Name: In vivo (in vivo) Obrazowanie aktywności neuronalnej u nieznieczulonych dorosłych much Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Poznaj metodę obrazowania aktywności neuronalnej bez znieczulenia u dorosłych much Drosophila. Technika ta pozwala badać neuronalne podstawy aktywnego zapominania i elastyczności poznawczej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez National Institute for General Medical Science dla 1R01GM147917-01A1 oraz Brain and Behavior Research Foundation dla 30442.

Szczegóły dotyczące sprzętu i odczynników używanych do tego badania są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Transgeniczne muszki owocowe, Drosophila melanogaster
<ol>
	<li>Krzyżuj samice dziewic i samców much (hodowanych w temperaturze 25 °C przy 60% wilgotności względnej w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności) niosących pożądane konstrukty Gal4 i UAS, odpowiednio, w celu wyprodukowania much, w których określone neurony zainteresowania wyrażają pożądany genetycznie kodowany reporter aktywności.</li>
	<li>Starzej potomstwo powyższej krzyżówki do momentu, gdy znajdzie się w przedziale 2-5 dni po eklozji. Można używać zarówno mężczyzn, jak i kobiet, ponieważ komory obrazowania są wykonane na zamówienie, aby pasowały do obu płci.</li>
</ol>
2. Budowanie aspiratora (5-minutowy przepływ pracy)
<ol>
	<li>Przytnij rurkę silikonową o średnicy 6 mm do długości około 8 cali za pomocą żyletki. Weź końcówkę pipety p200 i odetnij około połowy za pomocą żyletki do ustnika (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Włóż odciętą końcówkę do rurki. Przytnij końcówkę pipety p1000 na tyle, aby mucha mogła się przez nią poruszać.</li>
	<li>Weź mały kawałek bawełny i przykryj silikonową rurkę. Ma to na celu zapobieżenie zasysaniu muchy do ust eksperymentatora. Umieść przyciętą końcówkę p1000 na rurki pokrytej bawełną.</li>
	<li>Zakryj końcówkę pipety p1000 nową końcówką do pipety p200. Aby określić odpowiednią długość do cięcia końcówki pipety p200, najpierw wyjmij końcówkę pipety p200 i zassaj muchę do końcówki pipety p1000. Ponownie zamocuj końcówkę p200. Delikatnie i postukaj w muchę, aby przesunąć ją tak daleko, jak to możliwe, do końcówki p200.
	<ol>
		<li>Gdy nie może już się dalej poruszać, użyj mikroskopu preparacyjnego, aby zaznaczyć punkt, w którym kończy się głowa muchy, a zaczyna klatka piersiowa, używając żyletki. Zassać rozporek z powrotem do końcówki pipety p1000 i odciąć końcówkę pipety p200 w zaznaczonym miejscu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Budowa aspiratora do metalowych rurek (5 - 10-minutowy przepływ pracy)
<ol>
	<li>Przytnij metalową rurkę podskórną o grubości 22X do żądanego rozmiaru (~10 cm) za pomocą narzędzi Dremel i diamentowego brzeszczotu. Wypoleruj końce metalowych rurek za pomocą tarczy do cięcia Dremel 420, aby uzyskać gładkie i czyste otwory. Ten otwór pomieści trąbkę muchy.</li>
	<li>Owiń rurkę wokół probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, aby uzyskać pożądany zakrzywiony kształt (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Krzywizna powinna tworzyć haczykowaty kształt, który pozwoli ciału muchy znaleźć się w jednej linii z komorą.</li>
	<li>Wytnij kawałek (~7 cm długości) metalowej rurki podskórnej o rozmiarze 12TW za pomocą narzędzi Dremel (ta rurka powinna pasować do końcówki do pipety o pojemności 2 μl). Weź końcówkę pipety o pojemności 2 μl i odetnij koniec za pomocą żyletki, aby pasował do metalowej rurki o średnicy 22X. Zamontuj większą metalową rurkę na drugim końcu końcówki pipety o pojemności 2 μl.</li>
	<li>Wymieszaj ze sobą niewielką ilość żywicy i utwardzacza kleju epoksydowego. Nałóż mieszaninę w miejscu, w którym mała metalowa rurka styka się z końcówką pipety i w miejscu, w którym większa metalowa rurka łączy się z końcówką pipety. Poczekaj, aż klej całkowicie utwardzi się przez noc przed podłączeniem zespołu do uchwytu na mikromanipulatorze. W razie potrzeby dostosuj kąt.</li>
</ol>
4. Budowa pipety do badania wstrząsów i eksperymentów pamięciowych pod mikroskopem (10-minutowy przepływ pracy)
<ol>
	<li>Za pomocą narzędzia diamentowego Dremel pokrój 1 ml w szklanej pipecie 1/100 w miejscu oznaczenia 3 ml. Wytnij mały prostokątny kawałek arkusza akrylowego o wymiarach 24,5 mm x 8 mm i grubości 1/8 cala. 
	UWAGA: Alternatywnie, ten element może być wydrukowany w 3D, aby lepiej dostosować się do siatki uderzeniowej (pliki stl i obj można znaleźć w pliku uzupełniającym 1 i pliku uzupełniającym 2).</li>
	<li>Wytnij miedzianą siatkę uderzeniową, aby pasowała do prostokątnego elementu akrylowego z poprzedniego kroku. dwa przewody elektryczne na przeciwległych końcach siatki miedzianej. Umieść miedzianą siatkę w prostokątnym akrylowym kawałku i wyginij ją tak, aby brzuch i nogi muchy zmieściły się na siatce uderzeniowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1I).</li>
	<li>Przyklej miedzianą siatkę do prostokątnego plastiku za pomocą kawałka taśmy izolacyjnej. Za pomocą gorącego pistoletu do klejenia bezpiecznie przymocuj szklaną pipetę do siatki uderzeniowej, upewniając się, że jest prosta i odpowiednio wyśrodkowana. Za pomocą multimetru cyfrowego sprawdź, czy miedziana siatka działa, aby skutecznie dostarczyć wstrząs do nóg muchy.</li>
</ol>
5. Montaż rezystora platynowego do topienia kleju (kwas mirystynowy) (20-minutowy przepływ pracy)
<ol>
	<li>Za pomocą szczypiec do ściągania izolacji przytnij 200 mm drutów na żądaną długość i zdejmij izolację z jednego końca obu drutów. Wytnij około 60 mm drutu platynowego (ta długość powinna wystarczyć do stworzenia pętli, która posłuży do stopienia kleju).</li>
	<li>Za pomocą pistoletu lutowniczego jeden koniec drutu platynowego do przewodu elektrycznego. Przełóż rurkę termokurczliwą przez przewód elektryczny i użyj palnika Bunsena, aby obkurczyć rurkę na drucie, aby zakryć lutowane części.</li>
	<li>Wytnij dwa 20-milimetrowe kawałki gumowej rurki o średnicy wewnętrznej 2,55 mm i przełóż je przez drut platynowy (drut platynowy powinien być wyprostowany, aby ułatwić ten proces). Użyj pistoletu lutowniczego, aby drugi koniec platynowego drutu do drugiego przewodu elektrycznego. Użyj nowej rurki termokurczliwej, aby przykryć tę nową lutowaną część.</li>
	<li>Wyjąć tłok strzykawki BD TB 1 ml i przepuścić przez cylinder przewody z poprzednich kroków. Platyna powinna wystawać z końca cylindra strzykawki. Nie powinno być żadnych odsłoniętych przewodów, a mała gumowa rurka powinna zakrywać drut platynowy, z wyjątkiem samego końca.</li>
	<li>Za pomocą ściągacza izolacji usuń niewielką ilość z obu pozostałych końców przewodów elektrycznych. Za pomocą pistoletu lutowniczego każdy przewód do wtyczki bananowej, aż zostanie bezpiecznie podłączony.</li>
	<li>Użyj kleju epoksydowego, aby skleić górną i dolną część cylindra strzykawki, aby skleić druty i lufę ze sobą; pozwoli to uniknąć naprężeń przewodów wewnątrz strzykawki i zapewni dłuższą żywotność rezystora. Pozwól klejowi utwardzić się przez noc.</li>
	<li>Podłącz gotowy rezystor do zasilacza prądu stałego.</li>
</ol>
6. Budowa komory nagraniowej - (2-dniowy przepływ pracy)
<ol>
	<li>Po pilniku uzupełniającym 3 wytnij laserowo czarną podkładkę z blachy (grubość 0,0125 cala). Rozmiar otworu w środku komory może być modyfikowany tak, aby pasował do wielkości much (rozmiar w pilniku zazwyczaj pasuje do samic i samców).</li>
	<li>Weź szklane szkiełko mikroskopowe, które posłuży jako podstawa komory. Wymieszaj ze sobą żywicę i żywicę epoksydową. Weź czarną akrylową komorę i za pomocą kleju epoksydowego przymocuj magnesy neodymowe 3 mm x 2 mm na wszystkich czterech rogach. Zaleca się przyklejanie jednego magnesu na raz i trzymanie go do czasu utwardzenia kleju za pomocą spinacza do papieru.</li>
	<li>Umieść dwa nowe magnesy na każdym z magnesów przyklejonych wcześniej do komory. Używając żywicy epoksydowej, przyklej ostatni przymocowany magnes do szkiełka i użyj spinaczy do papieru, aby utrzymać go na miejscu podczas kuratorowania. 
	UWAGA: Po wyselekcjonowaniu kleju komora jest kompletna i można dodać więcej magnesów, aby dostosować wysokość komory do eksperymentów. Plik uzupełniający 4, plik uzupełniający 5 i plik uzupełniający 6 pokazują zmontowaną komorę zapisu.</li>
</ol>
7. Protokół sekcji in vivo bez znieczulenia - (5 - 7-minutowy przebieg pracy)
<ol>
	<li>Wyjmij końcówkę pipety p200 z aspiratora. Włożyć aspirator do fiolki i odessać pojedynczą muchę do końcówki pipety p1000. Załóż końcówkę pipety p200 z powrotem na aspirator. Delikatnie przedmuchaj i potrząśnij aspiratorem tak, aby mucha została unieruchomiona w górnej części końcówki pipety p200, głową do przodu.</li>
	<li>Umieść komorę preparacyjną na uchwycie manipulatora. Podłącz odkurzacz do rurki przytrzymującej muchę i wyreguluj poziom przepływu w razie potrzeby (~500 ml/min). Użyj szybkiego złącza, aby łatwo i szybko podłączyć i odłączyć odkurzacz (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Przesuń metalową rurkę próżniową, aby wyśrodkować ją w polu view podczas patrzenia przez mikroskop. Upewnij się, że komora jest prawidłowo umieszczona, tak aby znalazła się bezpośrednio na metalowej rurce, gdy będzie gotowa do sklejenia muchy. Delikatnie zassaj trąbkę muchy do uchwytu próżniowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Gdy mucha znajdzie się we właściwej pozycji, przesuń manipulator tak, aby głowa muchy znalazła się w jednej linii z otworem komory.</li>
	<li>Włącz zasilanie prądem stałym. Prąd powinien być ustawiony w zakresie od 0,40 do 0,50 A. Wyższe prądy mogą spowodować stopienie się kwasu mirystynowego do punktu, w którym jego lepkość stanie się zbyt niska, zwiększając ryzyko rozprowadzenia kleju po głowie muchy.</li>
	<li>Korzystając z odporności na platynę, przyklej boki oczu i klatkę piersiową do komory za pomocą stopionego kwasu mirystynowego (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1B). Aby zapobiec dostaniu się kleju do naskórka głowy, użyj jak najmniejszej ilości kleju, zwłaszcza podczas klejenia boków oczu.</li>
	<li>Po sklejeniu oczu i klatki piersiowej odłącz rurkę próżniową i użyj manipulatora, aby zdjąć komorę nagrywającą z rurki próżniowej. Odwróć komorę do góry nogami i użyj platynowego oporu, aby przykleić trąbkę od dołu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Klejenie oczu od dołu jest opcjonalne i może pomóc utrzymać muchę na miejscu podczas sekcji, ale nie jest to konieczne.</li>
	<li>Gdy wszystko zostanie sklejone, wyłącz zasilanie prądem stałym, obróć komorę do pionu i przymocuj ją do szklanej podstawy bocznej. Wytnij mały kawałek taśmy za pomocą nożyczek i przyłóż go bezpośrednio przed i z tyłu głowy muchy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D).</li>
	<li>Obróć komorę tak, aby głowa była skierowana w stronę eksperymentatora pod kątem 90. Za pomocą igły preparacyjnej wykonaj pionowe nacięcie wzdłuż boków oczu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E). Obróć komorę tak, aby była umieszczona poziomo. Za pomocą igły preparacyjnej przeciąć naskórek (Rysunek 1E). 
	UWAGA: Upewnij się, że właśnie utworzone "okienko" naskórka można podnieść za pomocą igły preparującej. Jeśli podnosi się bez żadnego oporu, umieść igłę preparacyjną z powrotem na osłonie. Sól fizjologiczna nie jest używana w krokach 13 i 14, aby zapobiec załamaniu światła, które mogłoby utrudniać wyraźny widok podczas cięć.</li>
	<li>Dodaj 100 μl soli fizjologicznej na czubek głowy muchy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F). Za pomocą ostrych kleszczy ostrożnie zdejmij okno (Rysunek 1G). Za pomocą ostrych kleszczy ostrożnie usuń pozostały tłuszcz lub tchawicę. Mózg powinien być teraz gotowy do obrazowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1H-1J).</li>
</ol>
8. Wizualizacja plastyczności wywołanej uczeniem się poprzez awersyjne warunkowanie węchowe (20-minutowy przepływ pracy)
<ol>
	<li>Za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser i obiektyw do zanurzenia w wodzie umieść przygotowaną muchę na stoliku mikroskopu. Opcjonalnie użyj aparatu z obiektywem makro, aby ustawić ostrość w locie, upewniając się, że mucha jest zdrowa i porusza się.</li>
	<li>Dostosuj położenie siatki uderzeniowej/pipety zapachowej za pomocą mikromanipulatora tak, aby mucha znajdowała się na siatce uderzeniowej. 
	UWAGA: Mucha powinna nadal być w stanie swobodnie się poruszać, ponieważ siatka uderzeniowa dotyka tylko nóg i lekko brzucha (mucha powinna być w stanie zdjąć nogi i brzuch z siatki, jeśli jest schowana). Pipeta doprowadzająca zapach powinna być skierowana w stronę czułków muchy.</li>
	<li>Za pomocą pokrętła regulacji zgrubnej Z przeskanuj oś Z mózgu i zlokalizuj interesujący Cię obszar mózgu. Dostosuj rozmiar ramki do 512 x 512 px. Częstotliwość skanowania powinna być dostosowana do żądanej prędkości - minimum 2 Hz. Na koniec ustaw czas trwania nagrania.</li>
	<li>Rozpocznij rejestrowanie interesującego neuronu za pomocą specjalnie opracowanego lub komercyjnego systemu dostarczania zapachów i jednocześnie zainicjuj "wstępne szkolenie" dostarczania zapachu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C). Ustaw nagrywanie na 2 minuty. Prezentacja zapachu przed treningiem rozpoczyna się od zarejestrowania reakcji na 5-sekundowy pierwszy impuls zapachowy (CS-), po którym następuje 5-sekundowy impuls zapachowy (CS+) z 30-sekundowym interwałem bodźców.</li>
	<li>Po zebraniu odpowiedzi przedtreningowych odczekaj 5 minut przed zainicjowaniem protokołu treningowego w systemie dostarczania zapachów. W tym przykładzie podczas szkolenia zaprezentowano tylko CS+. Zapach CS+ jest prezentowany przez 1 minutę, inicjowany po 30 s po wyzwoleniu systemu dostarczania zapachów. Stymulator wstrząsów jest zaprogramowany tak, aby jednocześnie dostarczać wstrząsy o napięciu 12, 90 V podczas wydzielania zapachu.</li>
	<li>Po treningu odczekaj 5 minut lub 15 minut przed uzyskaniem odpowiedzi potreningowych. Rejestruj odpowiedzi potreningowe w taki sam sposób, w jaki odpowiedzi przedtreningowe były rejestrowane w kroku 6. Zapisz wszystkie pliki w odpowiednim formacie do późniejszej analizy obrazu.</li>
</ol>
9. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Aby przeanalizować nagrania, narysuj obszar zainteresowania (ROI) wokół obszaru neuronu. Powinno to być tak precyzyjne, jak to tylko możliwe, aby ograniczyć wpływ fluorescencji tła.</li>
	<li>Użyj narzędzia pomiarowego, aby wyodrębnić dane o średniej intensywności fluorescencji w ramach ROI dla każdej klatki nagrania. Wyeksportuj te dane jako plik CSV.</li>
	<li>Otwórz dane w MATLAB lub dowolnym programie do analizy danych, aby obliczyć wartości ΔF/Fo dla każdego śladu zapachu. Połącz dane, aby uzyskać średnie ΔF/Fo ogólne nagrania poszczególnych much i utwórz wykres średnich śladów reakcji na zapach przed i po treningu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2E,F).</li>
</ol>

<ol><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca2%2B+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Chen, T. W., Wardill, T. J., Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Akerboom, J., Chen, T. W., Wardill, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators.</a> Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).</li>
<li>Sun, F., Zeng, J., Jing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+fluorescent+sensor+enables+rapid+and+specific+detection+of+dopamine+in+flies%2C+fish%2C+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded fluorescent sensor enables rapid and specific detection of dopamine in flies, fish, and mice.</a> Cell. 174 (2), 481-496 (2018).</li>
<li>Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pHTomato%2C+a+red%2C+genetically+encoded+indicator+that+enables+multiplex+interrogation+of+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity.</a> Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).</li>
<li>Wang, L., Wu, C., Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-performance+genetically+encoded+fluorescent+indicator+for+in+vivo+cAMP+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A high-performance genetically encoded fluorescent indicator for in vivo cAMP imaging.</a> Nat Commun. 13 (1), 5363(2022).</li>
<li>Jing, M., Zhang, P., Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+fluorescent+acetylcholine+indicator+for+in+vitro+and+in+vivo+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded fluorescent acetylcholine indicator for in vitro and in vivo studies.</a> Nat Biotechnol. 36 (8), 723-737 (2018).</li>
<li>Yu, D., Akalal, D. B. G. B., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+alpha%2Fbeta+mushroom+body+neurons+form+a+branch-specific%2C+long-term+cellular+memory+trace+after+spaced+olfactory+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila alpha/beta mushroom body neurons form a branch-specific, long-term cellular memory trace after spaced olfactory conditioning.</a> Neuron. 52 (5), 845-855 (2006).</li>
<li>Hige, T., Aso, Y., Modi, M. N., Rubin, G. M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosynaptic+plasticity+underlies+aversive+olfactory+learning+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Heterosynaptic plasticity underlies aversive olfactory learning in Drosophila.</a> Neuron. 88 (5), 985-998 (2015).</li>
<li>Berry, J. A., Phan, A., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neurons+mediate+learning+and+forgetting+through+bidirectional+modulation+of+a+memory+trace%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dopamine neurons mediate learning and forgetting through bidirectional modulation of a memory trace.</a> Cell Rep. 25 (3), 651-662 (2018).</li>
<li>Cervantes-Sandoval, I., Davis, R. L., Berry, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1+impairs+forgetting-induced+cellular+plasticity+in+mushroom+body+output+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rac1 impairs forgetting-induced cellular plasticity in mushroom body output neurons.</a> Front Cell Neurosci. 14, 258(2020).</li>
<li>Martinez-Cervantes, J., Shah, P., Phan, A., Cervantes-Sandoval, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+order+unimodal+olfactory+sensory+preconditioning+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">High order unimodal olfactory sensory preconditioning in Drosophila.</a> Elife. 11, 79107(2022).</li>
<li>Faber, T., Joerges, J., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+learning+modifies+neural+representations+of+odors+in+the+insect+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Associative learning modifies neural representations of odors in the insect brain.</a> Nat Neurosci. 2 (1), 74-78 (1999).</li>
<li>Yu, D., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+calcium+transients+in+Drosophila+mushroom+body+neurons+with+camgaroo+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Detection of calcium transients in Drosophila mushroom body neurons with camgaroo reporters.</a> J Neurosci. 23 (1), 64-72 (2003).</li>
<li>Yu, D., Keene, A. C., Srivatsan, A., Waddell, S., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+DPM+neurons+form+a+delayed+and+branch-specific+memory+trace+after+olfactory+classical+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila DPM neurons form a delayed and branch-specific memory trace after olfactory classical conditioning.</a> Cell. 123 (5), 945-957 (2005).</li>
<li>Yu, D., Ponomarev, A., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+representation+of+the+spatial+code+for+odors+after+olfactory+classical+conditioning%3A+Memory+trace+formation+by+synaptic+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Altered representation of the spatial code for odors after olfactory classical conditioning: Memory trace formation by synaptic recruitment.</a> Neuron. 42 (3), 437-449 (2004).</li>
<li>Tully, T., Quinn, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+conditioning+and+retention+in+normal+and+mutant+Drosophilamelanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophilamelanogaster.</a> J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).</li>
<li>Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioned+behavior+in+Drosophilamelanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Conditioned behavior in Drosophilamelanogaster.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 71 (3), 708-712 (1974).</li>
<li>Quinn, W. G., Dudai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+phases+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Memory phases in Drosophila.</a> Nature. 262 (5569), 576-577 (1976).</li>
<li>Tempel, B. L., Bonini, N., Dawson, D. R., Quinn, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reward+learning+in+normal+and+mutant+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reward learning in normal and mutant Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (5), 1482-1486 (1983).</li>
<li>Turner, G. C., Bazhenov, M., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+representations+by+Drosophila+mushroom+body+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Olfactory representations by Drosophila mushroom body neurons.</a> J Neurophysiol. 99 (2), 734-746 (2008).</li>
<li>de Belle, J. S., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+odor+learning+in+Drosophila+abolished+by+chemical+ablation+of+mushroom+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies.</a> Science. 263 (5147), 692-695 (1979).</li>
<li>Schwaerzel, M., Monastirioti, M., Scholz, H., Friggi-Grelin, F., Birman, S., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+and+octopamine+differentiate+between+aversive+and+appetitive+olfactory+memories+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopamine and octopamine differentiate between aversive and appetitive olfactory memories in Drosophila.</a> J Neurosci. 23 (33), 10495-10502 (2003).</li>
<li>Kim, Y. C., Lee, H. G., Han, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D1+dopamine+receptor+dDA1+is+required+in+the+mushroom+body+neurons+for+aversive+and+appetitive+learning+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">D1 dopamine receptor dDA1 is required in the mushroom body neurons for aversive and appetitive learning in Drosophila.</a> J Neurosci. 27 (29), 7640-7647 (2007).</li>
<li>Riemensperger, T., Völler, T., Stock, P., Buchner, E., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Punishment+prediction+by+dopaminergic+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Punishment prediction by dopaminergic neurons in Drosophila.</a> Curr Biol. 15 (21), 1953-1960 (2005).</li>
<li>Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight+different+types+of+dopaminergic+neurons+innervate+the+Drosophila+mushroom+body+neuropil%3A+Anatomical+and+physiological+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: Anatomical and physiological heterogeneity.</a> Front Neural Circuits. 3 (5), 1-17 (2009).</li>
<li>Liu, C., Plaçais, P. Y., Yamagata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+dopamine+neurons+signals+reward+for+odour+memory+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A subset of dopamine neurons signals reward for odour memory in Drosophila.</a> Nature. 488 (7412), 512-516 (2012).</li>
<li>Burke, C. J., Huetteroth, W., Owald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layered+reward+signaling+through+octopamine+and+dopamine+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Layered reward signaling through octopamine and dopamine in Drosophila.</a> Nature. 492 (7429), 433-437 (2012).</li>
<li>Tomchik, S. M., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+learning-related+cAMP+signaling+and+stimulus+integration+in+the+Drosophila+olfactory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dynamics of learning-related cAMP signaling and stimulus integration in the Drosophila olfactory pathway.</a> Neuron. 64 (4), 510-521 (2009).</li>
<li>Gervasi, N., Tchenio, P., Preat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKA+dynamics+in+a+Drosophila+learning+center%3A+Coincidence+detection+by+rutabaga+adenylyl+cyclase+and+spatial+regulation+by+dunce+phosphodiesterase%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">PKA dynamics in a Drosophila learning center: Coincidence detection by rutabaga adenylyl cyclase and spatial regulation by dunce phosphodiesterase.</a> Neuron. 65 (4), 516-529 (2010).</li>
<li>Séjourné, J., Plaçais, P. Y., Aso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mushroom+body+efferent+neurons+responsible+for+aversive+olfactory+memory+retrieval+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mushroom body efferent neurons responsible for aversive olfactory memory retrieval in Drosophila.</a> Nat Neurosci. 14 (7), 903-910 (2011).</li>
<li>Aso, Y., Sitaraman, D., Ichinose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mushroom+body+output+neurons+encode+valence+and+guide+memory-based+action+selection+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila.</a> Elife. 3, 04580(2014).</li>
<li>Pai, T. P., Chen, C. C., Lin, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ORB+protein+in+two+mushroom+body+output+neurons+is+necessary+for+long-term+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Drosophila ORB protein in two mushroom body output neurons is necessary for long-term memory formation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (19), 7898-7903 (2013).</li>
<li>Owald, D., Felsenberg, J., Talbot, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+defined+mushroom+body+output+neurons+underlies+learned+olfactory+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity of defined mushroom body output neurons underlies learned olfactory behavior in Drosophila.</a> Neuron. 86 (2), 417-427 (2015).</li>
<li>Perisse, E., Owald, D., Barnstedt, O., Talbot, C. B., Huetteroth, W., Waddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aversive+learning+and+appetitive+motivation+toggle+feed-forward+inhibition+in+the+Drosophila+mushroom+body%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Aversive learning and appetitive motivation toggle feed-forward inhibition in the Drosophila mushroom body.</a> Neuron. 90 (5), 1086-1099 (2016).</li>
<li>Aso, Y., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+neurons+write+and+update+memories+with+cell-type-specific+rules%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic neurons write and update memories with cell-type-specific rules.</a> Elife. 5, 16135(2016).</li>
<li>Hige, T., Aso, Y., Rubin, G. M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity-driven+individualization+of+olfactory+coding+in+mushroom+body+output+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Plasticity-driven individualization of olfactory coding in mushroom body output neurons.</a> Nature. 526 (7572), 258-262 (2015).</li>
<li>MacMillan, H. A., Nørgård, M., MacLean, H. J., Overgaard, J., Williams, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+test+of+Drosophila+anaesthetics%3A+Isoflurane+and+sevoflurane+are+benign+alternatives+to+cold+and+CO2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">A critical test of Drosophila anaesthetics: Isoflurane and sevoflurane are benign alternatives to cold and CO2.</a> J Insect Physiol. 101, 97-106 (2017).</li>
<li>Margulies, C., Tully, T., Dubnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+memory+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Deconstructing memory in Drosophila.</a> Curr Biol. 15 (17), R700-R713 (2005).</li>
<li>Amiri, A., Karvandian, K., Ramezani, N., Amiri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+memory+impairment+in+patients+undergoing+general+anesthesia+and+its+contributing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+J+Anaesth%22%5BJournal%5D)">Short-term memory impairment in patients undergoing general anesthesia and its contributing factors.</a> Saudi J Anaesth. 14 (4), 454-458 (2020).</li>
<li>Wang, R., Zhang, L., Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+activity+pattern+of+mouse+hippocampal+CA1+and+dentate+gyrus+under+isoflurane+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological activity pattern of mouse hippocampal CA1 and dentate gyrus under isoflurane anesthesia.</a> Front Cell Neurosci. , 18(2024).</li>
<li>Berry, J. A., Cervantes-Sandoval, I., Chakraborty, M., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+facilitates+memory+by+blocking+dopamine+neuron-mediated+forgetting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sleep facilitates memory by blocking dopamine neuron-mediated forgetting.</a> Cell. 161, 1656-1667 (2015).</li>
<li>Delestro, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+large-scale+analysis+of+Drosophila+neuronal+calcium+traces+by+automated+tracking+of+single+somata%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata.</a> Sci Rep. 10, 1-15 (2020).</li>
<li>Moore, R. J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FicTrac%3A+A+visual+method+for+tracking+spherical+motion+and+generating+fictive+animal+paths%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">FicTrac: A visual method for tracking spherical motion and generating fictive animal paths.</a> J Neurosci Methods. 225, 106-119 (2014).</li>
<li>Seelig, J. D., Chiappe, M. E., Lott, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+from+head-fixed+Drosophila+during+optomotor+walking+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging from head-fixed Drosophila during optomotor walking behavior.</a> Nat Methods. 7 (7), 535-540 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zrozumienie obwodów neuronalnych stojących za uczeniem się i pamięcią jest głównym celem w dziedzinie neuronauki. Zestaw narzędzi genetycznych dostępnych u Drosophila, w połączeniu z prostotą i wszechstronnością testów behawioralnych, sprawia, że jest to idealny organizm modelowy do badania tych procesów. Opublikowane badania z różnych laboratoriów opisały różne protokoły przygotowania muszek do obrazowania funkcjonalnego bez użycia znieczulenia44,45. Jednak protokoły te różnią się znacznie i często opierają się na wysoce wyspecjalizowanych, niestandardowych narzędziach z ograniczonymi wskazówkami dotyczącymi ich tworzenia lub używania. W protokole tym przedstawiono metodę wykonywania funkcjonalnego obrazowania in vivo u muszek, która pozwala uniknąć mylących skutków znieczulenia ogólnego. Co więcej, podejście to pozwala na uchwycenie aktywności neuronalnej w czasie rzeczywistym w obrębie tej samej muchy, umożliwiając bezpośrednie porównanie reakcji neuronalnych przed i po ekspozycji na różne bodźce.
Podczas wypełniania tego protokołu krytyczne kroki obejmują upewnienie się, że trąbka muchy jest prawidłowo umieszczona w rurce próżniowej. Ten krok zapewnia, że kolejne klejenie nastąpi we właściwych miejscach i upewnia się, że głowa jest pod odpowiednim kątem, aby uwidocznić interesujące neurony. Minimalne nakładanie kleju jest niezbędne do utrzymania zdrowia much; Użycie najmniejszej ilości niezbędnej do zabezpieczenia rozporka na miejscu jest idealne. Protokół ten pozwala również na pewne modyfikacje w celu dopasowania do konkretnych potrzeb, takie jak sklejenie tylko boków oczu, aby całe ciało było wolne. Podobnie, komora perfuzyjna może być przymocowana do górnej części komory nagrywającej, aby ułatwić perfuzję Ringera lub dostarczanie leku. Wreszcie, obrotowa bieżnia pływająca może być umieszczona poniżej muchy, jak wcześniej informowano, co pozwala na analizę kierunkowości lokomocji46,47.
Protokół ten ma pewne ograniczenia, w tym stres, na jaki poddawane są muszki podczas mikrochirurgii w celu przygotowania much do obrazowania na żywo. Obchodzenie się z małymi muchami, oszczędne nakładanie kleju i ostrożne otwieranie torebki głowy bez uszkadzania jakiejkolwiek tkanki mózgowej lub ciała wymaga znacznej wiedzy, którą można zdobyć tylko poprzez skrupulatną praktykę i powtarzanie. Chociaż metoda ta jest szczególnie korzystna w badaniu procesów poznawczych na poziomie komórkowym, obrazowanie in vivo nadal ma pewne ograniczenia w porównaniu z zapisami elektrofizjologicznymi. Dodatkowo, podczas gdy nasz protokół unika stosowania znieczulenia przed obrazowaniem, mucha jest nadal ograniczona do fizycznej komory, która zawsze może zmienić odpowiedzi komórkowe. Niemniej jednak nasza metodologia zapewnia najbliższy sposób na zachowanie zdrowia muchy w celu optymalnego obrazowania in vivo . W porównaniu z istniejącymi metodami, które wykorzystują znieczulenie i krępują muchę, nasza metoda ma na celu utrzymanie muchy w jak najbardziej swobodnym ruchu, przy jednoczesnej możliwości obrazowania z komórek przy minimalnym ruchu.

Ostatnie osiągnięcia w raportowaniu aktywności kodowanej genetycznie zrewolucjonizowały neurobiologię, dostarczając w czasie rzeczywistym, bardzo szczegółowych informacji na temat aktywności neuronalnej. Te raporty, takie jak czujniki wapnia lub napięcia1,2,3,4,5,6,7,8,9, pozwalają naukowcom śledzić sygnały elektryczne i chemiczne w neuronach z niespotykaną precyzją czasową i rozdzielczością przestrzenną. Umożliwiając monitorowanie konkretnych, pojedynczych neuronów do sieci neuronowych w różnych regionach mózgu, narzędzia te pogłębiły naszą wiedzę na temat tego, w jaki sposób wzorce odpalania neuronów odnoszą się do procesów poznawczych, takich jak uczenie się, pamięć lub podejmowanie decyzji10,11,12,13,14.
Aby skorzystać z tych genetycznie zakodowanych wskaźników, naukowcy opracowali zaawansowane metody przygotowania swojego modelowego organizmu do obrazowania in vivo. Pierwszy raport o plastyczności neuronalnej za pomocą funkcjonalnego obrazowania in vivo, często określanego jako "ślad pamięciowy", został odkryty w płacie czułkowym pszczół miodnych po pożądanym kondycjonowaniu węchowym15. Odkrycie to zainspirowało badania nad genetycznie wszechstronnym organizmem modelowym, Drosophila melanogaster, co doprowadziło do opracowania innowacyjnych technik obrazowania in vivo10,16,17,18.
Drosophila służy jako doskonały model do zrozumienia uczenia się i pamięci ze względu na swoją silną zdolność do tworzenia wspomnień węchowych poprzez warunkowanie klasyczne, gdzie zapach (bodziec warunkowy-CS) staje się powiązany z bodźcem awersyjnym lub nagradzającym (bodziec bezwarunkowy-US)19,20,21,22. U Drosophila zapachy są słabo reprezentowane w ciele grzyba (MB)23, krytycznym regionie mózgu dla pamięci asocjacyjnej, który składa się z około 2000 neuronów komórek Kenyona (KC) na półkulę24. Informacje węchowe są przesyłane z kielicha do płatów MB za pośrednictwem aksonów KC, które łączą się ze sobą, tworząc płaty. Podczas warunkowania węchowego US, takie jak porażenie prądem lub nagroda cukrowa, jest przenoszone do płatów MB przez odrębne neurony dopaminergiczne (DAN): neurony PPL1 dla bodźców awersyjnych i neurony PAM dla bodźców nagradzających25,26,27,28,29,30. Uważa się, że akwizycja pamięci obejmuje jednoczesną aktywację szlaków CS i US, co skutkuje synergistycznym wzrostem cyklicznego AMP (cAMP), który koduje memory31,32. Proces ten indukuje plastyczność w synapsach KC→MBON, modyfikując ich wagę synaptyczną11,12,13,33,34,35,36,37. Plastyczność, w której pośredniczy DAN, ostatecznie napędza neurony wyjściowe ciała grzyba (MBON) do wywołania zachowania zbliżonego lub unikającego w stosunku do wyuczonego zapachu34. Obecny model sugeruje, że przepływ informacji z KC do MON przekształca reprezentację zapachu z tożsamości zapachu w KC na bardziej abstrakcyjne informacje w MBON, takie jak wartościowość zapachu na podstawie wcześniejszych doświadczeń34,38. W przeciwieństwie do KC, MBON mają szeroko dostrojone reakcje zapachowe; każdy dany zapach powoduje odpowiedź na większość MBONs39. Dostrajanie zapachu MBON-ów jest modyfikowane przez plastyczność synaptyczną i różni się znacznie między poszczególnymi muchami, co sugeruje, że MON zmieniają swoją reakcję na zapachy w oparciu o doświadczenie. Istnieją 34 MBON, przy czym większość sieci MBON wydaje się być podzielona na dwie wzajemnie antagonistyczne klasy, które napędzają oba podejścia do zachowań unikających34. Z tego powodu szeroko stosowane jest obrazowanie in vivo do badania odzyskiwania pamięci poprzez zapis w różnych MBON.
Wczesne metody obrazowania funkcjonalnego in vivo obejmują przeprowadzanie operacji w celu usunięcia fragmentu naskórka z górnej części torebki głowy, który następnie był przykrywany małym kawałkiem plastikowej folii18. Chociaż był to początek obrazowania in vivo u Drosophila, od tego czasu nastąpił znaczny postęp w technikach przygotowania muszek i dostarczaniu bodźców pod mikroskopem w celu zbadania procesów takich jak uczenie się i pamięć. Jednak nawet dzisiaj większość technik przygotowania muszek do obrazowania in vivo obejmuje znieczulenie muszek. Praktyka ta stanowi wyzwanie, ponieważ istnieje wiele dowodów - i cała dziedzina badań - pokazujących, jak znieczulenie wpływa na pamięć, a także inne procesy poznawcze i fizjologiczne. Na przykład przeprowadzono badanie mające na celu zrozumienie wpływu różnych środków znieczulających, które są bardzo powszechnie stosowane w warunkach laboratoryjnych (dwutlenek węgla, izofluran, sewofluran i szok zimna). Odkryli, że im dłuższa ekspozycja na znieczulenie, tym dłuższy czas rekonwalescencji, zmiany w aktywności lokomotorycznej, niższa płodność i może wpływać na zapasy wody i lipidów40. Ponadto doniesiono, że podanie znieczulenia zimnym wstrząsem bezpośrednio po treningu może całkowicie zakłócić pamięć krótkotrwałą21. Z tego wstępnego badania wiadomo teraz, że u Drosophila istnieje pamięć nieskonsolidowana (pamięć wrażliwa na znieczulenie), która zanika w ciągu 6-8 godzin, oraz forma pamięci skonsolidowanej (pamięć odporna na znieczulenie), która tworzy się stopniowo po nauczeniu się i może trwać około 24 godzin41. Na tej podstawie znieczulenie może wpływać na procesy poznawcze i aktywność neuronów, co ostatecznie pozwala na prawidłową ekspresję pamięci.
Wpływ znieczulenia na pamięć nie ogranicza się tylko do Drosophila. Liczne badania na ludziach i innych ssakach wykazały podobne wyniki. Na przykład badanie przekrojowe przeprowadzone w szpitalu uniwersyteckim wykazało, że pamięć krótkotrwała była znacznie zmniejszona u pacjentów 24 godziny po znieczuleniu ogólnym42. Inne badanie przeprowadzone na myszach wykazało, że znieczulenie ogólne znacznie zmniejszyło dynamikę skoków, zespoły komórkowe związane z dekoracją i zmieniło dynamikę kręgosłupa w regionie CA1 hipokampa, ważnym obszarze mózgu zaangażowanym w uczenie się i pamięć u ssaków43. Aby przezwyciężyć te trudności, celem tego badania jest zapewnienie nowatorskiego protokołu, który eliminuje stosowanie znieczulenia podczas przygotowania muszki do obrazowania in vivo, pozostawiając ciało muszki całkowicie wolne. Takie podejście pozwala na dokładniejsze zapisy aktywności neuronalnej, poprawia zdrowie much przy dłuższych zapisach i eliminuje możliwe zakłócające efekty znieczulenia w porównaniu z innymi podejściami. Protokół ten ma na celu rejestrowanie aktywności neuronów u Drosophila, w szczególności przyglądanie się, jak neurony wykazują plastyczność podczas i po doświadczeniu uczenia się. Jednak protokół preparacji jest wszechstronny i można go dostosować do różnych zastosowań w badaniach obrazowania na żywo.

<table><tbody><tr><td>Drut platynowy 0,102 mm</td><td>Surepure Chemetals</td><td>2690</td><td></td></tr><tr><td>0,25 OD, 0,125 ID, rurka silikonowa utwardzana platyną</td><td>VWR</td><td>89068-474</td><td></td></tr><tr><td>0,3 mm ID Rurka silikonowa&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-189-14</td><td></td></tr><tr><td>Wtyki bananowe</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>arkusz akrylowy do komory 0,0125 cala</td><td>Precision Brand</td><td>44250</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>Miedziana siatka przeciwwstrząsowa</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>zasilacz prądu stałego do rezystora platynowego</td><td>Fisher Scientific</td><td>S35740</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie Dremel 3000-1</td><td>Dremel</td><td>3000-N/18</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster / ; uas-tdtom</td><td>BDSC</td><td>36328</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster / ; UAS-GCAMP6F;</td><td>BDSC</td><td>42747</td><td>Ta linia UAS została połączona z ;; uas-td-tom w celu wygenerowania stado zawierającego obie insercje</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster/ ;; MB077C-gal4</td><td>BDSC</td><td>68287</td><td></td></tr><tr><td>Klej epoksydowy&nbsp;</td><td>Gorilla</td><td>4200102</td><td></td></tr><tr><td>Przepływomierz gazu 1,5 l/min</td><td>Amazon</td><td>B01N0UWZ2T</td><td></td></tr><tr><td>Szklana pipeta serologiczna 1 ml&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-232-9516</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Podskórne rurki o średnicy 12TW</td><td>Microgroup</td><td>316H12TW</td><td></td></tr><tr><td>Rurka podskórna o rozmiarze 22X</td><td>Microgroup</td><td>304H22X</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mirystynowy</td><td>Acros Organics</td><td>156961000</td><td></td></tr><tr><td>Magnesy neodymowe 3X2 mm</td><td>Amazon</td><td>B0CXSQ387M</td><td></td></tr><tr><td>P1000 końcówki</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>23-165RL</td><td></td></tr><tr><td>P200 końcówki</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>23-150RL</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatyczne złącze wtykowe 6mm OD</td><td>Amazon</td><td>B07ZHG8Y1Y</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Rurka PTFE 6mm OD</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żyletki&nbsp;</td><td>Amazonka</td><td>B08LYD6645</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Trehaloza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) obrazowanie aktywności neuronalnej u nieznieczulonych dorosłych much drosophila

In Vivo Imaging of Neural Activity in Unanesthetized Drosophila Adult Flies

Obrazowanie in vivo jest kluczowe dla badania neurobiologii u Drosophila, ponieważ pozwala na wizualizację w czasie rzeczywistym aktywności neuronalnej, rozwoju i plastyczności u nienaruszonej, zachowującej się muchy. Ta technika dostarcza bezcennych wglądów w dynamiczne procesy, takie jak funkcja synaptyczna i łączność obwodów, które nie mogą być dokładnie uchwycone w preparatach stałych lub ex vivo. Większość technik przygotowania muszek do obrazowania in vivo polega na znieczuleniu muszek na krótko przed obrazowaniem funkcjonalnym. Niemniej jednak obszerne dowody wskazują, że znieczulenie wpływa na kilka procesów poznawczych i fizjologicznych. Z tego powodu obrazowanie in vivo dorosłych Drosophila melanogaster bez użycia środków znieczulających podczas przygotowania zwierząt jest podejściem wymagającym, ale wysoce pożądanym. Przedstawiony tutaj protokół polega na unieruchomieniu głowy obudzonych much poprzez zassanie trąbki do małej metalowej rurki podłączonej do systemu próżniowego. Podczas gdy głowa jest nieruchoma, mucha jest przygotowywana do funkcjonalnego obrazowania bez konieczności znieczulenia. Protokół ten jest szybki i powtarzalny, dzięki czemu nie szkodzi muchom. Główną zaletą tej metody jest unikanie stosowania środka znieczulającego, co uwzględnia potencjalny złożony wpływ znieczulenia na aktywność neuronalną. Ta metoda jest zarówno niedroga, jak i wysoce elastyczna, wykorzystując niedrogie, konfigurowalne narzędzia. Pozwala na skuteczne obrazowanie żywych much, rejestrując szybkie zmiany w aktywności neuronalnej związane z dynamicznymi procesami poznawczymi.

W niniejszej pracy wykorzystano obrazowanie in vivo dorosłych osobników Drosophila bez znieczulenia w celu zbadania plastyczności indukowanej przez awersyjne warunkowanie węchowe w dobrze scharakteryzowanym neuronie wyjściowym ciała grzybowatego (MBON γ2α'1)12. Wskaźnik wapnia GCaMP6f2, wraz z czerwoną białkiem fluorescencyjnym TdTom, są ekspresowane w neuronie wyjściowym ciała grzybowatego, którego dendryty unerwiają przedział płatów γ i α' ciała grzybowatego i jest on genetycznie celowany do MBON γ2α'1 przy użyciu linii split-Gal4 MB077C34 (Ryc. 2A,B).
Aby zaobserwować plastyczność po awersyjnym warunkowaniu węchowym, muchę umieszcza się pod mikroskopem konfokalnym, tak aby jej odwłok i odnóża znajdowały się w centrum siatki elektrycznej, a pipeta do podawania zapachów była skierowana w stronę anteny muchy. Najpierw zarejestrowano odpowiedzi wapniowe na 5 s impuls 4-metylocykloheksanolu (MCH), a następnie na 5 s impuls 3-oktanolu (OCT), z zachowaniem 30 s odstępu między bodźcami. Pięć minut później muchy poddano treningowi poprzez jednoczesną prezentację 1 min impulsu OCT (CS+) wraz z 12 wstrząsami o napięciu 90 V. Taki schemat warunkowania asocjacyjnego wywołuje trwałą behawioralną pamięć awersyjną. Na koniec, 5 min i 15 min po warunkowaniu, zarejestrowano odpowiedzi wapniowe na MCH i OCT w taki sam sposób, jak przed treningiem. MBON γ2α'1 wykazuje silne odpowiedzi w postaci przejściowych wzrostów poziomu wapnia zarówno na MCH, jak i OCT przed warunkowaniem (Rysunek 2D-F). Niemniej jednak, zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami12, 5 min po warunkowaniu odpowiedzi wapniowe na CS+ (OCT) są całkowicie stłumione (Rysunek 2D-F). Dodatkowo odpowiedzi na CS- (MCH) zostały znacząco potęgowane. Po piętnastu minutach od treningu zaobserwowano podobne wyniki: odpowiedź wapniowa na CS+ była znacząco stłumiona, a na CS- potęgowana. Wyniki te wskazują, że ślad pamięciowy obserwowany dla obu zapachów utrzymuje się przez co najmniej 15 min (Rysunek 2D-F). Odpowiedzi te ilościowo określono, wyliczając średnią odpowiedź na zapach podczas 5 s impulsu, a następnie porównano je w obrębie tej samej muchy. Zmiany w odpowiedziach na zapachy można również zwizualizować za pomocą reprezentacji w pseudokolorach, ukazującej zmianę fluorescencji GCaMP6 przed i po treningu awersyjnym (Rysunek 2E). W przeciwieństwie do tego, znieczulenie muchy podczas przygotowania skutkuje zmniejszoną plastycznością zarówno dla CS+, jak i CS-. U znieczulonych zwierząt obserwuje się jedynie częściowe stłumienie odpowiedzi na CS+, ponieważ odpowiedzi po treningu są nadal obecne. Ponadto odpowiedzi na CS- nie różnią się znacząco po treningu (Rysunek 2G,H). Aby lepiej to zobrazować, obliczyliśmy indukowaną plastyczność jako stosunek CS+/CS-, co wykazało, że muchy nieznieszone wykazują znacząco większą plastyczność w porównaniu z zwierzętami znieczulonymi (Rysunek 2I). Te reprezentatywne wyniki wskazują, że protokół ten nadaje się do badania uczenia się i pamięci pod mikroskopem oraz zapewnia zdrowie muchy podczas długotrwałego obrazowania neuronów. Protokół ten jest na tyle wszechstronny, że można go zastosować do innych rodzajów obrazowania in vivo oraz badania innych interesujących neuronów.
<img alt="Schemat zestawu do sekcji muchy; montaż aspiratora, przygotowanie muchy z wyszczególnionymi etapami przyklejania i mocowania taśmą." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68332/68332fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: In vivo przygotowanie do obrazowania Muszka owocowa bez zastosowania znieczulenia. (A) Panel górny: Schemat ilustrujący etapy przygotowania aspiratora. Panel dolny: Schemat przedstawiający komorę zamocowaną w mikromanipulatorze podczas pozycjonowania muchy. Chuştka muchy zostaje umieszczona przy wylocie metalowej rurki połączonej z próżnią o przepływie 500 ml/min za pomocą aspiratora. Następnie komora zostaje umieszczona nad muchą.BBoki oczu i klatki piersiowej są przyklejane kwasem mirystynowym za pomocą wykonanego na zamówienie platynowego drutu oporowego.C) Proboscis muchy wysuwa się z metalowej rurki, a następnie odwraca komorę, aby umożliwić przyklejenie proboscis w miejscu, co minimalizuje jego ruchy podczas pomiarów. (DKomora jest przymocowana do szklanego podstawki w postaci slajdu. Na górną część komory, pokrywając czułki, oraz na tylną stronę nakleja się taśmę, aby zapobiec wyciekowi soli fizjologicznej.EWykonuje się dwa nacięcia pionowe wzdłuż kutykuli w pobliżu oczu złożonych, a następnie trzecie nacięcie poprzeczne w kutykule w pobliżu klatki piersiowej, tworząc „okno” do mózgu.F) Pomiędzy 100-200 µL soli fizjologicznej nanosi się na głowę muchy w miejscu nacięć. (G) Okienko kutykularne zostaje podniesione, pociągnięte i oddzielone za pomocą ostrych, precyzyjnych pęset w celu odsłonięcia mózgu. (HTkankę tłuszczową oraz tkankę tchawicy usuwa się, aby umożliwić wyraźną wizualizację komórek mózgu pod mikroskopem.IPrzygotowaną muchę umieszcza się pod mikroskopem i pozycjonuje tak, aby jej ciało znajdowało się w osi siatki do szoku.J) Obraz w pseudo-kolorach przedstawiający wzorzec ekspresji MBON γ2α′1. Obszar zainteresowania (ROI) został zaznaczony przerywaną linią otaczającą drzewo dendrytyczne. Pasek skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68332/68332fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Eksperyment warunkowania węchowego; obrazowanie fluorescencyjne; aktywność neuronalna; wykresy; analiza statystyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68332/68332fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Plastyczność indukowana uczeniem w MBON γ2α′1 po awersyjnym warunkowaniu węchowym. (A) Wzorzec ekspresji drivera MB077C-splitGal4 wykazującego GCaMP. Mózgi zostały wypreparowane i zabarwione przeciwciałami anty-GFP oraz przeciwbarwione przeciwciałami anty-nc82. Pasek skali: 50 µm. (B) Obraz w pseudokolorach MBON γ2α′1 z zaznaczonym ciałem komórki, wypustką oraz arboryzacją dendrytczną. Region dendrytyczny reprezentuje obszar, z którego zbierano odpowiedzi wapniowe. Pasek skali: 50 µm. (C) Schemat protokołu treningu awersyjnego. Muchy były poddawane 5-s impulsom MCH i OCT z 30 s czystego powietrza pomiędzy nimi. Po 5-minutowym odstępie muchy zostały nauczone kojarzyć OCT z dwunastoma wstrząsami elektrycznymi o napięciu 90 V. Rejestracje odpowiedzi wapniowych na MCH i OCT przeprowadzono 5 min i 15 min po treningu. (D) Przedstawiono ślady odpowiedzi zapachowej na MCH (panel górny) i OCT (panel dolny) przed treningiem oraz 5 min i 15 min po treningu. Grube czarne paski wskazują czas prezentacji zapachu. (E) Obrazy w pseudokolorach arboryzacji dendrytycznej MBON γ2α′1 przed treningiem oraz 5 min i 15 min po treningu, w odpowiedzi na MCH i OCT. Obserwuje się potęgację fluorescencji dla CS- (MCH), podczas gdy fluorescencja zostaje zniesiona dla CS+ (OCT). Pasek skali: 20 µm. (F) Średnia odpowiedź zapachowa na MCH jest istotnie potęgowana w 5 min i 15 min po treningu, podczas gdy odpowiedzi na OCT (CS+) są istotnie stłumione. Nieparametryczny test znakowy Wilcoxona, N = 12. (G) Ślady odpowiedzi zapachowej na MCH (panel górny) i OCT (panel dolny) przedstawione dla much zanestetyzowanych przed treningiem i 5 min po treningu. Grube czarne paski wskazują podawanie zapachu. (H) U zwierząt zanestetyzowanych średnie odpowiedzi zapachowe na MCH nie wykazują istotnej potęgacji po treningu, a odpowiedzi na OCT wykazują jedynie częściowe stłumienie w porównaniu z zwierzętami niezanestetyzowanymi. (I) Plastyczność indukowana treningiem, obliczona jako stosunek CS+/CS-, jest istotnie niższa u much zanestetyzowanych w porównaniu z tymi przygotowanymi bez znieczulenia. Nieparametryczny test znakowy Wilcoxona, N = 8-12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68332/68332fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Plik uzupełniający 1: Grid_holder (STL). Plik STL niestandardowego elementu służącego do mocowania siatki elektrycznej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68332/Grid_Holder.stl" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Grid_holder (OBJ). Plik OBJ niestandardowego elementu zaprojektowanego do utrzymywania siatki elektrycznej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68332/Grid_holder.obj" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 3: Chamber_LaserCut. Plik Adobe Illustrator użyty do wycinania laserowego górnego elementu komór rejestracyjnych dla much samców i samic. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68332/Chamber_laserCut.ai" target="_blank">Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.</a>
Plik uzupełniający 4: Recording_chamber (STL). Plik STL specjalnie zaprojektowanej komory rejestracyjnej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68332/Recording_chamber.stl" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 5: Recording_chamber (OBJ). Plik OBJ specjalnie zaprojektowanej komory rejestracyjnej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68332/Recording_chamber.obj" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 6: Recording_chamber_animation. Film MP4 przedstawiający animację złożonej komory rejestracyjnej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68332/Recordig_chamber_animation.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Istotną przeszkodą w badaniu aktywności komórkowej podczas procesów poznawczych, takich jak uczenie się i pamięć, jest stosowanie środków znieczulających do przygotowania obrazowania in vivo. Znieczulenie upośledza pamięć krótkotrwałą i funkcje poznawcze w wielu modelach, w tym u Drosophila. W pracy przedstawiono unikalną metodę przygotowania dorosłej Drosophila do obrazowania in vivo bez znieczulenia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie aktywności neuronalnej u nieznieczulonych dorosłych much Drosophila

In vivo imaging is crucial for studying neurobiology in Drosophila as it allows real-time visualization of neuronal activity, development, and plasticity ...

Próbujemy zrozumieć molekularne, komórkowe i obwodowe podstawy naturalnego zapominania pamięci, dążąc do odkrycia, w jaki sposób mózg aktywnie wymazuje lub tłumi wspomnienia, aby zachować elastyczność poznawczą. Ostatnie badania wykazały, że zapominanie nie jest jedynie biernym zanikiem wspomnień, ale raczej wysoce regulowanym aktywnym procesem biologicznym, który wymaga określonych wzorców aktywności neuronalnej.Głównym wyzwaniem jest powiązanie określonych manipulacji obwodami z dynamicznymi procesami pamięciowymi przy jednoczesnej integracji danych konektomicznych, genetycznych i behawioralnych w rygorystyczny i możliwy do interpretacji sposób. Pomogliśmy ustalić, że zapominanie jest aktywnym, biologicznie regulowanym procesem. Nasza praca pozwoliła zidentyfikować specyficzne neurony dopaminergiczne i szlaki molekularne niezbędne do normalnego zapominania w mózgu Drosophila. Nasz protokół umożliwia funkcjonalne obrazowanie u muszek bez znieczulenia, zapobiegając niepożądanym niespecyficznym efektom działania środków znieczulających. Używamy tego podejścia do zbadania neuronalnych korelatów leżących u podstaw tworzenia pamięci i aktywnego zapominania pamięci.[Narrator] Aby rozpocząć, użyj narzędzi Dremel i diamentowego brzeszczotu, aby przyciąć metalową rurkę podskórną o rozmiarze 22 do długości około 10 centymetrów. Za pomocą tarczy tnącej Dremel 420 wypoleruj oba końce rurki, aby uzyskać gładki i czysty otwór, który może pomieścić trąbkę muchy. Owiń przeciętą rurkę wokół 15-mililitrowej probówki wirówkowej, aby uzyskać pożądany zakrzywiony kształt. Następnie wytnij 7-centymetrowy kawałek metalowej rurki podskórnej o średnicy 12 mm. Teraz użyj żyletki, aby przyciąć koniec końcówki pipety o pojemności 2 mikrolitrów, aby pasowała do metalowej rurki o średnicy 22 mm. Zamontuj rurkę o rozmiarze 12 na drugim końcu końcówki pipety. Następnie wymieszaj ze sobą niewielką ilość żywicy epoksydowej i utwardzacza. Nałóż żywicę epoksydową na połączenia, w których mała metalowa rurka styka się z końcówką pipety i gdzie większa rurka łączy się z drugim końcem. Poczekaj, aż żywica epoksydowa całkowicie utwardzi się przez noc przed podłączeniem zespołu do uchwytu mikromanipulatora i dostosowaniem kąta w razie potrzeby. Aby zbudować pipetę do wykrywania wstrząsów i zapachów, odetnij 1 mililitr z pipety szklanej 1 x 100 na poziomie 3 mililitrów za pomocą narzędzia diamentowego Dremel. Następnie wytnij mały prostokątny arkusz akrylowy o wymiarach 24,5 milimetra x 8 milimetrów o grubości 1/8 cala. Wytnij miedzianą siatkę uderzeniową, aby pasowała do prostokątnego elementu akrylowego. dwa przewody elektryczne do przeciwległych końców siatki miedzianej. Teraz umieść miedzianą siatkę na akrylowym elemencie i lekko ją zegnij, aby pomieścić brzuch i nogi muchy. Użyj taśmy elektrycznej, aby przymocować miedzianą siatkę do elementu akrylowego. Następnie użyj gorącego pistoletu do klejenia, aby przymocować szklaną pipetę do siatki uderzeniowej, upewniając się, że jest prosta i wyśrodkowana. Aby zbudować komorę zapisu, weź szklane szkiełko mikroskopowe jako podstawę komory. Wymieszaj ze sobą żywicę i klej epoksydowy. Za pomocą kleju epoksydowego przymocuj magnesy neodymowe do wszystkich czterech rogów czarnej akrylowej komory. Umieść dodatkowy magnes na każdym przyklejonym magnesie. Następnie przyklej nowo umieszczone magnesy do szkiełka za pomocą żywicy epoksydowej. Przytrzymaj zespół na miejscu za pomocą spinaczy do papieru podczas utwardzania. Wyjmij końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów z aspiratora. Włóż aspirator do fiolki zawierającej Drosophila i odessaj pojedynczą muchę do końcówki pipety o pojemności 1,000 mikrolitrów. Załóż końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów z powrotem na aspirator. Następnie delikatnie przedmuchaj i potrząśnij aspiratorem, aby mucha została unieruchomiona głową w dół na górze końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Następnie umieść komorę preparacyjną na uchwycie manipulatora. Podłącz podciśnienie do rurki przytrzymującej muchę i dostosuj natężenie przepływu do około 500 mililitrów na minutę. Teraz przesuń metalową rurkę próżniową do środka pola widzenia mikroskopu. Delikatnie zassaj trąbkę much do uchwytu próżniowego. Wyreguluj manipulator tak, aby wyrównał głowę muchy z otworem komory. Włącz zasilanie prądem stałym. Za pomocą platynowego drutu oporowego nałóż stopiony kwas mirystynowy, aby przykleić oczy i klatkę piersiową do komory. Po zabezpieczeniu odłącz rurkę próżniową. Wyjmij komorę nagrywania z przyłącza podciśnienia za pomocą manipulatora i odwróć komorę do góry nogami. Następnie przyklej trąbkę od dołu za pomocą platynowego oporu. Gdy wszystko zostanie sklejone, wyłącz zasilanie prądem stałym. Następnie obróć komorę do góry nogami. Przymocuj komorę do szklanej podstawy prowadnicy. Wytnij mały kawałek taśmy nożyczkami i umieść go przed i za głową muchy. Obróć komorę tak, aby głowa muchy była skierowana w stronę eksperymentatora pod kątem 90 stopni. Za pomocą igły preparacyjnej wykonaj pionowe nacięcia wzdłuż boków oczu. Obróć komorę poziomo. Następnie wykonaj poziome cięcie w poprzek naskórka. Teraz dodaj 100 mikrolitrów soli fizjologicznej na czubek głowy muchy. Za pomocą ostrych kleszczy usuń okienko naskórka, a następnie usuń pozostały tłuszcz lub tchawicę za pomocą kleszczy. Umieść przygotowaną muchę na stoliku mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser i obiektyw do zanurzenia w wodzie. Za pomocą mikromanipulatora wyreguluj położenie siatki uderzeniowej i pipety zapachowej tak, aby mucha była prawidłowo umieszczona na siatce wstrząsowej. Użyj pokrętła regulacji kursu z, aby przeskanować oś z mózgu i zlokalizować obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania. Ustaw rozmiar klatki na 512 x 512 pikseli. Rozpocznij nagrywanie od interesującego Cię neuronu za pomocą specjalnie wykonanego lub dostępnego na rynku systemu dostarczania zapachów. Ustaw czas nagrywania na 2 minuty. Zainicjuj protokół treningowy za pomocą systemu dostarczania zapachów 5 minut po zebraniu odpowiedzi przedtreningowych. Następnie zapisuj odpowiedzi potreningowe około 5-15 minut po treningu. Wskaźnik wapnia GCaMP6f i czerwone białko fluorescencyjne tdTomato były selektywnie eksprymowane w neuronie wyjściowym ciała grzyba z dendrytami rzutującymi do płatów gamma i alfa kreski ciała grzyba, a neuron został uwidoczniony za pomocą linii sterującej MB077C split-GAL4. Odpowiedzi wapnia w neuronie wydalającym ciało grzyba na 3-oktanol były znacznie zmniejszone 5 minut po odwróceniu kondycjonowania bez znieczulenia i pozostawały stłumione po 15 minutach. W przeciwieństwie do tego, odpowiedź wapnia na 4-metylocykloheksanol była znacznie zwiększona 5 minut po treningu i pozostała podwyższona po 15 minutach. Obrazy pseudokolorowe wykazały wyraźne zmiany fluorescencji przed i po treningu. U znieczulonych muszek potreningowe odpowiedzi wapnia na CS+ były tylko częściowo zmniejszone, a odpowiedzi na CS- nie różniły się znacząco od wartości wyjściowej. Analiza ilościowa potwierdziła, że odpowiedź CS+ była znacznie obniżona po treningu u znieczulonych muszek, ale odpowiedzi CS- pozostały statystycznie niezmienione. Plastyczność była istotnie wyższa u much nieznieczulonych w porównaniu ze znieczulonymi.

in-vivo-imaging-neural-activity-unanesthetized-drosophila-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół opisuje niezawodną metodę znieczulania i obrazowania nienaruszonych larw Drosophila melanogaster. Wykorzystaliśmy lotny anestetyk desfluran, aby umożliwić powtarzalne obrazowanie z rozdzielczością podkomórkową oraz ponowną identyfikację struktur przez okres do kilku dni1.

Obrazowanie in vivo nienaruszonych larw Drosophila z rozdzielczością podkomórkową

Ten film opisuje obrazowanie in vivo wapnia w neuronach Drosophila za pomocą GCaMP. Prezentowany klip protokołu pokazuje, jak rejestrować zmiany we fluorescencji GCaMP z neuronów ciała grzyba podczas eksperymentu kondycjonowania węchowego.

Drosophila In Vivo (Drosophila) in vivo (Drosophila) Obrazowanie wapnia: metoda funkcjonalnego obrazowania aktywności neuronalnej

Ten film demonstruje metodę obrazowania wapnia in vivo za pomocą synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia u muszek. Przedstawia etapy przygotowania muszek do mikroskopii, przeprowadzania kondycjonowania węchowego i wizualizacji napływu wapnia wywołanego zapachem.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia za pomocą synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia u Drosophila melanogaster

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Tutaj prezentujemy nowatorskie podejście do obrazowania Ca2+ za pomocą bioluminescencyjnego reportera. Podejście to wykorzystuje stopiony konstrukt GFP-aequorin, który wiąże się z Ca2+ i emituje światło, eliminując potrzebę wzbudzenia światła. Co istotne, metoda ta pozwala na długie, ciągłe obrazowanie, dostęp do głębokich struktur mózgu i wysoką rozdzielczość czasową.

In vivo (in vivo) Funkcjonalne obrazowanie mózgu oparte na bioluminescencyjnym wskaźniku wapnia GFP-aequorin

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Ten artykuł opisuje protokół obrazowania ex vivo wapnia mózgu Drosophila. W tej metodzie do buforu można zastosować naturalne lub syntetyczne związki, aby przetestować ich zdolność do aktywacji określonych neuronów w mózgu.

Ex vivo Obrazowanie wapnia do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół, za pomocą którego można wizualizować wapń pre- i/lub postsynaptyczny w kontekście uczenia się i zapamiętywania Drosophila. Obrazowanie wapnia in vivo przy użyciu synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia jest połączone z klasycznym paradygmatem warunkowania węchowego, dzięki czemu można określić plastyczność synaptyczną leżącą u podstaw tego typu uczenia się asocjacyjnego.

Optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u Drosophila melanogaster

Prezentujemy metodę specjalnie dostosowaną do obrazowania całego mózgu dorosłego Drosophila podczas zachowania i w odpowiedzi na bodźce. Głowa jest ustawiona tak, aby umożliwić optyczny dostęp do całego mózgu, podczas gdy mucha może poruszać nogami i czułkami, czubkiem trąbki, a oczy mogą odbierać bodźce czuciowe.

Przygotowanie dorosłego osobnika Drosophila melanogaster do obrazowania całego mózgu podczas reakcji na zachowanie i bodźce

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania ex vivo wapnia u dorosłych Drosophila wykazujących ekspresję GCaMP6 w celu monitorowania aktywności epileptiformalnej. Protokół stanowi cenne narzędzie do badania zdarzeń moczowych u dorosłych Drosophila poprzez obrazowanie wapnia ex vivo, co pozwala na zbadanie potencjalnych mechanizmów padaczki na poziomie komórkowym.

Ex vivo Obrazowanie wapnia w modelu padaczki Drosophila

Przedstawiamy protokoły obrazowania wapnia dla larwalnego neuronu węchowego Drosophila , wykorzystując miejscowy klej tkankowy do unieruchomienia. Ta metoda zwiększa stabilność, ułatwiając wiarygodne eksperymenty in vivo i ex-vivo . Niestandardowe skrypty R analizują sygnały wapnia, zapewniając efektywną platformę do szczegółowych badań neurofizjologicznych.

Obrazowanie wapnia in vivo i ex vivo neuronu obwodu węchowego u larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium

Poznaj metodę obrazowania aktywności neuronalnej bez znieczulenia u dorosłych much Drosophila. Technika ta pozwala badać neuronalne podstawy aktywnego zapominania i elastyczności poznawczej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie aktywności neuronalnej u nieznieczulonych dorosłych much Drosophila

Przeglądaj więcej filmów