In vivo (in vivo ) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach nerwu trójdzielnego

Badania te koncentrują się na sieciach neuronowych zwojów obwodowych, mając na celu zrozumienie sygnałów i interakcji międzykomórkowych związanych z bólem, swędzeniem i odczuwaniem dotyku. Neurony wyczuwają bodźce, ale badanie ich aktywności in vivo w normalnych warunkach fizjologicznych pozostaje dużym wyzwaniem. Nasz protokół pozwala na badanie aktywacji neuronalnej zwoju nerwu trójdzielnego na poziomie populacji bezpośrednio w odpowiedzi na bodźce, co jest fizjologicznie ważne, ale technicznie bardzo trudne.

Dane generowane przez ten protokół służą jako potężne uzupełnienie danych dotyczących zachowania, hodowli komórkowych i immunohistochemii, umożliwiając badanie natychmiastowego wpływu bodźców lub leków na cały ganglion. Na początek umieść znieczuloną mysz na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 stopni Celsjusza, a następnie umieść głowę w masce stereotaktycznej z nachyleniem około 15 stopni w lewo. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu i podrażnieniom.

Po ogoleniu prawej strony głowy myszy wykonaj prostokątne nacięcie o wymiarach dziewięć milimetrów na pięć milimetrów między prawym uchem a prawym okiem. Przeciąć tkankę na powierzchni czaszki tylko brzusznie do oka. Zatamuj krwawienie za pomocą wacika hemostatycznego lub chusteczki laboratoryjnej.

Za pomocą wiertła dentystycznego i wiertła do szczeliny stożkowej wywierć otwór o wymiarach około dziewięć milimetrów na pięć milimetrów w czaszce grzbietowej wyśrodkowany w miejscu nacięcia. Przechyl głowę, aż zwój nerwu trójdzielnego będzie wyraźnie widoczny. Jeśli występuje krwawienie z zwoju nerwu trójdzielnego, odessać krew lub usunąć ją za pomocą wacika hemostatycznego lub chusteczki laboratoryjnej.

Upewnij się, że zwój nerwu trójdzielnego jest wyraźnie widoczny bez usuwania tkanki korowej. Przenieś zwierzę i poduszkę grzewczą do stolika mikroskopowego. Po potwierdzeniu, że mysz otrzymuje ciągłe znieczulenie izofluranem, ustaw ramkę stereotaktyczną tak, aby obiektyw mikroskopu znajdował się dziewięć milimetrów bezpośrednio nad otworem czaszki.

Włóż termometr doodbytniczy i podłącz przewód zasilający do termometru i poduszki grzewczej. Użyj obiektywu 5X, aby zlokalizować powierzchnię zwoju nerwu trójdzielnego za pomocą mikroskopu. Wyreguluj obiektyw i stożek nosowy, aby spłaszczyć powierzchnię zwoju i zmaksymalizować powierzchnię w płaszczyźnie ogniskowej.

Teraz załaduj podany protokół szybkiego skanowania mikroskopu. Skanuj zwój nerwu trójdzielnego w krótkich seriach od sześciu do ośmiu cykli. Zastosuj ortogonalne rzuty skanów, aby utworzyć film i sprawdź klarowność i spójność obrazu między klatkami.

Załaduj protokół skanowania w wysokiej rozdzielczości mikroskopu i utwórz obraz zwoju nerwu trójdzielnego w wysokiej rozdzielczości. Ponownie załaduj protokół szybkiego skanowania używany do tworzenia ortogonalnego filmu projekcyjnego i rejestruj spontaniczną aktywność przez 80 cykli. Utwórz film i sprawdź, czy obrazy są wystarczająco wyraźne i spójne, aby można je było przeanalizować.

Aby zastosować stymulację, ustaw mikroskop na skanowanie przez 15 do 20 cykli. W przypadku stymulacji von Freya ukierunkowanej na obszar V2 zwoju nerwu trójdzielnego, przytrzymaj włókno i przyłóż je wielokrotnie do obszaru ipsilateralnego poniżej oka i nad ustami od razu po skanie 5 do bezpośrednio po skanie 10. W przypadku stymulacji regionu V3 należy kilkakrotnie przyłożyć filament do obszaru ipsilateralnego tuż pod uchem podczas tego samego okna skanowania.

W przypadku bodźców zimnych i cieplnych ostudź lub podgrzej zlewkę z wodą do temperatury nieco poniżej lub powyżej żądanej temperatury. Rozpocznij skanowanie, a natychmiast po skanowaniu 5 użyj plastikowej pipety do przenoszenia, aby zastosować bodziec termiczny w obszarze ipsilateralnym poniżej oka i nad ustami w przypadku obszaru V2 lub tuż pod uchem w przypadku obszaru V3. Pod koniec eksperymentu wstrzyknij podskórnie 50 milimolowy chlorek potasu do regionów V2 lub V3, zaczynając od cyklu 6, aby aktywować i zidentyfikować wszystkie reagujące neurony.

Otwórz plik rzutowania ortogonalnego, przeciągając go i upuszczając w oprogramowaniu do analizy. Wybierz typ obrazu, klikając Obraz, a następnie Typ i wybierając kolor RGB. Aby otworzyć Menedżera ROI, kliknij Analizuj, a następnie Narzędzia i wybierz Menedżer ROI.

Wybierz aktywne neurony, rysując ROI za pomocą narzędzia elipsy na pasku narzędzi. Dodaj każdy wybrany region do pliku ROI, klikając przycisk dodawania w oknie Menedżer ROI. Teraz przejdź do Analizuj, wybierz Ustaw pomiary i zaznacz opcję dla średniej wartości szarości.

W oknie Menedżer zwrotu z inwestycji kliknij przycisk Więcej, a następnie wybierz opcję Wiele miar, aby zmierzyć intensywność. Gdy otworzy się nowe okno z etykietą Wyniki, zapisz plik CSV, wybierając Plik, a następnie Zapisz jako.Otwórz plik CSV w oprogramowaniu do arkuszy kalkulacyjnych i zapisz go jako plik arkusza kalkulacyjnego. Oblicz przejściową intensywność wapnia za pomocą podanego równania.

Do analizy losowo pobieraj próbki w przybliżeniu tej samej liczby neuronów z każdego zwoju, aby upewnić się, że jeden ganglion nie zdominuje analizy. Zmierz średnicę neuronu za pomocą narzędzia linii na pasku narzędzi, aby narysować linie wzdłuż najdłuższej i najkrótszej średnicy każdego neuronu. Następnie oblicz średnią z tych pomiarów.

Obrazowanie konfokalne zwoju nerwu trójdzielnego umożliwiło jednoczesną wizualizację ponad 3 000 neuronów, wychwytując zarówno spontaniczne, jak i wywołane bodźcem przejściowe wapń w regionach V2 i V3. W przypadku braku stymulacji podzbiór tych neuronów wykazywał spontaniczne stany przejściowe wapnia z różnymi profilami aktywności w sześciu indywidualnie śledzonych komórkach. Zastosowanie szkodliwego ciepła w okolicy szczęki spowodowało widoczną aktywację wielu neuronów, na co wskazuje jasna fluorescencja z zsynchronizowanym wzrostem przejściowej intensywności wapnia.

Szkodliwe ciepło przyłożone do okolicy żuchwy podobnie aktywowało odrębne neurony o zmiennych wzorcach reakcji wapnia w poszczególnych komórkach. Znacznie większa liczba neuronów zareagowała na dwugramową stymulację von Freya w porównaniu do 0,4 grama w regionie V2. Przejściowa intensywność wapnia w poszczególnych neuronach wzrastała silniej przy stymulacji dwugramowej niż przy 0,4 gramie, z wyższym szczytem i szerszym rozpiętością odpowiedzi.

Średnia intensywność odpowiedzi wapnia podczas pierwszej klatki bodźca była również znacznie większa po stymulacji dwoma gramami w porównaniu z 0,4 grama.