In vivo (in vivo) Obrazowanie aktywności neuronalnej u nieznieczulonych dorosłych much Drosophila

Próbujemy zrozumieć molekularne, komórkowe i obwodowe podstawy naturalnego zapominania pamięci, dążąc do odkrycia, w jaki sposób mózg aktywnie wymazuje lub tłumi wspomnienia, aby zachować elastyczność poznawczą. Ostatnie badania wykazały, że zapominanie nie jest jedynie biernym zanikiem wspomnień, ale raczej wysoce regulowanym aktywnym procesem biologicznym, który wymaga określonych wzorców aktywności neuronalnej.

Głównym wyzwaniem jest powiązanie określonych manipulacji obwodami z dynamicznymi procesami pamięciowymi przy jednoczesnej integracji danych konektomicznych, genetycznych i behawioralnych w rygorystyczny i możliwy do interpretacji sposób. Pomogliśmy ustalić, że zapominanie jest aktywnym, biologicznie regulowanym procesem. Nasza praca pozwoliła zidentyfikować specyficzne neurony dopaminergiczne i szlaki molekularne niezbędne do normalnego zapominania w mózgu Drosophila. Nasz protokół umożliwia funkcjonalne obrazowanie u muszek bez znieczulenia, zapobiegając niepożądanym niespecyficznym efektom działania środków znieczulających. Używamy tego podejścia do zbadania neuronalnych korelatów leżących u podstaw tworzenia pamięci i aktywnego zapominania pamięci.

[Narrator] Aby rozpocząć, użyj narzędzi Dremel i diamentowego brzeszczotu, aby przyciąć metalową rurkę podskórną o rozmiarze 22 do długości około 10 centymetrów. Za pomocą tarczy tnącej Dremel 420 wypoleruj oba końce rurki, aby uzyskać gładki i czysty otwór, który może pomieścić trąbkę muchy. Owiń przeciętą rurkę wokół 15-mililitrowej probówki wirówkowej, aby uzyskać pożądany zakrzywiony kształt. Następnie wytnij 7-centymetrowy kawałek metalowej rurki podskórnej o średnicy 12 mm. Teraz użyj żyletki, aby przyciąć koniec końcówki pipety o pojemności 2 mikrolitrów, aby pasowała do metalowej rurki o średnicy 22 mm. Zamontuj rurkę o rozmiarze 12 na drugim końcu końcówki pipety. Następnie wymieszaj ze sobą niewielką ilość żywicy epoksydowej i utwardzacza. Nałóż żywicę epoksydową na połączenia, w których mała metalowa rurka styka się z końcówką pipety i gdzie większa rurka łączy się z drugim końcem. Poczekaj, aż żywica epoksydowa całkowicie utwardzi się przez noc przed podłączeniem zespołu do uchwytu mikromanipulatora i dostosowaniem kąta w razie potrzeby. Aby zbudować pipetę do wykrywania wstrząsów i zapachów, odetnij 1 mililitr z pipety szklanej 1 x 100 na poziomie 3 mililitrów za pomocą narzędzia diamentowego Dremel. Następnie wytnij mały prostokątny arkusz akrylowy o wymiarach 24,5 milimetra x 8 milimetrów o grubości 1/8 cala. Wytnij miedzianą siatkę uderzeniową, aby pasowała do prostokątnego elementu akrylowego. dwa przewody elektryczne do przeciwległych końców siatki miedzianej. Teraz umieść miedzianą siatkę na akrylowym elemencie i lekko ją zegnij, aby pomieścić brzuch i nogi muchy. Użyj taśmy elektrycznej, aby przymocować miedzianą siatkę do elementu akrylowego. Następnie użyj gorącego pistoletu do klejenia, aby przymocować szklaną pipetę do siatki uderzeniowej, upewniając się, że jest prosta i wyśrodkowana. Aby zbudować komorę zapisu, weź szklane szkiełko mikroskopowe jako podstawę komory. Wymieszaj ze sobą żywicę i klej epoksydowy. Za pomocą kleju epoksydowego przymocuj magnesy neodymowe do wszystkich czterech rogów czarnej akrylowej komory. Umieść dodatkowy magnes na każdym przyklejonym magnesie. Następnie przyklej nowo umieszczone magnesy do szkiełka za pomocą żywicy epoksydowej. Przytrzymaj zespół na miejscu za pomocą spinaczy do papieru podczas utwardzania. Wyjmij końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów z aspiratora. Włóż aspirator do fiolki zawierającej Drosophila i odessaj pojedynczą muchę do końcówki pipety o pojemności 1,000 mikrolitrów. Załóż końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów z powrotem na aspirator. Następnie delikatnie przedmuchaj i potrząśnij aspiratorem, aby mucha została unieruchomiona głową w dół na górze końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Następnie umieść komorę preparacyjną na uchwycie manipulatora. Podłącz podciśnienie do rurki przytrzymującej muchę i dostosuj natężenie przepływu do około 500 mililitrów na minutę. Teraz przesuń metalową rurkę próżniową do środka pola widzenia mikroskopu. Delikatnie zassaj trąbkę much do uchwytu próżniowego. Wyreguluj manipulator tak, aby wyrównał głowę muchy z otworem komory. Włącz zasilanie prądem stałym. Za pomocą platynowego drutu oporowego nałóż stopiony kwas mirystynowy, aby przykleić oczy i klatkę piersiową do komory. Po zabezpieczeniu odłącz rurkę próżniową. Wyjmij komorę nagrywania z przyłącza podciśnienia za pomocą manipulatora i odwróć komorę do góry nogami. Następnie przyklej trąbkę od dołu za pomocą platynowego oporu. Gdy wszystko zostanie sklejone, wyłącz zasilanie prądem stałym. Następnie obróć komorę do góry nogami. Przymocuj komorę do szklanej podstawy prowadnicy. Wytnij mały kawałek taśmy nożyczkami i umieść go przed i za głową muchy. Obróć komorę tak, aby głowa muchy była skierowana w stronę eksperymentatora pod kątem 90 stopni. Za pomocą igły preparacyjnej wykonaj pionowe nacięcia wzdłuż boków oczu. Obróć komorę poziomo. Następnie wykonaj poziome cięcie w poprzek naskórka. Teraz dodaj 100 mikrolitrów soli fizjologicznej na czubek głowy muchy. Za pomocą ostrych kleszczy usuń okienko naskórka, a następnie usuń pozostały tłuszcz lub tchawicę za pomocą kleszczy. Umieść przygotowaną muchę na stoliku mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser i obiektyw do zanurzenia w wodzie. Za pomocą mikromanipulatora wyreguluj położenie siatki uderzeniowej i pipety zapachowej tak, aby mucha była prawidłowo umieszczona na siatce wstrząsowej. Użyj pokrętła regulacji kursu z, aby przeskanować oś z mózgu i zlokalizować obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania. Ustaw rozmiar klatki na 512 x 512 pikseli. Rozpocznij nagrywanie od interesującego Cię neuronu za pomocą specjalnie wykonanego lub dostępnego na rynku systemu dostarczania zapachów. Ustaw czas nagrywania na 2 minuty. Zainicjuj protokół treningowy za pomocą systemu dostarczania zapachów 5 minut po zebraniu odpowiedzi przedtreningowych. Następnie zapisuj odpowiedzi potreningowe około 5-15 minut po treningu. Wskaźnik wapnia GCaMP6f i czerwone białko fluorescencyjne tdTomato były selektywnie eksprymowane w neuronie wyjściowym ciała grzyba z dendrytami rzutującymi do płatów gamma i alfa kreski ciała grzyba, a neuron został uwidoczniony za pomocą linii sterującej MB077C split-GAL4. Odpowiedzi wapnia w neuronie wydalającym ciało grzyba na 3-oktanol były znacznie zmniejszone 5 minut po odwróceniu kondycjonowania bez znieczulenia i pozostawały stłumione po 15 minutach. W przeciwieństwie do tego, odpowiedź wapnia na 4-metylocykloheksanol była znacznie zwiększona 5 minut po treningu i pozostała podwyższona po 15 minutach. Obrazy pseudokolorowe wykazały wyraźne zmiany fluorescencji przed i po treningu. U znieczulonych muszek potreningowe odpowiedzi wapnia na CS+ były tylko częściowo zmniejszone, a odpowiedzi na CS- nie różniły się znacząco od wartości wyjściowej. Analiza ilościowa potwierdziła, że odpowiedź CS+ była znacznie obniżona po treningu u znieczulonych muszek, ale odpowiedzi CS- pozostały statystycznie niezmienione. Plastyczność była istotnie wyższa u much nieznieczulonych w porównaniu ze znieczulonymi.