007-12</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury DC</td><td>FHC (Szpital Rolny)</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza regulatora temperatury DC</td><td>FHC (Szpital Rolny)</td><td>40-90-2-05</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont z powłoką ceramiczną</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury FHC DC</td><td>FHC (Szpital Rolny)</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Fluriso (Izofluran)</td><td>MWI Zdrowie Zwierząt, Grupa Piramal</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>Friedmana-Pearsona Rongeursa</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>16221-14</td><td></td></tr><tr><td>Pianka żelowa</td><td>Pfizer</td><td>09-0353-01</td><td></td></tr><tr><td>ObrazJ</td><td>Narodowe Instytuty Zdrowia</td><td>ij153 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Ketaset (ketamina)</td><td>Urządzenie Zoetis</td><td>KET-00002R2</td><td></td></tr><tr><td>Model 923-B Uchwyt na głowę do znieczulenia gazem myszy (mysz dla dorosłych)</td><td>Instrumenty Kopf</td><td>Zobacz materiał 923-B</td><td></td></tr><tr><td>Luminescencyjna zielona taśma sceniczna</td><td>JSITON/ Amazonka</td><td>B803YW8ZWL</td><td></td></tr><tr><td>Kompaktowy elektryczny system rękojeści laboratoryjnej M35</td><td>Buffalo Dental Manufacturing Co., Inc.</td><td>Zobacz materiał M35</td><td></td></tr><tr><td>Waporyzator izofluranowy Matrx VIP 3000</td><td>Znak środkowy</td><td>91305430</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do mikro preparacji</td><td>Roboz powiedział:</td><td>Złącze RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe do mikro preparowania</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe do mikro preparowania</td><td>Roboz powiedział:</td><td>Złącze RS-5677</td><td></td></tr><tr><td>Mini sonda termistora doodbytniczego</td><td>FHC (Szpital Rolny)</td><td>40-90-5D-02</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki operacyjne</td><td>Roboz powiedział:</td><td>Złącze RS-6812</td><td></td></tr><tr><td>Myszy Pirt-GCaMP3 C57/BL/6J</td><td>Uniwersytet Johnsa Hopkinsa</td><td>N/A</td><td>Każda płeć może być równie dobrze zobrazowana. Myszy powinny mieć co najmniej 8 tygodni ze względu na słabą lub przerywaną ekspresję promotora Pirt u młodszych myszy.</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher Naukowy</td><td>Zobacz materiał BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Ramka stereotaktyczna</td><td>Kopf Typ 923-B</td><td>Zobacz materiał 923-B</td><td></td></tr><tr><td>Maska sterotaktyczna (aktywna) dla myszy < 30g z tubkami</td><td>RWD Nauki Przyrodnicze</td><td>68663</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło TNT ze szczeliną stożkową (31P)</td><td>Buffalo Dental Manufacturing Co., Inc.</td><td>31P-ZŁOTO</td><td></td></tr><tr><td>Myszy td-Tomato C57BL/6J</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>7909</td><td></td></tr><tr><td>Płyta górna, 6 cali x 10 cali</td><td>Newport</td><td>Zobacz materiał 290-TP</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa, 3 ml</td><td>Cole'a Parmera</td><td>UX-06226-23</td><td></td></tr><tr><td>Myszy TrpV1-CRE C57BL/6J</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>17769</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Zeiss LSM 800</td><td>Cal Zeiss</td><td>Zobacz materiał LSM800</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Zeiss Zen 2.6 Blue Edition</td><td>Cal Zeiss</td><td>Zen (Niebieska Edycja) 2.6</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo ) obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach nerwu trójdzielnego

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Trigeminal Ganglia

Obrazowanie wapnia jest ważnym narzędziem do monitorowania mechanizmów sygnalizacyjnych, które albo napływająCa2+ do cytozolu, albo uwalniają Ca2+ z wewnątrzkomórkowych zapasów Ca2+ . Zastosowanie myszy Pirt-GCaMP3, które mają czujnik Ca2 + GCaMP3 wstawiony poniżej regionu promotora Pirt i ulegający ekspresji w prawie wszystkich (>95%) pierwotnych neuronach czuciowych, pozwala na jednoczesne monitorowanie aktywności >3 000 neuronów poprzez obrazowanie Ca2 + pierwotnych neuronów czuciowych zwoju nerwu trójdzielnego (TG). Dzięki temu badacze mogą badać reakcje sieci neuronowych na szkodliwe bodźce oraz reakcje somatosensoryczne i hormonalne in vivo, które w przeciwnym razie byłyby bardzo trudne do wykrycia innymi metodami.
W szczególności możliwość monitorowania obszaru TG unerwiającego twarz i innych obszarów głowy oddzielnie pozwala na monitorowanie pierwotnych neuronów czuciowych aktywowanych przez bodźce obszaru twarzy przed późniejszymi warstwami przetwarzania neuronów. Można również zaobserwować liczbę neuronów generujących stany przejściowe Ca2+ i amplitudę stanów przejściowych Ca2+ , które wskazują na ich wrażliwość na różne modalności sensoryczne. Dodatkowo badacze mogą mierzyć średnicę neuronów, co jest wskaźnikiem rodzaju aktywowanego włókna (nieszkodliwe włókna mechaniczne kontra szkodliwe włókna nocyceptywne, włókna Aβ, Aδ i C). Dlatego obrazowanie wapnia TG metodą Pirt-GCaMP3 byłoby potężnym narzędziem do analizy określonych modalności sensorycznych i typów komórek neuronalnych w celu zbadania bólu pochodzenia trójdzielnego (ustno-twarzowego i czaszkowego, bólu zębów i/lub zębów, bólu głowy, migreny, bólu stawu skroniowo-żuchwowego, neuralgii nerwu trójdzielnego), swędzenia i dotyku oraz wszelkich innych somatosensacji, a także odpowiedzi hormonalnych.

Obrazowanie dużej liczby neuronów i specyficznych gałęzi nerwu trójdzielnego za pomocą skanowania konfokalnego zwoju trójdzielnego Pirt-GCaMP Po chirurgicznej ekspozycji na TG u myszy Pirt-GCaMP3, mikroskopia konfokalna umożliwia obrazowanie ponad &gt;3000 neuronów jednocześnie (ryc. 4). Daje to potężną zaletę w postaci jednoczesnej obserwacji tysięcy neuronów TG w ich normalnym kontekście fizjologicznym. Spontaniczne stany przejściowe Ca2+ można monitorować pr...

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo GCaMP nienaruszonych neuronów zwoju trójdzielnego (TG). Opis ten obejmuje chirurgię ekspozycji na TG, obrazowanie neuronów TG za pomocą mikroskopii konfokalnej in vivo , zastosowanie bodźców somatycznych podczas obrazowania mikroskopowego neuronów TG oraz analizę danych obrazowania wapnia GCaMP in vivo .

In vivo (in vivo ) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach nerwu trójdzielnego

Calcium imaging is an important tool for monitoring signaling mechanisms that either influx Ca2+ into the cytosol or release Ca2+ from intracellular Ca2+ ...

Badania te koncentrują się na sieciach neuronowych zwojów obwodowych, mając na celu zrozumienie sygnałów i interakcji międzykomórkowych związanych z bólem, swędzeniem i odczuwaniem dotyku. Neurony wyczuwają bodźce, ale badanie ich aktywności in vivo w normalnych warunkach fizjologicznych pozostaje dużym wyzwaniem. Nasz protokół pozwala na badanie aktywacji neuronalnej zwoju nerwu trójdzielnego na poziomie populacji bezpośrednio w odpowiedzi na bodźce, co jest fizjologicznie ważne, ale technicznie bardzo trudne.Dane generowane przez ten protokół służą jako potężne uzupełnienie danych dotyczących zachowania, hodowli komórkowych i immunohistochemii, umożliwiając badanie natychmiastowego wpływu bodźców lub leków na cały ganglion. Na początek umieść znieczuloną mysz na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 stopni Celsjusza, a następnie umieść głowę w masce stereotaktycznej z nachyleniem około 15 stopni w lewo. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu i podrażnieniom.Po ogoleniu prawej strony głowy myszy wykonaj prostokątne nacięcie o wymiarach dziewięć milimetrów na pięć milimetrów między prawym uchem a prawym okiem. Przeciąć tkankę na powierz

in-vivo-calcium-imaging-neuronal-ensembles-networks-primary-sensory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Shannonhouse, J., et al. In vivo Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego. J. Vis. Exp. (2023). Film przedstawia technikę obrazowania wapnia in vivo w celu monitorowania aktywności neuronalnej w zwojach korzenia grzbietowego (DRG) myszy transgenicznej. Neurony DRG wyrażają wskaźnik wapnia, który zwiększa intensywność fluorescencji po związaniu się z wapniem. Bodźce mechaniczne lub termiczne...

Obrazowanie in vivo wapnia zespołów neuronalnych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego myszy

Opisujemy eksperymentalną procedurę pomiaru aktywności neuronalnej za pomocą podwójnych okien optycznych nad obustronnymi głównymi korami somatosensorycznymi (S1) u transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s przy użyciu mikroskopii 2-fotonowej (2P) in vivo.

Obrazowanie aktywności neuronalnej w pierwotnej korze somatosensorycznej przy użyciu transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s

Tutaj prezentujemy, jak odsłonić kolankowaty ganglion żywej, znieczulonej myszy laboratoryjnej i jak wykorzystać obrazowanie wapnia do pomiaru reakcji zespołów tych neuronów na bodźce smakowe, co pozwala na wielokrotne próby z różnymi stymulantami. Pozwala to na dogłębne porównania, które neurony reagują na które degustacje.

Obrazowanie wapnia in vivo reakcji neuronów zwojowych układu nerwowego myszy na bodźce smakowe

Ten protokół opisuje chirurgiczną ekspozycję zwoju korzenia grzbietowego (DRG), a następnie GCaMP3 (genetycznie kodowany wskaźnik Ca2+; Białko zielonej fluorescencji-białko kalmoduliny-M13 3) Ca2 + obrazowanie zespołów neuronalnych przy użyciu myszy Pirt-GCaMP3 przy jednoczesnym stosowaniu różnych bodźców do ipsilateralnej tylnej łapy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego

Obecny protokół opisuje obrazowanie wapnia in vivo do pomiaru odpowiedzi zespołów neuronów DRG lędźwiowych-6 na bodźce somatyczne i trzewne. Można dokonać dokładnych porównań między neuronami reagującymi na różne bodźce. Protokół ten jest cenny w badaniu mechanizmów bólu trzewnego i stymulacji somatycznej, takich jak akupunktura.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe reakcji neuronów zwojów korzenia grzbietowego na bodźce somatyczne i trzewne

Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) umożliwiają solidną analizę na poziomie populacji sygnalizacji neuronów czuciowych. W tym miejscu opracowaliśmy nowatorskie podejście, które pozwala na wizualizację in vivo GECI aktywności neuronów zwojów nerwu trójdzielnego szczurów.

In-vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów czuciowych w zwoju trójdzielnym szczura

Spontaniczną aktywność rozwijających się sieci neuronalnych można mierzyć przy użyciu form estrów AM barwników wskaźnikowych wrażliwych na wapń. Zmiany wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia, wskazujące na aktywację neuronalną, są wykrywane jako przejściowe zmiany fluorescencji wskaźnika za pomocą obrazowania jedno- lub dwufotonowego. Niniejszy protokół można dostosować do różnych sieci neuronalnych zależnych od etapu rozwoju in vitro.

Funkcjonalne obrazowanie wapnia w rozwijających się sieciach korowych

Transport retrogradny barwnika fluorescencyjnego pozwala na oznakowanie subpopulacji neuronów na podstawie projekcji anatomicznej. Oznakowane aksony mogą być celowane wizualnie in vivo, co umożliwia rejestrację pozakomórkową z zidentyfikowanych aksonów. Technika ta ułatwia rejestrację w przypadkach, gdy neurony nie mogą zostać oznakowane poprzez manipulacje genetyczne lub gdy ich izolacja za pomocą „ślepych” metod in vivo jest utrudniona.

Retrogradne znakowanie fluorescencyjne umożliwia ukierunkowaną zewnątrzkomórkową rejestrację pojedynczych jednostek z zidentyfikowanych neuronów in vivo

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

W tym artykule przedstawiamy szybką mikrojonoforezę neuroprzekaźników jako technikę badania integracji sygnałów postsynaptycznych z dużą precyzją przestrzenną i czasową.

Szybka mikrojonoforeza glutaminianu i GABA: przydatne narzędzie do badania integracji synaptycznej

Poznaj obrazowanie wapniowe GCaMP in vivo neuronów zwoju nerwu trójdzielnego u myszy. Ta metoda umożliwia badanie aktywności neuronalnej w odpowiedzi na bodźce mechaniczne i termiczne w czasie rzeczywistym.

In vivo (in vivo ) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach nerwu trójdzielnego (Wideo) | JoVE Journal

In vivo (in vivo ) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach nerwu trójdzielnego

Przeglądaj więcej filmów